在进行免疫沉淀前，需要取一部分断裂后的染色质做Input对照。Input是断裂后的基因组DNA，需要与沉淀后的样品DNA一起经过逆转交联，DNA纯化，以及最后的PCR或其他方法检测。Input对照不仅可以验证染色质断裂的效果，还可以根据Input中的靶序列的含量以及染色质沉淀中的靶序列的含量，按照取样比例换算出ChIP 的效率，所以Input对照是ChIP实验必不可少的步骤。
1.1.1 免疫沉淀
1）蛋白提取
（1）取10盘长满10 cm 大皿的Hep G2细胞，弃去培养基，用预冷PBS清洗细胞3次，吸净PBS残液。
（2）加预冷的裂解液（含蛋白酶和磷酸酶抑制剂）至培养皿中（每皿500-1000 ul），冰上孵育30 min。
（3）用细胞刮刮取，收集细胞裂解液并移至离心管，4℃离心13,000 g，10 min。
（4）将上清移至新离心管中，可用于蛋白浓度测定或远期研究。2）准备磁珠
（1）将protein A和protein G珠子分别摇晃5 min混悬，各吸取50 ul珠子到1.5 ml EP管中，组成100 ul 珠子混合物。
（2）小离心机离心20-30 s，去上清。
3）结合抗体
（1）将肝细胞癌患者血清20 ul 和200 ul Ab Binding & Washing Buffer 加入上述EP管中。
（2）室温旋转10 min孵育。
（3）小离心机离心20-30 s，去上清。
（4）加入200 ul Ab Binding & Washing Buffer，轻柔吹打重悬珠子。4）免疫沉淀
（1）将上述EP管离心，去上清。
（2）取5 ml蛋白裂解液轻柔吹打重悬珠子-抗体复合物。
（3）室温旋转孵育30 min（将抗原结合到珠子-抗体复合物上）。（4）离心机离心20-30 s，将上清吸入干净离心管备用。
（5）使用200 ul Washing Buffer 清洗珠子-抗体-抗原复合物3次，即轻柔重悬、离心去上清3次。
（6）100 ul Washing Buffer 重悬珠子-抗体-抗原复合物，将混悬液移至干净EP管。
5）洗脱目的抗原
（1）将EP管离心，去上清。
（2）加20 uL Elution Buffer，轻柔吹悬复合物，避免产生气泡。（3）室温旋转孵育2 min，分离复合物。
（4）EP管离心，将上清放吸入新EP管备用。
完成《WB实战指南》后，朋友曾央分享点免疫共沉淀方面的咚咚；当时不得不回绝。因为，WB指南是基于这些年的回复的汇总，基本上方方面面的问题都有提及，只需要做些串联；而论及coIP，目前在国内还不太普及，尽管它已经是生化领域最基本的技术之一。因此，再想写这么个长篇颇耗时间，于我的时间和精力太为难；不过，今天是个特殊的日子，凑凑热闹吧。——人，如果在某些方面成功了，必然在另外一面有亏欠，也许这就是上帝的公允吧。——在自己最擅长的地方找点成功的感觉吧，当然我的失败也只是因为没有更多的时间。。。哎！扯远了
玩coIP也玩了5年多了，因为上手就是最难的B蛋白结合量多少的变化（假定IP A蛋白）而非检测B蛋白的有无，说句吹牛皮的话，在我们这个小领域三家最强的lab唯有我们敢于通篇基于这种检测手段，所以，对于coIP算是非常得有心得了。以下论述基于最难的B蛋白结合水平变化的检测，所以部分实验操作非常苛求；学会这个，其他就是小菜了；所以，这也算一个进阶篇。
一.样品的制备。
如《WB指南》，在这里我最强调从制备样品开始的一致性。如果不触及细胞的凋亡或死亡，那么任何处理组样品和ctrl最后的终体积应该保持一致；如果细胞有大量凋亡或死亡，可以通过比对标准体积对样品的体积粗略定量后再加裂解液，一般可以把误差控制在WB的检出范围以下，基本保持样品的均一；组织样品可以通过称重添加相应体积比的裂解液。
裂解液的配方可以采用《WB指南》里给出的，原配方如下：20mM Tris/HCl, pH7.6, 100mM NaCl, 20mM KCl, 1.5mM MgCl2, 0.5% NP-40 and protease inhibitors（0.5M PMSF)
此裂解缓冲液裂解条件相对温和，适合后续的coIP分析。
“不过”用它做coIP有明显的缺陷；
要理解此配方的缺陷，我们先聊聊如何在coIP实验中“作伪”。
伪造结果，也分为单纯性造假和技术型伪造。撇去前者，从技巧上来讲，如果要想获得设定、预想的相互作用结果，可以从几个角度着手——此类结果可重复。
a.在低盐离子裂解液中进行IP。
很多蛋白复合体对盐浓度敏感，但敏感性有强弱之别。通常来说，真实存在着的蛋白复合体能耐受生理盐（0.15M）或更高浓度，即在生理盐浓度下不会解体。具体如，某种CDK和Cyclin其牢固程度能耐受0.8-1.0M 以上的高盐而不解体，即使其抑制蛋白CKI能耐受0.6M以上高盐。因此，了解一个蛋白复合体对盐浓度的耐受，既是一个帮助判断蛋白复合体是否真实存在的一个重要依据，更是一个非常重要的生化数据；对某些体外生化反应的蛋白原料的纯化制备也是很重要的辅助依据。例如，纯化有生物活性的CDK和Cyclin，如果采用盐浓度漂洗，则最低需0.6M以上以解离CKI。所以，在生化领域的coIP分析中，很多实验体系的盐浓度是比生理盐浓度更高的。当然，不排除某些弱相互作用需要生理盐浓度，但这种情况不多见；也容易跟瞬时的相互作用混淆，某些实验中的弱相互作用实际是由于生化反应的瞬时性，且缺乏有效的截留、富集手段，诸如酶和底物。
很多非生化领域的，喜欢在生理盐或更低盐浓度下进行coIP，这大大增加了假阳性的几率——很多蛋白间非特异性的黏粘被记录下来。这也成为了获得“设定的”相互作用的有效手段。
b.过表达。
现在已经存世的相当多的实验论文和数据，其蛋白复合体相互作用的数据是通过过表达，甚至原核GST pulldown获得的；笔者认为，在阅读这类文献时，大家要特别小心，多长一个心眼——即始终抱怀疑的态度。并非说一定不可取，但是有一点很明确，这样的数据送到我们手里，首先我们会要求对方补充内源性蛋白相互作用的证据，否则该结果一律不采信。
在《WB指南》里面我提过，血清中丰富的BSA可以被任意抗体识别（其实也是一种相互作用），那么同理高丰度的两种或多种蛋白人为拼凑到一起，为什么不可以非特异性的黏粘或者发生弱的相互作用呢？
因此，如果想要“特定”的相互作用，可以考虑过表达所有的蛋白，就是核蛋白结合胞浆蛋白甚至膜表面受体也不稀奇。
c.不添加NP40一类表面活性剂，削弱对非特异性结合的拮抗。
NP40除可以在膜上穿孔外，也可以有效的拮抗非特异性的蛋白相互作用，提高coIP的特异性。因此，减少或不添加NP40也可以辅助“预期”目的。
实际上，掌握a、b两点技巧，基本上可以“无往而不胜”——彻底搞定一切“想要的”相互作用。
基于以上的原因，如果想获得切实可靠的相互作用数据，那么裂解液的选取相当讲究。
1.首先盐浓度至少0.15M或以上。
盐浓度主要指Na盐浓度。有人会问为什么不是钾盐？因为钾盐会更容易跟某些试剂（或离子）形成沉淀，诸如SDS，因此在某些情况下，钾盐会对后续的某些实验带来未知的麻烦，所以一般盐浓度指Na盐。盐浓度过低对某些与染色体结合较牢的蛋白的抽提（非破膜的温和裂解）效率也较差，可能会丢失部分信息；而盐浓度过高又会造成某些相互作用较弱的复合体解体，因此，通常选择0.15——0.3M做细胞裂解。纯化蛋白通常选取0.6M以上进行IP。
