东南大学
硕士学位论文
FGFR1、FGF10和FGF18基因多态性与非综合征性唇腭裂相关研究
姓名：杨顺露
申请学位级别：硕士
专业：外科学
指导教师：万伟东
20090410
中文摘要
ＦＧＦＲｌ、ＦＧＦ１０和ＦＧＦ１８基因多态性与非综合征性唇腭裂相关研究
中文摘要
目的探讨ＦＧＦＲｌ、ＦＧＦｌ０和ＦＧＦｌ８基因多态性与中国部分人群发生非综合征性唇腭裂（Ｎｏｎｓｙｎｄｒｏｍｉｅｃｌｅｆｔｌｉｐｗｉｔｈｏｒｗｉｔｈｏｕｔｃｌｅｆｔｐａｌａｔｅ，ＮＳＣＬ／Ｐ）的关系。
方法实验选择７５个非综合征性唇腭裂核心家庭（其中包括患儿及其生物学父母．）和７５个无唇腭裂畸形的正常儿童作为对照，收集其临床资料和血液标本，提取其外周血基因组ＤＮＡ。ＦＧＦＲｌ基因ｒｓｌ３３１７位点采用限制性片段长度多态性分析；
ＦＧＦＲｌ基因Ｐ．Ｅ４６７Ｋ、Ｐ．Ｍ３６９Ｉ、Ｐ．￥３９３Ｓ，ＦＧＦｌ０基因ｒｓｌ４４８０３７和ＦＧＦＩ８基因ｒｓ４０４３７１６位点采用三维丙烯酰胺凝胶基因芯片方法进行单核苷酸多态性的检测。通过部分样本重复检测和测序验证的方法控制并保证结果的准确性。根据实验结果得出的基因型数据，比较患儿组与对照组的基因型和等位基因频率；对全部核心家庭的数据进行单倍型相对风险分析（Ｈａｐｌｏｔｙｐｅｒｅｌａｔｉｖｅｒｉｓｋ，ＨＲＲ）和以家系为基础的关联检验（Ｆａｍｉｌｙｂａｓｅｄａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｔｅｓｔ，ＦＢＡＴ）；对含杂合子父母的核心家庭进行传递不平衡检验（Ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄｄｉｓｅｑｕｉｌｌｉｂｒｉｕｍｔｅｓｔ，ＴＤＴ）。
结果ＦＧＦＲＩ基因：Ｐ．Ｅ４６７Ｋ、Ｐ．Ｍ３６９Ｉ和Ｐ．￥３９３Ｓ三个位点在所有研究样本中均未检测出多态性，三个位点对应的碱基均为Ｇ，ｒｓｌ３３１７位点检测出多态性。对ｒｓｌ３３１７基因型数据进行分析：患儿组和对照组基因型和等位基因频数进行病例对照研究发现分布差异无统计学意义（胗ｏ．０５）；病例组核心家庭ＴＤＴ检验矿＝ｏ．０５６，Ｐ＞０．０５；ＨＲＲ检验／＝０．０５８，Ｐ－－０．８０９ｇＦＢＡＴ检验Ｚ＝０．２３６，Ｐ＞０．０５。ＦＧＦｌ０基因：ｒｓｌ４４８０３７检测出多态性，对其基因型分型结果进行分析：患儿组和对照组基因型和等位基因频数进行病例对照研究发现分布差异无统计学意义（胗０．０５）；
病例组核心家庭ＴＤＴ检验≯＝ｏ．５２９，Ｐ＞０．０５；ＨＲＲ检验／＝０．５０６，Ｐ＝Ｏ．４７７）ＦＢＡＴ检验Ｚ＝０．７２８，Ｐ＞０．０５。Ｆ（３Ｆ１８基因：ｒｓ４０４３７１６检测出多态性，对其基因型分型结果进行分析：患儿组和对照组基因型和等位基因频数进行病例对照研究，发现基因型分布差别有统计学意义，Ｐ＝０．０４５，进一步分析得出基因型ＴＴｖｓ．ＣＴ，：４．６８８Ｐ－－－－０．０３０ＯＲ＝０．３８６（０．１６１．０．９２５）。等位基因频数的分布差异无统计学意义（尸＞０．０５）；病例组核心家庭ＴＤＴ检验，＝ｏ．０１２，Ｐ＞Ｏ．０５；ＨＲＲ检验≯＝ｏ．０１３，Ｐ－－Ｏ．９０８；ＦＢＡＴ检验Ｚ＝０．１１１，Ｐ＞０．０５。
结论ＦＧＦｌ８基因ｒｓ４０４３７１６位点多态性和中国人群ＮＳＣＬ／Ｐ可能存在一定的相关性；
ＦＧＦＲｌ基因ｒｓｌ３３１７和ＦＧＦｌ０基因ｒｓｌ４４８０３７位点多态性与中国部分人群ＮＳＣＬ／Ｐ町
一、前言
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一、刖吾
