实验二传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养一、实验目的
了解倒置显微镜的构造与使用，了解不同传代细胞的形态及接毒后的病变特征，掌握细胞的传代培养方法、病毒接种方法及收毒方法。
二、常用细胞的种类
BHK-21：仓鼠肾传代细胞
PK-15：猪肾传代细胞
IBRS-2：猪肾传代细胞
Hela：人的子宫瘤细胞
Vero：非洲绿猴肾细胞
Marc-145：来源于Vero细胞
TK-143：人的胸苷激酶阴性细胞
Sf9：昆虫细胞
三、材料
1、100ml细胞瓶、吸管、吸球、96孔细胞培养板、加样器、枪头
2、BHK-21（baby hamster kidney）细胞
3、0.25%胰酶
4、生长液：含10%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM
维持液：含2-5%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM
5、伪狂犬病病毒液（PRV）
四、传代细胞培养的条件要求
1）细胞密度：2-3×105个/ml
2）pH范围最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.8
3）培养温度
哺乳动物细胞一般为37℃
昆虫细胞28-30℃
五、常用细胞分散剂与作用原理
1、胰酶使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解，
导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。
2、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）：与二价钙、镁离子结合，从而使细胞分散。
3、灰色链丝菌酶：由灰色链丝菌提取的一种酶制剂，是蛋白酶、氨肽酶和羧肽
酶的混合物。
六、营养液
1、人工综合营养液
氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助生长因子。
2、血清
1）血清的种类
胎牛血清、新生犊牛血清、成年牛血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、人血清，其中以新生犊牛血清使用最为广泛。
2）血清的处理
无菌采集，过滤除菌。用前56℃灭活30min。
3）血清的作用
A、能提供细胞生存、生长和增生所必须的生长调节因子。
B、能补充基础培养液中没有或量不足的营养成分。
C、含有一些可供贴壁依赖型细胞在培养器皿表面贴附和铺展的生长基质成分。
D、有中和毒性物质保护细胞不受伤害的作用。
E、给培养液提供良好的缓冲系统。
F、提供蛋白酶抑制剂，保护细胞免受细胞释放的蛋白酶的损害。
4）应用血清存在的问题
A、血清中存在不少有害于细胞生长和繁殖的物质：补体、免疫球蛋白、生长抑制因子。
B、血清的成分不明确，影响对结果的分析。
C、不同动物、不同批次的血清成分和活性差别较大，使得培养结果不稳定。
七、传代细胞系培养
1、优点：1) 可以无限的传代。
2) 不少细胞系对病毒很敏感。
3) 某些传代细胞系能在悬浮培养条件下培养，适合病毒抗原的大量生产。
4) 生长旺盛，繁殖快速，对营养条件不苛刻。
2、缺点：在传代过程中遭到支原体和病毒的污染。
3、培养方法
1）取长满单层的细胞一瓶，倾去培养液。
2）加入2ml 胰酶消化液，于37℃培养箱放置几分钟，至细胞间出现空隙或细胞变圆后，倒去消化液。
3）加入生长液,反复吹打几次，使细胞分散成单个细胞，然后分装于3个小瓶中。再在每个小瓶中补充生长液至10ml，然后置37℃培养箱培养，培养1-2天即可长成单层。
八、病毒（PRV）在传代细胞中的培养
1、选长满单层的细胞，倒掉培养液。
2、加入适量的病毒悬液
3、置温箱中感作（吸附）45min-1h。
4、取出瓶子，倒掉或不倒掉培养液，补足维持液，置温箱中继续培养，直至80%以上的细胞病变。
5、收毒：将病变的细胞置于-20℃冰箱中，冻结后取出自然解冻，在解冻过程中振摇几次，以使细胞完全从瓶壁上脱落。然后将病毒液收集于盐水瓶或其它容器中。低温贮藏备用。
实验三、原代细胞培养（以鸡胚成纤维细胞为例）
一、实验目的
了解不同原代细胞的形态，掌握鸡胚成纤维细胞的制备与培养方法。
二、材料
1、9-11日龄鸡胚
2、照蛋灯与蛋座
3、碘酊棉球与酒精棉球
4、大剪子、眼科剪、小镊子
5、平皿、细菌瓶、吸管、吸球、细胞瓶、
6、胰酶、生长液、维持液
三、细胞培养的条件要求
1）细胞密度
原代细胞：4-6×105个/ml
传代细胞：2-3×105个/ml
2）pH范围最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.8
3）培养温度
哺乳动物细胞一般为37℃
昆虫细胞28-30℃
四、操作步骤
1、取9-12日龄孵育良好的鸡胚，依次用碘酊和酒精消毒气室部。
2、无菌操作下用剪子去除气室部卵壳，去除壳膜，穿破绒毛尿囊膜，夹住鸡胚
颈部，取出鸡胚放于灭菌平皿中。
3、用眼科剪、镊去除鸡胚头、四肢及内脏，用DMEM冲冼2次。
4、将冲洗后的鸡胚用剪子充分剪碎，使其近于乳糜状。
5、将剪碎的组织块倒入锥形瓶或烧杯或大青霉素瓶中，用DMEM充分冲洗，并静
置几分钟，待组织块下沉，吸弃上层液体，再加DMEM。如此反复冲洗2-3遍。
6、于沉淀组织块内加入约4倍量的0.25%胰酶，并调pH至7.6-7.8，振荡混匀
后置37℃水浴中感作30分钟，每10分钟轻轻摇动一次，使细胞消化完全（组织块变散松，沉降渐变缓慢时即表示消化足够）。
7、取出，静置几分钟，小心吸弃上层胰酶溶液，用DMEM轻洗2次后，加入生长
液5ml，用大口径吸管反复吹打，使细胞游离。
8、静置几分钟，使未消化好的组织块下沉。
9、细胞计数
取细胞悬液0.5ml+2ml 0.1%结晶紫—枸椽酸（0.1mol/L）溶液，室温或37℃温箱中5-10min，充分振荡后进行计数。
按白细胞计数法计算4角4个大方格内的细胞总数（N）。
每ml悬液中的细胞数（n）=N/4×10000×K（稀释倍数）。
活细胞数应在90%以上。
10、将计数好的细胞稀释到合适的浓度，使细胞量约为4-6×106个/ml，分层于
细胞培养瓶中，每瓶1ml，再补加DMEM生长液至10ml，盖上盖子，置于37℃恒温箱中培养。
○表示可计数
●表示不计数
五、结果的观察
于培养后每天观察结果，至长层单层。细胞量较大时，一天即可长成单层，细胞呈纤维状。
实验四病毒感染力的滴定（TCID50的测定）
一、实验目的
了解病毒感染力测定的几种常用方法，掌握半数细胞培养物感染量TCID
50
的操作步骤、计算方法及含义。
二、测定病毒感染力的方法
( 50% lethal dose)：用动物或鸡胚来检测
半数致死量LD