小技巧：最初几遍的漂洗buff要和IP时的盐浓度相同。经验上，纯化蛋白时，若用低盐裂解细胞、高盐漂洗去杂质，蛋白丢失较多；所以，一般如前所述。当然，也可以高盐裂解低盐漂洗，但是对除杂质不利。
2.通常IP体系中NP40含量0.2——0.5%。NP40在0.5——1.0%时，染色体很容易析出（很黏，成胶状会裹住beads，同时粘下很多蛋白），用这样的裂解液破碎细胞则可能需要超声。通常由于习惯上避免增加不必要的操作，所以在非必要的情况下，选择前述的浓度区间。
3.可适当添加EDTA，螯合金属离子保护DNA和蛋白。特殊情况下还可选择添加EGTA，螯合Ca2+研究钙相关蛋白。此外，裂解液中甘油浓度一般介于15%-20%之间。
4.很多市售或自制的裂解液过于温和，需要考虑采用机械或者超声等手段提高裂解效率（超声要慎用，可能破坏弱的相互作用）。但是，有些时候裂解液的冻融又可能影响某些弱的相互作用，所以不太建议冻融裂解液——即最好裂解液制备好后立即进行coIP。当然，如果证实冻融无影响可考虑将蛋白样品保存-80度待用，这对实验日程的安排会更平易。
5.裂解产物的蛋白浓度越高越好。前几日回复一贴子，不知道出于什么动因该LZ主动稀释裂解样品的蛋白浓度再IP，所幸不是做coIP。上面提到过表达会制造相互作用的假象，反过来说蛋白浓度过稀，某些相互作用就测不到（不一定是弱的相互作用）。因此，细胞的裂解效率会直接影响实验的结果。通常细胞裂解产物的蛋白浓度可达7-8mg/ml左右，但是更常规的现象是达不到这种浓度；当然不是说低于7-8mg/ml就不能进行coIP，只是需要考虑这一因素。因此，在多数情况下要尽可能避免稀释你的细胞裂解液。
【补充1】：
切记！实验要先有结果再来挑战极限！
在不少人的提问给出的流程中，其开始的样品量往往是以6 well或者60mm dish为单位的；不否认某些蛋白或复合体确实可以在如此苛刻的条件下完成coIP。但是，更多的时候不是这样子的。以我自己研究的复合体为例，其内源性IP最低起始细胞数是40-50% confluence的145mm dish；比这个数目更低，实验结果就很不稳定甚至无信号。当某些药品、试剂非常昂贵时，鄙人才会勉为其难。否则，一律2 dishes 100% confluence，可以elute成30ul跑两次；相互作用微弱时，15ul仅跑一次；再弱，多养几块板（CE增加抗
体和beads仍可保持不变，因此只浪费培养基总比浪费一个冗长的时间走麦城要好）。后续若为质谱分析，需考虑小规模量产。
二、IP前的准备工作：
coIP:分为内源性蛋白的相互作用和非内源性蛋白相互作用（后者包括外源蛋白之间以及外源拖内源蛋白）。非内源性蛋白的相互作用，主要是通过过表达来实现，通常为简化实验、提高IP效率会让外源蛋白带上标签（tagged；这也是没有相应的可用于IP的内源蛋白抗体之前唯一可行的方案），因此就tag的使用而言存在很多小技巧。
a.His-tagged主要用于纯化蛋白。有些人喜欢用His-tagged蛋白然后进行coIP，实际上它存在潜在的隐患。当初鄙人用Sigma a-His（鼠单抗；免费广告）WB外源蛋白发现CE里面一塌糊涂（带型漂亮就是非常多的带），那时候还抱怨这个抗体特异性不好。后来，当了解到很多蛋白会有富含histidine的domain以后，恍然大悟，恰恰是因为效价非常好，所以很多内源性的蛋白都被该抗体识别。同理，如果用Ni-NTA beads 去PD His-tagged的蛋白，完全有可能PD那些内源性的富含histidine domain的蛋白，造成coIP的假象，而这样的蛋白还非常多。
那么，当初开发His tag的主要目的，个人认为主要是可以用廉价的化学试剂洗脱，且Ni-NTA beads这类非抗体类的beads成本低廉，可大量工业生产。因此，用这个tag去生产有活性的蛋白是首选。
b.tandem-tagged不能用于分析钙调信号通路。tandem tag实际上从成本角度和His tag差不多，洗脱试剂价格低廉，因此可用于大规模PD之后的质谱分析，能获取最全面的相互作用的信息。然后由于其中包含钙调蛋白相互作用domain，天然会结合钙信号相关蛋白，从而干扰或掩盖靶蛋白与钙信号蛋白之间的相互作用，有一定的应用局限。当然，笔者不太清楚近年来该方法有无改进，但正是由于引入钙调domain 才实现了降低成本的目的，因此猜测可能性不大。
c.Myc、HA、Flag-tagged：
Myc仍然会有天然的干扰，应用略有局限；相较后两者是人工合成专门用于tagged蛋白（有相应的专利，因此目前无论抗体或交联好的beads价格都非常昂贵），因此干扰最小、最常用。如需进一步细致区分，a-Flag 效价比a-HA略高，因此更适合IP。当然，公司仍在努力寻找效价更好的a-HA以及IP HA的抗体（Flag 系Sigma专利，因此目前只能忍受其过高的定价）。那么，之前颇流行的a-HA鼠源单抗（其clone名称为12CA5）为何被潜在地摒弃了？
原因大概是：该克隆株可以轻易获取，流传甚广，因此可以取腹水自制；效价不高，特异性很差。尤其是特异性的问题，用该抗体去交联的beads做coIP，隐患很大（可以轻易PD非常浓的非特异性蛋白）——因此，购买商品化a-HA beads时，请仔细阅读产品说明（避开12CA5系列）。
还有GST等等，不一一列举了。
d.tag的位置。将tag构建到蛋白的N端还是C端，也是一个潜在的能够影响coIP结果的因素。比如，分泌蛋白的N端通常有分泌信号肽，如果将tag构建到N端，则外泌时会被信号肽酶连同信号肽一起切除；所以这时必须构建在C端。再如，多数蛋白的C端是疏水区，有的时候将tag构建在C端会影响蛋白原来的空间结构，如恰好C端同时是相互作用的结构域，某些时候还可能被遮蔽，从而干扰相互作用。因此，通常构建质粒的时候是N端、C端tagged同时分别构建，以备万一。
内源性蛋白的相互作用，主要依靠抗体IP，WB或者质谱分析。另外一条途径，是用外源性蛋白的coIP指代内源性蛋白，上文提到的tandem-tag技术的目的就是为了实现这种可能。它的核心是将外源性蛋白的过表达降低极低水平用于模拟体内环境。实际上，在构建外源过表达体系的时候，通常可以得到一系列表达水平差异的稳定单克隆，可以通过进一步筛选获得外源与内源相加与原内源蛋白水平相当的细胞株（在细胞调控承受的范围以内，内源性蛋白水平会因为相应的外源蛋白表达而适当下调），这样的细胞株可以用于模拟内源性蛋白的相互作用；因为理论上未改变细胞的生理特异，相应的生命过程仍受内源因素调控。
当然构建相应的细胞株需要转染并筛选，又因为要控制表达量水平，筛选工作耗时更长；并且细胞状态会
因为传代过多而有些改变。因此，绝对的内源性蛋白的相互作用仍是一个不可或缺的数据，尤其对一个新发现的蛋白复合体。
IP内源性蛋白首先要确认相应的抗体是否能够用于IP。能够用于IP的抗体，通常其识别区域恰是天然状态下靶蛋白暴露于外的区段，常为疏水性结构域；因此在自己制备抗体的时候要更多考虑这个因素，至于商品化的要仔细阅读说明。
在确定抗体可以用于IP A蛋白以后，抗体投入量如何掌握呢？通常情况下0.1ug-3ug较常用（纯化的抗体），其变化取决于抗体的效价，但通常未知情况下0.5ug或1ug是最常用。一般如果样品易制备则尽量用样品过饱和抗体，让投入抗体能物尽其用；相反，通常1ug抗体已经是过量的。
