漳州市医院肿瘤院士工作站百级标准GMP实验室信息介绍
生物多细胞免疫治疗是如今治疗肿瘤的四大方法之一，它更是具备自身特有的优势，就是不开刀，取材来自于自身所以更容易被患者接受，但同时它对治疗环境的要求极为苛刻，尤其是进行细胞培养阶段，对于温度、适度和细菌极为敏感，所以要想治疗成功，就必须在高标准的实验室完成细胞的免疫培养，作为生物免疫疗法的重点推广医院，漳州市医院肿瘤院士工作站为此专门配备的高标准的“GMP”细胞无菌实验室，让生物多细胞免疫治疗这个“绿色治疗”技术更有安全保障。该院的GMP细胞实验室是有细胞操作上、培养室、细胞保存间、耗材间、清洗消毒间、洁具室组成。细胞实验室GMP设备在国际上也是非常先进的，为培养出高质量细胞培养提供了保障。
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漳州市医院肿瘤院士工作站一直坚持强化无菌观念和正规化管理仍然是医疗程安全的根本保证与要求，仍然是管理GMP工作之根本、之重点，只有当两者紧密结合起来才是趋于完美的。漳州市医院肿瘤院士工作站是第一个真正的GMP 实验室(百级和千级)运行、使用三年来，设备状况良好，效果确实。加之严格地执行各项规章制度，加强管理，做到"人尽其责，物尽其利"，"质效"俱佳无一例患者感染病例发生。
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1、进入GMP实验室必须穿好防菌服，穿戴好医用鞋套、手套和帽子。
2、严格控制入室人数。
3、尽量减少实验室室的开门次数与时间(更不可将门打开不关),维持"相对密闭状态"，以防外来污染的进入。
4、室内设备用酒精擦拭室内物品、医疗程仪器、设备等。
5、每次出去GMP实验室及时、彻底清洁室内所有物品、墙壁及地面。
6、妇女不可用粉、头发喷雾剂和指甲油之类的化妆品，以减少污染来源。
7、工作服应选用不易产生静电、不易脱落纤维的涤纶和尼龙织物。
8、定期检测层流系统功能状态，测试GMP试验室环境空气洁净度指标和细菌培养等。
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1、“GMP”实验室是国际细胞培养最高标准的实验室，漳州市医院肿瘤院士工作站完全按照国际净化标准建立，让细胞培养更安全。
2、可供舒适的气流(室内温度可在20-24℃，湿度可在45-60%之间调节)。
3、实验室正压气流(+23-25Pa)可有效防止外来污染的进入。
4、实验室内空气清新、爽洁，工作环境舒适。
5、“GMP”实验室，一般情况下无需使用物理或化学方法进行消毒，既节省劳动，又免除了不良气影响。
6，噪音：实验室内音量为42dB，可以有效的过滤外界杂音，让患者感觉安静舒适。
7，严格的进入实验室制度，院内医务人员感染率细菌为“0”。
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漳州市医院肿瘤院士工作站肿瘤生物实验室是中科院院士姚开泰领衔，依托
漳州市医院的雄厚医疗实力、数十年的危重疾病临床诊疗经验，以生物治疗临床应用的重要问题为导向，以肿瘤新生血管、新生淋巴管生成调控的分子机理、肿瘤微环境和肿瘤转移、肿瘤患者自体免疫机制、免疫细胞与肿瘤细胞之间的相互作用等为研究内容，旨在为漳州市医院肿瘤院士工作站肿瘤生物实验室的研究工作提供新策略与探索方向，为科研成果转化为临床应用提供实验室支持体系，为临床肿瘤生物治疗提供实验室技术支持。
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漳州市医院肿瘤院士工作站肿瘤生物实验室是具有国际水准的开放性实验室，汇聚了一大批具有国际影响力的学术带头人，成为培养肿瘤生物领域高素质人才和产出原创性科技成果基地，国内外肿瘤生物免疫领域学术交流中心。漳州市医院肿瘤院士工作站肿瘤生物实验室依托完善的科研条件和管理机制，长期专业致力于与肿瘤生物治疗优化提升相关的科学研究(肿瘤生物治疗属于国家“973”重点基础研究发展规划项目、国家863计划项目)，通过全体科研人员的共同努力，实验室在这一领域取得了丰硕的科技成果，为漳州市医院肿瘤院士工作站的肿瘤预防、诊断、治疗等提供基础，促进了漳州市医院肿瘤院士工作站肿瘤诊疗整体水平的进步与发展。
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漳州市医院肿瘤院士工作站肿瘤生物实验室是获国家科技部批准运行的省重点实验室，主要用于临床用免疫细胞活性的培养和置备以及生物制剂的置备。GMP生物治疗实验室实现了局部操作区100级、整体1000级标准，主要开展细胞培养、收集和配制、细胞活性及免疫指标检测等操作，从而获得细胞数目、生物学活性、细胞表型、无其他修饰物、无内在毒素、无病原体的高质量免疫细胞。
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漳州市医院肿瘤院士工作站肿瘤生物实验室内部构建以国际标准细胞生物实验室为参考，内部配置包括细胞操作室、培养室、细胞保存间、耗材存放间、清洗消毒间、洁具室等。为确保生物置备环境符合国家相关的规定，实验室对相关指标进行实时监控，实验室的相关指标为：
①实验室区域一般控制温度为20-24℃，相对湿度为45%--60%
②单向流实验室总送风量的2%-4%
③每人每小时的新鲜空气量不小于40m3
④洁净室内噪声级动态测试时为42dB
⑤各1000级工作室的空气实际压力保持在24--26KPa/m3
⑥仪器室的实际空气压力保持在16-20KPa/m3
⑦物品出口室的实际空气压力保持在6-10KPa/m3
⑧缓冲室的实际空气压力比仪器室的略低，保持在10-14KPa/m3
⑨室内的尘埃粒子和细菌含量都达到GMP标准
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漳州市医院肿瘤院士工作站肿瘤生物实验室主要应用于临床用免疫细胞活性的培养和置备以及生物制剂的置备。在GMP生物实验室，通过生物技术从患者体内采集单个核细胞，通过实验室分离、诱导、增殖、激活获得细胞终制剂(生
物免疫细胞)，其得率和存活率、纯度和均一性或特征性表面标志、生物学活性、外源性因子的检测(细菌、真菌、支原体、病毒及内毒素)、稳定性、添加成分检测等指标均需达到标准。
漳州市医院肿瘤院士工作站生物实验室的细胞终制剂：
树突细胞疫苗、细胞因子诱导的杀伤细胞、树突细胞刺激剂的CIK细胞(生物多细胞)、自然杀伤细胞(NK细胞)、树突细胞疫苗(DC疫苗)、树突细胞负载肿瘤抗原刺激活的T淋巴细胞(DC-T细胞)、DC与肿瘤细胞融合细胞疫苗等。
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漳州市医院肿瘤院士工作站肿瘤生物实验室以肿瘤生物治疗临床应用的重要问题为导向，建立健全科研制度和管理制度，以保障各项工作的顺利开展。在漳州市医院肿瘤院士工作站肿瘤细胞科研方向、科研内容的指导下，实验室建立与完善了技术平台，建立了严格的实验室的准入制度，实验室公共设备、技术平台的共享规范，研究单元负责人制度管理规范，以整合相关的学科优势力量，保障实验室各项科研工作成功运行。实验室还建立了严格的管理和监督机制，实验室质量和安全性的监控体系，完善的患者治疗档案管理制度，生物治疗后特异免疫指标的检测技术与平台等多项条例，通过严肃的实验室纪律、严格的操作规程、严谨的工作作风、严密的制度管理等，确保肿瘤生物治疗临床用免疫细胞的高度安全性。
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1、漳州市医院肿瘤院士工作站肿瘤生物实验室科研团队
