阿司匹林原料和制剂在体及体外含量测定方法
蓝星宇药学1101 31104026
摘要阿司匹林,又名：2-(乙酰氧基)苯甲酸或乙酰水酸，是一种历史悠久，应用最早，最广和最普通的解热阵痛药。诞生于1899年3月6日。用于治感冒、发热、头痛、牙痛、关节痛、风湿病，还能抑制血小板聚集，用于预防和治疗缺血性、心绞痛、心肺梗塞、脑血栓形成，也可提高植物的出芽率，应用于血管形成术及旁路移植术也有效。中国药典（2010版）中阿司匹林原料药及其制剂的含量测定采用酸、碱滴定法，而近几十年来，随着色谱技术、光谱技术、电泳技术等的飞快发展，阿司匹林的含量测定方法有了突破与发展。该文主要分析阿司匹林原料及以阿司匹林为主药的多种制剂在体和体外的含量测定方法
关键词阿司匹林含量测定制剂
正文
1.阿司匹林原料药在体含量测定方法
反相高效液相色谱法
①色谱条件：填充剂十八烷基硅烷键合硅胶（5um）；色谱柱4.6mm×150mm；流动相甲醇-水-正丁醇-磷酸（300:200:10:0.05）；检测波长237nm；柱温：室温。
②对照品溶液制备：精密称取阿司匹林对照品适量，加甲醇溶解并制成浓度分别为0.5mg/ml
③样品处理：
取血清样品0.1ml，置于1.5ml具塞离心管中，加入50ul高氯酸（30%），再加不同浓度的阿司匹林及标溶液适量，使浓度均为10ug/ml.涡旋振荡2min，于10000r/min离心5min。
④测定方法：
取上清液20μl进样，用峰面积计算浓度C X。
⑥计算公式：
C X=（C R×A X）/A R
（C R为对照品溶液的浓度（ug/ml）；A X和A R分别为样品溶液与对照品溶液中阿司匹林的峰面积）
2.阿司匹林原料药在体外含量测定方法
1）直接滴定法
直接滴定法即将阿司匹林溶于中性乙醇、甲醇或丙酮中，以酚酞、酚红或酚硫酞为指示剂，用氢氧化钠滴定液直接滴定。
①阿司匹林含量测定的反应原理：
②测定方法：
取本品约0.4g，精密称定，加中性乙醇（对酚酞指示剂显中性）20ml溶解后，加酚酞指示剂3滴，用氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)滴定。每1ml氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)相当于18.02mg的C9H8O4。
③计算公式：
NaOH滴定度T=0.1×180.16×(1/1)=18.02（mg/ml）
F=M（实际）/M(规定)
含量（%）=（V×T×F）/W×100%
（V为滴定液体积（ml）； T为氢氧化钠的滴定度，W为供试品称样量（g）；F为滴定液浓度校正因子（F=滴定液实际浓度/滴定液规定浓度））
2）水解后剩余量滴定法
利用阿司匹林酯结构在碱性溶液中易于水解的特性，加入定量过量的氢氧化钠滴定液，加热使酯键水解后，再用硫酸滴定液回滴定剩余的氢氧化钠滴定液。
①反应原理：
②测定方法：
取本品 1.5g，精密称定，加氢氧化钠滴定液（0.5mol/L）50.0ml，混合，缓缓煮沸10min，放冷，加酚酞指示液，用硫酸滴定液（0.25mol/L）滴定，并将滴定结果用空白试验校正。
③计算公式：
从上述反应式可知：阿司匹林与硫酸的摩尔比为1:1
硫酸的T=0.25×（1/1）×180.16=45.04(mg/ml)
含量（%）=﹝（V0-V）×F×T﹞/W×100%
（V0为空白试验消耗硫酸滴定液的体积（ml）；V为样品测定时消耗硫酸滴定液的体积（ml）；W为阿司匹林样品的称取量（g）；F为硫酸的浓度校正因数；T为硫酸溶液的滴定度）
3.阿司匹林制剂药在体含量测定方法
高效液相色谱法
高效液相色谱法可用于小剂量阿司匹林制剂的体研究。