另外一个需要考虑的因素是B蛋白的大小，尤其B蛋白已知。当B蛋白分子量接近55KDa或24KDa附近的时候，问题会比较复杂。因为在最后一步洗脱的过程，很容易将轻链和重链带入到IP终产物，它将严重干扰实验结果。
解决方案：
1. IP外源tagged-A蛋白，洗脱尽量用相应的peptide，一方面提高特异性，另一方面由于洗脱条件温和，重链和轻链脱落也会较少；在IP前，尤其对于新Flag、HA beads可以用washing buffer或者低pH Glycine-HCl漂洗一下beads，把结合不牢的重链和轻链先洗掉。此外，Flag、HA-beads通常是鼠抗，那么IB B蛋白的抗体应该选用兔抗。
针对beads的新旧，反过来说，采用再生的旧beads有利于避免轻重链的干扰，且IP前的封闭可以省去——不要指望高盐、酸洗能彻底去除已经非特异结合到beads上的杂质，通常这些蛋白都比较黏。高盐、大量纯化蛋白时，采用再生的beads可以获取即便银染，背景仍非常干净的高纯度蛋白样品。
2. IP内源性蛋白，尤其最后涉及低pH Glycine-HCl洗脱或者SDS LB煮beads（后者重、轻链更严重），如B蛋白为60KDa即能与55KDa重链分开时，且抗体效价许可的前提下，降低抗体投入量会显著减弱重、轻链信号，从而不会使得B蛋白信号不致被重链信号吞没；若有条件再配合交错抗体种属来源，即IP A蛋白的抗体为兔抗，IB B蛋白用兔抗以外任何一种诸如鼠抗、羊抗；反之亦然。即使交错抗体的种属，实际上当重轻链脱落过多时（尤其是重链），在IB的时候它符合《WB实战指南》提到的杂蛋白过浓会非特异结合任意抗体，这在coIP的实验结果分析中要格外小心。有人会说可以用未免疫的IgG做阴性对照，但是偶尔会发生一些未知意外，恰好IgG的重链没有显影（毕竟这不是抗原抗体特异性结合）。【BTW：偶尔这样的结果还能重复出来，但是反过来IP B蛋白，IB A蛋白可能就100%失败。所以，当蛋白分子量接近重、轻链的时候，下结论要格外小心，除严格阴性、阳性对照外，reverse IP的结果也很重要。最好加一个不相干的蛋白的同种属的抗体做阴性对照】
beads封闭和样品的preclear：
如果采用新beads，beads的封闭就显得非常必要。封闭用1-5mg/ml BSA（ChIP还要加鱼精DNA）扔buffer 里一直静置就好了；若临时添加可考虑翻转半小时；样品preclear用protein A beads翻转半小时。实际经验，杂蛋白若是很黏怎么处理都只是相对好一些。所以，IP、漂洗的盐浓度影响更大。
coIP：
抗体剂量上文提过了；其他flag、protein A等等beads一般用10ul足够了，偶尔根据需要微调，诸如过表达纯化蛋白。总之，一般CE的成本较低，若用CE饱和抗体、beads，只要你抗体、beads和操作始终一致，最后IP的A蛋白能保证一致，结果有效。
干粉状的beads用IP buffer充分溶胀后离心去beads的碎片；其他液态的不需要此过程。现在市售的商品化beads如sigma flag可不需要IP buffer漂洗直接IP，未发现对coIP结果的明显干扰。通常，再生的beads 由于放置-20度延长保存期需要加入大量甘油，不漂洗直接使用不容易把beads分匀，从而造成不同tube 间初始差异，这时候会对IP结果影响很大。
用抗体做内源性IP时，个人喜欢抗体2hr+beads 1hr，抗体孵育可过夜；beads不超过3hrs（含flag等等标签蛋白IP情况）。这里面提到一个细节，就是先加beads还是先加抗体。在某些情况下，CE离心去除细胞碎片后的上清是一个刚好的溶解平衡体系，添加其他物质如beads这类可作为沉淀凝结核的物质会破坏原本的溶解平衡；它可能类似水蒸气凝结成雨水或雪花需要灰尘作为凝结核，其结果就是让一些原本溶解完全的蛋白发生沉淀。那么，beads翻转越久蛋白会沉淀越多，而这种沉淀无法靠漂洗去除干净，最终进入sample从而可以检测到任意蛋白的结合。因此，限制beads翻转孵育时间非常关键；通常beads孵育1-2hr已经充分结合了。
做IP的beads其物理性质跟吸附DNA的或诸如Ni-NTA之类的差异很大，不需要高速离心，通常台式小离心机4-5K、30sec就足够了；有时候忘记了，静置较久beads已自然沉降甚至不需要离心。在这种情况下，不必要的高速离心只会给beads施加巨大的离心力，次数多了beads通通碎裂，严重影响再生beads的质量——避免一些不必要的操作；当然不打算重复使用就无所谓了。
。。。
Beads再生：
商品化的beads尤其抗体交联的，因为抗体和专利的原因价格相对昂贵，那么回收beads并再生就显得非常必要。保管得好（防霉变），beads可以重复用20-30次。
再生beads没有什么特别的，常做生化柱层析的，那简直就是家常便饭。IP用beads的再生，也无非就是高盐接酸洗再高盐，最后用IP漂洗buffer复性，加甘油和NaN3扔-20度长期保存。
高盐即3M NaCl；酸洗，就是可用做elution buffer的0.1M pH3.0的Glycine-HCl。IP beads尤其抗体交联的，由于昂贵再加实验和回收过程的损失一般体积不大，所以Biorad公司一种小型塑料的柱层析管用来再生beads最合适（它是一次性的，但仅仅用于再生beads可以无限重复使用）；而常规的玻璃生化层析柱即便最小号的也太大，黏壁损失会很大，beads再生几次可能就全损失了。
再生操作就类似做DNA大抽的KIT，加液体到层析柱、控制流速让其一滴滴流下；再生质量可以通过改变酸、盐的体积控制，希望干净点多加一些、多洗几遍。
唯一需要注意的，由于再生流程通常要耗费半天时间，beads太少不值得操作且再生次数越多黏壁损失也越多；所以，通常都是等回收的旧beads积攒到一定体积再一次性操作。前文提过，IP用的beads通常不需要离心就会自然沉降，而积攒旧beads通常是一个很漫长的过程，那么等到决定再生的时候，beads可能因为静置过久而已经压挤得非常结实；直接重悬beads转移到层析柱里，你会发现液体根本流不下来。因此，对于静置很久的旧beads通常在回收前一天高速翻转过夜，这时候再把beads转移到层析柱中就会相对疏松，酸、盐洗涤就会比较流畅。同样的原因，再生过程中通常就是流速越来越慢，再生次数多的旧beads其内含的灰尘、颗粒也较多，可能最后液体就不滴了；这时候只能用枪反复吹吸、松松beads。当然，这些问题都只在beads体积较大的时候时明显，如果本来就不足1ml，以上就全是废话。
PS:此篇更新会相当慢，尽量不太监，请见谅——先留个爪
有感于坛友对本文的关注：
【近况】：非常抱歉最近一直没更新，原因主要有二。
1. 思路中断。这篇要全新写，通盘的概念是有的，但对于每个细节以及内容的衔接很模糊，很难下笔；因为即使勉强著述，按个人行文的习惯，前后修改等于重写，时间需要很久。
2. 最近忙于结尾自己的手头课题，拼尽全力追求进度，连续多日工作14-16小时以上，身体已多次出现过劳体征；还要应付研究以外的工作，实在无暇顾及这边。
目前，我优先保证问题的回复。
exciting news: paper accepted!
