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１０６６王长青．等．Ｅ２Ｆ．１基因真核表达载体的构建及其对胃癌细胞株ＭＫＮ．４５增殖的影响
增殖率。细胞增殖率＿Ａ瞟。／Ａｃｏ．向ｘ１００％。
１．７流式细胞仪分析细胞周期
将转染ｐＣＭＶ．Ｅ２Ｆ１．ＨＡ或空载体ｐＣＭＶ．ＨＡ
的ＭＫＮ．４５细胞使用血清剥夺的方式进行同步化
后，收集消化的贴壁细胞，离心后用７０％冷乙醇进
行固定。再次离心后。将细胞重悬在含１００ｍｇ／Ｌ
ＲＮＡ酶和１０ｍｇ／Ｌ碘化丙啶的ＰＢＳ中，用
图２Ｅ２Ｆ．１基因转染后的表达鉴定
ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ流式细胞仪进行单色荧光细胞流式仪
Ｆｉｇｕｒｅ２Ｅ２Ｆ－１ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＣｏｓ．７明ｄＭＫＮ－４５ｃｅｌｌｓａｆｔｅｒ计数，结果用ＭｕｌｔｉｐｌｕｓＳｏｆｌｗｉｒｅ１Ｉ软件分析数据，ｔｍｎｓｆｅｅｔｉｏｎｄｅｔｅｃｔｅｄｂｖＷｅｓｔｅｍｂｌ。ｔ
每个样本采集１００００个细胞。Ｌａｎｅ１：ＣＯＳ．７ｃｅＩｌｓｔｍ。ｓｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈｐＣＭＶ．Ｅ２Ｆ．１．ＨＡｆｏ，４８ｈ；１ａｎｅ１．８统计学处理２：ＭＫＮ一４５ｃｅｌｌｓｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈｐＣＭＶ－Ｅ２Ｆ一１－ＨＡｆｏｒ４８ｈ；ｌａｎｅ３：应用Ｏｒｉｇｉｎ５．０软件进行统计分析，计量资料ｃ０８－７。８１１８
ｔ砌８ｆｅｃｔｅｄｗｉ‘ｈｐＣＭＶ?Ｅ２Ｆ－１－ＨＡｆｏｒ２４ｈ；ｌ”８４：ＭＫＮ－婺袭以均数±霉准差（互±ｓ）表示，以ｔ检验进行统计兰。：：三：：点篙：：茹：篮２４虬ｈ肥５Ⅲ酬琊分析，Ｐ＜Ｏ．０５为差异有统计学意义。
～‘
２结果
２．１真核表达载体ｐＣＭＶ－Ｅ２Ｆ１．ＨＡ构建与转染的鉴定
ｐＣＭＶ．Ｅ２Ｆ１一ＨＡ经＆ＤＲＩ酶切后。得到与预期相符的外源基因Ｅ２Ｆ一１插入片段，长度约为１．３ｋｂ；空载体ｐＣＭＶ—ＨＡ酶切后无此插入片段显示（见图１）。ｐＣＭＶ—Ｅ２Ｆ１．ＨＡ重组质粒瞬时转染ＣＯＳ一７和ＭＫＮ一４５细胞后进行Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测．结果显示ｐＣＭＶ—Ｅ２Ｆ１一ＨＡ重组质粒在ＣＯＳ．７和ＭＫＮ一４５细胞均有表达（见图２）。
图１真核表达载体ｐＣＭＶ．Ｅ２Ｆ１．ＨＡ的酶切鉴定Ｆｉｇｕｒｅ１Ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｖｅｃｔｏｒ
ｐＣＭＶ—Ｅ２Ｆ—ｌ—ＨＡｗｉｔｈＥｃｏＲ
Ｉｄｉｇｅｓｔｉｏｎ
ＬａｎｅＭ：Ｄ１２０００ＤＮＡｍａｒｋｅｒ；ｌａｎｅ１：ｐＣＭＶ—Ｅ２Ｆ一１一ＨＡ：ｌａｎｅ２：ｅｍｐｔｙｖｅｃｔｏｒｐＣＭＶ—ＨＡ．
２．２转染载体对细胞克隆形成的影响
转染ｐＣＭＶ．Ｅ２Ｆ１．ＨＡ的ＭＫＮ－４５细胞形成的克隆数量为４．７±１．８。转染空载体ｐＣＭＶ．ＨＡ的ＭＫＮ．４５细胞形成的克隆数量为３０．２＋６．７。转染ｐＣＭＶ．Ｅ２Ｆ一１一ＨＡ组形成的克隆数明显少于转染空载体组，后者约为前者的７倍，两组间差异有统计学意义（Ｐ＜Ｏ．０１）（见图３）。
图３转染载体后各组ＭＫＮ一４５细胞克隆形成情况
Ｆｉｇｕｒｅ３ＥｆｆｅｃｔｏｆＥ２Ｆ?１ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｎｃｏｌｏｎｙｆｏｒｍａｔｉｏｎ