50
(egg 50% infective dose)：用鸡胚来检测
半数鸡胚感染量EID
50
半数细胞培养物感染量TCID
（50% tissue culture infective dose)：用细胞
50
来检测
蚀斑形成单位（plaque forming unit，PFU）：用细胞来检测
三、材料
1、长满单层的细胞1瓶
2、胰酶、吸球、吸管、生长液
3、96孔细胞培养板
4、加样器、枪头
5、病毒液（PRV）
四、TCID50的操作步骤
1、在青霉素瓶或离心管中将病毒液作连续10倍的稀释，从10-1-10-10。
2、将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度接种一纵排共8 孔，
每孔接种100μl。
3、在每孔加入细胞悬液100μl，使细胞量达到2~3×105个/ml。
4、设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。（100μl生长液+100μl细胞悬液）
5、逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天。
6、结果的计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法
五、TCID50的计算方法
1、Reed-Muench两氏法
CPE：Cytopathic effect
距离比例＝（高于50%病变率的百分数-50%）/（高于50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数）
＝（91.6-50）/（91.6-40）
＝ 0.8
=距离比例×稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数lgTCID
50
=0.8×(-1)+(-3)
=-3.8
=10-3.8/0.1ml
TCID
50
含义：将该病毒稀释103.8接种100μl可使50%的细胞发生病变。
2、Karber法
lgTCID
=L-d(s-0.5)
50
L：最高稀释度的对数
D：稀释度对数之间的差
S：阳性孔比率总和
lgTCID
=-1-1×(3.375-0.5)
50
=-3.875
=10-3.875/0.1ml
TCID
50
含义：将该病毒稀释103.875接种100μl可使50%的细胞发生病变。
致细胞病变效应（cytopathic effect，CPE）：指病毒在宿主细胞内大量增殖，导致细胞病变甚至死亡的现象。具体而言，体外组织细胞培养时，溶细胞病毒在易感细胞内大量复制增殖导致细胞死亡或细胞出现变圆、脱落、聚集等现象，称为致细胞病变效应。
在体外实验中，通过细胞培养和接种杀细胞性病毒，经过一定时间后，可用显微镜观察到细胞变圆，坏死，从瓶壁脱落等现象，称之细胞病变作用。缩写CPE。指病毒对组织培养细胞侵染后产生的细胞变性。利用此种病变效应可进行病毒定量。一般来说，肿瘤病毒的此种效应较弱，或是不具CPE。主要有以下几种：1.整个细胞都发生改变，有两种情况，其一是胞核及整个细胞都发生肿胀，胞浆呈颗粒样变化，胞膜边缘不整齐；其二是，整个细胞皱缩，变圆直至碎裂，脱落等，多见于肠道病毒、痘病毒、呼吸病毒、鼻病毒、科萨奇病毒；2.细胞发生聚合，如腺病毒；3.细胞融合形成合胞体，即多数细胞发生相互融合而成“巨细
胞”，但各个细胞核仍然能分辨清楚，如副粘病毒、疱疹病毒；4.细胞仅产生轻微病变，如正粘病毒、狂犬病毒、冠状病毒、逆转录病毒以及沙粒病毒。
实验五血清中和试验
一、实验目的
了解中和试验的基本原理和几种不同的测定方法，掌握固定病毒—稀释血清法的操作步骤和计算方法及含义。
二、原理
抗体与相应的病毒粒子特异性地结合，使病毒的感染力丧失。
三、用途
1、疾病诊断
2、病毒分离株的鉴定
3、不同病毒株的抗原关系研究
4、疫苗免疫原性的评价
5、免疫血清的质量评价
6、测定实验动物血清中是否存在抗体
四、分类
(一) 蚀斑（痘斑）减数试验
将病毒—正常血清混合物以及病毒—待检血清混合物分别接种到单层细胞上，随后覆盖营养琼脂或甲基纤维素，进行蚀斑测定，比较病毒—正常血清组和病毒—待检血清组产生的蚀斑数，两者的差数表示待检血清的中和能力。
以试验组的蚀斑数比对照组减少50%作为判定依据，血清稀释度就是其蚀斑减数试验效价。
(二) 交叉保护试验
先将实验动物进行主动免疫或被动免疫，然后以待检病毒进行攻击，根据实验动物被保护的情况，判定待检V的种类或型别。这一方法的缺点是试验周期太长，并且需要大量的实验动物。可用于以下几方面：应用已知V鉴定未知V ；应用已知免疫血清鉴定未知V；应用已知V鉴定未知血清。
（三）终点法中和试验
1、固定病毒—稀释血清法
将不同稀释度的血清与固定量的病毒液（一般为100或200个TCID
50、EID
50
或LD
50
）混合，置适当的条件下感作一定时间，再将血清-病毒混合物接种于敏
感细胞、鸡胚或实验动物，测定被检血清阻止组织培养细胞、鸡胚或实验动物发生病毒感染的能力及其效价。
以能保护50%组织培养细胞、鸡胚或实验动物不发生病变、感染或死亡的血
清最高稀释倍数，作为该血清的50%中和效价（PD
50
）。
2、固定血清——稀释病毒法
在固定量的血清中，加入等量不同稀释度的病毒，用对照非免疫血清（对照
组）和待检血清同时进行测定，计算每一组的TCID
50、EID
50
或LD
50
，然后计算中
和指数。
五、材料
1、长满单层的细胞1瓶
2、胰酶、吸球、吸管、生长液
3、96孔细胞培养板
4、加样器、枪头
5、病毒液（PRV）
6、待检血清、PRV阳性对照血清、PRV阴性对照血清
六、操作步骤
1、固定病毒—稀释血清法
1）测定病毒液的TCID
50
2）将测好TCID
50的病毒液稀释成200个TCID
50
的病毒悬液。
3）在96孔微量培养板中将血清（预先56℃灭活30min）作连续倍比稀释（具体方法是在96孔板中先加入50μl生长液，再加50μl待检血清，混匀后，吸50μl至下一孔，如此下去。一直到1∶256），每个稀释度作4孔。
4）在上述各孔内加入50μl稀释好的病毒液，混匀后放入37℃ 5%CO
2
培养箱中作用45min-60min。
5）同时设待检血清毒性对照，阴、阳性血清对照，病毒对照和正常细胞对照，
其中病毒对照要作 200个TCID
50、20个TCID
50
、2个TCID
50
、0.2个TCID
50
4
个不同浓度的对照。
6）感作完成后每孔加入100μl细胞悬液，放37℃ 5%CO
2
培养箱培养，逐日观察并记录结果，一般要观察5-7天。
7）结果计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法进行。
血清稀释度CPE孔数无CPE孔数
累计
保护率% CPE孔数无CPE孔数
