4-toluidine p-toluidine
1 。称取TMB １７．２mg(固体），加ＤＭＳＯ１ml 溶解，然后加醋酸钠缓冲液（０．１ｍｏｌ／ｌ，ｐＨ５．５）６６ml，此为底物A 底物B ,取双蒸水100ml，加３０％H2O2１７微升 使用时A：B 液等体积混匀即可． 称取TMB 20mg(固体），先用无水乙醇10ml 溶解，充分振荡（试剂瓶要干净，干燥），加双蒸水定容到100 ml，此为底物A 底物B ,取1水柠檬酸 2.1g，无水Na2HPO4 2.82g，0.75%的过氧化氢尿素0.64ml，双蒸水定容至100ml(无须调PH值，应在4.5-5.0范围。 使用时A：B 各取5ml 混匀，可用于一块96孔板显色。 过氧化氢脲比H2O2稳定，不必如H2O2现用现配，都起供氢体的作用。 2 TMB(10mg/5ml无水l乙醇) 0.5ml 底物缓冲液10ml 0.75%过氧化氢32ul 底物缓冲液: 0.2M磷酸氢二钠25.7ml 0.1M柠檬酸24.3ml 加蒸馏水50ml TMB使用液： TMB （10mg/5ml，无水乙醇）0.5ml 底物缓冲液10ml 0.75% H2O2 32 Ul 3. TMB加入2.5ml无水酒精中,可加热至37℃～40℃直到TMB完全溶解。 将TMB配成1%浓度，4 ℃保存半年以内使用。 使用前，用pH5.0磷酸—柠檬酸底物液9.9ml加入0.1ml（1mgTMB）1%TMB液，再按每毫升TMB加入30% H2O21ul混匀后立即使用。 2NH2SO4终止后，450nm测定OD值。 4. HRP的底物： A液：0.02%H2O2 ；用0.1M柠檬酸-0.2M磷酸氢二钠，PH4.5～5.0稀释。 B液：TMB-HCl：0.4‰；用50mM柠檬酸钠，浓HCl调PH值为2.8的溶液溶解。 A液，B液各50ul使用。可使用起来显色比较缓慢，OD值较PIERCE的底物稍偏低一点。 5. 1、TMB粉末，溶于N，N－二甲基甲酰胺，配成10mg/mL。 2、底物缓冲液：0.2Mol/LNa2HPO4 25.7mL 0.1Mol/L柠檬酸24.3mL 水50mL 3、H2O2 用时10mg/mL TMB 165uL 底物缓冲液11mL
https://www.doczj.com/doc/e617088138.html,/techniquezones/66 抗体稀释液和ELISA相关溶液的配制 1、抗体或免疫球蛋白稀释液0.01mol/L pH7.2PBS NaH2PO4·2H2O 0.39克 Na2HPO4 1.27克 NaCl 0.85克 NaN3 200mg H2O（蒸馏水）至1000ml 2、ELISA洗液及HRP标记抗体稀释液pH7.4，PBST NaCl 2.0克 KH2PO4 0.2克 Na2HPO4·12H2O 2.9克 KCl 0.2克 NaN3 0.2克 H2O 至1000ml 吐温（Tween）20 0.5ml 4°C保存备用 3、包被液（简称CB）pH9.6 Na2CO3 1.59克NaHCO3 2.93克 NaN3 0.2克 H2O 至1000ml 密封盖好，4°C存放备用 4、ELISA底物液（可溶性底物） 磷酸-柠檬酸缓冲液pH5.0 0.1mol/L柠檬酸（21.014克/100ml) 24.3ml 0.2mol/L Na2 HPO4（28.4克/1000ml) 25.7ml H2O 50ml 4°C存放备用 5、DAB底物液（不溶性底物，组化病理等）
0.05mol/L pH7.6 Tris-HCL Tris 6.05克 HCL(36%) 3.15克（约2.7ml浓HCL） H2O 至1000ml DAB为3′，3′二氧基联苯胺，不溶性底物，呈棕红色 6、DAB溶液配制：（组化及Western blot 显色） 称DAB30mg，用0.05mol/L pH7.6Trs-HCL缓冲液100ml溶解,如有沉淀，过滤后使用，一般新鲜配制使用。用前加入1%H2O2 1-1.5ml,H2O2浓度为0.01%，混均后使用。 7、3′，3′，5′，5′，-四甲基联苯胺（TMB）溶液配制： 用二甲基甲酰胺（dimethylformamide，DMF)或无水乙醇，将TMB配成1%浓度，4°C保存半年以内使用。使用前，用pH5.0磷酸-柠檬酸底物液9.9ml加入0.1ml(1mg/TMB)1%TMB液，再按每毫升TMB加入30%的H2O2 1ul，混匀后立即使用。2N H2SO4终止后，450nm测定OD值。 8、1%离子琼脂胶配制液 作免疫双相扩散，单相扩散及免疫电泳中使用。 0.05UpH8.6巴比妥钠-HCL缓冲液 巴比妥钠23.8克 1mol/L HCL 34.5ml H2O 2150ml