①色谱条件：色谱柱 Inertsil C18(250mm ×4．6mm，5um)；流动相甲醇一2．5％醋酸(45：55，v／v)；柱温 35℃；流速 1．2 ml/min；检测波长 237nm。
②溶液的配制：
水酸标准储备液：精密称取厄贝沙坦标准品10．00mg，置100mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀即为100 g/ml的水酸标准储备液，并用甲醇稀释成不同浓度的系列溶液。
③标准曲线的建立：
分别精密吸取适量水酸溶液，加入空白血浆，配制成浓度为0．3、0．5、l、2、4、6、8ug/ml的血浆样品，精密移取血浆样品0．5ml于10 ml离心管，加入100ul 磷酸，混匀。加入2．5 ml乙醚，涡旋提取3min，4000r/min 离心10 min，取上清液2．0ml，37℃水浴中氮气流吹干。残留物用100ul流动相溶解，取20ul进样分析。以样品峰面积(y)对血药浓度(c)作线性回归，得回归方程
Y=78038c-18518．r=0．9996。
③血浆样品的处理：
精密移取血浆0．5ml于10 ml离心管，加入100ul磷酸，混匀。加入2．5 ml 乙醚，涡旋提取3min，4000r/min 离心10 min，取上清液2．0ml，37℃水浴中氮气流吹干。残留物用100ul流动相溶解。
④测定方法：
取20ul进样，将血浆样品的峰面积Y代入标准曲线方程，计算样品浓度C。
4.阿司匹林制剂药在体外含量测定方法
1）两步滴定法
因阿司匹林片剂中除存在其水解产物水酸及醋酸外，在制剂工艺中添加了抑制阿司匹林水解的稳定剂酒石酸或枸橼酸，因而采用此法。
两步滴定法系指测定过程分两步进行：第一步中和制剂中的酸性水解产物和酸性稳定剂（同时中和阿司匹林的游离羧基），以消除其干扰；第二步水解与滴定，即水解后剩余量滴定法。
①阿司匹林片含量测定的原理：
中和：
水解与滴定：
②测定方法：
中和：取本品10片，精密称定，研细，精密称取片粉适量（约相当于阿司匹林0.3g），置锥形瓶中，加中性乙醇（对酚酞指示剂显中性）20ml，振摇使阿司匹林溶解，加酚酞指示液3滴，滴加氢氧化钠滴定液（0.1mol/ml）至溶液显
粉红色。此时中和了供试品中存在的游离酸，阿司匹林也同时成为钠盐。
水解与滴定：在中和后的供试品溶液中，精密加氢氧化钠滴定液（0.1mol/ml）40ml，置水浴上加热15分钟并时时振摇，迅速放冷至室温，用硫酸滴定液（0.05mol/ml）滴定，并将滴定的结果用空白试验校正。
③计算公式：
从上述反应式可知：阿司匹林与硫酸的摩尔比为2：1
硫酸的T=0.05×（2/1）×180.16=18.02（mg/ml）
标示量%=﹝（V0-V）×F×T×W(平均)﹞/（W×标示量）×100%
（V0为空白试验消耗硫酸滴定液的体积（ml）；V为样品测定时消耗硫酸滴定液的体积（ml）；F为硫酸滴定液的浓度校正因数；T为硫酸的滴定度（mg/ml）；W为供试品片粉的取样量（g）；W（平均）为供试品的平均片重（g）；标示量为片剂的规格（mg/片））
2）柱分配色谱-紫外分光光度法
采用柱色谱分离法消除阿司匹林胶囊和栓剂中辅料及降解产物的干扰。以阿司匹林胶囊柱分配色谱-紫外分光光度法为例：
①色谱柱的制备：于玻璃柱(20cm×2.5cm)下端塞入少量玻璃棉，装入硅藻土3g和新制碳酸氢钠(1→12)2ml的混合填充剂。
②对照溶液的制备：取阿司匹林对照品约50mg，精密称定，置50ml量瓶中，加冰醋酸0.5ml，加三氯甲烷溶解并稀释至刻度，混匀。精密量取5ml，置100ml 量瓶中，用冰醋酸三氯甲烷（1→100）稀释至刻度，混匀。制成每1ml中约50ug 的溶液。