唇腭裂是一种最常见的先天性颜面部缺陷，在世界不同地区、不同种族发病率有较大差异，平均发病率约为１／７００，其中亚洲发病率较高约１／５００，欧洲居中约１／１０００，非洲最低约１／２５００１¨。非综合征性唇腭裂（Ｎｏｎｓｙｎｄｒｏｍｉｅｃｌｅｆｔｏｆｌｉｐｗｉｔｈｏｒｗｉｔｈｏｕｔｐａｌａｔｅ，ＮＳＣＬ／Ｐ）是指单发的唇裂、腭裂或唇裂合并腭裂，它是一种排除了其它系统畸形和综合征的唇腭裂。目前研究显示７０％的唇裂伴／不伴腭裂和５０％单纯性腭裂的病例属于非综合征性唇腭裂，唇腭裂患者常常因为喂养、咬合、构音功能异常需要外科手术和后续的序列治疗。最近的研究还表明唇腭裂患者较正常人寿命短，同时拥有较高的癌症和精神疾病发病风险【ｚＪｊ。流行病学调查显示出生时患唇腭裂的患者成年后女性有较高的乳腺和颅脑肿瘤发病风险，男性有较高的肺癌发病风险［４１。因此针对唇腭裂病因学的研究显得尤为重要。
唇腭裂病因复杂，目前认为是一种多基因易感性疾病，环境及遗传因素共同作用引起发病。同时相关研究还表明唇和腭的形成依赖于多细胞相互作用、细胞分化及神经嵴迁移，受到大量结构蛋白和调控蛋白的影响，所有参与以上过程的基因都可能是唇腭裂发病的候选基因。目前为止已经有多个基因被认为与唇腭裂相关，但是唇腭裂的主要病因仍未明了。ＦＧＦ信号（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）在颅面发育中起重要作用，近来也被引入唇腭裂病因学的研究之中。这个通路中的成纤维细胞生长因子和成纤维细胞生长因子受体很可能与环境因素相互影响共同构成唇腭裂发病的危险因素。
在动物模型的研究中发现小鼠上唇和腭的组织中高表达ＦＧＦｓ很明显地与口面裂相关联。ＦＧＦ８在额鼻突处表达，此处鼻窝内陷使得内侧和外侧鼻突融合１５Ｊ。ＦＧＦＲｌ，ＦＧＦＲ２和ＦＧＦｌ０在腭部发育的不同阶段表达，包括腭上皮外向性生长时期以及在腭部融合时细胞间质和中嵴上皮的增殖时１６－９１。转基因的动物模型同样支持了ＦＧＦｓ／ＦＧＦＲｓ在唇腭裂病因中的作用。ＦＧＦｌ０－／４６１、ＦＧＦＲ２ｂ－／－［９１、ＦＧＦｌ８－／－［１ｏ＇１１】和ＦＧＦＲｌ亚效基因小鼠发生腭裂１１２】。亚效基因ＦＧＦ８“驯’突变的小鼠发生颅面部的缺陷，包括腭与腭骨的发育异常Ｉｌ引。此外定向干扰ＦＧＦｌ０／ＦＧＦＲ２ｂ信号的小鼠出现腭裂。因此可以推测ＦＧＦ卵ＧＦ黜在唇腭裂病因中可能是的候选因素。
近年研究表明ＦＧＦｓ／ＦＧＦＲｓ在综合征性唇腭裂形成起重要作用。人类疾病包括颅缝早闭骨骼发育异常综合征（ＦＧＦＲＩ—ＦＧＦＲ３）和Ｋａｌｌｍａｎｎ综合征（ＦＧＦＲＩ）都是由于ＦＧＦ信号转导异常所引起。以颅缝早闭和并指为特征的Ａｐｅｒｔ综合征的病例有４４％的病人同时合并腭裂ＩＩ４’巧Ｊ。在ＦＧＦＲ２基因上发现的两个突变￥２５２Ｗ和Ｐ２５３Ｒ，几乎出现于全部Ａｐｅｒｔ综合征的病人；表现为显性裂的病例更常出现￥２５２Ｗ突变（５９％），而出现Ｐ２５３Ｒ突变的只占１７％１１４—６１。常染色体显性的Ｋａｌｌｍａｎｎ综合征，其主要特征是嗅觉减退／丧失和促性腺激素不足性腺功能减退，主要是由ＦＧＦＲｌ突变所致，５％一１０％的这种病人合并唇腭裂【１７。１９Ｊ。