1∶2（10-0.3）0 4 0 15 100（15/15）1∶4（10-0.6）0 4 0 11 100（11/11）1∶8（10-0.9） 1 3 1 7 87.5（7/8）1∶16（10-1.2） 1 3 2 4 66.7（4/6）1∶32（10-1.5） 3 1 5 1 16.7（1/6）
1∶64（10-1.8） 4 0 9 0 0（0/9） 1∶128（10-2.1） 4 0 13 0 0（0/13） 1∶256（10-2.4） 4
17
0（0/17）
即1∶20稀释的待检血清可保护50%的组织培养细胞免于出现CPE 。 2、固定血清——稀释病毒法 1）将病毒作连续10倍稀释
2）将稀释好的病毒接种96孔板，每个稀释度接种一纵排共8孔，每孔50μl ，做两块板子。在其中一块板子的每孔加入50μl 待检血清（试验组），另一块板子的每孔加入50μl 正常血清（对照组），混合后置37℃ 5%CO 2培养箱作用1h 。
3）然后在每孔中加入100μl 细胞悬液。 4）设两纵排正常细胞对照。
5）置37℃ 5%CO 2培养箱培养，逐日观察并记录结果。 6）分别计算每组病毒的TCID 50，然后计算血清的中和指数。
中和指数=试验组TCID 50 /对照组TCID 50 如：中和指数=10-4.0/10-7.0 =103.0=1000
距离比例=（高于50%的保护率-50% ）/（高于50%的保护率—低于50%的保护率）
=（66.7-50）/（66.7-16.7）
lgPD50=高于50%的保护率的血清稀释度的对数+距离比例×稀释度对数的差
=-1.2+0.33×(-0.3) =-1.299
=0.33
PD50=-1.299的反对数=0.05=1/20
判定标准：以待检血精的中和指数大于50者，判为阳性；10-49为可疑；小于10为阴性。
大规模细胞培养技术简介 大规模培养技术应用简介通过大规模体外培养技术培养哺乳类动物细胞是生产生物制品的有效方法。上世纪60-70 年代，就已创立了可用于大规模培养动物细胞的微载体培养系统和中空纤维细胞培养技术。近十数年来，由于人类对生长激素、干扰素、单克隆抗体、疫苗及白细胞介素等生物制品的需求猛增，以传统的生物化学技术从动物组织获取生物制品已远远不能满足这一需求。随着细胞培养的原理与方法日臻完善，动物细胞大规模培养技术趋于成熟。 所谓动物细胞大规模培养技术( large-scale culture technology )是指在人工条件下(设定ph、温度、溶氧等) ，在细胞培养工厂 (Cosmo Cat.No. 1101-400 or 1101-800 )或生物反应器( bioreactor )中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。目前可大规模培养的动物细胞有鸡胚、猪肾、猴肾、地鼠肾等多种原代细胞及人二倍体细胞、cho(中华仓鼠卵巢) 细胞、BHK-21( 仓鼠肾细胞)、Vero 细胞(非洲绿猴肾传代细胞，是贴壁依赖的成纤维细胞)等，并已成功生产了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、红细胞生成素、单克隆抗体等产品。 在过去几十年来，该技术经有了很大发展，从使用转瓶(roller bottle) 、CellCube 等贴壁细胞培养，发展为一次性细胞培养工厂( Made by Cosmo )或生物反应器 (Bioreactor )进行大规模细胞培养。第一代细胞培养技术核心问题是难以产业化或者说是规模化生产：一是在工艺生产时不能大规模制备产品；二是非批量生产容易导致产品质量的不均一性；三是难以对同批生产进行生产和质量控制。 随着生物技术的发展，迫切需要大规模的细胞培养，特别是培养表达特异性蛋白的哺乳动物细胞，以便获得大量有用的细胞表达产物。采用玻璃瓶静置或旋转瓶的培养方法，已不能满足所需细胞数量及其分泌产物。因而必须为工业化生产开创一种新的技术方法。自70 年代以来，细胞培养用生物
细胞传代培养的原理及操作步骤 （一）原理：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，须进行传代再培养。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 （二）细胞传代培养具体操作 1、细胞：贴壁细胞株 2、操作步骤 1）将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。 2)加入0.5-1ml 0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。 3)瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入10ml培养液终止消化。 观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1-3分钟。 4)用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，实践培养液塞好橡皮塞，置37℃下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。 细胞冻存 1. 实验前准备：细胞室及工作台紫外线照射15min；培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、恒温水 浴箱37℃预热备用；收集对数生长期细胞，在冻存前一天最好换液 2．用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液，PBS清洗2遍吸出冲洗液，加入适量胰蛋白酶消化。 3. 适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。吸管吸取培养液吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的 细胞悬液。 4. 用吸管将培养液加入冻存管中，离心(1000r/min，10分钟)。 5. 去上清液，加入与细胞悬液等量的冻存液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀 6. 冷存管置于4℃10分钟----20℃30分钟----80℃16～18小时(或隔夜)---液氮槽vaporphase长期储 存。-20℃不可超过1h，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 7．记录每一个冷冻管的位置以确保在以后应用时能够找到每一个冷冻管。 细胞复苏 1.室内紫外消毒；培养基、PBS于37℃恒温水浴预热备用。 2.自液氮罐中取出冷冻管，立即放入37℃水槽中快速解冻，离心。 3.去上清，加入培养基，吹打，然后移入培养瓶中，用培养基清洗冻存管，清洗液也移入培养瓶中。 4.于培养瓶中加入适量培养基，放入CO2培养箱中培养 5.记录复苏日期；次日换液。