③供试品的制备：取胶囊20粒，尽可能完全倾出容物，精密称定，研细，混匀；取细粉适量(相当于阿司匹林50mg)，精密称定，置50ml量瓶中，加盐酸甲醇溶液（1→50）1ml，加三氯甲烷稀释至刻度，混匀。精密量取5ml，移至色谱柱填充剂上，用三氯甲烷5ml、25ml相继洗涤，弃去洗液，用冰醋酸三氯甲烷溶液（1→50）10ml洗涤后，再用冰醋酸三氯甲烷溶液（1→100）85ml洗脱，收集洗脱于100ml量瓶中，并用冰醋酸三氯甲烷溶液（1→100）稀释至刻度，混匀。
④测定法：用1cm吸收池，以三氯甲烷为空白，立即于最大吸收波长280nm 处测定对照溶液和供试溶液的吸光度。
⑤计算公式：
阿司匹林（mg）=C R×(A X/A R)
（C R为阿司匹林对照溶液浓度（ug/ml）；A X和A R分别为供试溶液和对照溶液的吸光度）
3）离子抑制-反相高效液相色谱法
典型芳酸类非甾体抗炎药物制剂大多采用离子抑制-反相高效液相色谱法测定，用外标法计算含量。以阿司匹林栓的含量测定为例，方法如下：
①色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-四氢呋喃-冰醋酸-水（20：5：5：70）为流动相；检测波长为276nm。理论板数按阿司匹林峰计算不低于3000，阿司匹林峰与水酸峰的分离度应符合要求。
②测定方法：取本品5粒，精密称定，置小烧杯中，在40~50℃水浴上微温熔融，在不断搅拌下冷却至室温，精密称取适量（约相当于阿司匹林0.1g），置50ml量瓶中，加1%冰醋酸的甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，置冰浴中冷却1小时，取出，迅速滤过，取续滤液作为供试品贮备液。精密量取供试品贮备液5ml，置100ml量瓶中，用1%冰醋酸的甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，精密量取1ul，注入液相色谱仪，记录色谱图；另取阿司匹林对照品，精密称定，加1%冰醋酸的甲醇溶液振摇使溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.1mg的溶液，同法测定，按外标法以峰面积计算，即得。
③计算公式：
标示量%=﹝C R×(A X/A R) ×D×W(平均)﹞/(W×标示量)×100%
（C R为对照品溶液浓度（mg/ml）；A X和A R分别为供试品溶液和对照品溶液的峰面积；D为稀释体积（ml，D=50×100/5=1000）；W为栓剂熔融物取样量（g）；W(平均)为栓剂平均粒重(g)；标示量为栓剂规格（mg/支））
4）可见分光光度法
以阿司匹林肠溶片为例：
①原理：
阿司匹林肠溶片的主要成分为乙酰水酸，分子中酯基在碱性溶液中可与羟胺反应生成羟肟酸;后者在酸性条件下与三氯化铁形成酒红色的羟肟酸铁，最大吸收波长为520nm，在一定浓度围，吸光度呈线性关系，可测出阿司匹林药片中乙酰水酸的含量。
②标准溶液系列和样品溶液的配制：
分别取0.5g·L-1乙酰水酸标准溶液0.00mL(空白溶液)，0.50mL，1.00mL，1.50mL，2.00mL和阿司匹林样品溶液1.00mL置于25mL容量瓶中，分别加入7%盐酸羟胺乙醇液1.00ml，2mol·L-1NaOH1.00ml，放置3分钟，再分别加入4mol·L-1HCl和10%FeCl3各1.00mL，加水至刻度，摇匀。
③标准曲线的绘制：
标准溶液系列和样品溶液放置10分钟后，用空白溶液作对照，在520nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标作图，绘制出标准曲线。