Elisa 相关试剂的配制 1、抗体或免疫球蛋白稀释液0.01mol/L pH7.2PBS NaH2PO4·2H2O——0.39克；Na2HPO4——1.27克；NaCl——0.85克；NaN3——200 mg；H2O（蒸馏水）至1000ml 2、ELISA洗液及HRP标记抗体稀释液PH7.4，PBST NaCl——2.0克；KH2PO4——0.2克；Na2HPO4·12H2O——2.9克；KCl——0.2克；NaN3——0.2克；H2O至1000ml 吐温（Tween）20 0.5ml； 4°C保存备用 3、包被液（简称CB）pH9.6 Na2CO3——1.59克；NaHCO3——2.93克；NaN3——0.2克；H2O至1000ml 密封盖好，4°C存放备用 4、ELISA底物液（可溶性底物） 磷酸-柠檬酸缓冲液pH5.0 0.1mol/L柠檬酸（21.014克/100ML）——24.3ml；0.2mol/L Na2 HPO4（28.4克/L)——25.7ml；H2O ——50ml； 4°C存放备用 5、DAB底物液（不溶性底物，组化病理等）0.05mol/L pH7.6 tris-HCL Tris——6.05克；HCL(36%)——3.15克（约2.7ml浓HCL）；H2O 至1000ml DAB为3′，3′二氧基联苯胺，不溶性底物，呈棕红色 ELISA试剂配制及实验流程 是酶联接免疫吸附剂测定(( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。以双抗体夹心法举例说明。 试剂配制： (1) 包被缓冲液(PH9.6 +0.2 0.05M碳酸盐缓冲液)： Na2CO3——1.59g ;NaHCO3 ——2.93g ；加蒸馏水至1000ml。（用时稀释成1x，加0.1%BSA） (2)洗涤缓冲液(PH7.4 0.15M PBST)：0.05%Tween-20——0.5ml；加在PBS缓冲液1000ml 中。PBS缓冲液： KH2PO4——0.2g ；Na2PO4·12H2O——2.9g ；NaCl——8g ；KCl——0.2g；加蒸馏水至1000ml。 (3)封闭缓冲液：牛血清白蛋白(BSA)2%——2g ；（或5%脱脂奶粉）加洗涤缓冲液100ml。(4）稀释液：牛血清白蛋白 0.1 % ——0.1g ；加PBS 缓冲液100ml。 (5）底物缓冲液（PH5.0）：0.2M Na2HPO4(无水28.4g/L，带12结晶水71.7g/L) 取25.7ml 0.1M 柠檬酸(无水19.2g/L，带1结晶水21.01g/L)取24.3ml；加蒸馏水至100ml。 (或Na2HPO4·12H2O——1.84g ；柠檬酸·H2O ——0.51g 加蒸馏水至100ml) (6)TMB(四甲基联苯胺)显色液（显蓝色）：TMB(2mg/ml水)——0.05ml；底物缓冲液——0.95ml； 30% H2O2 ——0.001ml ；总体积1ml。 (7) 或配OPD(邻苯二胺)显色液（显黄棕色）（现配避光）：OPD（干粉）——0.004g ；底物缓冲液——10ml ；30% H2O2 ——0.015ml ；总体积——10ml。 (8)终止液(2M H2SO4)：在178.3ml水中，逐滴加入浓硫酸(18M，约98%)21.7ml，边加边摇。操作步骤： 1. 包被：用包被液将抗体（一抗）稀释至蛋白质含量为1~10μg/ml。在每板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜（或37℃温育2~3小时）。次日，弃去孔内溶 液，用洗涤液冲洗3次，中间振荡。(简称洗涤，下同)。 2. 封闭：加0.3ml封闭液于上述已包被之反应孔中，置37℃温育2小时。然后洗涤3次
