动物学报 48(1):44～49,2002A cta Zoologica S i nica
毛冠鹿与3种麂属动物的线粒体细胞色素
b 的系统进化分析
3
曹祥荣① 束峰珏①② 张锡然①毕春明① 李朝军① 胡 均③ 方笺阳③
(①南京师范大学生命科学学院,南京210097)(②复旦大学遗传学研究所,上海200433)(③安徽省皖南野生动物救护中心,安徽休宁245400)
摘 要 采用PCR 直接测序法,获得毛冠鹿、小麂、赤麂和黑麂等4种麂亚科动物线粒体细胞色素b 核酸序列
366bp ,麂属动物之间的序列差异为315%～416%,毛冠鹿属与麂属之间的序列差异为9129%～10111%,麂属3种动物分歧时间约为142～184万年,毛冠鹿与麂属动物的分歧时间约为370万年。结合鹿科其余3亚科动物
的同源序列,用MEG A 软件的Neighbor 2Joining Method (NJ 法)和最大简约法构建系统进化树。结果表明,小麂、赤麂与黑麂组成一个单系群,毛冠鹿细胞色素b 核苷酸序列与麂属的分化程度似已达到属间水平。关键词 毛冠鹿 麂属 线粒体细胞色素b 核苷酸序列 系统进化
2000202228收稿,2000206219修回
3国家自然科学基金资助项目(No 139970388)
第一作者简介 曹祥荣,男,37岁,博士,副教授。研究方向:细胞与分子遗传学。E 2mail :biocell @2631net
麂亚科(M utiaci nae )是一类小型鹿科动物,
分为麂属(M untiacus )和毛冠鹿属(Elaphodus )。一般认为麂属现生动物有赤麂(M 1m untjak )、小麂(M 1reevesi )、黑麂(M 1cri nif rons )、费氏麂(M 1f eae )、罗氏麂(M 1rooseveltorum )和贡山麂(M 1gongshanensis )等6个种(兰宏,1993),而毛冠鹿属仅有毛冠鹿(E 1cephalophus )。
麂亚科动物的细胞遗传学研究一直是国内外热门课题之一。尤其是麂属不同种间染色体差异显著,核型演化规律较为明显,其中赤麂和小麂的染色体研究为染色体进化的串联易位学说提供了主要依据(Shi et al.,1980)。毛冠鹿核型特殊(束峰珏等,1999),染色体数目和大部分形态与小麂相似,又有2～3对大的近中着丝粒染色体(SM ),中着丝粒染色体(M )与赤麂相似,它们的关系究竟如何,从传统分类和细胞遗传学特征还不能真正认识其本质。
随着分子生物学的发展,动物线粒体DNA 上的细胞色素b (cytochrome b ,Cyt b )基因被认为是探讨近缘种间和种内遗传分化程度的良好指标,在系统进化和分类研究中有较强的适用性(Irwin
et al.,1991),已在多种动物类群的系统进化和分
类研究中都得到了有效应用(Smith et al.,1991;
李明等,1998,1999;王义权等,1999)。因此,本工作用细胞色素b 核苷酸序列对麂亚科动物4个现生种进行分子进化研究,并比较鹿亚科(Cervinae )的梅花鹿(Cerv us ni ppon )、獐亚科(Hydropotinae )的獐(Hydropotes i nerm is )、空齿鹿亚科(Odocoileinae )的驼鹿(A lces alces )和鼷鹿科(Tragulidae )的鼷鹿(T ragelaphus scri pt us )的细胞色素b 核苷酸同源区序列,以探讨麂亚科动物的起源。
1 材料和方法
111 研究动物及材料
小麂(M untiacus
reevesi )
和毛冠鹿(Elaphodus cephalophus )的肌肉组织与黑麂(M untiacus cri nif rons )血液均来自安徽;赤麂(M untiacus m untjak )胚肾细胞株(KCB80002)来自中国科学院昆明动物研究所。驼鹿(A lces alces ,登录号AJ 000026)、獐(Hydropotes i nerm is ,登录号AJ 000028)、梅花鹿(Cerv us ni ppon ,登录号AB021093)、鼷鹿(T ragelaphus
scriptus,登录号AF022067)细胞色素b基因同源区序列来自G enBank。
112 实验方法
11211 DNA提取 参照Sambrook等(1989)的方法提取DNA,测定其260nm吸光度,-20℃保存。
11212 PCR扩增 通用引物L14724、H15149 (Irwin et al.,1991;K ocher et al.,1989)由复旦大学遗传研究所合成,引物序列为:L14724(5′2 CG AA GCTTG A TA TG AAAAACCA TCGTTG23′)和H15149(5′2AAACTGCA GCCCCTCA G AA TG A TA2 TTTGTCTCA23′)。反应总体积60μl,含10×Buffer710μl,115mmol MgCl2316μl,2mmol dN TP318μl,Taq酶(Sagoon,4U/μl)014μl, 5pmol/L引物各118μl,模板DNA015μl(约50 ng),加纯水至60μl。PCR反应循环参数为:95℃预变性5min,然后95℃变性40s,57℃退火1 min,72℃延伸2min,32个循环,72℃延伸10 min。用115%琼脂糖凝胶、5V/cm电泳,紫外检测扩增产物,凝胶成像仪扫描。
11213 DNA序列测定 采用PE公司dRhodamine Terminator310型循环测序仪及配套试剂盒对PCR 产物进行纯化和序列测定。
11214 DNA序列分析 按照K imuraπs Two2 Parameter Method(1980)对每个核苷酸位点的替换数进行估计,并计算物种间的DNA序列差异。用M EG A(Kumar et al.,1993)软件中的NJ法(Neighbor2Joining Method)和最大简约法(Maximum Parsimony Method)来构建系统进化树,以鼷鹿为外群,结合从G ene Bank检索获得鹿科其余3亚科各1个物种的同源序列进行比较。
2 实验结果
211 PCR结果
所有样品中均扩增出015kb左右的片段,而同样条件下的空白对照未见扩增产物(图1),说明结果可信。优化PCR反应条件,得到可直接测序的扩增产物。
212 序列分析结果
对小麂(Mre)、黑麂(Mcr)、赤麂(Mmu)和毛冠鹿(Ece)的细胞色素b核苷酸扩增片段进行测序,得到366bp序列。从G enbank检索获得驼鹿(Aal)、獐(Hin)、梅花鹿(Cni)和鼷鹿(Trg)的同源序列,进行比较(图2)
。
图1 细胞色素b基因PCR扩增结果
Fig11 The PCR amplif ication products of
Cyt b gene
a:小麂M untiacus reevesi b:黑麂M untiacus cri nif rons
c:赤麂M untiacus m untjak d:毛冠鹿Elaphodus cephalophus
e:空白对照(The reagent controls)
213 数据处理
小麂、黑麂、赤麂和毛冠鹿细胞色素b的序列差异值和转换/颠换值如表1,鼷鹿为外群,采用M EG A软件分析。
从表1可以看出,小麂、赤麂和黑麂之间的序列差异为3155%～4164%,麂属与毛冠鹿属之间的差异为9129%～10111%,它们与外群鼷鹿间的差异为12184%～15130%。
214 系统进化树
根据K imuraπs Two2Parameter Method(1980)估计每个核苷酸位点的碱基替换数。以鼷鹿为外群,用NJ法和最大简约法构建7种鹿科动物系统进化树(图3),得到以下结果。置信值(Bootstrap)来自500个重抽样数据组的统计。
表1 麂属动物和鼷鹿的细胞色素b序列差异百分比(对角线以上)及转换/颠换值(对角线以下) T able1 Percentage divergence(above diagonal)and numbers of transitions/transversions(below diagonal)for Cyt b sequences of Muntiacus and Tragelaphus scriptus
12345 141643155912913166
216/131831*********
312/114/0915613139
429/533/431/415130
532/1830/1732/1739/17
1:小麂M.reevesi 2:黑麂M.cri nif rons 3:赤麂M. m untjak 4:毛冠鹿E.cephalophus 5:鼷鹿Tragelaphus scri pt us
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1期曹祥荣等:毛冠鹿与3种麂属动物的线粒体细胞色素b的系统进化分析
图2 鹿科7种动物的细胞色素b 核苷酸序列(366bp)
Fig 12 Alignment of Cyt b nucleotide sequences (366bp)of seven deer species
点表示与小麂(Mre )相同的核苷酸序列,鼷鹿(Trg )为外群
(Dots indicate identities with nucleotides in the M untiacus reevesi (Mre ).