漳州市医院肿瘤院士工作站肿瘤生物实验室始终将人才建设至于首位，实验
室由肿瘤生物领域杰出学术专家姚开泰领衔，以从硕士到博士的完整人才培养模式为中坚技术力量，并构筑了与国内外肿瘤生物医学领域的科研机构合作的科技创新人才的培养体系，为实验室的科研、教学、临床工作奠定了人力基础。实验室的多位研究人员曾在国际生物医学学术机构任要职，承担相关领域科研项目。
2、漳州市医院肿瘤院士工作站肿瘤生物实验室高端设备
漳州市医院肿瘤院士工作站肿瘤生物实验室配备了符合国家临床应用标准管理规范的GMP细胞制备设施，拥有数控超净工作台、美国BD流式细胞仪、冷冻干燥系统、超滤系统、美国热电台式高速冷冻离心机和超低温冰箱、PCR仪、液氮装置、血细胞自动分离机、生物安全柜、日本三洋CO2培养箱等系列国际尖端生物设备，为中心实验室各项科研项目研发、转化、临床应用奠定了基础。
3、漳州市医院肿瘤院士工作站肿瘤生物实验室的细胞终制剂
漳州市医院肿瘤院士工作站肿瘤生物实验室通过生物技术从患者体内采集单个核细胞，通过实验室分离、诱导、增殖、激活获得细胞终制剂(生物免疫细胞)，为生物多细胞免疫治疗等提供了技术支持。
漳州市医院肿瘤院士工作站肿瘤生物实验室的细胞终制剂的优势：
①免疫细胞的各项基本指标行业内领先
漳州市医院肿瘤院士工作站肿瘤生物实验室培养的免疫细胞得率和存活率、纯度和均一性或特征性表面标志、生物学活性、外源性因子的检测(细菌、真菌、支原体、病毒及内毒素)、稳定性、添加成分检测等指标均需达到标准。
②免疫细胞的各项临床应用指标质量高
漳州市医院肿瘤院士工作站肿瘤生物实验室培养获得的细胞数目、生物学活性、细胞表型、无其他修饰物、无内在毒素、无病原体均属高质量免疫细胞。
③免疫细胞的种类丰富
DC细胞、CIK细胞、NK细胞、NKT细胞、CD3AK细胞、TC细胞、巨噬细胞、T细胞等。
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漳州市医院肿瘤院士工作站肿瘤生物实验室的对外交流
漳州市医院肿瘤院士工作站肿瘤生物实验室与南方医科大学、美国密苏里大学、美国哈佛大学、韩国和澳大利亚等国内外知名生物医学科研机构、科研院所建立了科研战略合作关系，开展了长期的广泛、深入、持久战略合作。实验室以开展研究组之间的优势互补为目标，积极参与、开展国内外学术交流活动，促进多学科、多领域交叉合作，为促进肿瘤生物诊疗技术的进步做出了应有贡献。
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漳州市医院肿瘤院士工作站肿瘤生物实验室科研与临床成果
漳州市医院肿瘤院士工作站肿瘤生物实验室自建成运行以来，在科研创新、科研转化、临床引用领域成绩斐然，荣获了国家科学技术进步奖、卫生部科技进步奖、中华医学科技奖和北京市科学技术奖等多项殊荣。大部分肿瘤生物治疗领域科技成果成功研发并有效转化，填补了国内生物治疗领域空白，造福了广大肿瘤患者。
漳州市医院肿瘤院士工作站肿瘤生物实验室科研成果示例：
①系统研究了影响肝癌、肺癌、胃癌等恶性肿瘤多阶段进程的重要分子及作用机制，发现了调控恶性肿瘤细胞凋亡的特异性免疫细胞群，倡导更加科学有效的靶向生物免疫治疗。
②首创生物多细胞免疫模式，建立了完善的个性化多细胞方案体系，可为患者提供数十种高效特异靶向治疗方案，该模式已进入临床应用阶段，在肝癌、胃癌、肺癌、食道癌、贲门癌、结肠癌等恶性肿瘤的治疗领域取得了较为理想的效果。
漳州市医院肿瘤院士工作站肿瘤生物实验室的发展
1、总体定位
漳州市医院肿瘤院士工作站肿瘤生物实验室将分子生物学、细胞工程、临床医学、免疫学、药物学、纳米生物技术、化学、材料学等多学科进行多学科交叉和融合，致力于肿瘤的生长机制、转移机制、免疫细胞与肿瘤细胞的相互作用机制，肿瘤患者自体免疫机制等领域的研究。漳州市医院肿瘤院士工作站肿瘤生物实验室建立了从科学发现、科研创新到科研成果临床转化等一系列的关键技术支持平台，支撑漳州市医院肿瘤院士工作站肿瘤学术交流的重要基地的科研成果分享、先进技术引进等，目标为更好的为广大肿瘤患者服务。
2、研究方向
漳州市医院肿瘤院士工作站肿瘤生物实验室的主要研究方向为：免疫细胞、细胞因子在恶性肿瘤早、中、晚期的作用机制；肿瘤新生血管的生成机制；肿瘤微环境和肿瘤转移分子的机制；肿瘤患者自体免疫机制、肿瘤免疫在肿瘤生长和转移中的功能等。
①、肿瘤生长机制(肿瘤新生血管和新生淋巴管生成调控的分子机理)
A、新生血管生成和调控的分子机理等方面
B、肿瘤新生血管生成、淋巴管生成过程中的信号转移途径
C、筛选血管生成促进、抑制分子，并研究其分子作用机制
②、肿瘤转移机制：(肿瘤微环境和肿瘤转移)
A、肿瘤前转移灶建立的分子机理，肿瘤组织特异性转移的分子机理
B、研究肿瘤分泌蛋白组，筛选肿瘤转移促进、抑制因子，以及肿瘤早期筛查标志物，并阐明其分子机理。
③、肿瘤患者自体免疫机制
A、免疫应答与免疫耐受的分子机制研究
B、免疫细胞的分化发育、功能调控及其相关机制研究
C、移植免疫学研究
D、免疫预防和免疫治疗及相关机制研究
④免疫细胞与肿瘤细胞的相互作用
免疫细胞被招募到肿瘤组织后与肿瘤细胞相互作用，分泌大量的因子影响肿
瘤的生长和转移，以肿瘤免疫细胞为靶点，重点研究肿瘤细胞对免疫细胞的“同化”作用，免疫细胞分泌因子因肿瘤生长和转移的作用和分子机理。
3、研究内容
漳州市医院肿瘤院士工作站肿瘤生物实验室以研究肿瘤的生物学行为、分子机理、人体自体免疫机制、免疫系统、免疫系统与肿瘤的相互作用机制等为主要研究内容。在研究过程中，漳州市医院肿瘤院士工作站肿瘤生物实验室以恶性肿瘤细胞增殖、分化、转移、凋亡等生物学行为为切入点，通过将现代生物技术、临床医学、免疫学、药物学、纳米生物技术、化学、材料学等多学科进行交叉与融合，从分子、细胞、尤其是整体水平研究疾病的发病机理和病理生理过程，在此基础上寻找和发现新的生物靶点，获得可应用于肿瘤临床分子分型及转归的免疫细胞谱，为临床恶性肿瘤的早期特异性诊断、个性化治疗、肿瘤转归等提供准确信息和技术支持。
4、发展战略
恶性肿瘤是世界性医学难题且缺乏有效的根治措施，认识肿瘤生物学特点、规律，从分子学的角度探讨肿瘤的发生、发展的机理，阐明肿瘤发展过程中各种分子事件及其调控机制，为理想的肿瘤预防、诊断、治疗方案提供理论和应用基础，是肿瘤生物实验重要意义所在。
漳州市医院肿瘤院士工作站实验室属于国内知名生物实验室，依托漳州市医院肿瘤院士工作站的大力支持，实验室始终围绕肿瘤生物领域开展长期、系统、深入的研究，坚持科学研究和临床转化双核心战略，在肿瘤的预防、早期诊断、个体化治疗和肿瘤的转归等方面取得了可观成效，在促进肿瘤治疗生物技术的发展，推动我国肿瘤科学的发展和人才培养，引导肿瘤生物学领域具有探索性、原创性、前沿性和系统性的科研方向，倡导肿瘤科研多学科交融协作，
推动我国肿瘤生物学领域整体研究实力做出了不懈努力。
在未来的建设和发展过程中，漳州市医院肿瘤院士工作站生物实验室将为广大肿瘤患者提供更多科学有效的肿瘤生物治疗技术，为生物免疫细胞的高效应用提供更多的优化途径，从而满足广大肿瘤患者的诊疗需求，提升肿瘤患者的生存期和生存质量。漳州市医院肿瘤院士工作站肿瘤生物实验室将努力把实验室建成高水平的肿瘤生物研究基地、肿瘤生物免疫诊疗领域高素质科研人员的摇篮、广泛开展国内外学术交流的肿瘤专科学术研讨中心，为漳州市医院肿瘤院士工作站整体医疗水平提高做出更大的贡献。
漳州市医院肿瘤院士工作站生物实验室优势
A、实验室环境国内领先
1、规模大
漳州市医院肿瘤院士工作站GMP生物实验室达到500平方米以上，是国内最大的生物医学实验室之一。
2、规范性
漳州市医院肿瘤院士工作站肿瘤细胞获得省卫生部批准运行，所开展的生物免疫技术属于获得国家批准的第三类医疗技术，其权威性、规范性得到保障。