BTW:个人还是喜欢先回复再写一个总结，因为接触到的问题会比较全面，诸如最近好几个人提问时，给出了详细的流程，这很好；可是当我看到第一步，就知道下面不用细看了。可能很多人都喜欢在刀尖上跳舞玩心跳，不过我个人还是喜欢稳稳当当先有结果再来跳舞——为什么很多人起始细胞量只有6孔板、60mm dish，大家都喜欢这么虐待自己嘛——让心灵承受一次次实验无信号的打击！？！？！？
因此，我也知道在制备CE那一部分需要补充强调的东西。
免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术（比如流式细胞仪）测定含量。 紫外光激发荧光物质放射荧光示意图 免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透（或称为透化）、封闭、抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备（通俗的说法是细胞爬片）是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。这一步关键的是玻片（Slides or Coverslips）的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法（如ELISA或Western Blot）中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。 由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。 基本实验步骤：
United States/Canada 800.662.2566Asia Paci?c +1.650.919.7300Europe +33.(0)1.3904.6880Japan +81.(0)77.543.6116Clontech Laboratories, Inc.A T akara Bio Company U s e r M a n u a l Antibodies Protocol Guide PT3407-1 (PR99224) Published 14 September 1999
Antibodies Protocol Guide Table of Contents I. Introduction 3 II. Materials Required 3 III. Western Blotting 4 A. Preparation of Cell Lysate and Electrophoresis 4 B. Western Blotting 5 IV. Immunoprecipitation 6 A. Preparation of Cell Lysate 6 B. Immunoprecipitation 7 V. Immunofluorescence and immunocytochemistry 8 A. Sample Preparation 8 B. Immunofluorescence 9 C. Immunocytochemistry 9 VI. ELISA 11 VII. References 12 Notice to Purchaser Clontech products are to be used for research purposes only. They may not be used for any other purpose, including, but not limited to, use in drugs, in vitro diagnostic purposes, therapeutics, or in humans. Clontech products may not be transferred to third parties, resold, modified for resale, or used to manufacture commercial products or to provide a service to third parties without written ap-proval of Clontech Laboratories, Inc. Clontech, the Clontech logo and all other trademarks are the property of Clontech Laboratories, Inc. Clontech is a Takara Bio Company. ?2006
免疫荧光操作步骤及注意事项 免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术(比如流式细胞仪)测定含量。 紫外光激发荧光物质放射荧光示意图 免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透(或称为透化)、封闭、抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备(通俗的说法是细胞爬片)是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。这一步关键的是玻片(Slides or Coverslips)的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法(如ELISA或Western Blot)中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4?或-20?避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。
由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。 基本实验步骤: (1) 细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次;对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤(1000rpm,5min)2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。 (2) 固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4?保存3个月。PBS洗涤3×5 min. (3) 通透。使用交联剂(如多聚甲醛)固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min.通透后用PBS洗涤3×5 min. (4) 封闭。使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min. (5) 一抗结合。室温孵育1h或者4?过夜。PBST漂洗3次，每次冲洗5min. (6) 二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。 (7) 封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。 (一)细胞准备 用于免疫荧光实验的细胞可以是直接生长在盖玻片上的贴壁细胞，也可以是经过离心后涂片的悬浮细胞或者是将取自体内的组织细胞悬液离心后涂片。贴壁良好
免疫共沉淀实验原理及方法 免疫共沉淀（CoIP）概述及原理 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）是研究蛋白-蛋白间相互作用的经典方法，属于免疫沉淀技术的一类，常被用于鉴定特定蛋白复合物的中未知蛋白组分。免疫共沉淀的设计理念是，假设一种已知蛋白是某个大的蛋白复合物的组成成员，那么利用这种蛋白的特异性抗体，就可能将整个蛋白复合物从溶液中“拉”下来（常说的“pull-down”），进而可以用于鉴定这个蛋白复合物中的其他未知成员。免疫共沉淀的特点可以概括为两点，第一是天然状态，第二是蛋白复合物。 免疫共沉淀的优势： 与其他研究蛋白质相互作用技术（如GST-Pull down、酵母双杂交等）相比，免疫共沉淀鉴定的相互作用蛋白是在细胞内与目的蛋白发生的天然结合，避免了人为的影响，因此符合体内实际情况，得到的蛋白可信度更高。 免疫共沉淀的局限性和注意事项： 1. 免疫共沉淀是建立在蛋白复合物成员间彼此紧密结合的基础上，意味着松散结合的蛋白组分很可能检测不到； 2. 由于蛋白质形成复合物以后，某些表位就会被掩盖，因此可能导致使用某一种pull-down抗体，无论怎么增加抗体浓度，也极少能将不到一半的目标蛋白复合物沉淀出来，如有必要最好使用多种不同抗体分别进行CoIP；
3. 由于检测的是天然状态，因此在不同的时间和不同的处理下，CoIP拉下来的蛋白复合物都可能是不同的，当然随着实验次数的增加，得到的蛋白复合物成员也会越来越庞大； 4. 如果使用Western Blot的方法检测的蛋白复合物中的目标蛋白，则需要在试验前进行预测，具有一定的冒险性；当然如果将蛋白复合物直接进行质谱分析就不存在上述问题，但需要得到较高纯度和浓度的蛋白复合物样品也非易事，并且成本较高； 5. CoIP鉴定得到的蛋白间相互作用可能是直接作用也可能是间接作用，进一步区分还需要进行GST-Pull down等实验检测； 6. 为了保证CoIP实验的可靠性和严谨性，需要使用复合物的不同成员分别独立进行CoIP实验，并且结果应该能够彼此验证，因为原则上使用复合物的任一成员进行CoIP都会得到其他所有成员[1] 免疫共沉淀的一般操作流程（中英文对照）：
细胞免疫荧光步骤集团文件发布号：（9816-UATWW-MWUB-WUNN-INNUL-DQQTY-