Tragelaphus scri pt us is outgroup )
64动 物 学 报48卷
图3 N J法(a)和最大简约法(b)构建鹿科动物细胞色素b系统进化树
Fig13 Phylogenetic trees of the C yt b sequence of C ervid ae
deers constructed with N J method(a)and MP method(b)
每个位点上的核苷酸替换用K imuraπs Two2Parameter Method估计
(The number of nucleotide substitutions per site was estimated using K imuraπs two2parameter method)
3 讨论
据费辽罗夫等(1957)的古生物学研究,麂亚科真正形成时间大致为中新世的后半期,即中新世的中期和晚期,这个时期又被认为是真正鹿科的形成时期。麂亚科现生种动物则被认为出现在更新世,小麂化石最早发现于更新世(距今约300万年),赤麂化石最早发现于晚更新世(距今约50万年),毛冠鹿被认为是与更新世在中国陕西蓝田、四川万县出现的麂族的近缘鹿(盛和林,1992)。马世来等(1986)应用分支分类学(Cladistics)方法对麂属的种级分类进行了系统整理,他们认为小麂比较原始,黑麂是小麂分支中的近缘种。兰宏等(1993)用RFL P技术对麂属部分种的起源研究认为,赤麂、黑麂和小麂之间的亲缘关系比较复杂,但小麂比较原始,毛冠鹿是麂属的近缘种。
本文从细胞色素b核苷酸序列基因的序列分析表明3种麂属动物种间序列差异在3155%～416%之间,而毛冠鹿与3种麂属动物的差异则在9129%～10111%之间,与鼷鹿之间的差异为1513%。根据细胞色素b核苷酸序列的进化速度为每百万年为215%的研究报道(Meyer et al., 1990),推测麂属的3个种分歧时间约为142～184万年之间,这与兰宏等(1993)根据mtDNA RFL P计算得出的赤麂、小麂和黑麂之间分歧时间为200万年左右的结果比较接近。根据毛冠鹿序列差异,推测与它们的分歧时间约为370万年。本文序列分析结构基本符合Cronin(1991)和Tamate 等(1995)有关鹿类动物的种间、属间及科间线粒体DNA序列差异范围,即毛冠鹿与3种麂属动物的序列差异似已达到属间差异水平,提示毛冠鹿与麂属的分化程度较高。本文根据7种鹿科动物细胞色素b基因的同源序列构建的系统进化树中,赤麂、小麂和黑麂首先聚合,组成一个并系,这在NJ法构建的进化树(图3:a)和最大简约法构建的进化树(图3:b)中都得到了反映,提示三者分歧时间较为接近。与之相比,毛冠鹿与它们的亲缘关系较远,至于能否将毛冠鹿另列一属,尚需进一步的证据。由于本研究没有得到费氏麂、罗氏麂和贡山麂的分析样品而无法对麂亚科的系统进化关系进行全面分析。
Miyamoto等(1990)以獐为外群,利用12S rRNA和16S rRNA序列对麂、鹿和空齿鹿的进化关系进行的研究表明,麂和鹿的关系最近并组成姐妹群,空齿鹿较原始。这一结论得到了细胞色素b 核苷酸序列研究结果的证实(李明等,1998; 1999;Randi et al.,1998)。本文构建的系统进化树与上述研究结果基本吻合。
以上仅从线粒体DNA的细胞色素b一个基因片段序列讨论了毛冠鹿与麂属部分种动物的系统进化关系。由于采用不同方法所获得的分子系统进化树之间存在一定差异,为了更准确地阐明麂亚科动物之间尤其是毛冠鹿属与麂属动物之间的系统进化关系,还必须综合多方面材料进行讨论,这正在进一步研究中。
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1期曹祥荣等:毛冠鹿与3种麂属动物的线粒体细胞色素b的系统进化分析
84动 物 学 报48卷
参 考 文 献(R eferences)
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3This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (No 13990388)
外 文 摘 要(Abstract)
PH YLOGENETIC RE LATIONSHIPS OF EL A P HODUS C EP HAL O P HUS
AN D THREE MUN TIACUS SPECIES REVEAL ED BY MITOCH ON D RIAL
CYTOCHROME B NUCL EOTIDE SEQUENCE 3
CAO Xiang 2Rong ① SHU Feng 2J ue ①② ZHAN G Xi 2Ran ①B I Chun 2Ming ① L I Chao 2J un ① HU J un ③ FAN G Jian 2Yang ③
(①College of L if e Science ,N anji ng Normal U niversity ,N anji ng 210097,Chi na )
(②Instit ute of Genetics ,Fudan U niversity ,S hanghai 200433,Chi na )(③W annan Fi rst 2A i d Cent re of Wil d A ni mal ,Xi uni ng 245400,A nhui ,Chi na )
Phylogenetic relationships of Mutiacinae are of considerable interest because of their suitability for the study of evolutionary patterns and processes.
The extant species of Mutiacinae includes M untiacus m untjak ,
M untiacus
reeves ,
M untiacus
cri nif rons ,
M untiacus
f eae ,
M untiacus
rooseveltorum ,
M untiacus
gongshanensis and Elaphodus cephalophus .Previous phylogenetic studies on morphological and palontological
information for the Mutiacinae have demonstrated that the extant subfamilies of muntjak originated in Pleistocene.The earlist fossil record of M untiacus reeves shows that this species evolved in early and mid 2Pleistocence ,while M untiacus muntjak evolved in mid 2and late 2Pleistocence.
Elaphodus cephalophus is a
sister group to the M untiacus which envolved in Pleistocence too.Most chromosomes of the Elaphodus
cephalophus have similar characteristics with M untiacus reeves except that 2～3chromosomes are homologous
with M untiacus m untjak .Evolutionary relationships among them are not well understood.Mitochondrial DNA has been used extensively for phylogenetic inference.In this study ,fragments of mitochondrial DNA cytochrome b gene (each 366base pairs in length )have been characterized from M untiacus m untjak ,
M untiacus reeves ,M untiacus cri nif rons and Elaphodus cephalophus by direct sequencing of PCR products.
The nuclearted divergence of the cytochrome b region was 3155%～4164%among three species of M untiacus ,and 9129%～10111%between Elaphodus and three species of M untiacus .
These results showed that
divergence time was about 1142～1184million years among three species of M untiacus and Elaphodus diverged from M untiacus about 317million years ago.These results indicated that nuclearted divergency was level of inter 2subfamily between Elaphodus cephalophus and M untiacus .We obtained homologous nuclear sequence of
Cerv us ni ppon (Cervinae ),Hydropotes i nerm is (Hydropotinae )and A lces alces (Odocoileinae )as well as T ragelaphus scri pt us
(Tragulidae )for outgroup from gene bank.The phylogenetic relationship of
mitochondrial DNA of seven species of Cervidae was described.Phylogenetic trees were constructed with neighbor 2joining method and maximum parsimony method.Results indicated that M untiacus m untjak ,
M untiacus reeves and M untiacus cri nif rons construted a monophyletic group.The phylogenetic relationships of
mitochondrial DNA suggested that Elaphodus cephalophus be more closely related with M untiacus than other three species of subfamilies.These results are consistent with previous phylogenetic studies of mitochondrial DNA on the whole.