综合征性唇腭裂的研究也为非综合征性唇腭裂的病因学研究提供了借鉴，多个在综合征性唇腭裂中发现的致病候选基因，都被引入到非综合征性唇腭裂的病因研究之中，如ＩＲＦ６、ＰＶＲＬＩ、ＭＳＸｌ、ＴＢＸ２２等１２ＵＪ，ＦＧＦｓ／ＦＧＦＲｓ也一样。基于ＦＧＦ信号在颅面部发育以及在综合征性唇腭裂发病中的重要作用，ＦＧＦｓ／ＦＧＦＲｓ与人类ＮＳＣＬ／Ｐ相关性的研究在２００７年引起了相关学者的关注，Ｒｉｌｅｙ等１２ｌＪ通过测序发现了ＦＧＦｓ／ＦＧＦＲｓ中７个可能致病的突变，同时发现ＦＧＦＲｌ基因ｒｓｌ３３１７、ＦＧＦｌ０基因ｒｓｌ４４８０３７和ＦＧＦｌ８基因ｒｓ４０７３７１６等ＳＮＰ位点与ＮＳＣＬ／Ｐ相关。Ｒｉｌｅｙ等１２ｒ２１根据基因组扫描和基因定位、连锁相关分析发现ＦＧＦＲｌ可能与唇腭裂的发生相关。Ｒｉｌｅｙ等田Ｊ对ＦＧＦ信号相关基因保守的非编码区进行测序，结果发现５５个新的ＳＮＰ位点，其中ＦＧＦｌ０基冈有４个突变位点在８种以上的物种中高度保守，１个突变位点使得转录凶子ＳＴＡＴ的结合位点缺失，而该位点与颅面部的发育息
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息相关。这些都提示了ＦＧＦＲｌ、ＦＧＦｌ０和ＦＧＦＩ８基因可能在唇腭裂的发生中起作用，故本次实验我们选择这些基因的一些多态性位点作为检测对象。
综合相关的其他研究，２００８年初Ⅵｅｉｍｌ２４Ｊ提出ＦＧＦ信号通路可能在ＮＳＣＬ伊的发病中起到３％的作用。目前国外在ＦＧＦｓ／ＦＧＦＲｓ与人类ＮＳＣＬ伊相关性研究的报道较少，国内尚
无相关文献。我们以中国部分汉族人群ＮＳＣ价患儿核心家庭和正常儿童作为研究对象，采用病例．对照和核心家庭病例患儿父母亲内对照的研究设计，检测部分ＦＧＦ信号相关基因多态性与该部分人群ＮＳＣＬ／Ｐ发生风险之间是否存在关联。
本次研究选择６个ＳＮＰ位点作为研究对象，针对ＦＧＦＲｌ基因璐１３３１７位点选择采用限制性片段长度多态性分析；针对ＦＧＦＲｌ基因Ｐ．Ｅ４６７Ｋ、Ｐ．Ｍ３６９Ｉ、Ｐ．￥３９３Ｓ，ＦＧＦｌ０基因璐１４４８０３７和ＦＧＦｌ８基因ｒｓ４０４３７１６位点选择采用三维丙烯酰胺凝胶基因芯片方法进行单核苷酸多态性的检测。在实验方法上，限制性片段长度多态性分析是一种比较经典的检测单核甘酸多态性的方法，准确性高；三维丙烯酰胺凝胶基因芯片方法是近年发展起来技术成熟的，检测效率和特异性均高的新的检测手段，该实验方法由东南大学生物电子学国家重点实验室提供技术支持。根据实验检测结果进行多种遗传统计学分析，探讨研究位点多态性与该部分人群ＮＳＣＬ伊发生风险之间是否存在相关性，为寻找ＮＳＣＬ伊遗传易感性标记提供流行病学证据。通过这些研究确定唇腭裂发病的相关基因类型，为患病人群及后代提供预警和遗传风险的评估，据此建立有效的预防和干预措施。
二、文献综述
二、文献综述
ＦＧＦｓ／ＦＧＦＲｓ与唇腭裂相关研究的进展
唇腭裂是一种比较常见的先天性颜面部缺陷，在世界不同地区、不同种族发病率有较大差异，平均约为１／７００［¨。唇腭裂可以分为综合征性和非综合征性两种类型。综合征性唇腭裂是指除唇腭裂畸形外同时合并有身体其他部位的畸形和发育异常，可以分为染色体综合征（超过３５０种的孟德尔氏病）、致畸因子（如苯妥英和酒精）引起的综合征以及未归类的综合征。而非综合征性唇腭裂（Ｎｏｎｓｙｎｄｒｏｍｉｃｃｌｅｆｔｏｆｌｉｐｗｉｔｈｏｒｗｉｔｈｏｕｔｐａｌａｔｅ，ＮＳＣＬ／Ｐ）是指单发的唇裂（Ｃｌｅｆｔｌｉｐ，ＣＬ）、腭裂（Ｃｌｅｆｔｐａｌａｔｅ，ＣＰ）或唇裂合并腭裂（Ｃｌｅｆｔｌｉｐａｎｄｐａｌａｔｅ，ＣＬＰ），它排除了其它系统畸形和综合征性的唇腭裂，目前研究显示７０％的唇裂伴／不伴腭裂病例和５０％的单纯性腭裂病例属于非综合征性唇腭裂。