ｏｆＭＫＮ．４５ｃｅｌｌｓａｆｔｅｒｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ
２．３转染载体对细胞增殖的影响
结果发现．转染ｐＣＭＶ—Ｅ２Ｆ一１．ＨＡ组的细胞较ｐＣＭＶ—ＨＡ组细胞增殖明显减慢，第５、６、７天的增殖率分别为７３．５％、６３．５％和５６．１％，明显少于空载体组（Ｐ＜Ｏ．０１）（见图４），提示Ｅ２Ｆ一１抑制ＭＫＮ一４５细胞的增殖。
２．４转染载体对细胞周期的影响
与转染ｐＣＭＶ—ＨＡ的细胞相比，转染ｐＣＭＶ—Ｅ２Ｆ１一ＨＡ的细胞出现Ｇ。期阻滞（见图５），表现为Ｇ．期细胞增加了１９．６％，Ｓ期细胞减少了３９．１％（Ｐ＜０．０５）。提示Ｅ２Ｆ一１通过Ｇ。期细胞周期阻滞抑
制了细胞增殖。 万方数据
王长青，等．Ｅ２Ｆ．１基因真核表达载体的构建及其对胃癌细胞株ＭＫＮ．４５增殖的影响１０６７
Ｔｉｍｅｓｆ－ｔｅｒｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ㈣ｓ）
图４转染载体后ＭＫＮ－４５细胞增殖情况Ｆｉｇｕｒｅ４ＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆＭＫＮ一４５ｃｅｌｌｓａｆｔｅｒｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ
ｏｆＥ２Ｆ．１
图５流式细胞仪分析转染载体后ＭＮＫ－４５细胞周期分布Ｆｉｇｕｒｅ５ＣｅｌｌｃｙｃｌｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆＭＫＮ一４５ｃｅｌｌｓａｆｔｅｒｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｏｆＥ２Ｆ?ｌａｎａｌｙｚｅｄｂｙｆｌｏｗｃ”ｏｍｅｔｒｙ
３讨论
细胞周期相关转录因子Ｅ２Ｆ。ｌ为１９８６年Ｋｏｖｅｓｄｉ等【ｓ］发现的一个新的细胞内转录因子。Ｅ２Ｆ一１作为重要的细胞周期调控因子，与ｐＲｂ一起参与调控细胞由Ｇ０／Ｇ。期向Ｓ期的过渡。ｐＲｂ与Ｅ２Ｆ．１结合形成复合物．发挥转录抑制因子的作用，并受到细胞周期依赖的磷酸化的调控。在细胞周期的Ｇ。和Ｇ，早期，Ｅ２Ｆ一１通过其特异结合位点与ＤＰ和ｐＲｂ形成复合物；此时，ｐＲｂ未被磷酸化，抑制Ｅ２Ｆ－ｌ的转录活性。在Ｇ，晚期，促有丝分裂生长因子促进ＣｙｃｌｉｎＤ／ｃｄｋ４／６和ＣｙｃｌｉｎＥ／ｃｄｋ２的表达，导致了ｐＲｂ的磷酸化，使Ｅ２Ｆ．１／ＤＰＩ脱离ｐＲｂ，从而启动了ＤＮＡ的生物合成。促进细胞进入ｓ期；在此期间。Ｅ２Ｆ．１的量逐步增加。在Ｓ／Ｇ：晚期时，Ｅ２Ｆ．１诱导的ｐ１４埘表达并最终与Ｅ２Ｆ．１结合，促使Ｅ２Ｆ．１通过蛋白酶途径降解。Ｅ２Ｆ．１上的ｐＲｂ、ｐ１４埘结合位点同处羧基端．ｐＲｂ与Ｅ２Ｆ．１的结合可能抑制ｐ１４脚与Ｅ２Ｆ一１的结合，从而保持Ｅ２Ｆ．１的稳定性，防止Ｅ２Ｆ．１被降解［７－１１］。
我们通过用ｐＣＭＶ．Ｅ２Ｆ．１，ＨＡ表达载体转染胃癌细胞ＭＫＮ．４５，得到过表达Ｅ２Ｆ一１的细胞系。实验结果显示，过表达Ｅ２Ｆ．１能够抑制ＭＫＮ．４５细胞的增殖，阻断细胞周期由Ｇ。向Ｓ期过渡，提示Ｅ２Ｆ．１过表达能抑制肿瘤的发展。另有几个研究报道了Ｅ２Ｆ．１的过表达能够抑制肿瘤细胞的增殖。诱导肿瘤细胞的凋亡【ｌ：。引。
ＣＯＳ．７细胞是Ｇｌｕｚｍａｎ博士利用编码野生型大Ｔ抗原的复制起点缺失的ＳＶ４０突变病毒，转化允许ＳＶ４０裂解性生长的非洲绿猴肾ＣＶ一１细胞得到的转化细胞系［１６１。ＣＯＳ．７细胞是一种有效的真核瞬时表达宿主，可高水平表达外源基因，证明以各种途径分离的ｃＤＮＡ片段或基因片段是否具有编码某种活性蛋白质的功能。本实验用ＣＯＳ一７细胞鉴定成功构建了真核表达载体ｐＣＭＶ．Ｅ２Ｆ一１一ＨＡ。