K ey w ords Elaphodus cephalophus ,
M untiacus ,Mitochondrial cytochrome b nucleotide sequence ,
Phylogeny
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41期曹祥荣等:毛冠鹿与3种麂属动物的线粒体细胞色素b 的系统进化分析
动物细胞培养和核移植技术 备课日期2014年 3 月 4 日课型新授课 教学目标 知识与技能 1\简述动物细胞养的含义。 2\说出动物细胞养的所需条件。 3\简述动物细胞培养的基本程序。 4\简述动物细胞核移植的概念。 过程与方法 情感态度 与价值观 1\通过学习基因工程的概念，使学生认识到科学研究需要的严谨，激 发为祖国而奋斗的精神。 2\通过学习基因操作的工具，使学生树立结构与功能相统一的辩证唯 物主义观念。 教学重点 1\动物细胞培养的过程及条件； 2\用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程和应用前景 教学难点用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程 教学方法以探究法、谈话法、材料教学法相结合。 教学用具多媒体课件 课时安排1课时 教学内容设计与反思 板书设计:
教学内容设计与反思一、复习导入: 教师活动：投影幻灯片，引导学生思考、分析讨论。 （1）植物细胞工程常用的技术手段有哪些？ 植物组织培养 植物体细胞杂交 （2）植物体细胞杂交的结果是产生了？ （3）植物体细胞杂交过程中涉及的原理是？ 二、讲授新课: （一）动物细胞工程 动物细胞工程常用的技术手段 动物细胞核移植、动物细胞融合、生产单克隆抗体、动物细胞培养 动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。 （二）动物细胞培养 1.发展历史: 单20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形 成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问 题展开了激烈的争论。1907年，美国生物学家哈里森(Harrison)从蝌蚪的 脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神 经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验 不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后， 在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物 细胞培养。 2、动物细胞培养的应用和概念： 动物细胞培养就是从动物有机体中取出相关 的组织,将它分散成个细胞,然后,放在适宜的 培养基中,让这些细胞生长和增殖. 3、动物细胞培养过程： 引导学生阅读课文44--46面相关内容。
基础知识巩固 、动物的生殖系统 1、组成: 、生殖类型: 如田螺和某些昆虫、鱼、蛇、蜥蜴等，是对不良环境长期 二、受精方式: 1、体内受精: 2、体外受精: 四、动物个体的发育: 2、胚后发育：从脱离 五、发育类型: 、昆虫的生殖 受精，卵生。 、昆虫的发育 动物的生殖和发育 1、胎生：受精卵在母体 （内或外）发育 2、卵生：受精卵在母体 （内或外）发育 3、卵胎生：受精卵在母体 （内或外）发育，但是发育所需要的营养来自 1、无变态发育：又称 ，幼体和成体 差异较 小 。 2、 变态发育：又称 ，幼体和成体 差异较大。 3、 变态发育的两种类型 4、 不完全变态发育的三个时期: （若虫）、 5、 完全变态发育的四个时期: 2、演化过程：结构从不完善到 、从雌雄同体到 形成的繁殖方式。 1、胚胎发育：从 开始到脱离 为止。 为止。 雌雄
1．昆虫的发育经过了 和 三个阶段，而且幼虫和成虫 ，这样的发育过程叫做不完全变态。如：蝗虫、蟋蟀、蚱蜢、蝼蛄等的 发育就是这种类型。 2. 昆虫的发育经过了、、和四个阶段，而且幼虫和成虫的差别，这样的发育过程叫 做完全变态。如：菜粉蝶、果蝇、棉铃虫、松毛虫等的发育就是这种类型。 两栖动物的生殖和发育 、两栖动物的生殖 、鸟卵的结构 由卵壳、卵壳膜、卵白（功能是 养一段时间的，属于 例题解析 的差别 雌雄 受精，卵生。受精必须在 完成。 、两栖动物的发育 青蛙的发育经过了 四个阶段，其幼体和成体 在外部形态、 内部结构和生活习性上都有许多差异， 幼体生活在 ，用 吸；成体既能生活在水中，也能生活在潮湿的陆地上，主要用 呼吸。像 这样的发育过程属于 鸟的生殖和发育 、鸟的生殖 具有明显的 性。筑巢后，雄鸟会表现出各种各样的 行为，如仙鹤跳 舞、孔雀开屏等，然后，雌雄鸟交配，精子与卵细胞在 结合成受精卵。 卵黄膜、卵黄（功能是 ）、胚盘（内有 ，是 的部位）组 成，其中后三部分结构构成了鸟卵的 三、鸟的发育 鸟的受精卵在 就已经开始发育，产出后，由于外界温度低于亲鸟的体温， 胚胎停止发育，需由亲鸟 才能继续发育。雏鸟可分为两类：像雏鸡一样，孵出 时已充分发育的，属于 ；像雏蓝山雀一样，孵出时尚未充分发育、需由亲鸟喂
一、鱼类，两栖类，爬行类、鸟类和哺乳类的骨骼 观察经制备好的骨骼标本，了解其特点。 ◆鱼类脊柱的分化程度很低，脊椎只有躯椎（trunk vertebra）和尾椎（caudal vertebra）两种。 ◆躯椎附有肋骨（lib），尾椎特具脉弓，容易区分。 ◆鱼类特有的双凹形（amphicoelous）椎体。 鱼类成对的附肢骨骼没有和脊柱发生联系，这是其骨骼系统的特点之一 两栖类 ◆分颈椎（cervical vertebra）、躯干椎（trunk vertebra）、荐椎（sacral vertebra）和尾椎（cauda vertebra）。具有颈椎和荐椎是陆生脊椎动物的特 征。 ◆颈椎1枚，又称为寰椎（atlas） ◆躯干椎7-200枚，12-16枚（有尾两栖类），无尾 两栖类最少为7枚，无肋骨。 ◆椎体多为前凹型或后凹型。少为双凹型。 ◆荐椎1枚。 ◆尾椎在无尾类中为1枚 爬行类 ?出现了枢椎、2枚荐椎。寰椎与头骨的枕骨髁作关节，能与头骨一起在枢椎的齿状突上转动，从而使头部有了更大的灵活性。 ?与两栖动物的比较： 两栖动物：颈椎(1枚)+体椎+荐椎(1枚)+尾椎 爬行动物：颈椎(2枚)+胸椎+腰椎+荐椎(2枚)+尾椎 ?有发达的肋骨，一部分胸椎的肋骨与胸骨形成羊膜动物特有的胸廓（throax），它与保护内脏器官和加强呼吸作用的机能密切相关 ?蛇类不具有胸骨，其肋骨具较大的活动性，并借助皮肤肌支配腹鳞，以完成特殊的运动方式 肩带有十字形上胸骨（而非胸骨的组成部分） 四肢与身体长轴呈横出的直角相交，肩臼浅小。故爬行动物在停息或爬动时都保持着腹部贴地的姿态。 鸟类 ?鸟类的脊柱可分5区，即颈椎、胸椎、腰椎、荐椎和尾椎。 ?颈长，颈椎数目较多。颈椎的特点是活动性很大，其椎体呈马鞍型，称为异凹型椎体。这种类型的椎体是鸟类所特有的，椎间关节活动性极大，鸟头能转动180°，某些鸮形目的鸟头甚至能转动270°。