唇腭裂的病人常常因为喂养困难、咬合和构音功能异常等需要外科手术和后续的序列治疗，给家庭和社会带来沉重的负担。最近的研究还表明唇腭裂患者较正常人寿命短同时拥有较高的癌症和精神疾病的发病风险１２，引。流行病学调查显示出生时患唇腭裂的女性患者成年后有较高的乳腺和颅脑肿瘤的发病风险，而男性患者成年后患原发性肺癌的风险较高【４Ｊ。因此唇腭裂病因学研究显得尤为重要，是目前的研究热点。
唇腭裂病因复杂，涉及基因和环境因素以及两者之间的相互作用。目前已经有多个基因被认为与唇腭裂相关，但是唇腭裂的主要病因仍未明了。综合征性唇腭裂的研究也为非综合征性唇腭裂的病因学研究提供了借鉴，多个在综合征性唇腭裂中发现的致病候选基因，都被引入到非综合征性唇腭裂的病因研究之中，如ＩＲＦ６、ＰＶＲＬｌ、ＭＳＸｌ、ＴＢＸ２２、ＦＧＦＲＩ等１２…。ＦＧＦｓ／ＦＧＦＲｓ在颅面发育中起重要作用，使得其在综合征性唇腭裂中被较多地研究，现在也被引入到非综合征性唇腭裂的研究之中。最新的研究在唇腭裂病例中发现了ＦＧＦｓ／ＦＧＦＲｓ基因编码区的多个突变１２¨，这凸显出了ＦＧＦｓ／ＦＧＦＲｓ在唇腭裂病因中的重要作用。这个通路很可能与环境因素相互影响共同构成唇腭裂的危险因素。下面就ＦＧＦｓ／ＦＧＦＲｓ与唇腭裂的相关研究做一综述。
ｌ、ＦＧＦｓ／ＦＧＦ黜的分子生物学特征
成纤维细胞生长因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｓ，ＦＧＦｓ）是一类由ＦＧＦ基因家族编码的结构相关的蛋白质，由约１５０．２００氨基酸组成的多肽，其中心区域有大约１２０个氨基酸序列存在高度的同源性（３０％．７０％）。到目前为止ＦＧＦｓ已发现有２３个成员，ＦＧＦｓ亚科与各染色体定位之间无明显的相关性，人类ＦＧＦｓ基因多数散在分布于全基因组中。但也有一些ＦＧＦｓ基因在基因组上形成群落，由此推断ＦＧＦｓ基因家族是在进化、复制和易位等复杂过程中形成的Ｉｚ引。成纤维细胞生长因子受体（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｓｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ＦＧＦＲｓ）是一类跨膜的酪氨酸激酶受体，它们介导ＦＧＦ信号传递入细胞质中。目前已经确定了有４种独立基因编码的ＦＧＦＲｓ，ｆｌＯＦＧＦＲｌ、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３和ＦＧＦＲ４。它们都为单链的糖蛋白分子，由细胞外区、跨膜区和细胞内区组成。这４种ＦＧＦＲｓ具有５５％一７２％的氨基酸一致性，但它们与配体的亲和力和组织的分布有所不同。
ＦＧＦＲｓ的激活主要是通过ＦＧＦＲｓ的二聚体化和自磷酸化来实现。ＦＧＦＲｓ受体二聚体化是ＦＧＦ信号传递中的一个重要步骤，该步骤需细胞表面硫酸肝素蛋白多糖（ｎｅｐａｒａｎｓｕｌｆａｔｅｐｒｏｔｃｏｇｌｙｃａｎｓ，ＨＳＰＧ）的参与，不同组织的细胞外间质一定区域上的ＨＳＰＧ的生物合成为表达ＦＧＦＲｓ的细胞提供了支架，从而使这些细胞移行过来ｆ８Ｊ。在受体二聚体中，一个受体分子能磷酸化另一个受体分子，从而实现受体的自磷酸化。磷酸化一般发生在两类不同的酪氨酸残基上。
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ＦＧＦ信号转导主要通过ＰＬＣ吖路径１２６】、Ｒａｓ瓜ａ价肛舳ＲＫ路径１２７，２ｓ］和ＪＡＫ／Ｓ吖汀圈途径来实现磷酸化、激活转录因子等生物学功能。除了Ｉｊｉ『面３条主要的路径，ＦＧＦ信号传递还有其它的一些路径。这些路径之间以及与其他生长因子的传导路径相互作用形成网络，从而调节细胞的某些生理过程。但是目前对细胞内ＦＧＦｓ／ＦＧＦＲｓ系统下游其他信号的传递作用仍所知甚少，有待进一步研究揭示。