细胞传代培养（胰蛋白酶消化法） 具体操作： 一. 传代前准备： 1.预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。 2.用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。 3.正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。 4.点燃酒精灯：注意火焰不能太小。 5.准备好将要使用的消毒后的空培养瓶，放入微波炉内高火，8分钟再次消毒。 6.取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。 7.从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。 8.打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。 二.胰蛋白酶消化； 1.加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37℃。 2. 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。 3.吸弃消化液加入培养液：弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液。 三.吹打分散细胞： 1.吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。 2.吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入10ml离心管中。 3.平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000转/分钟离心6-8分钟。 4.弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。 四.分装稀释细胞： 1.分装：将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。 2.显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。最后要做好标记。 五.继续培养： 用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25％时为一个＋，占50％为＋＋，占75％时为＋＋＋。 传代细胞培养注意事项： 1.严格的无菌操作 2.适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。
总结---细胞培养 一．基本理论概论 原代培养: 也叫初代培养，指直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养。 传代培养：将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶即称为传代或传代培养。 细胞系：原代培养物成功传代后，则称之为细胞系。(如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系。) 细胞株：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物称为细胞株。 培养类型：细胞培养，组织培养，器官培养。 细胞生长的方式：贴附生长，悬浮生长 培养细胞的形态（形态不一定，环境改变形态可能改变）：成纤维性型细胞，上皮型细胞（单层膜样生长），游走性细胞（游散生长，常有伪足跟突起） 二．培养过程及要点（切记无菌操作） （一）工作环境的处理 1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70 % 酒精擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70 % 酒精擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。 2. 实验用品以70 %酒精擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在台面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。 3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。吸管口切勿碰到容器瓶口 4. 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒 感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少Class II)。操作过程中，应避免引起aerosol 之产生，小心毒性药品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐针头之伤害等。 5. 定期检测下列项目： CO2 钢瓶之CO2 压力。CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300 小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。 6. 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水。 （二）试验用玻璃塑料用品清洗及其消毒灭菌 清洗： （1）玻璃器皿的清洗（酸液由重铬酸钾，浓硫酸，蒸馏水配置） 浸泡—刷洗—浸酸—冲洗 （2）胶塞的清洗 刚买回的常含滑石粉等杂质，先用自来水冲洗后再按常规方法处理。2%NaoH或洗衣粉煮沸10-20分钟---1%稀Hcl浸泡30分钟或蒸馏水冲洗后再煮沸10-20分钟—晾干备用 （3）塑料制品的清洗 2%NaoH浸泡过夜—自来水冲洗--5%稀Hcl浸泡30分钟—自来水和蒸馏水冲干备用。