一、实验目的 1、学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。 2、学习并掌握细胞传代培养的方法。 3、学习并掌握用倒置荧光显微镜观察细胞细胞形态。 二、实验原理 细胞培养（cell culture）：细胞在体外条件下生长，细胞不再形成组织。 动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。由于细胞具有生长和自我复制的能力，为细胞体外培养和研究提供可能。 动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。 原代培养（primary culture）即直接从动物机体分离、获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法。 传代培养（subculture）当细胞生长增值达到一定密度，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，将细胞转移到新的培养皿中扩大培养的方法。 高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的，但如果把或细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则方便简单的多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类探索防治各种疾病途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，因此，动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。 三、细胞培养相关设施及材料 1、细胞培养室 无菌操作区：只限于细胞培养及其它无菌操作，与外界隔离。 孵育区：培养箱设定的条件为37℃，5%CO2。 制备区：培养液及有关培养用液体的制备，液体制备后应该在净化工作台进行过滤除菌。 储藏区：包括冰箱、干燥箱、液氮罐等。 清洗区和消毒灭菌区：清洗区为相对污染区，消毒灭菌区与清洗区分开。 2、细胞培养常用基本设施： 荧光显微镜、超净工作台、孵箱、电热鼓风干燥箱、冰箱、液氮罐、消毒器、恒温水浴槽、滤器等。 细胞培养常用器皿：培养瓶、培养板、培养皿，玻璃瓶、吸管，离心管、冻存管，注射器，烧杯、量筒等。 3、细胞培养用品的清洗、消毒 新玻璃器皿要用5%稀盐酸浸泡，以中和其表面碱性物质：刷洗： 硫酸清洁液浸泡：浓硫酸+重铬酸钾+蒸馏水； 冲洗：流水冲洗15-20次，蒸馏水冲洗3次，三蒸水漂洗1-3次。 所有需灭菌的器械、物品灭菌前均需包装，防止灭菌后污染。使用时放入超净工
第一章：动物进化基本原理 第一节：关于生命起源的问题 第二节：动物进化的例证 一、比较解剖学的例证： 动物的演化反映在形态结构上，比较各类动物的体制结构不难找到它们之间的进化线索与亲缘关系。 1、同源器官（homologous organ）： 不同类动物的某些器官有时在外形上不 同，功用也不同，但其基本结构和胚胎 发育的来源上却相同。如脊椎动物的前 肢——鸟翅、蝙蝠的翼、鲸的鳍状肢、 狗的前肢以及人的手臂等，它们在外形 和功能上不相同，但内部结构却相似， 在胚胎发育中由共同的原基构成。这种 一致性证明了这些动物有共同的祖先， 其外形的差异则是由于适应不同的生活 环境，执行不同的功能造成的。哺乳类 中的3块听小骨（镫骨、砧骨、和锤骨）和其祖先的一部分咽弓（舌颌骨、方骨和关节骨）也是同源器官。又如陆生脊椎动物的肺与鱼类的膘，从胚胎发生上看，均由原肠突出形成。 2、同工器官（analogous organ）：指在功能上相同，有时形状也相似，但来源和基本结构均不同。例如蝶翼与鸟翼均为飞翔器官，但蝶翼是膜状结构，由皮肤扩展形成，而鸟翼是脊椎动物前肢形成，内有骨骼外有羽毛。又如鱼鳃与陆栖脊椎动物的肺，均为呼吸器官，但鱼鳃鳃丝来自外胚层，而肺来自内胚层。
3、痕迹器官（vesrigial organ）：指动物或人体中一些残存的器官，它们的功用已经丧失或极小。如鲸残存的腰带证明其为次生性水栖哺乳类，其祖先应是陆生哺乳类。同样，从蟒蛇泄殖腔孔两侧是一对角质爪和退化的腰带的存在证明其祖先应为四足类型爬行动物。 人体也有许多痕迹器官的存在，如退化的盲肠与蚓突，已失去消化功能；分节的腹直肌为原始肌肉分节现象的残遗；眼角的瞬膜、动耳肌、尖形的犬牙、体毛、男性的乳头和小的尾椎骨等。痕迹器官的存在只有用进化观点才能合理的解释，即人类是由具有这些器官的动物进化而来。 二、胚胎学的例证： 不同的脊椎动物的早 期胚胎发育彼此很相似， 都具有鳃裂和尾，头部较 大，身体弯曲。胚期越早， 体形也越相似，以后才逐 渐分化显出差别。在分类 地位上越相近的动物，其 相似的程度也越大。 动物胚胎发育的过程 一般能重现其在种系进化历程中的重要阶段。如：哺乳动物从一个受精卵发育开始，历经囊胚、原肠胚至三胚层等是相当于无脊椎动物阶段，待出现鳃裂（或鳃囊），相当于鱼类阶段，再出现心脏的分隔变化，相当于由鱼类→两栖类→爬行类→哺乳类各阶段。这就是德国生物学家赫克尔(Haeckel)提出来的“生物发生律”或“重演论”（biogenetic law或recapitulation theory），即“个体发育的历史是系统发育历史的简单而迅速的重演”。蛙的个体发育中由蝌蚪到成蛙的变态的一系列体制结构的变化，清晰地反映出脊椎动物的由水生到陆生的演变。
浅谈动物神经系统的结构与机能演化历程 陈章（学号：201421191529） 摘要：神经系统是动物有机体重要的机能调节系统。大多数动物, 特别是脊椎动物，神经系统调节和控制着机体的绝大部分重要的生命活动。在动物的器官系统中，与演化历程联系最紧密的是神经系统。在演化阶段上地位越高的动物，其神经系统的发达和复杂程度就越高，其机能行为也越复杂，致使其适应环境的能力也越强。本文主要讨论了从动物神经系统的结构和机能的演化过程，阐述了神经系统在动物与环境的适应性进化中的重要作用，这将有助于我们进一步加深对动物进化趋势的理解。 关键词：神经系统；结构；机能；神经元；脑 神经系统是随着动物进化而不断进化发展的，可以说动物的进化程度越高，神经系统的分化程度就越高。在不同阶段神经系统都有不同的特点，在进化过程中有几次飞跃，最终进化为哺乳动物的高级神经系统。人脑是自然界长期进化过程的产物。从没有神经系统的单细胞动物，到脊椎动物复杂的神经系统，再到高度复杂的人脑，经过了上亿年的发展。 1、无脊椎动物神经系统结构和机能的发展 无脊椎动物总的演化趋势是由低级到高级，从简单到复杂，从水生到陆生，从分散到集中。对这个总的趋势，起柱石作用的是无脊椎动物各大系统的演化趋势。无脊椎动物各大系统的演化趋势虽然在某些个别阶段上出现了螺旋式变化的现象，但总的方向还是遵循了从低级到高级，从简单到复杂，从分散到集中的进化原则的。无脊椎动物神经系统的演化是这个原则的具体体现。无脊椎动物二十多个门，从进化树上来看，越高等一点的类群，其神经系统越发达，越低级一点的类群，其神经系统就越简单。动物要维持个体生存，必须具备寻找食物和逃避敌害的能力。要保证物种的延续，还必须具备寻找配偶，进行生殖的能力，这些行为的完成需要神经系统的参与。机体内各器官系统相互影响，相互制约，相互协调，具备统一的生理功能，也是在神经系统的调节和控制下完成的。在生物体不断适应体内外环境变化的过程中，神经系统起了决定性作用。一般认为，神经系统的发达和复杂程度越高，那么该物种在演化阶段上的地位就愈高，其机能就愈复杂，适应环境生存竞争的能力也就越强。即神经系统的结构发育水平直接决定着其机能。 1.1 原生动物