方法一： 1.首先需要把细胞养在玻璃片上（悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻 璃片） 2.然后在4％PFA里面室温下固定30分钟，PBS洗两次，0.1% TX-100室 温下作用1－2分钟使细胞膜通透。 3.接下来进行荧光标记，需要在一个大的容器（面积大，扁平状的，比如 大的培养皿）里面，放一张用水打湿的滤纸，以保持湿度。 4.剪一片合适大小的parafilm，在上面滴上稀释在1％BSA/TBS中的一抗 （稀释倍数依具体抗体而定），每个玻璃片30ul足够，把玻璃片盖在上面（细胞面朝下），室温下孵育30分钟，然后在PBS里洗三次。 5.接下来二抗孵育步骤同上。 6.最后，在载玻片加上mounting medium（大约每个玻璃片加10ul），把 玻璃片放上去（细胞面朝下），37度30分钟，然后就可以在荧光显微镜下观察了。 7.抗体很重要，不能有非特异性结合。你可以先做WB检测一下你的抗 体，看看有没有杂带。 8.双标的话，可以把两个一抗一起加或者分别标记两次（可以都试一下看 看那种方法合适）。如果一个抗体需要二抗，一个是直接荧光标记的，可以把荧光标记的那个和另外一个的二抗一起加。 方法二： 1.选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit和rat 的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti- rabbit-FITC（绿）和donkey anti-rat-Tex-Red（红）。 2.我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵 育时间要仔细摸索，我感觉一抗4度孵育过夜比较好，背景比较清晰。 3.我的阳性对照用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的 IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。 4.封闭血清与二抗来源动物一致，我用的是10%的正常donkey血清。 5.其余步骤同一般免疫荧光单标操作。 方法三：
Pierce? Co-Immunoprecipitation (Co-IP) Kit（26149） 中文说明书 介绍： Thermo 公司的Pierce?免疫共沉淀试剂盒，可通过将铆钉抗体固定在琼脂 糖支撑物上，从裂解液中或其他复杂混合物中，分离出天然蛋白复合物。Co-IP 是一种研究蛋白与蛋白相互作用通用的方法，该方法使用一种诱饵蛋白与抗原 进行免疫沉淀反应，然后可通过免疫共沉淀任何与诱饵蛋白具有相互作用的猎 物蛋白。传统的Co-IP方法使用蛋白A或G共同洗脱抗体的重链和轻链，这很 可能导致将相关的蛋白一起洗脱下来，掩盖一些重要的结果。Pierce?免疫共沉 淀试剂盒通过将共价结合抗体固定在一个胺类活性反应树脂上解决了这一问题。该试剂盒包含足够的用于蛋白结合和恢复的缓冲液，完成对照试验的高校离心 柱和收集管，这些产品进一步缩短了操作实验的时间。 重要产品信息： 略 Co-IP实验步骤： A.抗体固定 注意：以下试验步骤是针对用无胺和其他载体蛋白稀释的10-75μg亲和纯 化抗体（参考重要产品信息一节）。根据实际使用比例参考这一协议步骤。参 考重要产品信息节表1中的建议抗体用量和树脂体积用量。 1.室温平衡胺连接耦合树脂（AminoLink?Plus Coupling Resin）和试剂； 2.为每个Co-IP反应准备2ml 1×Coupling Buffer（超纯水稀释20×Coupling Buffer）；
3.轻轻涡旋混匀装有AminoLink?Plus Coupling Resin的瓶子，使其处于悬浮状态。使用大口径（或剪掉一段枪头端），添加50μl树脂悬液到Pierce提供的离心柱中，将离心柱放入微量离心管中，1000g离心1min，弃滤液； 4.添加200μl 1×Coupling Buffer 清洗树脂2次，离心弃滤液； 5.将离心柱放于纸巾上，轻巧离心柱底部，去除剩余的液体，插上底塞； 6.准备10-75μg亲和纯化抗体用于结合蛋白，调整体积至200μl，使用足够的超纯水和20×Coupling Buffer来制备1×Coupling Buffer。例如：添加10μl 20×Coupling Buffer，180μl超纯水和10μl浓度为1μg/μl。可直接添加含有超纯水、20×Coupling Buffer、亲和纯化抗体的树脂在离心柱中。 7.在通风厨中，每200μl反应体系，添加3μl氰基硼氢化钠溶液； 注：氰基硼氢化钠属剧毒物质，操作时要小心并穿戴防护服。 8.拧紧离心柱上螺帽，室温涡旋孵育90-120min，确保浆体在孵育过程中处于悬浮状态； 9.握紧底塞，拧开并拿走螺帽，将离心柱置于收集管中离心，保存滤液以便验证抗体耦合； 10.打开螺帽，添加200μl 1×Coupling Buffer，离心弃滤液，重复此步骤1次； 11. 向离心柱中添加200μl Quenching Buffer，离心弃滤液； 12. 将离心柱放于纸巾上，轻巧离心柱底部，去除残留液体，插上底塞。在树脂上添加200μl Quenching Buffer； 13. 在通风厨中，添加3μl氰基硼氢化钠溶液，拧紧螺帽；轻轻摇动并孵育15min； 14.取出底塞，拧开螺帽，将离心柱置于一收集管中，离心弃滤液； 15.打开螺帽，采用200μl 1×Coupling Buffer洗脱树脂，离心。再次重复此步骤； 16.用150μl Wash Solution洗脱树脂6次，每次洗脱后离心； 17.不管是进行细胞裂解、Co-IP，还是储存树脂，都需要继续进行下列步骤； 18.用200μl 1×Coupling Buffer洗脱树脂2次，每次需离心；
细胞免疫荧光实验步骤 细胞免疫荧光实验步骤 简单实验步骤如下: 1.漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小时. 2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟 3.PBS洗净:3min＊3 4.1%Triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS 5.PBS洗净:2＊5min 6.羊血清封闭：３７度，２０分钟 ７.一抗，４度过夜，一般要大于１８小时或者３７度１－２小时 ８.４度PBS洗净，３min＊５次 ９.二抗３７度小于一小时 １０.３７度PBS洗净，３＊５min 凉干封片（封闭液ＰＨ８.５） 活细胞免疫荧光技术－流式细胞仪标本的制备 （一）制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、 胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法) ↓ 用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为 5×10６～１×10７／ml ↓ 取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl) 的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS 稀释)灭活正常兔血清 ↓4℃ 30min 用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右 1000rpm×5min
↓ 弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠 (或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇 ↓4℃ 30min 用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右 1000rpm×5min ↓ 加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入 1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察， 视细胞浓度加入100～500μl固定液) ↓ FCM检测或制片后荧光显微镜下观察 (标本在试管中可保存5～7天) （二）试剂和器材 1. 各种特异性单克隆抗体。 2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。 3. 10％ FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。 4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。 （三）注意事项 1. 整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN ３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。 2. 洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。 3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。 4. 细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。 附: 1. DPBS (×10, 贮存液)