２、ＦＧＦｓ／ＦＧＦＲｓ在面部与腭的形成和发育过程的表现
ＦＧＦｓ／ＦＧＦＲｓ在进化中高度保守，在胚胎发育中起至关重要的作用，其作用几乎涉及颅面部所有的结构从早期的形态萌出到生长发育调节的全过程。脊椎动物面部的发育形成是一个复杂的面部始基外向生长和分化的过程，是一个精确的细胞增殖、分化、迁移和凋亡相互配合的过程，由不同的诱导信号交织，大量的信号分子参与其中，ＦＧＦ信号即是其中之一。
２．１ＦＧＦ信号在面部始基形成过程中的作用
ＦＧＦ信号参与了诱导神经嵴的形成过程［３０－３２１，同时促成了神经嵴上软骨细胞谱系的形成Ｌ３２，３３ｌ。神经嵴细胞的诱导，包括来源于神经管背脊上面外胚层处细胞的起源［３４１。这些细胞迁移至鳃弓并形成额鼻、上颌骨和下颌骨的始基。这些始基和神经嵴浓缩产生的软骨以及骨组织负责形成面部的主要结构如颌、唇、腭，这些结构的形成过程同样为ＦＧＦ和其他信号通路所调控。
干扰面部始基的发育过程将会引起不同的口面裂和面部发育不全。在面部裂中，腭裂是最常见的畸形。在大多数病例中唇裂常与腭裂伴发，但有些是单发的畸形，这提示两者的分子形成基础有共同点又有不同点。它们形成的不同机制在小鼠的动物实验中也得到了体现【３５１。
２．２ＦＧＦ信号在腭发生中的作用
哺乳动物的腭是由初腭和继发腭连接形成。哺乳动物继发腭的形成是一个多步骤的过程，包括腭架的外向性生长、抬升、融合和成熟【３６１。在这一过程中，腭突处的间质增殖活跃，这对于腭的外向生长和融合是必需的。腭的发生中腭的融合是至关重要的，腭部在融合过程受到任何干扰都可能导致腭裂发生。如腭架抬升的延迟，间质增殖的减少和ＭＥＳ（Ｍｉｄｌｉｎｅｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｓｅａｍ）不正常的凋亡都可能是腭裂的病因。腭发育中的基因水平的机制正被人类开始逐渐了解，ＢＭＰ、ＳＨＨ、ＳＯＸ９、ＭＳＸ、ＦＧＦ、ＴＧＦｌ３３和ＥＧＦ信号都在腭发生中起到至关重要的作用１３７】。腭发生过程中的主要调节因素是中胚层来源的间质和外胚层、内胚层来源的上皮之间的相互作用，即上皮．问质的相互作用。ＦＧＦ信号在几乎所有结构的上皮和间质中同时出现，通过受体亚型特异区域表达来调节上皮．间质之间的相互作用。ＦＧＦ信号介导上皮．问质相互作用指导腭发育中的分化和成熟。上皮．间质转化（ＥＭＴ）是唇与腭融合过程的重要机制，这一观点目前已被学术界广泛认可１３引。
ＦＧＦ信号对腭的发生至关重要，然而其在唇腭裂形成中的作用仍未被阐明。
３、受损的ＦＧＦ信号与唇腭裂的研究
在研究中发现小鼠上唇和腭的组织中高表达ＦＧＦｓ很明显地与口面裂相关联。ＦＧＦ８在额鼻突处表达，此处鼻窝内陷使得内侧和Ｊ＇ｂ倾ｆＪ鼻突融合【５】。ＦＧＦＲｌ，ＦＧＦＲ２和ＦＧＦｌ０在腭部发育的不同阶段表达，包括腭上皮外向性生长时期以及在腭部融合时细胞间质和中嵴上皮的增殖时［６－９１。转基因的动物模型同样支持了ＦＧＦｓ／ＦＧＦＲｓ在唇腭裂病因中的作用。ＦＧＦｌ０乒［６１、ＦＧＦＲ２ｂ壬１９１、ＦＧＦｌ８－／－【１０，１１】和ＦＧＦＲｌ亚效基因的小鼠发生腭裂【１２】。亚效基因ＦＧＦ８‘恻一突变的小鼠发，Ｅ颅【ｆＩｉ部的缺陷，包括腭与腭骨的发育异常１１３】。此外，定向干扰ＦＧＦｌ０／ＦＧＦＲ２ｂ信号的小鼠出现腭裂。因此，可以预期ＦＧＦ信号在唇腭裂病因中是
二、文献综述
一个重要的候选因素。