《动物细胞培养技术》复习思考题 1.动物细胞培养的实验器皿清洗要求为何较高？你认为该如何保证器皿中无杂质？如果 器皿中有杂质，会对细胞培养产生什么样的影响？ 答：①离体细胞对各种毒物都很敏感，若所用器材清洗效果未达到要求，各种毒物会损坏细胞影响实验。②器皿使用高压灭菌锅，121.3℃，20~30分钟，在取拿的时候用经过高压灭菌后的镊子取拿，避免造成污染。③ 2.叙述超净工作台的工作原理？ 答：超净工作台最主要的是空气循环过滤的过程，在这个过程中风机起到了心脏的作用。鼓风机驱动空气通过高效过滤器得以净化，净化的空气被徐徐吹过台面空间而将其中的尘埃、细菌甚至病毒颗粒带走，使工作区构成无菌环境。 3.正压过滤器为何会除菌？ 答：正压式过滤器没有内置灭菌灯，正压式过滤器利用的是两层0.22um孔的过滤膜，这层膜可以将细菌阻挡在膜上，过滤的液体流下去就基本上完成了灭菌过程 4.各种细胞培养用液的配制需要很精确吗？如果不精确，会导致什么后果？请举例说明。 你认为精确配制各种溶液？ 答： 5.配制后平衡盐溶液呈黄色意味着液体的pH发生了什么变化？ 答：配制后的液体应呈桃红色，PH值为7.4左右。苯酚红的变色域：1.2（橙）~3.0（黄），6.5（棕色）~8.0（紫色），若为黄色，则液体呈酸性，不利于细胞的生存。 6.用于分离细胞的消化液为什么宜用无Ca、Mg离子的D-Hanks液或PBS液配制 答：Ca＋2、Mg＋2是细胞膜的重要组分，具有使细胞凝聚的作用。因此，用于分离细胞的消化液宜用无Ca＋2、Mg＋2离子的D-Hanks液或PBS液。 7.L-谷氨酰胺在营养液中有何作用？ 答： L－谷氨酰胺是细胞的能量来源；是一种必须氨基酸，是使物体合成核酸、蛋白质、嘌呤、嘧啶的重要前体，也是蛋白质合成分解的调节物；是细胞内氨的清除剂，氨对一些细胞有毒性。 8.HEPES溶液的作用机理？ 答：它是一种氢离子缓冲剂。主要作用是防止培养基pH迅速变动 9.平衡盐溶液的组成与基本作用？小牛血清在细胞培养中有哪些作用？ 答：①平衡盐溶液主要是由无机盐、葡萄糖组成,它的作用是维持细胞渗透压平衡,保持pH 稳定及提供简单的营养.主要用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂等。②作用：a提供能促使细胞指数生长的激素、基础培养基中没有或含量微小的营养物，以及某些低分子营养物质；b提供结合蛋白，识别维生素、脂类、金属离子，并与有毒金属和热源物质结合，起解毒作用；c是细胞贴壁、铺展生长所需因子的来源；d起酸碱度缓冲液作用； e提供蛋白酶抑制剂，细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受损伤。 10.营养液制备后为什么要小剂量分装？ 答：避免营养液被污染后，全部的营养液都被污染。 营养液一次用完过后，下一次的实验就不能用，会引起污染，影响实验，若冷冻营养液，则营养液的营养成分会有所损失，影响细胞的生长 11.10万U/mL单位青霉素、链霉素的配制方法？ 答：用注射器吸10毫升双蒸水溶解100万单位的链霉素，弃去2ml，用剩余的8ml链霉素溶解80万单位的青霉素，配制成每毫升青霉素、链霉素各10万单位的母液。
动物呼吸系统的演化
我们知道，几乎所有的动物都要从水环境或直接从空气中获取O2，同时释放生物氧化代谢产生的CO2，整个过程就是呼吸。 那么这一节，我们要讲的是动物呼吸系统的演化，也就是从单细胞的原生动物到高等的哺乳动物，它们的整个呼吸系统是如何演变的： 首先，我们来看原生动物，它是单细胞生物，所以只能靠细胞膜的表膜通过扩散作用得到O2，排除CO2。然后到多细胞海绵动物，2胚层腔肠动物，最原始的3胚层扁形动物，再到线虫动物，环节动物，由于这些动物个体小、扩散距离短，通过扩散就能满足气体交换的需要，因此，它们都是在体表进行呼吸，即皮肤呼吸。从软体动物开始出现了真正的鳃，水生种类用鳃呼吸，陆生种类用肺直接摄取空气中的氧，这个肺是外套膜内一定区域微血管密集形成的网。节肢动物的呼吸器官就形式多样了，小型节肢动物是靠体表进行气体交换，如
那么另外一个区别呢？就是软骨鱼的鳃间隔很发达，尤其是板鳃亚纲，可以直接达到体表，那么到了硬骨鱼，鳃间隔退化，鳃丝直接着生在鳃弓上面。 为了更直观地认识鳃的演化，我们画个简单的模式图：这里是消化道，外面是皮肤，中间是肌肉层，中胚层。消化道向外突起，一直到皮肤这里打通，这就是七鳃鳗的一个鳃了，然后再打通一个，类似地，它就有七个鳃囊形，这是它的内鳃孔、鳃囊、外鳃孔，鳃丝着生在这上面，那中间这个部分叫什么呢？对，是鳃间隔；然后到了硬骨鱼呢，鳃间隔退化，鳃丝直接着生在鳃弓上。 为了看得更清楚一些，我们画另一个侧面的图，这是鳃弓，这是鳃间隔，上面着生鳃丝。中华鲟呢，鳃间隔退化不完全，还残余一点鳃间隔，鳃丝是这样着生的，然后到硬骨鱼，鳃间隔完全退化，鳃丝直接着生在鳃弓上面。这就是水生动物鳃的演变情况。
认知心理学第二次作业 1、简述神经系统的进化过程及其趋势？ 答：1）神经系统指由神经元构成的一个异常复杂的机能系统，它的进化经历了网状神经系统、链状神经系统、节状神经系统、管状神经系统等几个主要的发展阶段。脑的出现在神经系统的进化史上有着特别重要的意义。脑成为调节和支配动物行为的最高司令部。从低等的脊椎动物（如鱼），到高等脊椎动物（如人类），脑是进化是遵循以下方向不断完善的：脑的相对大小的变化，在动物进化史上，脑或神经系统的大小与动物行为的复杂程度是相关的；皮层相对大小的变化，在脊椎动物脑的进化中，新皮层大小的增加具有重要的意义；皮层内部结构的变化等。 2）神经系统由于结构和机能的不同，可以将神经系统分成中枢神经系统和周围神经系统两部分，从进化论的观点来看其各自的发展：周围神经系统有三部分组成：脊神经、脑神经、植物性神经；中枢神经系统包括脊髓与脑干、间脑、小脑、边缘系统，各自顺势发展，边缘系统比脑干、间脑、小脑出现得更晚些。在系统发生的阶梯上，哺乳动物以下的有机体没有边缘系统，随着人类的进化边缘系统好像能抑制某些本能行为的模式，是机体对环境的变化能做出更好的反应等。 2、简述神经元的基本结构及其分类？ 答：1）神经元即神经细胞，是神经系统结构和机能的单位。它
的基本作用是接受和传递信息。神经元是具有细长突起的细胞，它由胞体、树突和轴突三个部分组成，其中胞体的形态和大小有很大的差别，有圆形、锤体形和星形等几种，胞体最外是细胞膜，内含细胞核和细胞质。树突则较短，长度只有几百微米，形状如树的分枝，其作用类似于电视的接收天线，负责接受刺激，将神经冲动传向胞体。轴突一般较长，其长度从几十微米到一米，每个神经元只有一根轴突，轴突的作用是将神经冲动从胞体传出，到达与它联系的各种细胞。 2）神经元有各种不同的形态，按突起的数目可以分成单级细胞、双级细胞核多级细胞，按功能可以分成内导神经元（感觉神经元）、外导神经元（运动神经元）和中间神经元。内导神经元收集和传导身体内、外的刺激，到达脊髓和大脑；外导神经元将脊髓和大脑发出的信息传到肌肉和腺体，支配效应器官的活动。中间神经元介于前两者之间其联络作用。 3、简述神经冲动的传输方式？ 答：冲动性是神经和其他兴奋组织的重要特性，当任何一种刺激作用于神经时，神经元就会比较静息的状态转化为比较活动的状态，这就是神经冲。神经冲动传输的特点是： 1）它传输的是一种生物电脉冲信号，表现为一定的锋电位。锋电位能保持一定的振幅大小，在短时间内不需耗氧供能而不衰减。 2）锋电位具有“全或无”的性质。刺激强度的大小只能影响频率的高低，而不改变锋电位的振幅大小。因而它所传输的信号是一种“数字信号”。具有较好的抗干扰能力。一条神经于包含着许多条神
