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第８期李娟，等：ｍｉｃｒｏＲＮＡ检测方法的研究进展１２３５
高，这些特点使对ｍｉＲＮＡ的检测完全不同于传
统的ＲＮＡ（ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ等）检测。目前，对于
ｍｉＲＮＡ检测主要方法有Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ和ＰＣＲ
和芯片检测，在这３种技术的基础上，又有了新的
改进与发展。
ｌＮｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交检测
Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ是目前ｍｉＲＮＡ检测中最常用
的方法［１３ｌ，许多实验都将其视为半定量检测方
法。它的基本原理为凝胶电泳将总ＲＮＡ样品进
行分离，使用电转等方法将ｍｉＲＮＡ转移并固定
到特殊的膜上，通过靶ｍｉＲＮＡ与特异的探针杂
交，对其进行检测。
Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ独特优势在于可以同时显示被检测的ｍｉＲＮＡ的相对分子质量和丰度２个方面的信息，但是它的缺点也是很明显的。首先，因其步骤繁琐，做一次反应持续的时问特别长，需要耗费大量的精力。其次，为了提高灵敏度，与ＲＮＡ杂交的特异性探针都是放射性元素标记的，这增加了实验的危险性。值得注意的是，ｍｉＲＮＡ中包含许多同族序列，它们彼此间非常相似，有些甚至只有单个碱基的差别。基于杂交技术的Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ，无法区别这种碱基相差很小的同族ｍｉＲＮＡ序列。针对这些缺点，人们对Ｎｏｒｔｈ－ｅｒｎｂｌｏｔ技术不断改进，如用地高辛代替３２Ｐ进行标记，提高了试验的安全性［１４』，使用锁核酸（１０ｃｋｅｄｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ，简称ＬＮＡ）掺杂的探针提高杂交的特异性等［Ｊ５｜。但是，这些都需要相对较高的样品量，而ｍｉＲＮＡ在细胞中的表达水平比较低，一些含量较低的ｍｉＲＮＡ无法用Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ检测。
２实时荧光定量ＰＣＲ检测
实时荧光定量ＰＣＲ（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ）技术，指在ＰＣＲ反应体系中加入荧光基团，通过对ＰＣＲ扩增反应中每一个循环产生的荧光信号进行实时检测，进而实现对起始的未知含量的模板定量及定性分析的方法［１６］。
实时荧光定量ＰＣＲ对ＲＮＡ检测灵敏度非常高，可以达到单分子检测能力。但是ｍｉＲＮＡ非常小，其２０～２５个核苷酸的长度相当于ＰＣＲ引物的长度，需要特殊的设计，这给用ＲＴ－ＰＣＲ检测ｍｉＲＮＡ带来很大的困难。
利用加长引物反转录ＰＣＲ检测ｍｉＲＮＡ，如图１所示。
图ｌ利用加长引物反转录ＰＣＲ检测ｍｉＲＮＡ
在用Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅＰＣＲ检测ｍｉＲＮＡ时，用加尾法对其延长从而实现检测。常用的加尾法有２种：一种是通过末端转移酶在ｍｉＲＮＡ分子的３’末端加上Ｐｏｌｙ－Ａ尾巴［１７ｌ，用３０～４０个核苷酸的Ｏｌｉｇ－ｄＴ作为引物进行反转录得到被延长的ｅＤＮＡ，可以使用ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ进行实时定量ＰＣＲ检测；另一种是直接使用与ｍｉＲＮＡ末端配对的加长引物反转录成ｅＤＮＡ，而后使用ＬＮＡ修饰的引物对ｅＤＮＡ进行Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣ｜Ｒ【１８］（如图ｌｂ所示）。
加尾法操作简单，但是也有缺点。线性引物反转录虽然延长了ｅＤＮＡ，但是降低了模板的特异性，从而增大了ＰＣＲ引物设计的困难度。对此，文献［１９３设计了利用茎环加尾ＲＴ－ＰＣＲ方法克服了此缺点，具体过程如图１ａ所示。茎环探针作为引物与ｍｉＲＮＡ杂交进行反转录，不与茎环配对的ｍｉＲＮＡ无法反转录，这是第一步的特异筛选。随之进行的Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ中，没有使用容易造成引物二聚体污染ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ做为荧光检测信号，而是使用与靶序列特异杂交的ＬＮＡ掺杂的ＴａｑＭａｎ探针进行检测，大大提高了检测的特异性与灵敏度，最高可以达到ｌｏ个ｍｉＲＮＡ水平。
在检测单条ｍｉＲＮＡ的基础上，同时将３８４个ｍｉＲＮＡ茎环引物加入到检测样品中，对３８４个ｍｉＲＮＡ样品进行检测，实现了ｍｉＲＮＡ的ＲＴ－ＰＣＲ较大通量检测Ｌ２０。，该技术目前已经被ＡＢＩ公司商品化。
Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅＰＣＲ具有高特异性高灵敏度的优点，虽然能够实现３００多个ｍｉＲＮＡ样品同时检
测，但在ｍｉＲＮＡ的筛选中，往往需要同时对几千
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１２３８合肥工业大学学报（自然科学版）第３３卷
后，加入ＤＮＡ连接酶连接，跑胶显影检测如图３所示。
圈３基于Ｔ４ＤＮＡ连接酶检测ｍｉＲＮＡ原理圈
此方法利用ＤＮＡ链接酶只有在靶ｍｉＲＮＡ与桥连ＤＮＡ链完全配对时才能进行连接的特性，跑胶显影时只能够看到１条大于标记ＤＮＡ链的长链，而当没有靶ｍｉＲＮＡ时，ＤＮＡ连接酶无法工作，只能观察到标记ＤＮＡ，提高了特异性。在实验中无需对ｍｉＲＮＡ进行任何处理，避免了实验过程中的交叉污染，并且使操作变得非常简单，虽然没有进行后续的放大，但是最高能从０．１肛ｇ的总ＲＮＡ中检测出目标ｍｉＲＮＡ，比Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ提高了近１０００倍。
利用Ｔ４ＤＮＡ连接酶的连接特异性，文献［３５３将Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接与目标ｍｉＲＮＡ互补的ＤＮＡ探针，与Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅＰＣＲ结合起来，实现了对ｍｉＲＮＡ的检测。
在连接过程中，ＤＮＡ探针与ｍｉＲＮＡ互补配对部分使用了茎环结构设计，高温下茎环结构打开与目标ｍｉＲＮＡ配对，在１６℃连接温度下，没有与ｍｉＲＮＡ配对的游离ＤＮＡ探针恢复成茎环结构，有效地抑制游离探针的自连，为下一步Ｒｅ．ａｂｔｉｍｅＰＣＲ的放大过程大大地降低了检测信号的背景噪音。
５利用新一代测序技术检测ｍｉＲＮＡ
第一代测序方法（ｓａｎｇｅｒ测序）需要大量的实验样本并且对所测目标的序列长度有所要求，新一代测序技术克服了它的缺点，并且能够轻松检测ｍｉＲＮＡ。
新一代测序技术以罗氏公司的４５４测序、ｉ１一ｌｕｍｉｎａ公司的Ｓｏｌｅｘａ基因组测序平台为代表。２种方法在对ｍｉＲＮＡ分子进行测序时，都是在其两端分别连接接头，不同的是在接下来的步骤中，４５４技术［３６］将连接得到的每一条片段分别与一个珠子结合，使珠子在含有ＰＣＲ反应体系的油滴中进行独立扩增。对珠子中的双链ＤＮＡ变性，变性得到的带有单链ＤＮＡ的珠子加入到排列有微升级小孔的检测板中，对珠子上片段进行基于焦磷酸盐的测序。Ｓｏｌａｘｅ技术［３７］是将连接片段与表面带有单链引物的芯片结合，使用桥式扩增得到大量的簇群，最后加入引物、ＤＮＡ聚合酶以及４种标记的染料应用边扩增边测序的原理对序列进行测序。
新一代的测序技术因ｍｉＲＮＡ的序列长度与高通量测序的长度相当，使其在测序中充分利用。它轻易地解决了芯片技术在检测ｍｉＲＮＡ时遇到的序列短、同源性高的难题，通过统计每个基因的测序频数从而计算出ｍｉＲＮＡ的表达含量［３８，３９］，能够对低至１００ｎｇ的样品进行超高通量的检测，并且通过生物信息学方法预测新的候选ｍｉＲＮＡＥ４０。。
除了以上的方法，文献Ｅ４１］利用共聚焦光学显微镜实现了ｍｉＲＮＡ单分子检测；在使用荧光染料对所检测的ｍｉＲＮＡ进行放大时，除了传统的Ｃｙ３、Ｃｙ５等荧光染料，人们又发现了量子点（ｑｕａｎｔｕｍｄｏｔ，简称Ｑｄｏｔ），量子点因其强荧光强度、稳定耐光、激发光谱广及发射光谱窄的优点，被应用到ｍｉＲＮＡ的检测当中［４２Ｉ。
６结束语
人们对于ｍｉＲＮＡ的研究处于一个不断探索的阶段，但是各种检测方法的出现对ｍｉＲＮＡ的深入研究起到了很大的推动作用，人们也在不断地研究出更适合ｍｉＲＮＡ的检测方法。如何进一步提高灵敏度、增强安全性、减少操作的烦琐程度以及降低实验的成本，是各种检测方法最终的追求目标。在上述介绍的方法中，每个都有其鲜明的优势，但是也有着无法克服的缺点，一种方法往往不会很准确，常常需要多种方法综合应用。随着各种新材料与产品的出现，以及对ｍｉＲＮＡ研究的不断深入，相信会有更多、更准确、更方便的
方法被研发，更好地推动ｍｉＲＮＡ检测的发展。万方数据
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microRNA检测方法的研究进展
作者：李娟， 王翔， 张有光， LI Juan， WANG Xiang， ZHANG You-guang
作者单位：北京航空航天大学,电子信息工程学院,北京,100191
刊名：
合肥工业大学学报（自然科学版）
英文刊名：JOURNAL OF HEFEI UNIVERSITY OF TECHNOLOGY(NATURAL SCIENCE)
年，卷(期)：2010，33(8)
被引用次数：0次
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下载时间：2011年2月18日