近年研究证实ＦＧＦ家族成员在综合征性唇腭裂形成起显著作用。人类疾病包括颅缝早闭骨骼发育异常综合征（ＦＧＦＲｌ．ＦＧＦＲ３）和Ｋａｌｌｍａｎｎ综合征张Ｓ）（ＦＧＦＲｌ）都是由于ＦＧＦ信号失调所引起。以颅缝早闭和并指为特征的Ａｐｅｒｔ综合征的病例有４４％的病人同时合并腭裂１１４’１５Ｊ。在ＦＧＦＲ２基因上发现的两个突变￥２５２Ｗ和Ｐ２５３Ｒ，几乎出现于全部Ａｐｅｒｔ综合征的病人：表现为显性裂的病例更常出现￥２５２Ｗ突变（５９％），而出现Ｐ２５３Ｒ突变的只占１７％１１４—６１。常染色体显性的Ｋａｌｌｍａｎｎ综合征，其主要特征是嗅觉减退／丧失和促性腺激素不足性腺功能减退，主要是由ＦＧＦＲｌ突变所致，５％．１０％的这种病人合并裂１１７—９１。
ＦＧＦ基因在颅面部发育的几个方面都起着重要作用，下表列举了几个由于ＦＧＦ基因突变导致的先天疾病和相关的小鼠模型实验结果１３９］。这些都提示了受损的ＦＧＦｓ／ＦＧＦＲｓ很可能与唇腭裂的发病相关。
关于ＦＧＦ信号的基础研究以及其与综合征性唇腭裂的相关研究较多，而其与人类ＮＳＣＬ／Ｐ相关性的研究直到２００７年才引起相关学者关注。Ｒｉｌｅ矿２ｌＪ等最近针对１２个ＦＧＦｓ／ＦＧＦＲｓ基因（ＦＧＦＲｌ，ＦＧＦＲ２，ＦＧＦＲ３，ＦＧＦ２，ＦＧＦ３，ＦＧＦ４，ＦＧＦ７，ＦＧＦ８，ＦＧＦ９，ＦＧＦｌ０，ＦＧＦｌ８和ＮＵＤＴ６）的编码区进行测序，分析与唇腭裂的相关性，并从蛋白结构去分析预测突变后氨基酸的功能。实验发现了７个可能致病的突变，其中包括ＦＧＦＲｌ（Ｒ６０９Ｘ）的无义突变，ＦＧＦ８（Ｄ７３Ｈ）的新生（ｄｅｌｌＯＶＯ）错义突变以及ＦＧＦＲｌ、ＦＧＦＲ２和ＦＧＦ８的一些错义突变。分析ＦＧＦＲｌ、ＦＧＦＲ２和ＦＧＦ８的突变后结构，提示这些突变可能通过不同的机制损害了蛋白质的功能。同时针对１１个ＦＧＦｓ／ＦＧＦＲｓ基因（ＦＧＦ２，ＦＧＦ３，ＦＧＦ４，ＦＧＦ７，ＦＧＦ８，ＦＧＦ９，ＦＧＦｌ０，ＦＧＦｌ８，ＦＧＦＲｌ，ＦＧＦＲ２和ＦＧＦＲ３）分别选取２＿４个ＳＮＰ位点做与
ＮＳＣ坍相关的研究，统计分析发现ＦＧＦ３、ＦＧＦ７、ＦＧＦｌ０、ＦＧＦｌ８和ＦＧＦＲｌ的ＳＮＰ位点与ＮＳＣＬ／Ｐ相关。综合这些资料Ｒｉｌｅｙ提出ＦＧＦｓ／ＦＧＦＲｓ可能在ＮＳＣＬ／Ｐ的发病中起到３％．５％的作用。
Ｒｉｌｅｙ等【２２】根据大样本唇腭裂家族基因组范围的扫描数据分析得出在位于８ｐ１１．２３２０ｃＭ区域微卫星重复标志的ＬＯＤｓ（优势对数积分眨１．０，并有统计学意义。针对这一区域的基因组扫描之前未被用于唇腭裂的研究，其包含的基因也未被作为唇腭裂的致病候选基因而被广泛研究。１０个已知基因（ＦＧＦＲｌ，ＮＲＧｌ，ＦＺＤ３，ＳＬＣ８ＡＩ，ＰＰＰ３ＣＣ，ＥＰＨＸ２，ＢＮＩＰ３Ｌ，ＥＧＲ３，ＰＰＰ２Ｒ２Ａ和ＮＡＴＯ的ＳＮＰ位点对样本的８ｐ１１．２３区域进行精细的基因定位，连锁相关分析提示位于ＦＧＦＲｌ和ＢＡＧ４有统计学意义，提示了ＦＧＦＲｌ和ＢＡＧ４与唇腭裂之间的关系。
Ｒｉｌｅｙ等Ｉｘ３１对位于１１个ＦＧＦｓ／ＦＧＦＲｓ基因（ＦＧＦ２，ＦＧＦ３，ＦＧＦ４，ＦＧＦ７，ＦＧＦ８，ＦＧＦ９，ＦＧＦｌ０，ＦＧＦｌ８，ＦＧＦＲｌ，ＦＧＦＲ２和ＦＧＦＲ３）基因内部和附近上下游保守的非编码区进行测序，结果发现５５新的ＳＮＰ位点。有７个突变点在８种或以上的物种中高度保守，３１个突变点改变了转录因子的结合位点，其中８个与颅面部的发育息息相关。另外对应其前面的
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研究【２ＩＪ发现，１５个ＮＳＣＬ／Ｐ病人同时合并编码区和高度保守区的突变，这提示着ＦＧＦｓ／ＦＧＦＲｓ变异的累积效应可能导致唇腭裂的发生。