实验四动物细胞的传代培养 1. 实验目的 （1）了解动物细胞培养的基本知识。 （2）了解体外培养细胞的的基本形态类型；学会通过镜检判定体外细胞生长的状态。 （3）掌握动物细胞的传代培养法。 2.实验背景与原理 2.1 动物细胞培养的基本概念 （1）组织培养：把来自机体内的细胞、组织或器官放在类似于体内的外环境中，使之成活、生长和繁殖。严格又分为细胞培养、组织培养和器官培养。值得注意的是和植物组织培养不同，目前动物组织培养在一般培养条件下难以维持组织的结构和功能，常最终转变成为细胞培养，所以动物细胞与组织培养并无严格区别。（2）原代培养：直接从供体取来的细胞，组织或器官进行的初次培养。通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。 （3）传代培养：原代培养物长成单层细胞，达到一定密度时，营养消耗殆尽，需要补充营养，分开扩大培养，使之继续增殖。注意的是传代的这个“代”与细胞分裂的一个世代不同，一代细胞约分裂3~5次，不要混淆。 （4）细胞系：原代培养后的细胞经传代即可成为细胞系。若其形态均一，生长增殖稳定，生物性状明确，即可称之为已鉴定的细胞（Certified Cells）。不同种类的细胞成系的难易程度也不同，一般胚胎、更新组织的细胞如造血、上皮等以及
癌细胞较容易成系，而神经等细胞则较难成系。按照其生存期可分为有限细胞系（生存期有限的正常二倍体细胞）和无限细胞系（生存期无限的癌细胞、转化细胞等，大多异倍体） 2.2 动物细胞培养的基本条件 体外培养细胞的条件总原则就是要尽可能模拟细胞在体内生长的环境，因此必要的营养、适宜的胞外环境以及严格的无菌条件是主要的三个方面。 （1）营养：早期培养主要采用天然的生物性液体，但其成分不确定，难以控制营养成分。现广泛使用的是化学成分明确的各种商品化的合成培养基，其主要成分包括各种氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖等必要的营养物质。培养基中还含有酚红指示剂，使培养基的颜色可显示细胞生长状态。随着细胞数目的增长，酸性代谢物增多，培养基变黄。污染的培养物也会使培养基迅速变黄。 培养基在使用前还要加血清，它的主要作用有三点：一是提供生长因子、激素、酶等营养；二是中和有毒物质，对细胞起着保护作用，尤其可中和培养中使用的胰蛋白酶的毒性。第三是提供黏附和伸展因子，是贴壁细胞附壁生长所必不可少的。所以，血清的品质对细胞的生长有很大影响，通常换用新的批次的血清要预先进行血清的筛选实验。一般进口的胎牛血清更有利于细胞的生长，但价格较昂贵，可根据培养细胞的要求选用。另外，有些细胞培养中还需要添加谷氨酰胺（Gln）。 （2）胞外环境条件：主要是温度、气体和pH条件。这些胞外环境条件应该符合细胞在体内的生长环境。哺乳动物适宜的培养温度是37℃，鸟类是39℃，爬行类是22~25℃等；大多动物细胞适宜的pH条件都是7.2~7.4，以不超过pH6.8~7.6为宜。在动物细胞培养过程中随着代谢产物的积累，酸性产物增多，
细胞培养常见问题及其解决 1. 如何选用特殊细胞系培养基？ 培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始。 2. 何时须更换培养基？ 视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。 3. 可否使用与原先培养条件不同之培养基？ 不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基，若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基，细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。 4 可否使用与原先培养条件不同之血清种类？ 不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。 5 何谓FBS, FCS, CS, HS ? FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思，两者都是指胎牛血清，FCS 乃错误的使用字眼，请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。 6 培养细胞时应使用5 % 或10% CO2？或根本没有影响？ 一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统，而培养基中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g 时，细胞培养时应使用10 % CO2；当培养基中NaHCO3 为每公升1.5 g 时，则应使用5 % CO2 培养细胞。 7.Hank's 平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用，不需要CO2培养箱。原因是什么？Hank's 平衡盐溶液(HBS)和Earle's平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别？ HBS和EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平,在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中，溶液会变碱，Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles 液，。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks液就可以了。 8. 细胞之接种密度为何？
细胞培养技术原理及应用研究进展 姓名：赵鹏学号：158033038 专业：流行病与卫生统计学 摘要：细胞培养是指将采集体内组织的细胞模拟体内生长环境，放置在无菌、一定营养条件、适宜的温度及酸碱度下，使其生长、繁殖，并维持其结构和功能的一种技术，已成为生物、医学研究及应用广泛采用的技术方法。文章对细胞培养技术的应用作一综述。 关键词：细胞培养；应用；研究进展 细胞是构成机体的基本单位，是生命活动的基本单位。一切有机体（除病毒）都是由细胞组成的。细胞具有独立的、有序的自控代谢体系。因此，对细胞的深入研究是揭开生命奥秘、征服疾病的关键。细胞培养是指将采集体内组织的细胞模拟体内生长环境，放置在无菌、一定营养条件、适宜的温度及酸碱度下，使其生长、繁殖，并维持其结构和功能的一种技术。细胞培养技术的优点是可以直接观察活细胞的形态结构、生命活动及其变化；提供大量生物性状相似的试验对象，特别是研究大型动物（奶牛）时具有耗资少的优点。但模拟体内环境仍与实际有很大的差异，因此利用细胞培养技术的试验结果不可以轻易做出与体内等同的结论。 动物组织（细胞）培养开始于20世纪初，现已成为生物、医学研究及应用广泛采用的技术方法[1 ]。随着细胞培养技术的不断发展，现在也广泛应用于动物生产研究。20 世纪60 年代，该技术应用于水产动物的病毒分离和纯化，对于鱼类疾病的防治具有重要作用。近年来研究发现单一种子细胞难以完成构建复杂组织的需要，因此产生了联合培养细胞技术。