动物的生殖和发育 基础知识巩固 一、动物的生殖系统 1、组成：、、。 2、演化过程：结构从不完善到、从雌雄同体到。 二、生殖类型： 1、胎生：受精卵在母体（内或外）发育 2、卵生：受精卵在母体（内或外）发育 3、卵胎生：受精卵在母体（内或外）发育，但是发育所需要的营养来自。如田螺和某些昆虫、鱼、蛇、蜥蜴等，是对不良环境长期形成的繁殖方式。 三、受精方式： 1、体内受精：、、、。 2、体外受精：、。 四、动物个体的发育： 1、胚胎发育：从开始到脱离或为止。 2、胚后发育：从脱离或到为止。 五、发育类型： 1、无变态发育：又称，幼体和成体和差异较小。 2、变态发育：又称，幼体和成体和差异较大。 3、变态发育的两种类型、。 4、不完全变态发育的三个时期：、（若虫）、。 5、完全变态发育的四个时期：、、、。 一、昆虫的生殖 雌雄________，________受精，卵生。 二、昆虫的发育
1．昆虫的发育经过了________、________和________三个阶段，而且幼虫和成虫的差别________，这样的发育过程叫做不完全变态。如：蝗虫、蟋蟀、蚱蜢、蝼蛄等的发育就是这种类型。 2.昆虫的发育经过了、、和四个阶段，而且幼虫和成虫的差别，这样的发育过程叫做完全变态。如：菜粉蝶、果蝇、棉铃虫、松毛虫等的发育就是这种类型。 两栖动物的生殖和发育 一、两栖动物的生殖 雌雄_______，_______受精，卵生。受精必须在_______完成。 二、两栖动物的发育 青蛙的发育经过了_______、_______、_______和_______四个阶段，其幼体和成体在外部形态、内部结构和生活习性上都有许多差异，幼体生活在_______，用_______ 呼吸；成体既能生活在水中，也能生活在潮湿的陆地上，主要用______________呼吸。像这样的发育过程属于_____________________。 鸟的生殖和发育 一、鸟的生殖 具有明显的_______性。筑巢后，雄鸟会表现出各种各样的_______行为，如仙鹤跳舞、孔雀开屏等，然后，雌雄鸟交配，精子与卵细胞在_______结合成受精卵。 二、鸟卵的结构 由卵壳、卵壳膜、卵白（功能是____________________________）、气室、系带、卵黄膜、卵黄（功能是______________）、胚盘（内有_______，是_______的部位）组成，其中后三部分结构构成了鸟卵的_______ 。 三、鸟的发育 鸟的受精卵在_______就已经开始发育，产出后，由于外界温度低于亲鸟的体温，胚胎停止发育，需由亲鸟_______才能继续发育。雏鸟可分为两类：像雏鸡一样，孵出时已充分发育的，属于_______；像雏蓝山雀一样，孵出时尚未充分发育、需由亲鸟喂养一段时间的，属于_______。 例题解析
动物进化过程中出现的重大事件及其意义 广二师生物系2012级生物科学本四A班 众所周知，我们今天地球上绚丽的动物世界是经过几亿年的进化而形成的。在这漫长的进化过程中，出现了许多重大事件，每一个都是里程碑式的，它们使动物的进化出现了跨越式发展。接下来让我们以动物演化历程为线索，对这些重大事件及其意义进行一一阐述。 在无脊椎动物中首先出现的重大事件为扁形动物门中两侧对称体型和中胚层的出现。两侧对称体型，即通过动物体的中央轴，只有一个对称面（或说切面）将动物体分成左右相等的两部分，因此，两侧对称也成为左右对称。从动物演化史上看，这种体型主要是由于动物从水中漂浮生活进入到水底爬行生活的结果。这种体型对动物的进化有重要意义。因为凡是两侧对称的动物，其体可明显地分出前后、左右、背腹。体背面发展了保护功能，腹面发展了运动功能，向前的一端总是首先接触新的外界条件，促进了神经系统和感觉器官越来越向体前端集中，逐渐出现了头部，使得动物由不定向运动变为定向运动，使动物的感应更为准确、迅速而有效，使其适应的范围更广泛。两侧对称不仅适于游泳，又适于爬行。从水中爬行才有可能进化到陆地上爬行，是动物由水生发展到陆生的重要条件。 中胚层的出现对动物体结构与机能的进一步发展有很大意义。一方面由于中胚层的形成减轻了内、外胚层的负担，引起了一系列组织、器官、系统的分化，为动物体结构的进一步复杂完备提供了必要的物
质条件，使扁形动物达到了器官系统水平。另一方面，由于中胚层的形成，促进了新陈代谢的加强。比如由中胚层形成复杂的肌肉层，增强了运动机能，再加上两侧对称的体型。使动物有可能在更大的范围内摄取更多的食物。同时由于消化管壁上也有了肌肉，使消化管蠕动的能力也加强了、这些无疑促进了新陈代谢机能的加强，由于代谢机能的加强，所产生的代谢废物也增多了，因此促进了排泄系统的形成。扁形动物开始有了原始的排泄系统——原肾管系。又由于动物运动机能的提高，经常接触变化多端的外界环境，促进了神经系统和感觉器官的进一步发展。扁形动物的神经系统比腔肠动物有了显著地进步，已开始集中为梯型的神经系统。此外，由中胚层所形成的实质组织有储存养料和水分的功能,动物可以耐饥饿以及在某种程度上抗干旱，因此，中胚层的形成也是动物由水生进化到陆生的基本条件之一其次是假体腔动物中假体腔（体腔）与环节动物中真体腔（次生体腔）的出现。假体腔，是动物体腔的一种形式，也是动物进化中最早出现的一种原始的体腔类型，它是由胚胎发育期的囊胚腔持续到成体而形成的体腔，其中充满体腔液，没有体腔膜。假体腔的出现比之于扁形动物的元体腔或实质有着明显的进化意义。首先，它对体内器官系统的自由运动与发展提供了空间；其次，体腔液较之间质能更有效地输送营养物质及代谢产物，以完成循环的机能，体腔液也能调节及维持体内水分的平衡，以维持体内稳定的内环境。此外，体腔液作为一种流体静力骨骼，能使身体更迅速的运动，从而使假体腔动物大多数类群摆脱了以纤毛作为主要的运动器官的状态。总之假体腔的出
细胞培养技术
细胞培养发展史及其应用 （一）前言 20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问题展开了激烈的争论。1907年，美国生物学家哈里森(Harriso n)从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后，在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物细胞培养。 所谓动物细胞培养(亦称组织培养)既有别于植物细胞培养，又与微生物的培养完全不同。所谓动物细胞培养是指离散的动物活细胞在体外人工条件下的生长、增殖过程，在此过程中细胞不再形成组织。 由于动物细胞培养是在人工条件下进行的，便于调控和观察，因而成为现今研究动物的物质代谢过程、染色体的形态变化、以及遗传物质的表达调控等高难领域的既便利而又有效的新方法。同时，随着现代生物化学、分子生物学、分子遗传学、以及现代医学的发展，细胞培养也在许多应用领域充分展示了其巨大的发展潜力，并已为世人所关注。尽管如此，动物细胞培养仍是一门年轻的新学科，在发展之初被混淆于动物组织培养之中。 （二）细胞培养技术及其历史 细胞培养的历史最早可追溯到19 世纪末，据可考证的资料记载W ilhelm Roux是第一个进行动物组织培养实验的人。 1885年Wilhelm Roux 将鸡胚髓板放置于温热盐水中使之维持存活了数天，是有记录的第一个体外移植成功的例子。 1887年Arnold把恺木的木髓碎片接种到蛙的身上。当白细胞侵入这些木髓碎片后，他把这些白细胞收集在盛将盐水的小碟中，接下来观察到这些白细胞在运动，并存活了一个短的时间。