④样品的测定：
通过测定样品的吸光度，从标准曲线上，找出阿司匹林样品稀释溶液的浓度C（g/L），⑤计算公式：
原阿司匹林样品溶液的浓度=C×25
（C为阿司匹林样品稀释溶液的浓度（g/L）；25为稀释倍数）
5）差示分光光度法
差示分光光度法是利用被测物在两种不同溶液中吸收光谱发生了特征性变化，而共存干扰物在该两种溶液中未引起光谱变化，测定两种溶液的吸收度差值（ΔA值），根据ΔA与被测物浓度C的线性关系进行定量测定。以阿司匹林肠溶片为例：
①原理：
利用阿司匹林在0．1 mol/L 盐酸溶液和0．1 mol/L 氢氧化钠溶液中紫外光谱发生变化的特征，试用差示分光光度法，通过测定差示吸收值(△A)直接测定阿司匹林的含量。
②测定波长的选择：
精密称取阿司匹林对照品10．29 mg，置100 ml量瓶中，加0．1 mol/L盐酸
溶液溶解并稀释至刻度，制成阿司匹林对照品溶液。精密量取2等份，每份1．0ml，各置l0 ml量瓶中，分别以0．1 mol/L盐酸溶液和0．1mol/L氢氧化钠溶液稀释至刻度，摇匀。以前者作参比液，后者为样品液，在波长260～320 nm围进行扫描，本品在297 nm波长处有最大差示吸收值(△A)，而辅料在此处的吸收值(△A)为零，故选用297 nm为测定波长
③线性关系考察：
精密量取对照品溶液1．0、1．5、2．0、2．5、3．0 ml各两等份，分别置10 ml量瓶中，每组分别用0．1mol/L 盐酸溶液和0．1 mol/L 氢氧化钠溶液稀释至刻度，摇匀。以前者作参比液，后者为样品液，在297nm处测定ΔA，求得回归方程：△A=51．8746C一0．04373，r=0．9998。结果表明，阿司匹林在10．29～30．87 mg/L 围线性关系良好。
④样品的测定：
取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量(约相当于阿司匹林25 mg)，置100 ml量瓶中，加0．1mol/L盐酸溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过。精密量取续滤液两等份，每份2．0 ml，各置25 ml量瓶中，分别用0．1mol/L盐酸溶液和0．1 mol/L氢氧化钠溶液稀释至刻度，摇匀，以前者作参比液，后者为样品液，照紫外—可见分光光度法，在297 nm的波长处测定吸光度；另精密称取阿司匹林对照品适量，同法测定，计算含量。
⑤计算公式：
C样=（△A样×C对）/△A对
标示量（%）=( C样×D×W（平均）) /（W×标示量）×100%
(△A样为样品差示吸收值；C对为对照品浓度；△A对为对照品差示吸收值；D为稀释倍数；W（平均）为样品的平均片重（g）；W为样品片粉的取样量（g）)
6）百分吸收系数法
①供试品：
精密称取阿司匹林注射液适量，置100ml量瓶，用乙醇定容。精密量取2ml 置100ml量瓶，用乙醇定容，即得。
②含量测定：
在276nm下测定A
③计算公式：
（A= E1%cm×C×L）
C= A / E1%cm
样品% = A / E1%cm ×F/W
（F = 稀释倍数和浓度换算因子W = 取样量）
7）电极法
以三苄基锡辛酸酯为活性物质, 制备具有良好的电位响应性能和选择性能的PVC 膜水酸根离子敏感电极，该电极应用于阿司匹林制剂的含量测定。阿司匹林易水解得到水酸根离子, 且反应定量。因此, 通过对水酸根离子的测定即可得出样品中的阿司匹林含量。
①待测样品的处理
将适量阿司匹林片药品( 10 片) 研制成粉状，精密称取1～1. 5 g ，在0.