3、严格性
漳州市医院肿瘤院士工作站开展实验室全流程24小时实时监控，透明化的直观作业，保障对各工作环节的严格质量把控。
4、高效性
漳州市医院肿瘤院士工作站包括五个以上细胞培养室，实现了单种生物细胞独立培养，在独立的培养环境中，生物细胞制备无污染，质量高，效率快，细胞种类可达数百种之多，可根据患者病情，提供相应的个性化方案，应用临床更加高效、安全。
5、安全性
漳州市医院肿瘤院士工作站在细胞培养、检测、保存所使用的仪器内安装有自动报警装置，如细胞被不良因素侵袭，即刻会发出自动报警，以保证细胞制备高度安全。
B、细胞制备流程严格规范
1、杜绝医源性污染
①漳州市医院肿瘤院士工作站实现层流净化，是国内达到GMP标准的较大规模生物实验室，在每天使用前均有工作人员进行紫外线消毒处理。
②医务人员进入实验室之前，要先经历一次洗手、二次洗手、风淋等多个消毒环节，保障医疗安全。
③医疗物品进出实验室的通道、医务人员出入实验室通道属于独立单通道，物品传递窗设立独立紫外线消毒系统，保障实验室无菌环境。
④仪器、医疗耗材均为国外知名品牌，按照国际标准进行严格质量把关。
2、细胞质量高
①细胞培养时间达标
为保证细胞数量、活性等均达到临床应用标准，肿瘤细胞培养时间一般为10天左右，不存在细胞培养时间过短，质量不达标等现象。
②细胞临床应用前经流式分析仪严格检测
漳州市医院肿瘤院士工作站肿瘤生物细胞在培养后经流式分析仪严格检测、筛选、辨别，通过衣原体、支原体、内毒素、安全性、细胞数量、细胞质量、细胞活性等检测项目后，方可被应用于临床。
③细胞冻存与复苏系统
漳州市医院肿瘤院士工作站肿瘤细胞经流式分析仪检测达标生物细胞进入冻存系统，待患者接受治疗之时，对细胞进行复苏，保证了细胞治疗的高度安全性。
C、细胞培养技术国内领先
1、领先优势：
漳州市医院肿瘤院士工作站的生物细胞培养流程、细胞培养技术居国内领先地位，为细胞质量、临床应用效果提供了坚实的保障。
2、以生物多细胞的培养技术为例：
①传统的多细胞免疫治疗技术流程为：
先提取患者自体单个核细胞，对DC细胞、CIK细胞、NK细胞、CD3AK细胞、NKT细胞进行15-20天左右单独培养，然后进行回输。
②漳州市医院肿瘤院士工作站肿瘤生物实验室多细胞免疫治疗技术流程为：
提取患者自体单个核细胞，通过实验室分离提取DC细胞、CIK细胞、NK细胞、CD3AK细胞、NKT细胞，然后对5种细胞进行联合培养，细胞各项指标达到标准后为患者回输，五种细胞同时作用，临床效果显著高于传统技术。
D、生物免疫技术临床应用模式领先
1、个性化治疗，根据患者情况而定
漳州市医院肿瘤院士工作站肿瘤细胞可根据患者病情，提供个性化的生物免疫治疗方案，数十种方案，实现了特异性靶细胞杀伤、免疫功能恢复、肿瘤负荷下降同步，是高效、安全、个性化的全新肿瘤生物免疫治疗模式。
2、治疗方式科学灵活
临床治疗方式根据患者情况而定，以为患者争取最理想的治疗效果为目标，治疗方式种类多且可进行有效组合，如全身治疗方案、局部治疗+全身治疗方案、生物免疫治疗结合成功治疗等。
E、生物免疫技术临床效果国内领先
1、国内就诊患者数量较多
漳州市医院肿瘤院士工作站肿瘤生物实验室是国内就诊患者数量较多的生物实验室。
2、治疗有效率国内领先
治疗有效率国内领先，临床治疗有效率可82%以上。
3、医师整体素质国内领先
漳州市医院肿瘤院士工作站肿瘤生物实验室的医师均具有丰富的从业经验，对生物细胞的实验室制备、临床治疗领域具有深厚造诣。
4、临床效果患者满意度高
作为福建少数获得国家批准开展第三类医疗技术的权威医疗机构，肿瘤生物实验室是开展时间早、提供临床治疗案例多、临床效果获得患者满意度高的权威医疗机构代表。
5、肿瘤生物治疗领域权威代表
在肝癌、肺癌良、恶性肿瘤疾病的治疗领域居国内领先地位
判断肿瘤预后的免疫组 化标志物 集团标准化办公室：[VV986T-J682P28-JP266L8-68PNN]
肿瘤标志物是病理学研究的热点之一，当前所涉及的肿瘤标志物种类繁杂，方法多样，结果不一。本文力争从实用性出发，对目前众多医院已能常规开展免疫组化检测的有助于判断肿瘤预后的标志物进行综述。 １肿瘤分期 1.1微浸润与假性浸润：癌的微浸润通常指癌侵透基底膜，含基底膜成分的抗有助于确定基底膜的完整性，两种最常用的抗体是IV型胶原或层粘蛋白（LN）抗体。免疫组化染色显示基底膜缺如或明显断裂可确定有微浸润。在乳腺及前列腺病变中，良性假性浸润性病变与浸润性癌难以区别的情况较为多见。乳腺组织其基底细胞层由肌上皮细胞组成，通过特异性肌动蛋白(actin)抗体标记可以很容易地识别肌上皮细胞。浸润性小管成分如包绕有肌上皮细胞则提示良性病变。在前列腺组织，通过不同种类细胞角蛋白中间丝的表达情况可以将基底细胞与腔面的细胞加以区别，现已有几种专一性抗体，如基底细胞表达高分子量细胞角蛋白，而腔面的细胞表达低分子量细胞角蛋白。这些免疫反应特性可用于良恶性前列腺上皮的区别，如基底细胞几乎见于所有良性前列腺增生病例，而决不出现在恶性腺上皮的外周。 1.2隐匿性微转移：免疫组化检测骨髓及淋巴结隐匿性转移癌，其原理是利用抗体能区别不同组织来源细胞的能力，从而将上皮癌细胞与骨髓及淋巴结内的正常结构区别开来。通过这种手段，可以检测出不同肿瘤骨髓或淋巴结隐匿性微转移，包括结肠癌、前列腺癌、卵巢癌、、恶性黑色素瘤及神经母细胞瘤的转移等。Gute rson等发现，通过较细致的组织形态学观察或免疫组化方法来寻找淋巴结隐匿性微转移，约有8%--30%常规淋巴结组织病理检查“阴性”的乳腺癌病人可被检出有隐 匿性微转移。
人外周血循环肿瘤细胞检测试剂盒使用说明书 （免疫磁捕获、免疫细胞化学鉴定） 简介： 本试剂盒利用免疫磁球捕获肿瘤病人全血中极少量的循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cell，CTC），并通过免疫细胞化学鉴定所捕获的细胞，从而实现对CTC的灵敏检测。其中免疫磁球表面修饰有抗上皮细胞粘附分子（EpCAM）抗体。免疫细胞化学鉴定是通过异硫氰酸荧光素标记的细胞角蛋白抗体（FITC-anti-CK19）、Alexa Fluor594标记的抗白细胞共同抗原抗体（AF594-anti-CD45）和DAPI对细胞进行免疫荧光染色，DAPI染色阳性，CK19表达阳性，CD45表达阴性（DAPI+/CK19+/CD45-）的细胞被鉴定为CTC。本试剂盒对目标细胞的捕获效率高达90%，简便快速、特异性强、非常可靠，可以在3小时内完成对全血中CTC的检测。 试剂盒所含试剂：（10人份/盒） 试剂标号组分用途状态规格配制 试剂A牛血清白蛋白封闭固体粉末 试剂B免疫磁球磁捕获悬液200μL即用型试剂C4%多聚甲醛固定细胞液体5mL即用型试剂D1%Triton X-100通透细胞液体5mL即用型试剂E DAPI细胞染色液体50μL即用型试剂F FITC-anti-CK19细胞染色液体20μL即用型试剂G AF594-anti-CD45细胞染色液体50μL即用型试剂H1×PBS洗涤液体25mL即用型*保存条件：4-8℃ 用户自备试剂和材料： 1.试剂L：通透封闭液 于0.05g试剂A中加入0.5mL试剂D溶解待用，或按照此用量比配置所需用量的通透封闭液，标为“试剂L”。
