《近五年微生物在氨基酸发酵和酶制剂方面的研究进展》
柴化建
一.关于氨基酸发酵与酶制剂的生产与应用
建立在使用选育成的氨基酸生物合成高能力的菌株的前提下。氨基酸发酵，就是以糖类和铵盐为主要原料的培养基中培养此类微生物，积累特定的氨基酸。这些方法菌株的育种起初是由从自然界中筛选有产酸能力的菌株．并建立其培养条件开始的，从自然界或研究室保藏种类是有限的。而后在确立突变技术和阐明氨基酸生物合成系统调节机制的基础上发展为营养缺陷变异株、抗药性菌株的育种。这样，几乎所有的氨基酸都能生产出来。随着重组DNA技术的发展，接合、转导、转染、细胞融合等手段首先用于体内基因重组，是早期用基因重组方法构建生产菌株的尝试。70年代末至80年代初期，随着载体、受体系统的构建及体外基因重组技术的日益完善，氨基酸生物工程菌的构建有了长足的发展。
酶是由活细胞产生的以蛋白质为主要成分的生物催化剂，它是微生物次级代谢的产物。酶广泛存在于一切生物体中，虽然能从动、植物体内提取到酶，但微生物细胞及其培养物是酶的最重要来源。如今，微生物发酵已成为酶制剂的主要生产方法。特别是应用基因工程技术以后，存在于动、植物细胞中的酶都能利用微生物细胞获得。近年来，随着畜牧业生产方式的转变，饲料及饲料添加剂也向高产、安全、精准的功能转变，酶制剂被认为是饲料添加剂中最安全的产品，酶制剂产业获得了迅速发展。据了解，近年来，酶制剂的火热与其对抗生素的替代作用离不开。多位专家把酶制剂与抗生素对照比较。研究发现，使用酶制剂在促生长等方面虽然比不上抗生素，但作用也相当明显，且安全环保，可以在很大程度上解决我国养殖业中最受诟病的药残、污染问题。
二.传统微生物生产氨基酸与酶制剂的方法及研究进展
1.用野生株的方法
这是从自然界获得的分离菌株进行发酵生产的一种方法。典型的例子就是谷氨酸发酵。此外，改变培养条件的发酵转换法中，有变化铵离子浓度、磷酸浓度，使谷氨酸转向谷氨酰胺和缬氡酸发酵的例子。
2.用营养缺陷变株的方法
这一方法是诱变出菌体内氨基酸生物合成某步反应阻遏的营养缺陷型变异体，使生物合成在中途停止，不让最终产物起控制作用。这种方法中有用高丝氨酸缺陷株的赖氨酸发酵，有用精氨酸缺陷株的鸟氨酸发酵，还有用异亮氨酸缺陷株的脯氨酸发酵。
3.类似物抗性变异株的方法
在微生物体内，具有限制过量氨基酸生成的调节机制。因此，一般很难如愿获得所要的氨基酸。为此，用一种与自己想获得的氨基酸结构相类似的化台物加入培养基内，使其发生控制作用，从而抑制微生物的生长。这样，就可以得到在这种培养基中能够生长的变异株，而这种变异株正是解除了调控机制的，能够生成过量的氨基酸。利用此方法发酵的有：苏氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、组氨酸和精氨酸。
4.体内及体外基因重组的方法
基因工程包括细胞内基因重组方法和试管内的体外基因重组方法。其中，体内基因重组是在自然界中所观察到的现象，在应用上又称为杂交育种，主要方法包括：转化、转染、接合转移、转导和细胞融合等，这都是在细胞内暂时地产生染色体的局部二倍体，在两条DNA链之间引起两次以上的交叉，是遗传性重组现象。通过体内基因重组技术的应用，易于组合遗传特性，能较为有效地育种。上述方法中开始实际应用的是细胞融合技术和转导技术，前者的实例有用短杆菌的苏氨酸、赖氨酸等发酵产生菌的育种；后者的例子是用大肠杆菌的色氨酸，沙门氏菌的亮氨酸，沙雷氏菌的组氨酸、精氨酸、苏氨酸、异亮氨酸等发酵产生菌的育种。细胞内基因重组技术的缺点是，现在只在同种或有近缘关系的微生物之间进行并较难成功。近几年来，将基因工程技术应用于代谢工程中的研究越来越深入，代谢工程在阐明代谢途径及其调控规律的基础上，应用重组DNA技术可以改变代谢途径分支点上的流量或引入新的代谢步骤与管径构建新的代谢网络，其主要步骤为：鉴定目标代谢途径涉及的酶(特别是限速酶)；取得酶基因必要时可用蛋白质工程技术，如定点诱变，基因剪接等，使蛋白具有新的特点(增强活性或稳定性、解除反馈抑制等)；将一种或多种异源的或改造后的酶基因与调节元件一起克隆进目标生物；使调节元件的作用及培育条件最优化，这样则可以得
到性能优良的生产菌株。
5.基因工程菌的研究进展