Ｏｓｏｅｇａｗａ等【４０１通过运用阵列．比较基因组杂交技术分析出生时合并唇腭裂的病例以鉴别候选致病基因位点上的缺失和重叠。在１０４个ＮＳＣＬ／Ｐ病例中发现一例在染色体１０ｑ２６．１１．２６．１３的位置有一个２．２Ｍｂ的缺失，分析患者父母ＤＮＡ标本后显示这一缺失遗传于其患有唇裂的母亲，这个缺失可能作为致病因素与样本的表型相关联。通过区分基因优先次序的软件分析，位于１０ｑ２６．１１－２６．１３部位的ＦＧＦＲ２被认为是可能的致病基因。
４、展望
由于唇腭裂复杂的病因学和不同的外显率，对该病分子水平的研究一直是个难点。最近在唇腭裂的病例中发现的几个ＦＧＦｓ／ＦＧＦＲｓ基因上的突变提示了ＦＧＦ信号在唇腭裂病因中的重要作用。然而需要进一步的研究去认识这些突变在功能上的影响和ＦＧＦ信号在唇腭发育中的分子机制。预期ＦＧＦｓ／ＦＧＦＲｓ突变在非综合征性唇腭裂中的作用占３％．５％左右１２４１。从生物学上讲，知道了与唇腭裂形成相关基因的四分之一可以帮助我们建立动物模型和通路，有助于我们扩展认识和寻找其他可能起作用的路径。如ＳＰＲＹｌ，２是ＦＧＦ信号的下游调控基因１４¨，目前已经在ＮＳＣＬ／Ｐ病人中检出ＳＰＲＹｌ，２突变。在ＳＰＲＹ２基因中检出的三个错义突变，其中两个是潜在的致病因素：Ｄ２０Ａ和Ｋ６８Ｎ１４¨。ＳＰＲＹ基因通过调节Ｒａｓ／ＭＡＰ通路来拮抗ＦＧＦ信号引起不同的生物学效应，如调节细胞增殖和分化１４¨。将来的研究方向将会是注重ＦＧＦ信号上游下游调节基因的突变扫描，将ＦＧＦ信号在唇与腭的发育形成过程中的作用定义得更为精确，为进一步认识唇腭裂的病因学提供一个突破口。
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四、实验方法
４．１标本收集
患儿来自东南大学附属中大医院、江苏省人民医院和南京市儿章医院的住院病人，对其父母亲进行临床资料的采集，总计７５个核心家庭（患者及其父母组成）。对照组为７５个正常对照儿童。分别７５个核心家庭及７５个正常对照儿童外周血２ｍｌ，经ＥＤＴＡ抗凝后，置．７０℃冰箱保存备用。
４．２外周血基因组ＤＮＡ的提取
①１．５ｍｌ离心管加９００ｐ１红细胞裂解液，再加３００１上ｌ全血，室温孵育１分钟，轻柔颠倒１０次。
②１６０００９离心２０ｓ，尽量多吸去上清，留下可见的白细胞沉淀物在１０．２０ｍ液体中。剧烈涡旋１０ｓ重悬残液中的白细胞至沉淀物不可见。
③重悬白细胞中加３００肛１细胞裂解液，吸打。将样品放冰上１分钟。各管加入１００山蛋白沉淀液，高速涡旋２０ｓ，使蛋白沉淀液与细胞均匀混合。
④１６０００９离心１分钟，沉淀蛋白为紧贴管壁棕黑色小点。
⑤将含ＤＮＡ的上清倒入新的１．５ｍｌ离心管，管内预先加入３００“１１００％异丙醇，轻柔颠倒５０次混匀ＤＮＡ与异丙醇。１６０００９离心１分钟，可见小白点即为基因组ＤＮＡ。
⑥倒掉上清，滤纸快速干燥，加３００ｐ１７０％乙醇，颠倒数次，１６０００９离心１分钟，小心地倒掉乙醇。干净滤纸上颠倒离心管，干燥５ｓ。加１００肛ｌ水合液，中速涡旋５ｓ。６５度水浴孵育５分钟也可延长至２小时或室温过夜。
⑦抽提出的ＤＮＡ保存于４＂Ｃ冰箱备用。长期保存置于．２０℃或．８０℃冰箱。
４．３测定ＤＮＡ纯度、量和完整性
４．３．１ＤＮＡ纯度及浓度
以ＤＮＡ检测仪测定ＤＮＡ纯度和浓度，记录。要求Ｒ值（ＯＤ２６０／ＯＤ２８０）大于１．６，纯度大于８０％，浓度大于５０肛ｇ／ｍｌ为佳。
４．３．２ＤＮＡ完整性