2.试剂M：染色液 于0.01g试剂A中加入190μL试剂H溶解后，向其中加5μL的试剂E，2μL 的试剂F，5μL试剂G，或按照此用量比配置所需用量的染色液，标为“试剂M”，4℃避光保存待用。 4.磁力架（推荐Dynal公司123-20D） 5.移液器（吉尔森）、涡旋仪、超声波清洗器、进口耗材（离心管、枪头等）、恒温水浴摇床、荧光倒置显微镜等。 6.96孔板或PDMS小槽 检测步骤： 1.捕获 抽取约1.5mL病人血液于EDTA抗凝真空采血管中，将全血样品转移到2 mL的离心管内，加入20μL试剂B（试剂B预先用超声仪超声分散均匀），手摇或涡旋分散均匀后，置于恒温摇床上，150rpm，37℃下孵育30min。 2.细胞固定 将步骤1中的样品置于磁力架上，吸引约5min，用移液器延外侧轻轻吸出清液，再用400μL的试剂C重悬样品，室温放置10min。 3.细胞通透封闭 将步骤2中的样品于磁力架上，吸引约3min，用移液器去掉清液，再取400μL的试剂L重悬样品，室温放置20min。 4.细胞染色 将步骤3中的样品置于磁力架上，吸引约3min，用移液器去掉清液，再取200μL的试剂M重悬样品，37℃避光孵育30min。待孵育结束后，将样品置于磁力架上，吸引约3min，用移液器去掉清液；再用200μL的试剂H重悬，再磁吸引，去掉清液，用试剂H重复洗涤3次，最后用100μL的试剂H分散样品。 5．检测 将步骤4得到的样品转移到96孔板底部或者PDMS小槽内，磁富集到底部后用倒置荧光显微镜观察。 三通道同时观察并用CCD采集图片，其中DAPI+/CK19+/CD45-的细胞即为CTC。
肿瘤多细胞免疫治疗需几个疗程 生物免疫疗法一般需要做几个疗程是因人而异的，一般早期的肿瘤患者及时到院治疗，一到两个疗程就可达到预期的效果，甚至实现临床治愈，只需后期定期的复查既可；而对于一些中晚期的恶性肿瘤患者来讲，一到两个疗程可能起到的就是控制肿瘤的发展，如果想实现理想的治疗效果，就需要采取一些综合治疗方案，或是增加一到两个疗程的生物治疗，所以具体情况还要根据您目前的身体状况进行确定。不管治疗需要几个疗程，患者都不会有任何不良反应。 肿瘤生物免疫治疗，重启肿瘤患者免疫系统 肿瘤生物免疫治疗的诞生填补了手术、放化疗等常规疗法的不足，其不但具有清除体内不同部位的微小残留病灶，防止肿瘤复发与转移的作用，而且对病人受损的免疫系统又能起到恢复与重建的疗效。 生物免疫治疗应用免疫细胞群谱广，可以有针对性地联合应用多种免疫细胞，实现对不同肿瘤实施“个性化”免疫细胞治疗方案，进一步提高肿瘤治疗效果。手术后的肿瘤患者使用生物免疫治疗可以清除体内散在癌变细胞，预防多种肿瘤术后的复发和转移，如肝、肾部位肿瘤；食管、胃、肺、肠、乳腺等肿瘤患者在生物免疫治疗与放化疗结合使用的治疗中显示出很好的协同作用和疗效维持效果，大大改善了肿瘤患者的身体状况，减轻放化疗反应；处于康复期的肿瘤患者采用生物免疫治疗进行巩固治疗，可以控制肿瘤生长，维持疗效，并改善患者生活质量，提高患者生存机会和存活时间。 生物治疗肿瘤分为两大类，DC-CIK生物治疗和多细胞(高纯度NK)免疫治疗，多细胞(高纯度NK)免疫治疗是目前肿瘤(癌症)治疗最先进的技术。
漳州市医院肿瘤院士工作站为了弥补单一使用“DC-CIK细胞”抗肿瘤的缺陷，在积累了丰富的生物免疫治疗(DC-CIK疗法)经验的基础上，增加(高纯度)NK、 CD3AK、NKT三种免疫细胞的多细胞治疗模式，针对不同患者、不同阶段，有选择性地运用具有特异性的靶向免疫细胞，抑制肿瘤的生长、转移、复发，并同时提高机体免疫力，可独立使用，与手术、放化疗联合治疗效果更佳。以保障患者生活质量、提高远期生存率的治疗目标来指导癌症治疗，能从患者全身特点加以考虑，而不只是着眼于癌症病灶本身，是患者最好的选择。 多细胞免疫治疗具体流程 (一)与患者沟通交流 这个过程主要是为了让医生了解患者的大概病情，从而初步判断患者是否适合肿瘤多细胞免疫治疗 (二)检查并确定治疗方案 为患者做一些常规检查，客观详细分析患者病情，查看患者是否对多细胞免疫治疗存在禁忌症，如果符合多细胞免疫治疗的各项客观条件要求，专家会给患者制定具体的治疗方案。 (三)采集外周血单个核细胞 治疗方案经患者及家属同意后，便可以进行细胞采集，提取患者80ml-100ml 血液，这个过程患者不会感到任何不适。
肿瘤免疫组化指标含义大汇总 在当前精准医疗的时代，免疫组化（IHC）在肿瘤的诊断中具有极其重要的意义。在常规肿瘤病理诊断中，5%-10%的病例单靠H.E.染色难以作出明确的形态学诊断。利用好肿瘤IHC，将使肿瘤的诊断与治疗轻松许多。 近年来，随着免疫组织化学技术的发展和各种特异性抗体的出现，许多疑难肿瘤得到了明确诊断。尤其是免疫组化在肿瘤诊断和鉴别诊断中的实用价值受到了普遍的认可，其在低分化或未分化肿瘤的鉴别诊断中的准确率可达50%-75%。 免疫组化（IHC）是免疫学与组织化学两种技术的结合，基本原理是应用抗原与抗体的特异性结合，再用显色剂显色以达到标记细胞的某种抗原物质的定性／定位检测技术。 （1）上皮性肿瘤标记 表皮角蛋白（EK）：鳞状上皮或高分化鳞癌 细胞角蛋白（CK）： CK7 ／ CK18 标记腺上皮，通常在腺癌中表达。 CK19 分布于单层上皮和间皮，常用于腺癌诊断，胆管（＋）。 上皮膜抗原（EMA）：低／未分化上皮高表达；常存在于间变大细胞／恶性横纹肌样瘤。
P504：前列腺癌的敏感性为97％，特异性为100％。 HMB45：存在于恶性黑色素瘤。 （2）间叶源性肿瘤标记 波纹蛋白（Vimentin, Vim）：细胞中间死蛋白抗体，多数软组织肿瘤均可表达，但肌纤维较明显，在一些上皮性肿瘤也有阳性反应，作为间叶与上皮源性鉴别一线抗体。 结蛋白（Desmin, Des）：存在于平滑肌／横纹肌 肌动蛋白（Actin）：平滑肌／血管内皮／肌上皮 肌球蛋白（Myotlobin）／肌红蛋白（myosin）：横纹肌 CD34：血管内皮，通常用于血管源性肿瘤的诊断。 （3）神经细胞／神经内分泌肿瘤标记： S-100：周围神经雪旺氏细胞特异性标记 胶质纤维酸性蛋白（GFAP）：脑胶质细胞特异性标记抗体 神经原特异性烯醇化酶（NSE）：主要用于神经内分泌肿瘤诊断 Chr 嗜铬素：鉴别肾上腺髓质和皮质，用于神经内分泌肿瘤诊断。 神经内分泌肿瘤标记：Syn 突触素／NSE／嗜铬蛋白颗粒A（CgA） CK20：用于胃肠道腺癌、卵巢黏液性肿瘤、皮肤Merkel细胞癌诊断。 CD56：神经细胞黏附分子，主要分布于神经外胚层来源细胞，常用于星型细
CAR-T免疫疗法新模式——治疗实体瘤 导读免疫疗法已然成为人类对抗癌症新的希望，而CAR-T疗法则是近年来最有前景的肿瘤免疫疗法之一。CAR-T药物已经成功在人类血液癌症研究中被证明有重要作用，然而针对实体瘤仍然是一个巨大的考验。如果能应用于治疗实体瘤，那将具有很大的潜在市场。 为解决CAR-T疗法治疗实体瘤这个难题，科学家们与该领域内的主要公司展开密切的合作。宾夕法尼亚大学医学助理教授Edmund Moon和他们团队已成功地完成了临床前期研究，有助于开辟此道路前进。 Edmund Moon教授主要研究一种关键检查点的抑制性受体PD-1，其是最近刚批准的Nivolumab和Pembrolizumab药物的靶点。由于能产生肿瘤反应的免疫细胞数量较少，这两种药在治疗一些肿瘤中疗效受到一定的限制。 因此Edmund Moon教授和他所带领的团队设计了新一代免疫细胞，通过病毒载体在CAR-T细胞中插入一转基因受体PD1CD28。CAR-T细胞是CD19、间皮素、PSCA这三种关键蛋白的靶标，而这三种蛋白是在肿瘤细胞中表达的。另外，他们还在细胞内设计了PD-1受体，能识别CD28表达的肿瘤细胞内其对应配体PD-L1，从而产生免疫信号。 “我们发现一些肿瘤有很强的侵袭性，并且抵抗其他形式的治疗。我们惊讶地发现，载入PD1CD28的CAR-T细胞相比于没有插入PD1CD28的T细胞，能对小鼠肿瘤模型产生较强的免疫反应，能增加小鼠的存活率。另外，我们还发现其他形式的PD-1受体载入并没有增强CAR-T细胞的免疫效应。”Moon教授称，“我们希望在血液肿瘤中看到的巨大成功，能同样发生在治疗实体肿瘤中。