联合培养下的细胞之间存在着精细的相互调控关系，因而更符合仿生学的原理且更有利于种子细胞的增殖与分化，为复杂的细胞诱导分化以及体外组织构建提供了新思路、新方法[2 ]。 1 细胞培养 细胞培养是将活体组织或细胞从试验动物体内取出，放在模拟体内生存环境的体外环境（无菌、适温、营养丰富）中，使高体细胞生长、发育的一种方法。按照培养的结构成分不同，将其分为组织培养、细胞培养及器官培养等。根据细胞是否在支持物上生长，将其分为贴壁型和悬浮型。一般来说，圆形细胞如淋巴细胞属于悬浮型，而胞体梭型（成纤维型细胞）、扁平不规则（上皮型细胞）等属于贴壁型，贴壁型细胞必需贴附在支持物表面生长。细胞培养开始于1906 年，Harrison 用蛙新鲜淋巴液培养蛙胚神经组织4 周，首次成功地利用体外培养液培养神经元，标志着组织细胞的体外培养模式的基本建立。随着细胞培养技术的不断发展和完善，20 世纪50 年代进入繁盛阶段，细胞培养逐渐被基础研究与应用领域所应用，特别是在医学领域得到迅速的发展。目前，细胞培养技术已经涉及到生物学、农业、环境保护等领域[ 3 ]。 目前，在细胞培养过程中，只能根据离体细胞的特点和培养条件，提供满足其生长和发育的一些基本生理条件。必须在无菌条件下进行，细胞感染微生物后，会因被夺营养物质而导致细胞生长缓慢或停滞，甚至死亡。需要提供适宜的温度和pH，一般哺乳动物细胞培养的温度控制在37 ℃，鱼类的温度要低一些。温度过高或过低时，均不利于细胞生长甚至会导致细胞死亡。动物细胞最适宜pH一般控制在7.2~7.4，在此范围细胞生长活跃，增殖速度快，如果过低或过高性，细胞会因为细胞膜受损而死亡。细胞离体培养技术的关键是细胞培养液的设计，理想的细胞培养液可以同时解决细胞离体培养所需要的pH、渗透压、营养物质、调节物质的全部需要。细胞培养液中需含有细胞增殖、生长所需要的各种营养物质。如提供能量的物质（N源、C源）、代谢调节控制的物质（无机盐、维生素、激素）。另外，在细胞培养过程中需要提供一定量的气体（O2和CO2）。CO2具有调节pH和缓冲的作用，一般提供5% CO2。
细胞培养常见问题及解答 1、如何选用培养基？ 培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养，各种目的无血清培养的首选是AIM V培养基（SFM）。 2、为什么要热灭活血清？ 加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在进行免疫学研究、培养ES细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。 3、L－谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？ L－谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L－谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L－谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终确定。L－谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。 4、GlutaMAX-I是什么？培养细胞如何利用GlutaMAX-I？这个二肽有多稳定？ GlutaMAX-I二肽是L－谷氨酰胺的衍生物，将其不稳定的α－氨基用L－丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L－谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L－谷氨酰胺几乎完全降解。 5、为什么培养基中可以省去加酚红？ 酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。 6、如何用台盼兰计数活细胞？ 用无血清培养基把细胞悬液稀释到200－2000个/毫升，在0.1毫升的细胞中加入0.1毫升的0.4％的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞。 7、如何消除组织培养的污染？
一、实验目的 1、学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。 2、学习并掌握细胞传代培养的方法。 3、学习并掌握用倒置荧光显微镜观察细胞细胞形态。 二、实验原理 细胞培养（cell culture）：细胞在体外条件下生长，细胞不再形成组织。 动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。由于细胞具有生长和自我复制的能力，为细胞体外培养和研究提供可能。 动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。 原代培养（primary culture）即直接从动物机体分离、获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法。 传代培养（subculture）当细胞生长增值达到一定密度，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，将细胞转移到新的培养皿中扩大培养的方法。 高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的，但如果把或细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则方便简单的多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类探索防治各种疾病途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，因此，动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。 三、细胞培养相关设施及材料 1、细胞培养室 无菌操作区：只限于细胞培养及其它无菌操作，与外界隔离。 孵育区：培养箱设定的条件为37℃，5%CO2。 制备区：培养液及有关培养用液体的制备，液体制备后应该在净化工作台进行过滤除菌。 储藏区：包括冰箱、干燥箱、液氮罐等。 清洗区和消毒灭菌区：清洗区为相对污染区，消毒灭菌区与清洗区分开。 2、细胞培养常用基本设施： 荧光显微镜、超净工作台、孵箱、电热鼓风干燥箱、冰箱、液氮罐、消毒器、恒温水浴槽、滤器等。 细胞培养常用器皿：培养瓶、培养板、培养皿，玻璃瓶、吸管，离心管、冻存管，注射器，烧杯、量筒等。 3、细胞培养用品的清洗、消毒 新玻璃器皿要用5%稀盐酸浸泡，以中和其表面碱性物质：刷洗： 硫酸清洁液浸泡：浓硫酸+重铬酸钾+蒸馏水； 冲洗：流水冲洗15-20次，蒸馏水冲洗3次，三蒸水漂洗1-3次。 所有需灭菌的器械、物品灭菌前均需包装，防止灭菌后污染。使用时放入超净工