创作编号： GB8878185555334563BT9125XW 创作者：凤呜大王* 方法一： 1.首先需要把细胞养在玻璃片上（悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片） 2.然后在4％PFA里面室温下固定30分钟，PBS洗两次，0.1% TX-100室温下作用1 －2分钟使细胞膜通透。 3.接下来进行荧光标记，需要在一个大的容器（面积大，扁平状的，比如大的培养皿） 里面，放一张用水打湿的滤纸，以保持湿度。 4.剪一片合适大小的parafilm，在上面滴上稀释在1％BSA/TBS中的一抗（稀释倍数 依具体抗体而定），每个玻璃片30ul足够，把玻璃片盖在上面（细胞面朝下），室温下孵育30分钟，然后在PBS里洗三次。 5.接下来二抗孵育步骤同上。 6.最后，在载玻片加上mounting medium（大约每个玻璃片加10ul），把玻璃片放上 去（细胞面朝下），37度30分钟，然后就可以在荧光显微镜下观察了。 7.抗体很重要，不能有非特异性结合。你可以先做WB检测一下你的抗体，看看有没 有杂带。 8.双标的话，可以把两个一抗一起加或者分别标记两次（可以都试一下看看那种方法 合适）。如果一个抗体需要二抗，一个是直接荧光标记的，可以把荧光标记的那个和另外一个的二抗一起加。 方法二： 1.选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit和rat的抗体，二抗则 是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC（绿）和donkey anti-rat-Tex-Red（红）。 2.我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要仔 细摸索，我感觉一抗4度孵育过夜比较好，背景比较清晰。
精心整理 免疫共沉淀详细步骤 实验原理 当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互白质Y beads ）蛋1.RIPABuffer 配制： 基础成分： Tris-HCl （缓冲液成分，防止蛋白变性） NaCl （盐份，防止非特异蛋白聚集）
NP-40（非离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存液） 去氧胆酸钠（离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存液；避光保存） 注意：准备激酶（致活酶）实验时，不要加去氧胆酸钠，因为离子型去污剂能够使酶变性，导致活性丧失。 RIPA蛋白酶抑制剂 EDTA RIPA 激活的 NaF（ 2. 配制 1) 直到全部溶解，用HCl调节PH值到7.4 2)加10ml10%的NP-40 3)加2.5ml10%的去氧胆酸钠，搅拌，直到溶液澄清 4)加1ml100mM的EDTA，用量筒定容到100ml，2-8℃保存
5)理论上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入（抑蛋白酶肽，亮抑酶肽，胃蛋白酶抑制剂各100μl；PMSF，Na3VO4，NaF各500μl），但是PMSF在水溶液中很不稳定，30分钟就会降解一半，所以PMSF应该在使用前现加，其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定5天。 各种成分在工作液中的终浓度： 预冷PBS，RIPABuffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机 1.用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS； 2.加入预冷的RIPABuffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶， 0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)； 3.用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃，缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上）；
方法一： 1.首先需要把细胞养在玻璃片上（悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片） 2.然后在4％PFA里面室温下固定30分钟，PBS洗两次，0.1% TX-100室温下作用1－2分 钟使细胞膜通透。 3.接下来进行荧光标记，需要在一个大的容器（面积大，扁平状的，比如大的培养皿）里面， 放一张用水打湿的滤纸，以保持湿度。 4.剪一片合适大小的parafilm，在上面滴上稀释在1％BSA/TBS中的一抗（稀释倍数依具体 抗体而定），每个玻璃片30ul足够，把玻璃片盖在上面（细胞面朝下），室温下孵育30分钟，然后在PBS里洗三次。 5.接下来二抗孵育步骤同上。 6.最后，在载玻片加上mounting medium（大约每个玻璃片加10ul），把玻璃片放上去（细 胞面朝下），37度30分钟，然后就可以在荧光显微镜下观察了。 7.抗体很重要，不能有非特异性结合。你可以先做WB检测一下你的抗体，看看有没有杂带。 8.双标的话，可以把两个一抗一起加或者分别标记两次（可以都试一下看看那种方法合适）。 如果一个抗体需要二抗，一个是直接荧光标记的，可以把荧光标记的那个和另外一个的二抗一起加。 方法二： 1.选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit和rat的抗体，二抗则是不 同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC（绿）和donkey anti-rat-Tex-Red（红）。 2.我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要仔细摸索， 我感觉一抗4度孵育过夜比较好，背景比较清晰。 3.我的阳性对照用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对 照是PBS+荧光标记物。 4.封闭血清与二抗来源动物一致，我用的是10%的正常donkey血清。 5.其余步骤同一般免疫荧光单标操作。 方法三： 1.片子的制作：可以做细胞爬片，细胞甩片，还有直接在24well/12well/96well中直接染色 2.细胞爬片的制作：直接购买公司的已经处理过的细胞爬片，要是自己制作的话，就用无菌 的盖玻片用多聚赖氨酸处理后让细胞自己爬片 3.细胞甩片：需要甩片机将细胞悬液均匀甩到玻片上。
论坛里发的都是关于细胞的免疫共沉淀的实验方法,这是我做组织时用到的方法,希望能给大家有点帮助 实验方法如下: 第一步：制备组织裂解物 1. 把组织剪切成细小的碎片。 2. 融解Western及IP细胞裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1mM。 3. 按照每20毫克组织加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。) 4. 用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。 5. 充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。 6. 如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过强烈vortex使样品裂解充分。然后同样离心取上清，用于后续实验。 或 1. 使用洁净的工具用最快的速度切取待测组织。最好在冰上操作。以防止蛋白降解 2. 将组织放入圆底离心管中，浸入液氮以达到“snap freeze”. 如果马上裂解则将组织冰浴，否则将组织保存-80°C以备后用。 3. 每5mg组织加入300ul裂解液，使用玻璃匀浆器匀浆，直至充
分裂解。 4. 用300ul裂解液冲洗刀片两次，然后将组织液在4°C缓慢摇动2小时 5. 12000rpm 4°C.离心20分钟。轻轻的将离心管取出冰浴，将上清吸出到新的预冷的离心管中（保持冰浴），弃沉淀。 裂解液的体积要根据组织量来确定。蛋白提取物不能太过稀释一方面避免蛋白的损失，另一方面也减少后续电泳的上样量（如果需要的话）。蛋白的合适浓度为1-5 mg/ml ，最低不能少于0.1 mg/ml。第二步：预纯化裂解物 使用无关抗体或血清可以将裂解物非特异性结合Ig的蛋白去除，随后加入的agarose beads一方面将裂解物中非特异结合agarose 或sepharose beads的蛋白去除，另一方面也将加入的无关抗体和血清蛋白去除。经过处理的裂解物所得试验结果背景更低、信噪比更好。但如果最后是使用WB来检测的话，预纯化就不是特别的必要了。 主要步骤： 1. 每1ml裂解物加入50ul和IP抗体来源及亚型相同的无关抗体（例如后续免疫沉淀时用的是小鼠IgG，则在本步骤中可以加入normal mouse IgG）或者正常血清（常用兔血清），冰浴1小时 2. 加100 μl Preotein A/G agarose beads，4°C缓慢摇动10-30分钟 3. 14,000 x g 4°C离心10分钟 4. 取上清，弃沉淀