并且，随着我们继续研究其他免疫疗法与T细胞疗法的结合，治疗实体瘤中将会更好地发挥T细胞的功能。” CAR-T，全称Chimeric AntigenReceptor T-Cell Immunotherapy，即嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。可以特异性地识别肿瘤相关抗原，使效应T细胞更具有靶向性、活性和持久性。主要过程是：是从癌症病人身上分离免疫T细胞，利用基因工程技术给T细胞加入一个能识别肿瘤细胞，并且同时激活T细胞杀死肿瘤细胞的嵌合抗体，再经过体外培养，大量扩增CAR-T细胞，然后将细胞输回病人体内。 STCC特异性多细胞生物治疗 对于失去手术机会的晚期癌症患者，能缓解其临床症状，使机体抗癌免疫系统提升，一部分患者出现瘤体缩小甚至消失或长期带瘤生存的治疗结果;而对于放化疗无效的患者，或对化疗药物产生耐药性的患者，可提高敏感性和产生很好的疗效。 STCC特异性多细胞疗法利用肿瘤患者自身的单个核细胞进行科学培殖，在符合GMP 标准的生物实验室内促进细胞的数量和质量达到杀瘤标准，然后进行一系列科学筛选，将高质、高量的细胞回输患者体内。数据表明：STCC特异性多细胞疗法临床应用以来，让许多中晚期患者的五年得到明显的提高。
免疫组化 定义：免疫组化，是应用免疫学基本原理—-抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质),对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。 临床常用免疫组化指标的意义 临床病理工作中,我们常用到“肿瘤细胞免疫组化耐药预后标记”,但是许多单位只写阳性结果，不写临床意义，其结果对临床帮助不大，因为许多医生不懂得这些结果的意义，因此建议大家在出此类报告时，把“肿瘤细胞免疫组化耐药预后标记"的意义打印在报告中，以增加病理报告的使用价值。 1、恶性肿瘤免疫组化耐药预后标记,全套4项:P—gP，GSTπ，TOPOⅡ，Ki—67。 2、乳癌免疫组化耐药预后标记，全套7项：P—gp，GSTπ，TOPOⅡ，Ki—67，ER，PR，C-erbB—2。 3、意义：标记物—-作用-—阳性部位——临床意义 多药耐药基因蛋白(P-Gp）-—药泵作用—-胞膜/胞浆--阳性率越高，对下列药物耐药性越强：阿霉素、柔红霉素、表阿霉素、米托蒽醌、长春花碱、长春新碱、紫彬醇、泰素帝。 谷光甘肽S转移酶（GST π)--解毒作用-—胞浆—-阳性率越高,对下列药物耐药性越强：阿霉素、顺铂、氮芥、环磷酰胺、瘤可宁。 拓扑异构酶Ⅱ(TOPOⅡ）—-靶点作用—-胞核-—阳性率越高，对下列药物越有效：蒽环类抗生素和鬼臼毒素类，如VP16、替尼泊苷、玫瑰树碱、新霉素、柔红霉素、表阿霉素、阿霉素、VM26。阳性率高者对VP16尤其有效. 雌激素受体(ER)—-性激素作用——胞核-—阳性率越高，肿瘤对内分泌治疗越有效，预后越好. 孕激素受体（PR) -—性激素作用—-胞核-—阳性率越高，肿瘤对内分泌治疗越有效，预后越好。 C—erbB-2——癌基因产物-—胞浆—-阳性率越高，肿瘤恶性程度越高。ER、PR 阳性而C-erbB—2也阳性者,用三苯氧胺治疗效果不好。 Ki-67-—细胞增殖标志—-胞核——阳性率越高，肿瘤增殖越快，恶性程度越高. Ki-67为细胞增值的一种标记，在细胞周期G1、S、G2、M期均有表达,G0期缺如，
1.1肿瘤免疫治疗的概念及分类 肿瘤免疫治疗是通过激活体内的免疫细胞，特异性地清除肿瘤微小残留病灶或明显抑制肿瘤细胞增殖。这种治疗方法具有作用期长和副作用小等优点，被称为现代肿瘤治疗的第4种模式。最近几年，肿瘤免疫治疗获得了不少进展，《science》杂志把肿瘤免疫治疗列为2013年的重大科学突破。 1.1.1肿瘤就是免疫逃逸的结果 肿瘤细胞是一种不正常的细胞，表现为基因突变和致癌基因的过表达。这些突变或异常表达的蛋白是免疫细胞赖以识别癌细胞的基础。理论上，免疫细胞可以随时清除不正常的细胞，从而把肿瘤消灭于萌芽状态，即所谓的“免疫监视”。但免疫监视作用并不能完全地避免恶性肿瘤的发生，而且肿瘤一旦产生就会隨病情的发展，其恶性程度惭进增加，并最终发生广泛转移。2002年，美国肿瘤生物学家希雷伯（R.DSchreiber）博士提出了“肿瘤免疫编辑”理论。根据免疫编辑理论，免疫系统不但具有排除肿瘤细胞的能力，而且还具有促进肿瘤生长的作用。癌细胞在机体内发生、发展是一个免疫系统与癌细胞一系列动态复杂的相互作用过程。在这个过程中，免疫系统在清除一些肿瘤细胞的同时，也对另一些肿瘤细胞的生物学特性（如肿瘤的抗原性）进行重塑（Reshape），也即所谓的“免疫编辑”。被免疫辑过的肿瘤细胞恶性程度越来越高，对免疫攻击的抵抗力越来越强，直至最终摧毁机体的免疫系统，造成肿瘤细胞的恶性生长并扩散。
肿瘤的免疫编辑理论认为，免疫系统与肿瘤的相互关系可以分为三种不同的状态（Phase）：清除（Elimilation）、平衡（Equilibration）和逃逸（Escape）。引用转载:https://www.doczj.com/doc/e96143420.html, “清除”状态：新生的肿瘤具有较强的抗原性，较易被免疫系统识别并将其清除。非特异的天然免疫机制（如吞噬细胞，天然杀伤细胞等）和特异的获得性免疫机制（如CD4+T细胞，CD8+T细胞）都参与这个肿瘤细胞的清除过程。免疫系统清除肿瘤细胞的这个过程具有经典的免疫监视理论的特点。如果清除过程彻底，肿瘤细胞被完全排除，免疫编辑过程就此结束。如果一些变异的肿瘤细胞逃过了免疫编辑的“清除”作用而存活下来，它们与免疫系统的关系就进入了第二种状态，即“平衡”状态。 “平衡”状态：在这种状态下，肿瘤细胞的抗原性减弱，因而不会轻易被免疫系统识别和清除，但又时时处在免疫系统的清除压力下，因而不能过度生长，表现为检查不到可见的肿瘤。特异的获得性免疫是维持这种平衡状态的主要机制，一般认为天然免疫机制不参与这个过程。免疫系统和肿瘤细胞的这种平衡状态可以维持几年、十几年甚至终身都不发生变化。因此，免疫编辑的平衡状态实际上就是一种带瘤生存状态。但这种平衡状态是动态的，肿瘤细胞在免疫系统的压力下，其基因有可能会发生变化，这种基因突变产生的“积累效应”达到一定程度时，就可能打破平稳，使免疫系统与肿瘤的关系进入“逃逸”（Escape）阶段。 “逃逸”阶段：在这个阶段的肿瘤细胞可以产生一系列恶性
顾名思义，肿瘤细胞免疫治疗就是调动人体强大的免疫系统来对抗癌症的治疗方法。那么，人体免疫系统有何强大之处?其对抗肿瘤的原理是什么呢?本期专题将对此做一个简单的解读。 人体免疫系统的基石是细胞，而人体本身就是由各种细胞组成的名副其实的细胞王国，在这个王国里，免疫系统是最忠实的守护神。它有着庞大的防御工事和数量众多的军队，这套防御系统成功地抵御了外敌的入侵，镇压了内部的叛变分子，如果没有他们的出色工作，细胞王国将不能正常运转，感染、癌症将会使这个王国覆灭。 细胞王国的防御工事中最重要的部分是皮肤，完整的皮肤保护了王国绝大多数的边境不受外敌侵犯，而在与外界相通的各个通商口岸，我们也是层层设防。我们口腔中的唾液，含有一种溶菌酶，可以高效地分解细菌;我们的胃酸几乎可以”酸死”食物中的绝大多数微生物，当然也会有漏网之鱼和对强酸有抵抗力的致病菌，如胃中的幽门螺旋杆菌可以在胃酸中闲庭信步(这家伙据科学家说是引起胃炎的祸首);我们的鼻毛虽然不雅，却交织成一张大网，兜住了大部分的灰尘和大点的细菌;呼吸道中覆盖的恶心的黏液可以粘住绝大多数的入侵者，然后通过擤鼻涕和吐痰将它们扫地出门(当然，还通过打喷嚏将敌人吹走)。 对付普通敌人，免疫细胞大军只需派出队伍里的基层士兵 以上说的是细胞王国的强大边境防线，虽然阵地工事建得是固若金汤，拒外来之敌于千里之外，但俗话说得好，”明枪易躲，暗箭难防”，对于出现在人体内部的敌人，如细菌、病毒，这道防线可以说是形同虚设。