龙源期刊网 https://www.doczj.com/doc/e26225537.html, 细胞培养时存在的生物安全问题简析 作者：胡燕玲高习文 来源：《现代畜牧科技》2018年第07期 摘要：动物细胞培养技术在生物技术和生物医药的相关研究领域中的应用非常广泛。随着动物细胞培养在各个领域应用的内涵逐渐的深入，随之也产生了相应的生物安全问题，也就是生产中常说的生物健康和环境因素之间的风险性问题，而且此问题已经受到相关领域专业人士的广泛关注。现主要分析动物细胞培养过程中存在的生物安全问题，并且针对具体的问题及其风险进行评估，以及更深入的探讨和研究，以期为生物健康和环保提供更加可靠的理论基础和相关的技术支持。 关键词：动物细胞培养；生物安全；危险评估 中图分类号：R446.11+3 文献标识码：B 文章编号：2095-9737（2018）07-0018-01 1 概述 目前，通常是通过动物细胞进行培养，以作为培养基质提供给病毒疫苗的生产所用，此外，许多生物药品的生产过程中也不能缺少动物细胞的培养。随着动物细胞培养的不断深入应用，相应的生物安全问题随机出现，愈来愈受到关注。然而，实际生产中如果想将风险在最大程度上加以控制，就需要采取比较全面的风险评估再进行确定，还要考虑细胞培养操作的类型以及细胞培养潜在的生物危害等情况。 2 动物细胞培养过程中存在的生物安全问题 2.1 细胞培养的特点 实际生产中针对动物细胞培养过程的风险进行评估时，必须考虑的因素就是细胞培养的本质特征，主要体现在物种来源、细胞或组织类型以及培养类型三个不同的方面。 2.2 遗传修饰获得的特征 实际生产中，在实验室遗传修饰获得的重组细胞与其非重组类似物相比较，通常对生物健康和环境破坏的能力要更强一些。所以在实际评估动物细胞培养风险时，还必须确定重组细胞获得的遗传修饰特征，将其对评估的影响考虑在内。
实验5 细胞的传代培养 一、实验目的 熟练掌握动物细胞的传代培养法。 二、实验原理 哺乳动物细胞的传代培养是几乎所有细胞生物学实验的基础。当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长,这一过程就叫传代。传代培养可获得大量细胞供实验所需。 三、仪器、材料与试剂 1仪器 CO2培养箱，倒置显微镜，超净台 2材料 培养瓶，试管，移液管，巴斯德吸管，废液缸，75%酒精棉球，酒精灯，细胞。 3试剂 完全培养基（RPMLl640或DMEM），0.25%胰蛋白酶，D-Hanks液。 四、实验步骤 1.入无菌室之前用肥皂洗手，用75%酒精擦拭消毒双手。 2.倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。将培养用液置37℃下预热。 3.超净台台面应整洁，用75%酒精溶液擦净。 4.打开超净台的紫外灯照射台面20min左右，关闭超净台的紫外灯，打开抽风机清洁空气。 5.点燃酒精灯,取出无菌试管，刻度吸管；安上橡皮头；插在无菌试管内。 6.打开细胞培养瓶，过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。 7.倒掉培养细胞的旧培养基。酌情可用2-3mL Hanks液洗去残留的旧培养基，或用少量胰酶涮洗一下。 8.加入胰酶消化液，盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶倒掉。注意勿使细胞提早脱落入消化液。
9.加入少量的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养基（7-10mL/大瓶，3-5mL/小瓶）制成细胞悬液，分装到新培养瓶中。盖上瓶盖，适度拧紧后再稍回转，以利于CO2气体的进入，将培养瓶放回CO2培养箱。 10.对悬浮培养细胞，步骤7-9不做。可将细胞悬液进行离心去除旧培养基上清，加入新鲜培养基，然后分装到各瓶中。 五、注意事项 1.传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。每次最好只进行一种细胞的操作。培养用液应严格分开。 2.每天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折光性好，生长致密时即可传代。 3.如发现细胞有污染迹象，应立即采取措施，一般应弃置污染的细胞，如果必须挽救，可加含有抗生素的BSS或培养基反复清洗，随后培养基中加入较大量的抗菌素，并经常更换培养基等。 六、实验报告 1.试述传代培养的步骤和注意事项，并指出哪些是关键步骤？ 2.细胞传代培养的目的是什么？
初代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃） 材料：动物组织块 试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒 初代消化培养法 1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。 4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。 5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速 （500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。 7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。 8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。 初代组织块培养法 1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。 2. 摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。 3. 轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。 4. 培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。