实验十五动物细胞培养技术及其应用 一．实验目的 通过本实验使学生掌握细胞培养、细胞检测和细胞表达等成套技术的原理和方法。 二. 实验内容 1.培养基配制、细胞培养、细胞冻存与复苏等基本技术； 2.细胞生长曲线测定、细胞活性检测等常用技术； 3.细胞污染检测方法与技术； 4.病毒在细胞中的感染与增殖、重组病毒异源蛋白的细胞表达等实用技术。 三．实验用品 1. 材料：Sf 细胞、Hi5 细胞等 2. 器材：CO2培养箱、超净工作台、倒置显微镜、培养基抽滤装置、电泳仪、离心机、pH 计、液氮罐（含液氮）、水浴锅、温度计、培养瓶、血清瓶、5 ml和10 ml 移液 管、不锈钢移液管筒、大小不锈钢饭盒、酒精灯、吸耳球、血球计数板、96孔板、 24孔板、无菌冻存管、离心管、记号笔、一次性过滤器、微量加样器、精密pH 试纸、酒精棉球等 3. 试剂与药品：Grace培养基、胎牛血清、甘油、DMSO、双抗（青霉素、链霉素）100 u/ml、 Hank’s液、胰蛋白酶、台盼蓝、液氮、分析纯无水酒精、95%医用酒精、Tris 碱、硼酸、EDTA、琼脂糖粉（电泳用）、dNTPs、Taq酶、支原体检测试剂盒、 DNA提取试剂盒DNeasy Blood & Tissue kit （Qiagen）等。 四．实验方法与步骤 （一）培养基配制、细胞培养、细胞冻存与复苏 1. 缓冲液及培养基配制 Hank’s液：KH2PO4 0.06g，NaCl 8.0g，NaHCO3 0.35g，KCl 0.4g，葡萄糖1.0g，Na2HPO4·H2O 0.06g，加H2O至 1000ml，高压灭菌。4℃下保存。 胰蛋白酶液： 称取0.25克胰酶蛋白酶（活力为1：250），加入100ml无Ca2+、Mg2+的Hank’s 液溶解，滤器过滤除菌，4℃保存，用前可在37℃下回温。 4%台盼蓝染液：称取台盼蓝4克，加双蒸水至100 ml。 MTT溶液：MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液或无酚红的Hank’s液中。4℃下保存。Grace培养基：取一份GIBCO公司的Grace培养基粉剂，按说明用量加入1000ml三蒸水100单位／毫升青、链霉素，充分混匀使溶解，调节pH值至6.8左右。 0.22 μm 滤膜抽滤除菌，4℃下保存。此为基础培养基。使用前加入10%胎牛 血清。 细胞冻存液：基础培养基加入10%DSMO，20%胎牛血清，用前配制。 PBS缓冲液：137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 8.1 mmol/L Na2HPO4, 1.5 mmol/L KH2PO4,
我们知道，几乎所有的动物都要从水环境或直接从空气中获取O2，同时释放生物氧化代谢产生的CO2，整个过程就是呼吸。 那么这一节，我们要讲的是动物呼吸系统的演化，也就是从单细胞的原生动物到高等的哺乳动物，它们的整个呼吸系统是如何演变的： 首先，我们来看原生动物，它是单细胞生物，所以只能靠细胞膜的表膜通过扩散作用得到O2，排除CO2。然后到多细胞海绵动物，2胚层腔肠动物，最原始的3胚层扁形动物，再到线虫动物，环节动物，由于这些动物个体小、扩散距离短，通过扩散就能满足气体交换的需要，因此，它们都是在体表进行呼吸，即皮肤呼吸。从软体动物开始出现了真正的鳃，水生种类用鳃呼吸，陆生种类用肺直接摄取空气中的氧，这个肺是外套膜内一定区域微血管密集形成的网。节肢动物的呼吸器官就形式多样了，小型节肢动物是靠体表进行气体交换，如水生剑水蚤（zao）、陆生蚜虫；水生种类用鳃（虾、蟹）或书鳃（鲎hou）；陆生种类用书肺（蜘蛛）或气管（昆虫），昆虫的气管是体壁的内陷物，它的外端有气门和外界相通，内端在动物体内不断延伸，一再分支，直接与细胞接触，从而把氧气直接供应给组织。棘皮动物的呼吸系统不是很发达，主要通过皮鳃和管足完成。 那么软体动物的鳃结构、肺结构也好，昆虫的气管结构也好，它们都没有呼吸的动力，气体交换都是靠扩散作用进行。
接下来，我们再来看脊椎动物呼吸系统的情况：首先是水生动物，先来看圆口纲的七鳃鳗，顾名思义，即体表有七个外鳃孔；到软骨鱼一般有五对鳃裂直接裸露在外面；然后到硬骨鱼，出现了覆在鳃裂外面的鳃盖，它只有一个外鳃孔，即水从口进来，然后从外鳃孔出去，而软骨鱼呢，水从口进来，再从每一个鳃裂出去，这是他们的区别之一；那么另外一个区别呢？就是软骨鱼的鳃间隔很发达，尤其是板鳃亚纲，可以直接达到体表，那么到了硬骨鱼，鳃间隔退化，鳃丝直接着生在鳃弓上面。 为了更直观地认识鳃的演化，我们画个简单的模式图：这里是消化道，外面是皮肤，中间是肌肉层，中胚层。消化道向外突起，一直到皮肤这里打通，这就是七鳃鳗的一个鳃了，然后再打通一个，类似地，它就有七个鳃囊形，这是它的内鳃孔、鳃囊、外鳃孔，鳃丝着生在这上面，那中间这个部分叫什么呢？对，是鳃间隔；然后到了硬骨鱼呢，鳃间隔退化，鳃丝直接着生在鳃弓上。 为了看得更清楚一些，我们画另一个侧面的图，这是鳃弓，这是鳃间隔，上面着生鳃丝。中华鲟呢，鳃间隔退化不完全，还残余一点鳃间隔，鳃丝是这样着生的，然后到硬骨鱼，鳃间隔完全退化，鳃丝直接着生在鳃弓上面。这就是水生动物鳃的演变情况。 到了陆生脊椎动物，都是用肺进行气体交换，我们从四个方面来看一下肺的演变： 第一，肺的吸氧面积逐渐扩大 两栖动物的肺是囊状的肺，里面分隔很少，它皮肤的表面积比肺
神经系统的进化 生命可能起源于40亿年前覆盖地球的原始海洋。目前尚不能知道生命的具体发生过程和机制。大约35亿年前出现了DNA分子，形成第一批单细胞生物。DNA是生命的基础。在DNA拷贝过程中，核酸沿螺旋楼梯的顺序可能偶尔会发生错误。这种分子遗传的错误被称为突变。在极少的情况下，这种遗传突变可产生新的DNA序列，并得以生存和复制，于是物种产生了一个新性状。如果这个性状适应环境的改变，则物种得以发展。由于生物进化基本上是所有遗传基因空间中的一种随机游动，所以，进化在时间上是缓慢的，结果是复杂的。 15亿年前真核细胞的出现是生物进化的第二个里程碑。4.4亿年前，远古的节肢动物离开水域来到陆地，揭开生物进化史上新的一页。3.6亿年前,第一批两栖动物离开海洋来到陆地。然后由恐龙到爬行类动物，并进一步衍生出鸟类和哺乳类动物。 1.原生动物门 原生动物是单细胞生物，身体由一个细胞构成，功能由细胞器完成。细胞膜具有一定的反应能力，表现出一定运动性和反应的方向性。刺激可加快随意运动。 2.海绵动物门 海绵动物门是简单多细胞生物。海绵动物水生，身体由简单组合的多细胞构成，没有器官和真正的组织。没有神经系统，接受的刺激从一个细胞传递到另一个细胞，因此感受刺激和反应极缓慢，且只是局部的应答。 3.腔肠动物门 腔肠动物门的动物生活在海水或淡水中，身体辐射对称，开始出现最原始的神经组织。腔肠动物的神经细胞具有多个细长的突起，彼此连接成网，被称为神经网。 ●水螅：神经细胞连接成弥散型的最原始的神经网，机体的反应仍然是“全反应”型， 即神经冲动的传导没有一定的方向性，没有中枢和外周的极性之分，任何一点的刺 激可引发全身性反应。 ●海葵：神经网的突触出现了相对的极性，对神经冲动有了一定的调解作用，表现为 机体对弱冲击出现相应的局部反应，而不是不加区分的“全反应”。神经网络出现 的极性是神经系统发育的第一步。 4.扁形动物门 扁形动物出现神经链，左右对称。乙酰胆碱（Ach）和5-羟色胺(5-HT)作为神经递质出现在扁形动物神经系统中。神经链的前端开始出现头节和脑化。 5.环节动物门 环节动物身体分节，两侧对称，神经系统更趋于集中，头节发达而明显。如蚯蚓，位于食管上的一对神经节愈合成脑，脑再发出其它神经节，神经节呈索状串联，构成索状神经系统。神经节可支配身体局部反应，脑在进食和探索中的作用明显，协调机体与环境的关系。 6.节肢动物门 节肢动物门是动物界第一大门。身体形态结构多样，各个体节发生分化，具有不同结构