3 , 3 ′, 5 , 5 ′-四甲基联苯胺| 54827-17-7|显现法及应用注意事项 摘要：血手印是有色的手印,经常出现于杀人、抢劫、强奸等重特大暴力性案件中,通常情况下清晰的血手印是无须再行显现处理的,但有些潜血手印则需要进行处理,增强反差和显现。实际工作中我们常用的是四甲基联苯胺。 关键词：3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB），3 , 3 ′, 5 , 5 ′- 四甲基联苯胺显现法，应用注意事项 前言 3,3′,5,5′-四甲基联苯胺，白色或浅黄色结晶，熔点168.0-171.0℃，CAS：54827-17-7，[1]是一种新型安全的色原试剂,与传统的色原试剂如联苯胺、邻联甲苯胺及邻苯二胺等相比较,具有检测灵敏度高、稳定性好等优点,而且使用安全,无致癌、致突变作用。目前3,3′,5,5′-四甲基联苯胺已在逐步取代强致癌物联苯胺和其他致癌性的联苯胺衍生物,应用于临床化验、法医检验、刑事侦破及环境监测领域。尤其在临床生化检验方面,3,3′,5,5′-四甲基联苯胺作为过氧化酶的新底物,在酶免疫分析法(EIA)和酶联免疫吸附检验法(ELISA)中获得了广泛的应用。 1 3 , 3 ′, 5 , 5 ′- 四甲基联苯胺显现法[2] 刑事案件现场上经常遇到因盗窃、强奸、抢劫、绑架等原因发生的行凶杀人案, 在这些手段残忍、性质恶劣、影响极坏的杀人命案中, 在被害人的常用品、衣物、周围环境以及作案工具上经常会遗留下犯罪嫌疑人的血手印或潜血手印,这就给我们在现场勘查中提取血手印提供了可能。近年来, 各地在重、特大案件现场进行潜血手印的显现处理时, 都普遍采用了低毒安全的四甲基联苯胺显现法。 通常我们大都采用无水乙醇作为溶剂配制四甲基联苯胺显现液, 通常的配方为: 甲液: 四甲基联苯胺1- 1.2g, 无水乙醇100ml; 乙液: 3%过氧化氢(H2O2)。配制浓度: 甲: 乙= 5: 1, 即甲液100ml, 乙液20ml。对渗透性客体显现前, 如各种纺织品、本色木、浅色纸张等物体上的潜血手印, 传统的操作是在疑有潜血手印的部位用无水乙醇多次固定, 然后用四甲基联苯胺显现液进行显现, 但是在实际操作中经常发现显现出的手印只有轮廓, 纹线模糊不清等现象, 显现效果不够理想。笔者经反复试验摸索, 发现用无水甲醇替代无水乙醇对潜血手印进行固定, 改进潜血手印的固定剂, 显现效果较好。这种方法经多次验证, 与传统固定剂无水乙醇相比, 用无水甲醇固定显现出的手印有纹线清晰、不易扩散等优点。 ( 一) 无水甲醇是一种蛋白质变性剂, 且易挥发, 可使潜血手印中蛋白质快速凝固变性, 减少药液与潜血手印作用时间, 避免长时间浸泡使潜血手印扩散而造成显出的手印模糊不清, 同时提高手印显现速度, 并易于操作, 适合在实际工作中应用。 ( 二) 过氧化氢极易挥发, 所以新购的过氧化氢配制药液时的浓度可小些, 放置很久的过氧化氢配制药液时的浓度可大些。同时, 其浓度的大小要按检材上的潜血部位血清的多少与承痕体的性质而定。一般来说, 渗透性的客体使用过氧化氢溶液的浓度要小些, 非渗透性客体使用的过氧化氢溶液浓度要大些。 ( 三) 在显现出手印的部位, 往往潜血血痕较多, 影响显出手印的反差。直接拍照有时得不到满意效果, 可采用透明胶带纸直接沾取, 贴于光滑的白纸上, 使手印反差增大。 ( 四) 对于尸体皮肤显出的潜血手印, 用直接照相方法固定提取。潜血手印底色有影响时,往往是反差小, 效果差, 而且, 拍照常常受到现场环境的影响, 极不方便。用透明胶纸沾取后,贴于光滑白纸上, 可以减轻手印底色影响, 增大反差。但用透明胶纸提取时, 必须要等显现出的手印处的皮肤干燥后, 方可使用, 且在沾取时,要防止皮肤伸缩变形, 影响特征。 2 应用四甲基联苯胺应注意的两个问题[3] (一)要注意区别血手印是人血还是动物血形成 四甲基联苯胺的反应原理是利用血液中含有的过氧化氢酶和血卟啉,而动物血和人血一样,都