待ＤＮＡ完全溶解后，取３．５山ＤＮＡ样品，经１．５％琼脂糖凝胶电泳观测基因组ＤＮＡ完整性。
４．４引物设计
参照ＮＣＢＩ基因库公布的序列，用ｐｒｉｍｅｒ５．０软件设计引物。ＦＧＦＲｌ基因ｒｓｌ３３１７采用扩增产物限制性片段长度多态性（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＲＦＬＰ）法检测，引物设计要求包含酶切位点，且酶切位点前后序列相差至少＞２０ｂｐ。其余五个ＳＮＰ位点用基因芯片方法检测，引物设计要求目的片段长度以３００－４００ｂｐ为宜，其他要求同一般引物设计，下游引物５’端均被丙烯酰胺所标记。由于Ｐ．Ｍ３６９Ｉ和Ｐ．￥３９３Ｓ两个位点相距较近，所以共用一组引物。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
ＦＧＦＲｌ基因
（Ｄｒｓｌ３３１７序列：（前后标记部分为引物序列，羔为ＳＮＰ位点Ｃ／Ｔ，目的片段长度２６９ｂｐ，下划线部分为限制性内切酶ＭｓｐＩ识别序列）
５＇－ＡＧＧＣＡＴＡＣＣＡＡＣＡＡＧＡＡＡＣＧＡＡＧＣＣＡＧＧＧＡＣＣＴＧ№ＧＣＡＡＡＡＣＴＡＧＣＣＴＣＡＧＧＴＧＡＣＡＴＧＴＴＣＴＣＣＴＧＣＡＣＴＴＡＧＡＡＧＣＡ￡ＹＧ鱼ＣＡＡＡＡＣＣＡＴＧＣＣＣＡＣＡＴＡＧＡ
东南火学硕上学位论文
反应条件：９４℃预变性
９４℃变性
５９℃退火
７２℃延伸
７２℃延伸
４℃ＦＧＦｌ８基因ｒｓ４０４３７１６反应体系构成：
４ｍｉｎ４０ｓ３０ｓ４５ｓ４ｍｉｎ保存
去离子水
１０ｘＰＣＲｂｕｆｆｅｒ（Ｍｇ什ｆｒｅｅ）２５ｍＭＭｇＣｌ２１０ｍＭｄＮＴＰＴａｑＤＮＡ聚合酶２０１止ＭＰｒｉｌ］３ｅｒＦ２０Ｉ－ｔＭＰｒｉｍｅｒＲ?基因组ＤＮＡ模板１９．３５ｍ２．５Ｉｌｌ
１．Ｏｍ
０．５山
０．１５山
０．５山
０．５山
０．５ｍ
合计２５ｍ
４ｍｉｎ４０ｓ３０ｓ４５ｓ４ｍｉｎ保存
注意事项：每次实验均设置阴性对照，用去离子水代替模板。实验时，注意无菌操作，严防污染。戴一次性手套，在洁净工作台内加样。扩增前后的工作在不同的工作台面上进行。
４．６ＰＣＲ产物的琼脂糖凝胶电泳
①胶板的制备：用分析天平称取０．４５９琼脂糖并置入烧瓶，加入３０ｍｌ１ｘＴＢＥ缓冲液，微波炉中加热使之沸腾并完全溶解以配成１．５％琼脂糖凝胶，待凝胶冷却至６０℃时加入１％溴化乙锭（ＥＢ）Ｉ．５１ｔｌ，充分混匀。将温热的凝胶倒入已放置好梳子的胶槽中，倒胶过程缓慢以防气泡形成，凝胶厚度约为５－６ｍｍ。凝胶凝固后小心拔出梳子，将凝胶连同胶槽放入电泳槽中，加入ｌｘＴＢＥ缓冲液，使液面略高出胶面。
②上样：用微量移液器将３ｐｌＰＣＲ扩增产物和１ｍ１ｘＬｏａｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ混匀后加入样品孔内，对照孔内加入５ｐｌＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ２，０００。
③电泳和观察：１２０Ｖ下电泳１２分钟，至溴酚蓝指示剂到达凝胶远侧１／３处时，取出凝胶，用Ｇｅｎｅｇｅｎｉｕｓ紫外凝胶成像系统扫描凝胶。４．７ＦＧＦＲｌ基因ｒｓｌ３３１７扩增产物限制性片段长度多态性分析
４．７．１实验设计
扩增产物限制性片段长度多态性（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＲＦＬＰ）分析，其原理是检测ＤＮＡ在限制性内切酶酶切后形成的特定ＤＮＡ片段的大小。实验设计流程见下图：
性变性火伸伸预变退延延牝们∽龙抛℃９
９
６
７
７
４件条应反