别忘了免疫系统还有着一支庞大而高效的军队(免疫细胞)，这支军队不仅数量超卓，而且种类繁多，士兵各司其职，战争来临时紧密联系、相互配合，拳头握在一起，把敌人打得落花流水。 免疫细胞大军大部分时间呆在血液中(它们就是我们常说的白细胞)，它们和负责传送氧气的红细胞、负责止血的血小板都来源于骨髓造血干细胞。如果细胞王国安定团结，这些造血干细胞就大多会成长为红细胞，负责传送氧气，只保持一小部分的白细胞维持战斗力;如果细胞王国面临外敌入侵，那骨髓就马上开足马力大量生成造血干细胞，而且这些”儿童”大部分会成长为战士，白细胞数量在短期内大增，全国进入备战状态。 对付普通敌人(如异物、细菌)，免疫细胞大军只需派出队伍里的基层士兵即可搞定，比如中性粒细胞一般与细菌死磕，多数与细菌同归于尽，我们伤口化脓感染的脓液，其实主要就由中性粒细胞的尸体组成。巨噬细胞可将来犯之敌一口吞掉，并将敌人的情报上报上级，这样下次再看到同样的敌人就可以直接消灭。再难对付点的敌人可以由B细胞产生的抗体来消灭，这些抗体像精确制导的”导弹”一样一对一的消灭敌人，极为高效。 对付狡诈多变、凶残暴戾的癌细胞则需要出动精英部队
泌尿与男性生殖系统肿瘤 1.前列腺癌：CK、P63、34?E12、PSA、P504S(9AMAC)、AR 2.前列腺增生/腺瘤：CK、P63、34BE12、P504S 3.肾癌：CK、EMA、Inhibin、Melan-A、CK7、Vimentin、PAX2、CD10 4.肾母细胞瘤：WT-1、CK、P53、Ki-67 5.膀胱尿路上皮癌：CK7、CK20、P53、Ki-67、P63 6.精原细胞瘤：CK、PLAP、CD117、LCA、OCT3/4 淋巴造血系统肿瘤 7.胸腺肿瘤：CK、CD3、CD5、CD20、TdT、EBV* 8.霍奇金淋巴瘤：CD30、CD15、ALK-1、EMA、CD3、CD20、EBV*、PAX-5 9.非霍奇金淋巴瘤：CD3、CD20、CD45RO、CD79α、TdT、CD43 10.间变大细胞淋巴瘤：CD30、CD15、ALK-1、EMA、CD3、CD20、EBV* 11.弥漫性大B细胞淋巴瘤：CD3、CD20、CD45RO、CD79α、CD43、CD30、Ki-67 12.小B细胞淋巴瘤：CD3、CD5、CD10、CD20、CD23、CD79α、CyclinD1、TdT 13.T细胞淋巴瘤：CD3、CD20、CD43、CD45RO、CD79α、TdT、TiA-1、Perforin 14.套细胞淋巴瘤：CD3、CD5、CD20、CD79α、CyclinD1、TdT、Bcl-2、Ki-67 15.T/NK细胞淋巴瘤：CD3、CD20、CD45RO、CD79α、CD56、TiA-1、Perforin、粒酶B 16.淋巴上皮病变/癌：CK、EMA、S-100、Ki-67、P53、EBV*、P63、CD30、CD20 17.Burkitt淋巴瘤：CD3、CD20、CD79α、CD10、Bcl-2、Bcl-6、Ki-67、EBV*、TdT 18滤泡性淋巴瘤：CD3、CD20、CD45RO、CD79α、CD10、Bcl-2、Bcl-6、Ki67 19.脂膜炎样T细胞淋巴瘤:CD2、CD3、CD7、CD20、CD43、Perforin、TiA-1、EBV* 20.浆细胞瘤：CD3、CD20、CD38、CD138、CD79α、EMA、κ*、λ* 21.坏死性淋巴结炎：CD3、CD20、CD45RO、CD79α、CD43、CD68、Mac387、CD163 22.粘膜相关淋巴瘤：CK、CD3、CD5、CD10、CD20、CD23、CD43、CD79a、CyclinD1 23.血管免疫母细胞性淋巴瘤：CD3、CD20、CD45RO、CD43、CD79α 24.组织细胞肉瘤：S100、CD10、CD21、CD35、CD68、Lysozyme、MPO、CD33、CD34、CD11c、CD14、CD45R O 25.朗格罕氏细胞增生症/肉瘤：S100、CD1α、CD68、CD35、HMB45、CK、EMA、Ki67、CD45 26.指状突树突细胞肉瘤/肿瘤：S100、CD1α、CD68、CD21、CD35、CD3、CD20、CD30、CK、EMA、Ki67、C D45 27.滤泡树突细胞肉瘤/肿瘤：CD21、CD35、S100、CD1α、CD68、CD3、CD23、EMA、VIM、MPO、CD34、CD7 9α、CK、HMB45 28.肥大细胞肿瘤：CD117、CD45、CD33、CD68、CD15、CD3、CD20 消化系统肿瘤 29.胃癌：CK7、CK20、Villin、CEA、P53、Ki-67、CDX-2、GST-π、AB/PAS** 30.肠癌：CK7、CK20、Villin、CEA、P53、Ki-67、CDX-2、GST-π、AB/PAS** 31.肝细胞癌：AFP、CD34、CEA、CK8/18、CK19、Ki-67、P53、HbsAg、Hepatocyte 32.肝胆管细胞癌：CK7、CK20、Villin、AFP、CD34、CEA、CK8/18、CK19、Ki-67、Hepatocyte、HbsAg 33.食道癌：P53、Ki-67、CDX-2、GST-π、P63 34.胰腺癌：CEA、P53、Ki-67、CDX-2、GST-π、Villin、CK7、CK20、 35.胰岛细胞瘤：CD56、Syn、CgA、Ki-67、Insulin、CK8/18、CK19 39.肝炎病毒：HbsAg、HbcAg、HCV 涎腺肿瘤 37.涎腺粘液性囊腺癌：CK、P63、SMA、Vimentin、Myosin-heavy chain
免疫治疗与肿瘤微环境 原创编译：爱康得生物医学技术（苏州）有限公司医学转化部高级经理Paul Hsu 摘要 癌症免疫疗法近来获得令人振奋的进展，迎来了肿瘤治疗的新时代。免疫治疗可以在晚期癌症患者身上引起比常规化疗更大的空前的持续应答。然而，这一应答仅发生在相对少部分患者身上。免疫治疗的阳性反应通常依赖于肿瘤细胞与肿瘤微环境（TME）内免疫调节的相互作用。在这些相互作用下，肿瘤微环境在抑制或增强免疫应答中发挥着重要的作用。认识免疫治疗与TME间的相互作用不仅是剖析作用机制的关键，也为改善目前免疫治疗的疗效提供新的方法也具有十分重要的意义。在本综述中，我们将着重研究TME如何影响免疫治疗的疗效，以及在某些情况下如何调节TME来改善当前的免疫治疗方案。 前言 通过免疫检查点抑制剂和嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法，癌症免疫治疗在多种癌症患者身上显示出了显著的长期疗效。癌症的常规治疗，如放疗和化疗，通常作用于肿瘤细胞本身，并且可以引发大部分患者的反应。尽管这些常规治疗在初期会产生应答，但是在长期治疗后的癌症晚期常出现复发和耐药。与常规疗法显著不同，免疫疗法通过作用于免疫系统而引发免疫系统抗肿瘤响应。免疫检查点抑制剂临床试验显示出了前所未有的持续响应，尽管这仅限于一小部分患者。因此，免疫治疗首要任务是弄清其详细的作用机制，以及如何将这种积极的响应扩展到更多患者身上。 在体外免疫系统能够识别肿瘤抗原并杀伤肿瘤细胞。然而，要消除机体内形成的肿瘤仅靠识别肿瘤抗原是不够的。一个成型的肿瘤是一个复杂的组织，它不仅由肿瘤细胞组成，还包括也基质细胞，炎症细胞，脉管系统和细胞外基质（ECM），所有这些总和定义为肿瘤微环境（TME）。通过免疫治疗成功控制肿瘤需要免疫系统的激活，效应细胞的扩增，活化的效应细胞浸润到肿瘤组织并破坏肿瘤细胞（图1）。然而TME常阻碍效应淋巴细胞致敏，降低其浸润能力，并抑制浸润的效应细胞，从而导致机体的抗肿瘤作用出现损害。免疫治疗的抗性机制包括如下：（1）抑制性微环境或缺乏抗原刺激/协同刺激的免疫细胞，尤其是T细胞，可能会促使TME内肿瘤的生长和免疫逃逸；（2）生物屏障对肿瘤组织的包裹可导致免疫细胞迁移进肿瘤部位的数量不足；（3）有限的抗原特异性T细胞群短暂激活或耗竭未能抑制肿瘤生长；（4）由于TME的作用肿瘤抗原向引流淋巴结释放不足，淋巴组织内直接或间接抗原递呈量少，导致缺乏T细胞致敏。因此，对免疫治疗与TME间相互作用更好的了