在我们的实验中。Ｅ２Ｆ．１过表达抑制了肿瘤细胞增殖，表现为细胞周期阻滞和细胞活力减低，其中的分子机制现在还未明确。近来的研究显示，Ｅ２Ｆ．１不仅参与细胞周期阻滞、细胞凋亡和细胞分化。而且通过一种依赖Ｅ２Ｆ的自身反馈调节机制调节转录活动。抑癌蛋白ｐ１４脚在正常细胞中低表达．在多种肿瘤细胞中高表达，能够抑制肿瘤细胞增殖。ｐ１４埘又是Ｅ２Ｆ一１的靶基因，Ｅ２Ｆ．１可以直接作用于ｐ１４埘的启动子，调节ｐ１４脚基因转录，促进ｐ１４脚蛋白表达；ｐ１４埘蛋白在细胞周期中可以促进游离的Ｅ２Ｆ．１降解．能够负性反馈调节Ｅ２Ｆ一１。防止Ｅ２Ｆ一１异常积聚和／或避免高Ｅ２Ｆ．１活性。抑制Ｅ２Ｆ．１介导的转录［７－１１］。Ｈａｙａｓｈｉ等［１７］发现。ＣＤＣＡ４（一种Ｅ２Ｆ．１诱导的核因子）首先因Ｅ２Ｆ．１诱导而表达，然后再反过来抑制依赖Ｅ２Ｆ．１的转录的激活，因而在ＣＤＣＡ４与Ｅ２Ｆ．１之间形成了一个负反馈调节循环。ｍｉＲ．２０ａ是ｍｉＲ．１７．９２簇中的一员，有抗细胞凋亡的作用。Ｓｙｌｖｅｓｔｒｅ等Ｄ８１研究发现。Ｅ２Ｆ．１可以诱导并激活ｍｉＲ一２０ａ转录．而ｍｉＲ．２０ａ则能够抑制Ｅ２Ｆ一１ｍＲＮＡ的翻译。因此，ｐ１４埘、ＣＤＣＡ４和ｍｉＲ．２０等能够通过与Ｅ２Ｆ—ｌ之间的反馈抑制循环，调控依赖Ｅ２Ｆ一１的转录激活。并进而在细胞增殖中扮演重要角色。这种依赖Ｅ２Ｆ．１的负反馈调节能够创造出一种可靠的避免细胞内高Ｅ２Ｆ一１活性和／或Ｅ２Ｆ一１异常积聚的机制。我们实验中细胞增殖抑制、细胞Ｇ。期阻滞的原因，可能为
万方数据
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E2F-1基因真核表达载体的构建及其对胃癌细胞株MKN-45增殖
的影响
作者：王长青， 肖强， 李雷， 谢玉波， 谭宁， 宫志伟， WANG Chang-Qing， XIAO Qiang，LI Lei， XIE Yu-Bo， TAN Ning， GONG Zhi-Wei
作者单位：王长青,肖强,李雷,谭宁,宫志伟,WANG Chang-Qing,XIAO Qiang,LI Lei,TAN Ning,GONG Zhi-Wei(广西医科大学第一附属医院胃肠腺体外科,广西,南宁,530027)， 谢玉波,XIE Yu-
Bo(广西医科大学第一附属医院麻醉科,广西,南宁,530027)
刊名：
癌症
英文刊名：CHINESE JOURNAL OF CANCER
年，卷(期)：2007,26(10)
被引用次数：4次
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引证文献(4条)
1.严林海.李雷.谢玉波.肖强.王长青E2F-1过表达对胃癌细胞凋亡及相关基因表达的影响[期刊论文]-癌症
2009(11)
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3.钱倩.李雷.王晓通.苑汐子.谢玉波.肖强E2F-1基因反转录病毒载体的构建及其对人胃癌细胞MGC-803增殖的影响[期刊论文]-肿瘤 2010(5)
4.高晓宁.于力转录因子E2F1调控KIR3DL1基因表达的分子机制[期刊论文]-中华血液学杂志 2008(12)
引用本文格式：王长青.肖强.李雷.谢玉波.谭宁.宫志伟.WANG Chang-Qing.XIAO Qiang.LI Lei.XIE Yu-Bo.TAN Ning.GONG Zhi-Wei E2F-1基因真核表达载体的构建及其对胃癌细胞株MKN-45增殖的影响[期刊论文]-癌症
2007(10)