5 mol/ L NaOH 溶液25 ml 中加热回流1 h 后过滤，定容至250 ml。吸取10ml 滤液，用稀硫酸调至pH 5. 5，再用pH 5. 5的磷酸盐缓冲液定容至100 ml 作为待测液。
②测定方法：
使用该电极通过标准溶液法和样品加入法, 分别测定药品经前述处理后所得试样中的水酸根离子浓度, 通过换算得出药剂中阿司匹林的含量。
8）同步扫描荧光光谱
①原理：
荧光光度计同步扫描时, 得到两组分互不干扰的荧光峰, 借此分别测定两组分的含量。
②溶液的配制：
对照液：精密称取阿司匹林对照品适量，置100ml量瓶，用乙醇定容。精密量取2ml置100ml量瓶，用乙醇定容，即得。
供试品：精密称取阿司匹林注射液适量，置100ml量瓶，用乙醇定容。精密量取2ml置100ml量瓶，用乙醇定容，即得。
③测定方法：
用对照品溶液测定荧光强度与浓度的线性关系后，再在每次测定前，用一定浓度的对照品溶液校正仪器的灵敏度；然后再相同的条件下，分别读取对照品溶液及其试剂空白的荧光强度与供试品溶液及其空白的荧光强度
④计算公式：
C X =（R X—R Xb）/（Rr—Rrb）×Cr
（C X和Cr为供试品溶液、对照品溶液的浓度，R X供试品溶液荧光强度，R Xb供试品溶液试剂空白的荧光强度，Rr对照品溶液的荧光强度，Rrb为对照品溶液的试剂的空白荧光强度）
9）线性扫描伏安法
以玻碳电极为指示电极, 用线性扫描伏安法测定水酸, 从而间接测定阿司匹林。
①原理：
在硫酸- 硫酸钾底液中,阿司匹林的水解产物水酸在玻碳电极上产生一灵敏的氧化峰, 峰电位为1. 16 V; 在4. 0×10- 5mol/ L～8. 0×10- 3mol/ L 浓度围水酸与峰电流呈良好线性关系, 最低检测浓度为2. 0×10- 5 mol/ L。
②溶液的配制：
0. 1 mol/ L NaOH 溶液: 称取4g NaOH 于100 ml烧杯,用水溶解并转移到1 000 ml容量瓶中, 用水定容。
0.01mol/ L 水酸标准溶液: 称取0. 138 2 g分析纯水酸, 用0. 1 mol/ L NaOH 溶液溶解并定容到100ml, 放置阴凉处保存。
5 mol/ L硫酸溶液: 于720 ml水中徐徐加入280 ml浓硫酸, 同时用玻璃棒搅拌。
0. 5 mol/ L 硫酸钾溶液: 称取8. 713 g 硫酸钾于100 ml烧杯中, 用水溶解并转移到100 ml容量瓶中, 用水定容。
所用水均为去离子水.
③工作曲线制作：
按选定实验条件对不同浓度水酸标准溶液进行线性扫描伏安测定, 结果表明水酸在4. 0×10- 5mol/L～8. 0×10- 3mol/ L 浓度围与峰电流呈良好线性关系, 最低检测浓度为2. 0×10- 5mol/ L. 工作曲线回归方程为I p= - 7. 336 2C-
4. 687 6, 相关系数R= 0. 9941.
③精密称取10 片阿司匹林药片, 均匀研细, 再从中准确称取相当于一片重量的样品, 用0. 1 mol/ L NaOH溶液溶解, 放置10 min, 再用0. 1 mol/ L NaOH 溶液定容至50 ml。从中移取1. 00 ml至25. 00 ml容量瓶, 加入5 mol/ L 硫酸2. 5 ml, 0. 5 mol/ L 硫酸钾溶液2. 5 ml, 用去离子水稀释至刻度, 摇匀, 按实验方法进行测定, 由工作曲线计算样品中阿司匹林的含量C样。
④计算公式：
标示量（%）=( C样×D×W（平均）) /（W×标示量）×100%
（D为稀释倍数；W（平均）为样品的平均片重（g）；W为样品片粉的取样量（g）)
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