循环肿瘤细胞（CTC）检测 一、什么是循环肿瘤细胞（CTC）？ 循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cell，CTC）是存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称，因自发或诊疗操作从实体瘤病灶（原发灶、转移灶）脱落，进入外周血循环的肿瘤细胞。 CTC非常稀少，每毫升血液中109血细胞只有几个CTC。大部分CTC在进入外周血后会发生凋亡或被吞噬，少数能够逃逸并发展成为转移灶，增加恶性肿瘤患者的死亡风险。 二、肿瘤的发生及检测诊断 全国肿瘤登记中心发布的2015年年报显示，2011年我国新增癌症病例约337万例，比2010年增加28万例——这相当于每分钟有6人被诊断为癌症。然而，令人担忧的是这样的情势似乎仍未到达峰顶，未来可能还会不断增加。 美国约翰-霍普金斯大学Kinmel 癌症中心的Bert-Vogelstein 等专家在2013年3月份的一篇综述文章中写道：在今年将死于癌症的一百万人里，绝大部分是因为他们的癌症没有在发生、发展的前90%的时间内被发现。因此，我们需要明确一点：癌症是一种慢性病，它只是被突然发现，并非是突然发生的。我们需要尽可能早的发现它，从而提高治愈率。 伴随肿瘤的发生过程，肿瘤细胞的大小也随之增大。传统方法诊断出癌症的时候，大部分已经是晚期。晚期癌症的治愈率极低，其五年生存率也很低。在肿瘤的发生过程中，早期到中期之间是最佳治疗期，因此，如果在早期就可以发现肿瘤的存在，必然可以提高治愈率。临床癌症研究（Clinical Cancer Research）杂志上发表的荟萃分析（Meta-analysis）证实CTC
在乳腺癌预测中的价值，结果表明早期和转移性乳腺癌患者的循环肿瘤细胞CTC检测是一个稳定的预测和预后工具。 如果将肿瘤易感性基因检测和循环肿瘤细胞检测完美结合，那么能够将肿瘤的早期发现率提高数倍。肿瘤易感性检测是对未来可能患有癌症的一种风险预测。如果风险等级高，除了改变生活方式外，还可以定期做循环肿瘤细胞检测，即CTC检测，而且检查频率可以适当增加，每2-3个月检查一次，从而达到实时监控的目的。 三、CTC 检测临床意义有哪些？ CTC 检查的临床意义主要表现在体外早期诊断，血液中肿瘤在1mm时，即可检出CTC，抓住最佳治疗期；另外还可以进行预后判断，根据治疗前后CTC个数判断预后与存活时间，制定最佳治疗方案；此外，还有肿瘤复发检测、耐药性检测、化疗药物的疗效评价以及新药的研发等。 四、哪些人需要做CTC检测？ 1. 普通健康人：通过检查血液中是否存在循环肿瘤细胞来早期检测肿瘤的发生，建议每年检测一次，以期在肿瘤萌芽阶段就能检测到，从而保证早期治愈率。 2. 肿瘤易感人群：有癌症家族史人群，患有HPV阳性、慢性肝炎、慢性胃炎、慢性肠炎等人群，长期吸烟者，经常接触有毒有害物质者，生活压力大、精神高度紧张的亚健康人群，以及基因检测肿瘤易感性风险等级高者，建议每3个月或者半年检测一次。 3. 癌症患者：已经确诊的癌症患者，通过CTC计数，用于预后判断、疗效评价、复发检测等；通过CTC单细胞基因组分析，选择精准治疗方案，实现真正的液体活检。
关于循环肿瘤细胞（CTC）的一些认识 摘要：通常把进入人体外周血的肿瘤细胞称为循环肿瘤细胞（circulating tumor cell）。随着人们对循环肿瘤细胞研究的深入，尤其是伴随现代检测技术的广泛应用，CTC逐渐被人们所重视。循环肿瘤细胞的检测可有效地应用于体外早期诊断，化疗药物的快速评估，个体化治疗包括临川筛药、耐药性的检测，肿瘤复发的监测以及肿瘤新药物的开发等。检测CTC 有着良好的应用前景，随着这一研究领域的不断发展，必将产生新的诊疗手段，从而使肿瘤的治疗提高到一个崭新的阶段。 关键词：循环肿瘤细胞；CTC；检测方法；临床意义 早在1896年，Ashworth曾报道1例因癌症死亡的患者外周血中发现了类似肿瘤的细胞，并首次提出循环肿瘤细胞（circulating tumor cell, CTC）的概念[1]。随着人们对循环肿瘤细胞研究的深入，尤其是伴随现代检测技术的广泛应用，CTC逐渐被人们所重视。 1、概述 CTC指自发或因诊疗操作进入外周血循环的肿瘤细胞。随着肿瘤细胞的不断增殖,部分细胞可以通过分泌一种抑制黏附因子表达的物质,增加其运动能力并使之与肿瘤母体脱离。这些脱落的肿瘤细胞再分泌一种蛋白溶解酶，以破坏周边宿主结缔组织并进入脉管系统。诊疗操作也可使肿瘤细胞扩散进入外周血循环。 2、检测方法 2.1免疫细胞化学（immunocytochemistry, ICC） 这一检测方法基于抗原抗体结合反应的原理，利用单克隆抗体（McAb）与特异的肿瘤标记物结合，并通过酶与底物反应显色来判断肿瘤细胞的存在。检测的肿瘤标志物主要分三类：①上皮细胞角蛋白（CK），如CK19；②上皮细胞膜特异性抗原，如黏蛋白类，包括EMA、HMFG、HEA125等；③肿瘤相关糖蛋白（TAG），如TAG12。1980年，Sloane等首次 采用ICC的方法检测乳腺癌患者骨髓中的肿瘤细胞。该方法可以进行形态学分析，但是检 测的细胞量少，敏感性只有10－4～10－5（即在1万~10万个单核细胞中发现一个肿瘤细胞），而且许多分化差的肿瘤不能表达目标抗原，而非上皮细胞中细胞角蛋白和上皮细胞抗原亦可能阳性,故特异性不高。Braun等[2]认为由于CTC不表达白细胞共同抗原CD45，采用CD45－/CK＋双标技术可以提高ICC检测的特异性。 2.2多聚酶链反应（polymerase chain reaction，PCR） 该方法的原理是特异性扩增出肿瘤细胞中因癌基因、抑癌基因突变或染色体重排而产生 的DNA异常。这类基因的改变应满足以下条件：①该基因的突变在待检肿瘤中发生率较高，至少应达50％左右；②基因内发生碱基突变的部位应相对集中，如果过分分散，目前临床 应用有困难。这一方法检测肿瘤细胞的敏感性约1×10－6左右，比Southern印迹杂交法约提高10 000倍。应用PCR技术检测CTC受到缺乏肿瘤特异性和高表达标记的限制，该方法敏感度高，易出现假阳性，同时由于癌细胞的异质性亦可出现假阴性。目前多应用突变等位基因扩增（mutant allelie specific amplification, MASA）的PCR技术，检测大肠癌和胰 腺癌患者外周血中具有K-ras癌基因突变的肿瘤细胞。 2.3逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）