在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法。 (1)直接法双重免疫荧光标记：将标记有两种不同荧光素的抗体(如抗A 和抗B)以适当比例混合，滴加在标本上孵育，然后洗去未结合的荧光抗体，在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，即可对两种抗原进行定位和定量。直接法简便可靠，但灵敏度较低。 (2)间接法双重免疫荧光标记：用未标记的两种特异性第一抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第一抗体后，再用两种不同的荧光素分别标记的第二抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第二抗体，后在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，从而对两种抗原进行定位和定量。使用此法应注意两种特异性第一抗体必须来源于不同种属，且荧光标记第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配。 免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项 一、免疫荧光技术中标本制作的基本程序近似于酶免疫组化，不同点如下： 1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同。 2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定。 3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。 4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油：0.01M PBS (1：1)。条件许可，建议购买抗淬灭的封片液，使标本可以保存更久。
5、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光。 6、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要分别设定阳性和阴性对照。 二、注意事项 1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。 2、每次试验均需设置以下三种对照： (1) 阳性对照：阳性血清+荧光标记物; (2) 阴性对照：阴性血清+荧光标记物; (3) 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。 三、免疫荧光双标的经验之谈 1、选取一抗时，要求来源于两种不同的动物，我用的是来源于家兔和大鼠的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC(绿)和donkey anti-rat-Tex-Red(红)。 2、我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要自我摸索，我感觉一抗4℃孵育过夜比较好，背景比较清晰。 3、我的阳性对照采用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。 4、封闭血清是二抗来源动物的正常血清，我用的是10%正常donkey 血清。 5、其余事项同免疫荧光单标操作。 免疫组化双重染色方法和步骤 在生物医学和临床研究实践中，经常需要检测两种不同物质是否在同一
免疫沉淀与免疫共沉淀原理及方法 一、基本概念 免疫沉淀（immunoprecipitation）是利用抗体可与抗原特异性结合的特性，将抗原（常为靶蛋白）从混合体系沉淀下来，初步分离靶蛋白的一种方法。 免疫共沉淀（coimmunoprecipitation）是一种在体外探测两个蛋白分子间是否存在特异性相互作用的一种方法。其原理是如果两个蛋白在体外体系能够发生特异性相互作用的话，那么当用一种蛋白的抗体进行免疫沉淀时，另一个蛋白也会被同时沉淀下来。与酵母双杂交技术不同，免疫共沉淀技术所利用的是抗原和抗体间的免疫反应，是一种基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用的方法。 不难看出，免疫共沉淀与免疫沉淀技术所使用的原理与方法大致相似，所不同的是，在免疫共沉淀中，对靶蛋白的结合与沉淀由另一个与之发生相互作用的蛋白替代。在免疫共沉淀或免疫沉淀的基础上，通过进一步与其它技术的结合，如聚丙烯酰胺凝胶电泳，还可进一步对靶蛋白的的分子量等特性进行鉴定。 二、抗体的选择 （一）多克隆抗体 多克隆抗体因其制备相对简单，可与靶蛋白分子的多个位点结合，所形成的抗原抗体复合物较稳定因而应用的最为广泛。但多克隆抗体的缺点在于非特异性结合较多，常会导致反映本底（是否是背景）升高和一定的假阳性结果。 （二）单克隆抗体 与多克隆抗体相比，单克隆抗体往往只结合一种抗原表位，具有单一结合特异性，所以发生非特异结合的机会少，可被用于确定靶蛋白上某一部位的特殊结构，甚至可被用于区分相同靶蛋白的不同形式如构象变化和修饰。但反过来，单克隆抗体仅与单一表位结合的特性也会引起具有同一表位的不同靶蛋白间的交叉反应。 三、免疫沉淀方法 免疫沉淀的靶蛋白一般来自细胞裂解液，可以是被同位素标记的也可以是未被标记的。若为前者，免
免疫荧光染色大全（精华版） 组织免疫荧光法 （1）将待染组织切片置于65摄氏度恒温箱烤片1h，脱蜡 （2）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （3）0.5%Triton X-100（PBS 配制）室温通透 10min （4）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 注意：步骤（3）和（4）用于检测细胞核抗原，细胞膜抗原直接跳过此步骤（5）抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火3min，后转成低火 15min。 （6）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （7）3% H2O2，室温孵育30min，目的是灭活内源性过氧化物酶。 （8）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （9）使用1% BSA进行室温封闭 30min，用于封闭非特异性抗原表位。 （10）按抗体推荐使用说明书孵育特异性一抗，4°C 湿盒中静置过夜。（11）次日取出切片，室温下复温 30min。 （12）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （13）选取相应的免疫荧光二抗滴加于血管组织上，37°C避光孵育30min。（14）1×PBS洗涤 3 次，每次 5min。 （15）避光条件下，DAPI 染液染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用（16）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （17）在血管组织上滴加抗荧光淬灭剂进行封片。 （18）使用荧光显微镜进行观察拍照。 贴壁细胞免疫荧光法 （1）在培养板中接种的带染色的细胞爬片用PBS泡洗3次×3min （2）4%多聚甲醛固定细胞爬片15min （3）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （4）0.5%Triton X-100（PBS配制）室温通透10min （5）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （6）1%BSA室温封闭30min （7）弃掉封闭液，细胞爬片滴加适量稀释至适当比例的一抗，4℃孵育过夜（8）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （9）细胞爬片滴加稀释至适当比例的荧光二抗 （10）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （11）DAPI染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用 （12）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （13）用抗荧光淬灭剂封片 （14）荧光显微镜下观察采集图像 细胞免疫荧光（悬浮细胞方法一） （1）收集悬浮细胞，细胞在冰浴中冷却，然后用台式离心机于4℃以800 g 离心5 min，吸去培养液并以4℃ 1×PBS重悬细胞。
免疫共沉淀操作步骤 具体步骤： 1. 细胞用预冷的PBS液洗涤2次，最后洗涤完成后吸干PBS液。 2. 加入预冷的RIPA Buffer（1ml/107个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶）。 3. 刮留细胞：用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶中上刮下，将悬液转入 1.5mlEP 管中，EP管插冰上，置于水平摇床上缓慢晃动15min。 4. 4℃，14000g离心15min。 5. 立即将上清液转移到一个新的离心管中。 6. 准备Protein A琼脂糖，用PBS液洗两遍珠子，然后用PBS液配制成50%浓度。 *为避免操作中破坏琼脂糖珠，减掉移液器枪头的尖部分。 7. 每ml总蛋白中加入100ul Protein A琼脂糖珠（50%），EP管插冰上，置于水平摇床上4℃摇晃10min。 *目的是去除非特异性杂蛋白，可降低背景。 8. 4℃，14000g 离心15min，将上清转移到一个新的离心管中。 9. 测定蛋白浓度，可选用Bradford法做蛋白标准曲线。 10. 蛋白定量，分装，-20℃保存，可保存1个月。 11. 用PBS液将总蛋白稀释至约1ug/ml。 12. 加入500ul稀释好的兔抗到总蛋白中。 13. 于摇床上4℃缓慢摇动抗原抗体混合物，可选择过夜或室温放置2h。 14. 加入100ul Protein A琼脂糖珠用以捕捉抗原抗体复合物，摇床4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或者室温孵育1h。 15. 14000rpm瞬时离心5s，去上清，收集琼脂糖珠-抗原抗体的复合物。 16. 用800ul预冷RIPA buffer冲洗3遍。