基因工程技术应用于发酵工程，使发酵工业呈现欣欣向荣的景象。发酵工业中基因工程的研究虽然起步较晚，但已取得成效，通过基因突变和重组，已选育了大批优良菌侏，不仅提高了传统产品的产量，而且开发了新产品，然而道路是艰辛的。因为代谢途径工程比蛋白多肽的基因工程复杂得多，它涉及的基因通常不止一个，除了需要有效的载体受体系统外，对代谢途径及调控机理的研究也十分重要，通过多年的努力，人们在上述的研究结果的基础上，提出了构建工程菌的一些策略。
三．微生物生产氨基酸与酶制剂新的研究方向
1微生物代谢组学研究
代谢组学(metabolomics)是继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后出现的一门新学科。代谢组学是通过考察生物体系受刺激或扰动后所有小分子代谢产物随时空的变化情况，来研究生物体系的代谢途径的一种技术。代谢组学具有以下优点：(1)基因和蛋白表达的微小变化会在代谢物水平得到放大；(2)代谢组学的研究不需要进行全基因组测序或建立大量表达序列标签的数据库；(3)代谢物的种类远少于基因和蛋白的数目：(4)由于给定的代谢物在每个组织中都是一样的，所以，研究中采用的技术更通用。代谢物是基因型与环境共同作用的综合结果，由于微生物的基因数据中包含一些功能未知的基因，所以迫切需要微生物代谢组学策略共同译解其全部基因功能。
代谢组学研究的技术平台一般流程包括样品制备、代谢产物的检测和分析鉴定、数据分析与模型建立。并根据研究对象不同，采用不同的样品制备、分离鉴定手段及数据分析方法。一般研究步骤：1.样品制备：微生物的生长条件是可以控制和重复的条件下，对微生物进行培养、淬灭和代谢产物的提取。2.代谢产物的检测和分析鉴定：采用气相色谱与质谱联用、液相色谱与质谱联用、毛细管电泳与质谱联用以及核磁共振等技术，高灵敏度、高通量和无偏向的对胞内外代谢物分析。3.数据分析与模型建：由于生物样品的组成复杂，在得到分析对象的原始谱图后，需要对数据进行归一化和滤噪，消除干扰因素，保留有用信息。微生物代谢物的复杂多样，微生物组学的研究有助人们更深地了解微生物生态系中
各种复杂的相互作用，微生物细胞对环境和基因变化的响应，与生物信息学相整合，在微生物代谢层面更深入的研究有着重要作用。
2微生物代谢产物库研究
微生物是活性天然产物的重要来源,微生物代谢物具有极大的化学结构多样性和复杂性。通过对微生物代谢物的研究，发现并开发了许多重要的药物。建立微生物代谢物库对有价值的微生物产物高通量筛选、发现先导化合物有极其重要意义。建立数据库管理系统、微生物样品中提取的活性部位或单体化合物和少量合成化合物是代谢产物库是进行高通量筛是必要的。近年来对微生物代谢物库的研究主要包括预分离库、纯天然产物库的研究。1.预分离代谢物库：首先多种菌株的培养液过滤，其次经不同吸附性色谱柱、半制备高效液处理细分得到多种一定纯度的天然化合物，最后对化合物库中活性成分进行液相-质谱、核磁共振分析，排除重复性物质。2.纯天然产物库：首先选择培养条件简单，能产生多种含量丰富未知代谢物的微生物作为实验对象。采用高效液相结合蒸发散射检测器对所选微生物进行预筛选,从中挑选出目的菌株做进一步的扩大培养。其次提取物先浓缩、分离，最后通过查询天然产物数据库结合质谱、核磁共振信息对分离获得化合物进行高通量结构鉴定从而得到微生物代谢化合物。
3微生物代谢分子生化技术研究
(1)基因敲除技术在微生物代谢工程方面的应用
利用基因工程技术对微生物细胞内的代谢通量进行重新设计，是获得高产高效的工业菌株的重要手段之一。通过基因敲除技术可阻断细胞的代谢旁路，或通过引入突变位点改变目的产物的产量或质量而达到调节代谢流，优化代谢途径的目的。由于微生物应用的难题之一是如何对菌种进行改造，以获得高产高效的工业菌株。随着对微生物代谢机理认识的不断加深，随着生物化学、应用分子生物学、遗传工程的发展，定向操纵遗传变化成为可能，代谢工程研究有了新的发展。
(2)启动子和细胞全局转录机制的定向进化在微生物代谢工程中的应用
通过随机突变和定向选择而进行的定向进化(又称分子进化或人工进化)在改造酶的催化特性和稳定性、扩展酶的底物范围等方面具有广泛的应用。定向进化也开始应用在对结构基因的启动子区域和具有调节功能的蛋白如转录因子等进行代谢工程改造,并成功选育了对环境胁迫因素具有较强耐受性,以及发酵效率
提高的微生物菌种。利用易错PCR(Error prone PCR)或DNA改组(DNA shuffling)对酶分子编码基因进行定向进化。通过对基因进行随机突变(或基因重组)和定向选择，可获得催化效率提高的酶蛋白，并改善酶的一系列性质，如稳定性、底物特异性等。