C an c e r r e s e ar ch Cir c u la t in g T um o r C e l ls D e cisi o n T r ee 内部使用 肿瘤研究 循环肿瘤细胞 起始样品– 外周血/骨髓 您富集 CTC s ? 您直接分选 CTCs? M i cro be a d s Human : CD326 (E p C A M ) M i c r o B e a d s Anti-ErbB-2 M i c r obe ads Anti-Melanoma (MCSP) M i c r obead s I nd irec t M i cro B e a d s 您去除非 CTC s ? C D 45M i cro B e a d s 您做CTC 的分析吗? 您想做先富集再分析吗? H um an CD326 (E p C A M ) tumor c e ll E n r i c h m en t a nd Detection kit ErbB-2 tumor cell E n r i c h m en t a nd Detection kit A n t i -M e l a no ma (MCSP) cell E n r i c h m en t a nd Detection kit MACSQuant 您用流式细胞仪吗? E p C A M a n t i bod i e s , a n t i - E r b B -2 a n t i bod i e s , anti-Melanoma (MCSP) an t i bo di e s , CD45 an t i bo di e s , Available c on j ug a t ed to up to 8 f l uo r o c h r o m e s MACSQuant 您做免疫组化吗 (I H C )? Carcinoma Cell Detection K i t , I n s i de Stain K i t , A n ti -C y t o k e r a ti n Alkaline P h os ph a t a s e ; Anti-Cytokeratin (C K 3-3E 4), A n ti -C y t o k e r a ti n (CK3-6H5), C D 45, 您做分子分析吗? 您做基因表达谱分析吗? mRNA isolation k i t , cDNA isolation k i t , MultiMACS M96 T he rmo M i c r o a rr ay : labeling k i t s , s e rv i c e s , b i o i n f o r ma t i cs , superAMP
循环肿瘤细胞检测系统（CTC）设备购置 可行性报告 一、制造商基本情况 美国强生(Johnson & Johnson)成立于1886年，是世界上规模最大，产品多元化的医疗卫生保健品及消费者护理产品公司。1999年全球营业额高达275亿美元。强生在全球60个国家建立了250多家分公司，拥有约11万5千余名员工, 产品销售于175个国家和地区。 强生公司是世界上最具综合性、分布范围最广的卫生保健产品制造商、健康服务提供商，产品畅销于175个国家地区，生产及销售产品涉及护理产品、医药产品和医疗器材及诊断产品市场等多个领域。 美国强生公司研发的循环肿瘤细胞检测系统（CTC）2012年进入中国市场，立即被运用于肿瘤科研和临床检测，并受到业界好评。二、项目意义 随着循环肿瘤细胞检测技术的不断发展，循环肿瘤细胞（CTC）在肿瘤临床实践以及肿瘤基础科学研究领域得到了越来越多的重视。CTC数目已经被证实与晚期转移性乳腺癌，结直肠癌，前列腺癌等各种患者的无进展生存期和总生存期密切相关，CTC已经成为转移性乳腺癌等癌种的一种全新的，独立的预后因子，并被作为一种新的肿瘤生物标志物而广泛应用于新药开发，癌症机制研究等不同的领域。三、国内外研究 CTC是指存在于外周血循环中的肿瘤细胞，其含量非常稀少（1ml血液中可能只能检出1个CTC）。CellSearch系统是目前为止唯一获得FDA批准的可以应用于病人管理的自动化循环肿瘤细胞检测系统。检测技术的不断进步CTC越来越成为国内外癌症领域研究的热点。2004年，Cristofanilli等完成的前瞻性多中心临床研究表明治疗前
(基线期)和首次随访时的CTC水平对于转移性乳腺癌患者的无进展生存期和总生存期都是独立的预测指标。在177例转移性乳腺癌患者中，CTC水平较高者(≥5个/7.5ml全血)的平均无进展生存期只有2.7个月，总生存期只有10.1个月；CTC水平较低者则分别为7.0个月(P<0.001)和超过18个月(P<0.001)。随后又有多个研究证明治疗期间任何时间点CTC水平的升高都提示着疾病的快速进展和较差的预后。同时也出现了越来越多的不同癌种的关于CTC的研究，其结果也提示了CTC在前列腺癌，结直肠癌中也发挥了相同的预后作用。由于FDA 的批准，在美国CTC已经可以与传统肿瘤诊断检测方法相结合用于临床实践。国外也有较多的研究集中在了CTC的生物特性上，例如研究CTC表面的Her2抗体表达情况，进行CTC与原发肿瘤的抗体表达对照研究等。 此前，国内也有一些实验室开展了关于CTC的研究，但局限于手工磁珠法，PCR法等方法学问题，并没有取得国际认可的结果。不过随着CellSearch方法逐渐进入中国，越来越多的学者已经开始了关于CTC的研究。国内正在进行CellSearch的注册临床研究，将会验证CellSearch系统在中国人群中的有效性及安全性。同时一些国内的实验室也已经开始在CellSearch这一平台上进行不同的基础科学研究，包括CTC表面多重生物标志物分析，CTC分子生物学分析，CTC细胞FISH检测等，希望通过CTC这个全新的肿瘤标志物得到更多关于癌症发病机制，癌症转移机制等问题的答案。 四、国内开展现状 基于CellSearch平台的CTC检测技术是一种安全可靠的被美国FDA批准的癌症临床辅助诊断技术，随着中国注册临床试验的进行，CTC检测将会在中国得到越来越多的重视并迎来更加广阔的临床及科研应用前景。目前国内已有解放军307医院，复旦大学附属肿瘤医院，
临床病理工作中，我们常用到“肿瘤细胞免疫组化耐药预后标记”，但是许多单位只写阳性结果，不写临床意义，其结果对临床帮助不大，因为许多医生不懂得这些结果的意义，因此建议大家在出此类报告时，把“肿瘤细胞免疫组化耐药预后标记”的意义打印在报告中，以增加病理报告的使用价值。 1、恶性肿瘤免疫组化耐药预后标记，全套4项：P-gP，GSTπ，TOPOⅡ，Ki-67。 2、乳癌免疫组化耐药预后标记，全套7项：P-gp，GSTπ，TOPOⅡ，Ki-67，ER，PR，C-erbB-2。 3、意义：标记物--作用--阳性部位--临床意义 多药耐药基因蛋白（P-Gp）--药泵作用--胞膜/胞浆--阳性率越高，对下列药物耐药性越强：阿霉素、柔红霉素、表阿霉素、米托蒽醌、长春花碱、长春新碱、紫彬醇、泰素帝。 谷光甘肽S转移酶（GST π）--解毒作用--胞浆--阳性率越高，对下列药物耐药性越强：阿霉素、顺铂、氮芥、环磷酰胺、瘤可宁。 拓扑异构酶Ⅱ（TOPOⅡ）--靶点作用--胞核--阳性率越高，对下列药物越有效：蒽环类抗生素和鬼臼毒素类，如VP16、替尼泊苷、玫瑰树碱、新霉素、柔红霉素、表阿霉素、阿霉素、VM26。阳性率高者对VP16尤其有效。 雌激素受体（ER）--性激素作用--胞核--阳性率越高，肿瘤对内分泌治疗越有效，预后越好。 孕激素受体(PR) --性激素作用--胞核--阳性率越高，肿瘤对内分泌治疗越有效，预后越好。 C-erbB-2--癌基因产物--胞浆--阳性率越高，肿瘤恶性程度越高。ER、PE阳性而C-erbB-2也阳性者，用三苯氧胺治疗效果不好。 Ki-67--细胞增殖标志--胞核--阳性率越高，肿瘤增殖越快，恶性程度越高。 Ki-67为细胞增值的一种标记，在细胞周期G1、S、G2、M期均有表达，G0期缺如，其和许多肿瘤分化程度、浸润、转移、预后密切相关。PCNA(增埴细胞核抗原)。 CEA 多数腺癌表达CEA Rb (retinoblastoma视网膜母细胞瘤) 基因是肿瘤抑制基因，调节细胞周期。 P53在免疫组化中均为突变型，阳性率越高，预后约差。野生型半衰期很短 Nm23是转移抑制基因，其阳性表达和肿瘤转移呈负相关。目前已被广泛应用于乳腺癌、非小细胞肺癌、胃癌、大肠癌、肝癌、喉癌等多种恶性肿瘤的检测。几