使用的TMB配方： TMB储备液：60mgTMB溶于10mL DMSO 柠檬酸0.1M 磷酸氢二钠0.2M 显色液： TMB储备液：0.125ml 柠檬酸：2.5ml 磷酸氢二钠：2.5ml 二次水：5ml 30%双氧水：0.005ml 其他： 这个配方不好。推荐你用这个配方：B液配的时候要充分搅拌，大约三四个小时，避光。 底物显色液A液： 醋酸钠13.6g 柠檬酸1.6g H2O2（30%）0.3ml dH2O 至500ml 底物显色液B液（避光保存）： EDTA-Na 0.2g 柠檬酸0.95g 甘油50ml TMB(四甲基联苯胺) （用DMSO溶解为10mg/ml后在加）0.2g dH2O 至500ml 如果这个配方还不好，你可以试试下列配方： 1 。称取TMB １７．２mg(固体），加ＤＭＳＯ１ml 溶解，然后加醋酸钠缓冲液（０．１ｍｏｌ／ｌ，ｐＨ５．５）６６ml，此为底物A 底物B ,取双蒸水100ml，加３０％H2O2１７微升 使用时A：B 液等体积混匀即可． 称取TMB 20mg(固体），先用无水乙醇10ml 溶解，充分振荡（试剂瓶要干净，干燥），加双蒸水定容到100 ml，此为底物A 底物B ,取1水柠檬酸 2.1g，无水Na2HPO4 2.82g，0.75%的过氧化氢尿素0.64ml，双蒸水定容至100ml(无须调PH值，应在4.5-5.0范围。 使用时A：B 各取5ml 混匀，可用于一块96孔板显色。 过氧化氢脲比H2O2稳定，不必如H2O2现用现配，都起供氢体的作用。 2 TMB(10mg/5m无水l乙醇) 0.5ml 底物缓冲液10ml 0.75%过氧化氢32ul 这样的配方已经很好,为什么要用尿素?
试验抗日本血吸虫卵黄抗体的制备与鉴定 材料与方法 1.1主要试剂 正辛酸天津市弗晨化学试剂厂批号200101（分析纯） 硫酸铵天津市四通化工厂（分析纯） 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）Amresco批号T2007/10 二甲基亚砜（DMSO）郑州化学试剂厂批号20030224 十二烷基磺酸（SDS）北京鼎国生物技术公司Sigma进口分装L5750 丙烯酰胺沃德赛斯生物技术有限公司Sigma进口分装A8887 羊抗鸡IgY（FITC标记）Promega公司 低分子量标准蛋白质中科院上海生物化学研究所 DAB Amresco C069 DTT Genview DH116-2 1.2 试剂的配制 1.2.1 提取蛋白用试剂的配制 （1）饱和硫酸铵溶液 (NH4)2SO4760g， 蒸馏水（50～80℃）1000mL 搅拌溶解20分钟，趁热过滤冷却后以浓氨水（NH3·H2O）调PH至7.0～7.4，配制好的饱和硫酸铵置4℃处置30 min以上，瓶底应有结晶析出，用时应置室温平衡后再用。 （2）醋酸缓冲液（0.06M,pH4.8） 醋酸钠 4.082g 冰乙酸 1.815g（约1.7 mL ） 1.2.1 ELISA用试剂 （1）包被液（0.05M pH9.6 碳酸钠缓冲液） 无水Na2CO3 1.59g NaHCO3 2.93g 蒸馏水加至1000 mL （2）洗涤液（0.01M pH7.4 磷酸盐缓冲液）PBST
NaCL 8.0g KCL 0.2g KH2PO4 0.2g Na2HPO4?12H2O 2.9g 吐温-20 0.5mL 蒸馏水加至1000 mL （3）封闭液（1% BSA－PBST） 牛血清白蛋白（BSA）1g 洗涤液PBST 100mL （4）底物缓冲液（pH5.0 柠檬酸-磷酸缓冲液） 0.1M柠檬酸(19.2g/L) 24.3mL 0.2M Na2HPO4 (28.4g/L) 25.7mL 蒸馏水50mL （5）TMB底物使用液 TMB储存液（100mg溶于 10mLDMSO,4℃保存）100μL 底物缓冲液10mL 30%H2O2 10μL （临用新鲜配制） （6）终止液（2M H2SO4） H2SO4（96%）22.2mL 蒸馏水177.8mL 1.2.3 SDS-PAGE电泳用试剂 (1)10%（w/v）SDS溶液 十二烷基硫酸钠（SDS）10g 蒸馏水100mL （室温保存） (2)10%（w/v）过硫酸铵（AP） 过硫酸铵1g 蒸馏水10mL （临用前新鲜配制, 4℃保存＜1周）