17. 用60ul 2倍上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻敲打混匀。 18. 将上样样品煮5min。 19. 14000g离心，收集剩余琼脂糖珠。 20. 将上清电泳，电泳前应再次煮5min变性。 21. 上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳。 基础成分 （1）Tris-HCl（防止蛋白变性的缓冲液成分） （2）NaCl（防止非特异性蛋白聚集的盐分） （3）NP-40（用H2O配置成10%储存液。NP-40为非离子去污剂，用于提取蛋白） （4）去氧胆酸钠（用H2O配置成10%储存液；提取蛋白用离子去污剂；避光保存） *因为离子型去污剂能够使酶变性，导致活性丧失，准备激酶（致活酶）实验时，不要加去氧胆酸钠。
胞免疫荧光步骤： 1.细胞爬片；首先是玻片的处理，普通的盖玻片用砂轮划成自己要的大小的小方块，先用洗衣粉洗干净，用水冲静烤干，然后泡酸过夜，捞酸后流水洗净，烤干，置于器皿中高压灭菌，然后再烤箱中大约8小时烤干备用。 爬片可以在培养皿六孔板或24孔板中都可，我选择在培养皿中爬。一为节约经费（培养皿可以重复利用）二来觉得培养皿口大，操作比较方便。培养皿消毒同上，消毒时记得消两把镊子 具体操作是：用胰酶消化好细胞，充分吹打，使之成单细胞悬液（注意：这一点很重要，关系到将来爬出来片子的质量） 取出消毒的培养皿，可以先加少量培养基（以使玻片与培养皿紧密接触），将玻片小心放入摆放其中，然后将单细胞悬液一滴一滴的滴到玻片上。最后盖上培养皿置于37度5％CO2的暖箱中培养，根据细胞生长状况，24小时或更长时间适时取出爬片。 爬片置于37度PBS中洗三次，每次3到5秒钟，然后在4％多聚甲醛中固定15分钟，然后再用37度去离子水将甲醛冲干净，注意手法轻柔，要不然掉片很厉害。同时操作过程中注意玻片的正反面，要不然真的是前功尽弃。 将做好的爬片置于滤纸上晾干，然后用中性树胶粘在载玻片上。注意一定要等中性树胶彻底干了之后才能做后续实验，要不然玻片会掉下来的，就又是前功尽弃了做好的细胞爬片可以放在－20保存备用，具体能保存多长时间不太清楚，当然尽量早用。 2.4%多聚甲醛固定10min(固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮)； 3.PBS漂洗5min； 4.0.5% Triton 穿孔15min(丙酮固定法不用透化处理)； 5.PBS漂洗2次，每次5min； 6.1%BSA封闭30min； 7.加入1%BSA稀释的一抗，于37℃杂交2h； 8.PBS漂洗2次，每次5min； 9.加入1%BSA稀释的二抗，于37℃杂交1h； 10.PBS漂洗2次，每次5min； 11.5ug/ml DAPI染色2min； 12.抗淬灭封片剂封片。
石蜡切片免疫荧光染色方 法 Prepared on 22 November 2020
对于石蜡切片： 1、烤片：60℃ 60分钟 2、脱蜡：二甲苯中Ⅰ脱蜡15分钟→二甲苯Ⅱ脱蜡15分钟→无水乙醇Ⅰ5分钟→无水乙醇Ⅱ5分钟→90%乙醇Ⅰ5分钟→90%乙醇Ⅱ5分钟→70％乙醇5分钟 →蒸馏水5分钟→蒸馏水5分钟。 3、抗原修复：高压修复，事先烧开锅中的水，修复盒中加入l柠檬酸钠，(柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g加入1000ml蒸馏水中)，上汽后加热10分钟，关火。修复盒取出，放入装有自来水的瓷缸中缓慢冷却至室温。 2. 去除内源性酶：玻片取出放入湿盒，加3%H 2O2 2 (2ml H 2 O2 2 加入18ml蒸馏 水中，现配现用，避光)，室温孵育10分钟，PBS洗3次，每次5分钟。（也可不用去除内源性酶）。 3. 封闭(Blocking) 加10%正常驴血清（原液100ul+900ulPBS,1ml够用30张片子），室温孵育封闭30分钟。如果背景较高，可以4℃封闭过夜。不用洗，用滤纸吸干周边水分。从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。 4. 一抗孵育(Primary antibody incubation) 参考一抗的说明书，按照适当比例用（10%山羊血清PBS或1%BSA-PBS）稀释一抗。 立即加入稀释好的一抗， 4℃过夜，第二天取出复温45分钟。PBS洗3次，每次5分钟。 5. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation) 按照适当比例用稀释荧光标记的二抗，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。
免疫荧光通用操作规程 冰冻切片的免疫荧光 1，动物组织直接OCT包埋，或灌流后的组织30%蔗糖溶液4℃过夜后，OCT包埋。-20℃保存3月，-80℃长期保存。请勿保存于液氮。2，冰冻切片机切片至少10um，空气干燥2分钟后，-20℃储存 3，切片从-20取出后，在通风橱放10-30分钟以去除水汽，4%PFA 固定15分钟，或-20℃丙酮固定15分钟置通风橱2小时 4, 1XPBS清洗玻片，3X5min 从此请保持玻片湿润 5，有时，抗原修复3小时会得到更好的结果。为此请：选用稳定的抗原修复方式（真空负压.微波修复.高压修复.隔水加热.电炉加热）…关注修复的温度，时间（抗原修复时在有效的温度范围内所持续的时间），抗原修复液必须遵循自然降温规律，使用足量的抗原修复液…选择不同PH值的修复液（A液枸盐酸缓冲液PH6.0，B液EDTA-Na缓冲液PH8.0，C液枸盐酸缓冲液PH4.5） 6，室温封闭1小时 封闭液：5%BSA+10%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS 条件封闭液：1%BSA+3%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS（细胞因子，无需封闭的蛋白
7，一抗4℃过夜 请用封闭液稀释一抗 8, 第二天Wash,1XPBS, 2x1min 9,二抗，1:1000 （alexa系列）1:300（dyelight )in封闭液，避光室温1小时 10, Wash,1XPBS, 3x5min 11, DAPI 染核5min， 12，DDW Rinse 13，抗淬灭剂封片，（避免气泡）避光置于通风橱过夜 14，干片后4℃保存 石蜡切片的免疫荧光 1，动物组织取出后经固定-脱水-包埋（见随后操作步骤)，制成石蜡包块 2，组织学染色切片厚度2um，免疫荧光染色切片厚度至少6um，切片复水：58℃20min- xylene 2x10min- 100%EtoH2x10min 95%EtoH2x10min- 70%EtoH10min-，DDW5min
免疫荧光技术（Immunofluorescence technique）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位。 一、基本原理： 免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原（或抗体）。在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光（黄绿色或橘红色），可以看见荧光所在的组织细胞，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。 二、应用范围： 其应用范围极其广泛，可以测定内分泌激素、蛋白质、多肽、核酸、神经递质、受体、细胞因子、细胞表面抗原、肿瘤标志物、血药浓度等各种生物活性物质。根据诊断类别，又可分为传染性疾病、内分泌、肿瘤、药物检测、免疫学、血型鉴定等。 三、基本实验步骤：
1、细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤（1000rpm,5min）2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。 2、固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月。PBS洗涤3×5min. 3、通透。使用交联剂（如多聚甲醛）固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min.通透后用PBS洗涤3×5min. 4、封闭。使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min. 5、一抗结合。室温孵育1h或者4℃过夜。PBST漂洗3次，每次冲洗5min. 6、二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。 7、封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。 四、注意事项： 1、染完之后没有封片前直接照一些，因为有的时候可能封片会出现问题，再想照反而没有了，另外不要拖太长时间，荧光会崔灭的。 2、荧光的片子一定要避光保存，保存的好的话，过一段时间仍然能照出很好的片子。