动物分子系统发育研究的理论基础及方法 摘要:分子系统学是研究系统发育的重要方法, 其理论基础源于系统学、分类学、比较生物学、分子生物学和进化论, 是基于分子水平上的比较建立分子进化树。目前构建分子系统树的方法有最大简约法、距离矩阵法、最大似然法和贝叶斯法4 种。 关键词:分子系统; 理论基础; 方法; 动物 Abstract:Molecular systematics, theoretically origining from systematics, taxology, genetics, comparative biochemistry, molecular biology and evolutionism, is an important method to study phylogeny, which supports to build molecular tree on the basis of molecules. At present, the ways to build molecular tree are Maximum Parsimony Method, Distance Matrix Methods，Maximum Likelihood and Bayesian Analysis. Key Words:molecular phylogeny; theoretical principle; method; animal 系统发育是指任何分类单元的起源及进化关系。进行系统学研究最困难之处在于系统发育是一个漫长的历史过程, 人们无法完整记录及目睹整个过程, 因此, 初期的系统发育关系的研究, 都是利用与分类单元一起演化的性状及化石等特征的分析比较来推断的。几百年来, 众多的科学家在这个领域进行了广泛而深入的研究, 并且建立起基于化石记录、表型性状和生理性状的系统发育关系。随着分子遗传学理论和技术的迅猛发展, 分子数据开始被引入比较生物学领域的系统发育研究, 并因此形成了一门新的交叉学科——分子系统(发育) 学, 而其所重建的系统发育树又被称为分子树。 分子系统学研究的理论基础 分子系统学是检测、描述并解释生物在分子水平的多样性及其演化规律的科学。它的理论基础来源于系统学、分类学、遗传学、比较生物化学、分子生物学和进化论, 其方法来源于免疫学、仪器分析、生物化学和分子生物学。分子系统学就是以研究生命的普遍性为对象的分子生物学与研究生物多样性的系统学相结合而出现的一个新的生物学分支, 基于在分子水平上的比较建立分子进化树,
神经系统的进化 最简单的神经系统是神经网(nerve nets)。这种神经网是由神经细胞的很细的神经纤维交织而成的(见图)， 它在腔肠动物中广泛存在。刺激作用于机体的某部分所引起的反应可传到刺激点以外一定的距离。如果在短时间内重复刺激则产生易化作用(facilitation)，反应可以传播得更远。在这种神经网中没有发现传导的方向性。传导速度为0.1—1.0米每秒。 许多神经细胞体聚集在一起形成神经节是神经系统进化过程中一个重要的进步(见图)。
神经节在腔肠动物中已有发现，在更高水平的动物中普遍存在。神经节中神经细胞体之间通过轴突的侧支形成多方面的联系(见图)。 在有体节的无脊椎动物中，每一体节都有一个神经节。每个神经节既管本体节的反射机能，也与邻近几节的反射活动有关。一系列的神经节通过神经纤维联系在一起形成神经索。环节动物和节肢动物都有腹神经索(见图)。
神经系统的另一个重要的发展是动物体前部的几个神经节趋向于融合在一起形成“脑”。这些融合在一起的神经节的结构更加复杂，而且对其它神经节有不同程度的控制作用。脑对中枢神经系统后部的优势，部分原因是由于身体前部大量的感受器将感觉输入送至脑内，此外还由于脑内调节中枢的发展。 在进化过程中，神经系统中神经细胞的数目越来越多，章鱼(头足类)的神经系统是无脊椎动物中最发达最复杂的，仅在脑内就约有1亿神经元。脊椎动物神经系统的神经元为数更多，结构更复杂。 脊椎动物中枢神经系统的发育 脊椎动物的中枢神经系统是由外胚层内陷形成的神经管发展而成的(见图)。
在发育的早期，神经管的前端膨大形成三个原始脑泡：前脑(forebrain，prosencephalon)、中脑(midbrain，mesencephalon)和菱脑(hindbrain，rhombencephalon)(见图)。 神经管的其余部分发育成脊髓(spinal cord)。
浅谈神经系统的进化历程 摘要神经系统是随着动物进化而不断进化发展的，可以说动物的进化程度越高，神经系统的分化程度就越高。在不同阶段神经系统都有不同的特点，在进化过程中有几次突跃，最终进化为人类的高级神经系统。人脑是自然界长期进化过程的产物。从没有神经系统的单细胞动物，到脊椎动物复杂的神经系统，再到高度复杂的人脑，经过了上亿年的发展。从原始的感觉神经到具有初步应激反应的网状神经，再到如环节动物门呈节索状串联神经，构成索状神经系统，再进一步进化形成神经管，脊神经，经过大自然物种不断适应环境，出现了大脑的分化和分区。 关键词神经经系统进化神经元脑 无脊椎动物神经系统的发展 一、感觉细胞 1.单细胞生物的刺激感应。 原生动物尚未形成神经系统，但可以对外界刺激做出反应，可趋向有力的刺激而避开有害的刺激，草履虫的刺丝泡遇到刺激时可以释放刺丝。 2.多细胞动物感觉细胞 低等的多细胞动物—海绵，就已经存在一个原始的神经系统，它具有两种类型的神经元，这些神经元之间没有突出的联系，也没有接受感觉和支配运动的机能，因为海绵动物营固着生活，不需要太复杂的神经支配，所以在进一步进化上需要在一定程度上以来动物的生活习性。 二、网状神经 1.无体腔动物 在两胚层的腔肠动物体水母中，以观察到集结性神经元，可以认为在腔肠动物的网状神经系统中开始出现神经成分趋向集中的某些特征。如水螅，它的神经细胞连接成弥散型的最原始的神经网，机体的反应仍然是“全反应”型，即神经冲动的传导没有一定的方向性，没有中枢和外周的极性之分，任何一点的刺激
可引发全身性反应。 2.真体腔动物 典型的软体动物神经系统是由脑、侧、脏、足四队主要神经节和期间的联络神经所构成。但头足类的神经系统发达且集中，由中枢神经、周围神经及交感神经系统三部分组成。中枢神经又分为脑神经节、脏神经节和组神经节。之后，随着胶质细胞的出现而出现中枢神经系统。环节动物的真体腔更为发达，同律分节为重要特征，每一节都一个神经节，这就加快了运动过程中的反应速度。更好地适应情况复杂的陆地环境。环节动物具有较发达的中枢神经系统，每对神经节发出神经到体壁，支配肌肉的收缩活动。 三、脊椎动物的神经系统。 脊椎动物的体形一般是左右对称的，身体分为头部、躯干和尾部三部分，体内背侧有一条脊柱骨，称脊椎，脊椎动物由此得名。脊柱骨内有一条神经管，这是脊椎动物神经系统所具有的统一形式，称脊椎动物神经系统的通型。这种神经系统与无脊椎动物的神经组织的主要区别是：①无脊椎动物的链状、节状神经系统位于动物体内的腹侧、而脊椎动物的管状神经系统位于动物体内的背侧，故又称背式神经系统。背式神经系统的形成是由于脊惟动物的内骨骼代替了无脊椎动物的外骨骼，从而使动物的身体结构复杂化了。身体体积扩大、肌肉发达，也为神经系统的进一步发展提供了条件。②无脊椎动物的神经组织是实心的，脊椎动物的神经组织是空心的。管状空心的神经组织增加了空间和面积，有利于兴奋的传递和神经组织与外界物质的交换，因而使神经系统有可能向更高级和更完善的方向发展。 四、脊神经 脊神经出现于脊索动物门头索动物亚门。简单的神经管居背部，尚未完全封闭。脑和脊髓无明显分化。头部的脑泡发出两对脑神经：嗅神经和视神经。后部的脊髓发出脊神经。管状神经系统的出现为脑的形成准备了条件。在神经管的前端膨大部分首先形成脑泡，随后逐渐发展成为相对独立的五个脑泡：前脑、间脑、中脑、延脑和小脑。两栖动物的前脑已经发展成为两半球。爬行动物开始出现了大脑皮层。大脑皮层的出现是神经系统演化过程的新阶段，它使脑真正成为有机体的一切活动的最高调节者和指挥者。随着神经系统的发展，特别是脑的发展，