细胞培养技术 指的是细胞在体外条件下的生长，在培养的过程中细胞不再形成组织（动物）。 定义 培养物是单个细胞或细胞群。细胞在培养时都要生活在人工环境中，由于环境的改变，细胞的移动或受一些其他因素的影响，培养时间加长，传代导致细胞出现单一化型。 在现代医学和生物科学研究中应用广泛 优点 1.直接观察活细胞的形态结构和生命活动。用于细胞学、遗传学、免疫学、实验医学和肿瘤学等多种学科研究. 2.直接观察细胞的变化可便于摄影。 3.研究细胞种类如低等到高等到人类、胚胎到成体、正常组织到肿瘤。 4.便于使用各种技术：相差、荧光、电镜、组化、同位素标记等方法观察和研究细胞状况。 5.是分子生物学和基因工程学的研究对象，也是其主要的组成部分。 6.易于施用物理、化学生物的实验研究。 7.易于提供大量生物性状相似的实验对象,耗资少比较经济。 8.成为生物制品单克隆抗体生产和基因工程等的材料来源。 缺点 组织和细胞离体后独立生存在人工的培养环境中，虽然模拟体内环境，仍有很大差异。因而利用培养细胞做实验时，不应视为体内细胞完全相同，把实验结果推测体内，轻易做出与体内等同的结论。 细胞类型 细胞类型根据是否附于支持物上生长的特性，分为: 贴附型悬浮型（一）贴附型 细胞贴附在支持物表面生长，只依赖贴附才能生长的细胞叫做贴附型细胞(Anchorrage-dependent cells)这种现象与细胞分化有关。 贴附型细胞的分型 1.成纤维型细胞：(fibroblast) 来自中胚层 特点：与体内成纤维细胞形态相似,胞体梭型或不规则三角形,中央有圆形核,胞质向外伸出2～3个长短不同的突起。细胞在生长时呈放射状,漩涡或火焰状走行。 起源：细胞来自中胚层间充质组织。 除真正的成纤维细胞、心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮细胞。
1.为什么要热灭活血清？加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩， 细胞核血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。（在免疫学研究，培养ES细胞，昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。） 2.谷氨酰胺在细胞培养中起什么作用及使用方法？作用：几乎所有的细胞对谷氨酰胺有较高的要求， 细胞需要谷氨酰胺合成蛋白质，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。使用方法：谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4℃放置1周可分解50％，故应单独配制，置于-20℃保存，临用前加入培养液。配 制方法：谷氨酰胺溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分 装小瓶，-20℃保存，使用时可向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液。 3.如何用台盼兰计数活细胞？正常的活细胞，胞膜结构完整，能够排斥台盼蓝，使之不能够进入胞内；而丧失活性或细胞膜不完整的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色。台盼蓝染色后，通过 显微镜下直接计数或显微镜下拍照后计数，就可以对细胞存活率进行比较精确的定量。（用无血清培养基把细胞悬液稀释到200-2000个/毫升，在毫升的细胞中加入毫升的％的台盼兰溶液。轻轻混匀， 数分钟后，用血球计数板计数细胞。） 4.如何消除组织培养的污染？确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母，把污染细胞与其它细胞系隔 离开，用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台，检查HEPA过滤器。（一）认真做好外植体的选择和消毒工作，防止外植体带菌。（二）改善接种室和培养室的环境条件，保证接种与培养环境清洁无菌。（三）操作人员严格遵守无菌操作规程。（四）培养基及接种工器具要严格灭菌，确保灭菌质量。（五）在培养基中加入适量的抗生素。（六）利用病毒在植株体内分布不均匀的原理，生产脱毒苗。（七）利用培养基中高盐或高糖的浓度，抑制微生物的生长。（八）减少培养基中的某些有机成分， 可抑制微生物的生长繁殖。 5.培养基中丙酮酸钠的作用是什么？丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。 6.为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀？胎牛血清没有预老化，储存在2－8℃时，血清中的各种蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。由 –20℃至37℃解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。推荐在－20℃储存胎牛血清，避免反复冻融。 7.二价离子会抑制胰蛋白酶活性吗？使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的？二价离子能够抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。在胰蛋白酶处理细胞 前，用EDTA清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离子。 8. 液体培养基的保存是冷藏好？还是冷冻好？液体培养基冷冻后再经融化时，其溶液的pH值会发生改变，溶液往往会变碱，某些成分溶解也会受到影响，对细胞生长不利，故培养液一定要存放在冷 藏条件下。 9.培养用液pH对细胞生长的影响？由于大多数细胞适宜pH为，偏离此范围可能对细胞生长产生有害的影响。但各种细胞对pH的要求不完全相同，原代培养细胞一般对pH变动耐受差，无限细胞系耐受能力强。但总的来说，细胞耐酸性比耐碱性强一些。 法的原理？又称细胞增殖检测活细胞线粒体中琥珀脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物 甲臢（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定甲臢染料的吸光值，可间接的反应活细胞数量。 细胞培养实验室的基本设备有哪些常用的基本设备：1、仪器：显微镜、培养箱、干燥箱、水纯化
学号：20095071126 系（院）生命科学学院 专业生物科学专业 年级 2009 级 姓名黄璐 论文（设计）题目细胞培养技术的发展史及培养条件 指导教师卢东升职称教授 2011 年 5 月16 日
目录 摘要 (2) Abstract (2) 0引言 (3) 1细胞培养技术发展史 (3) 2细胞培养的条件 (4) 2.1 细胞培养的一般条件 (4) 2.1.1温度 (4) 2.1.2 pH (4) 2.1.3 渗透压 (4) 2.1.4 营养物 (4) 2.1.5 水 (5) 2.1.6 无菌条件 (5) 2.1.7 光 (5) 2.1.8 气体 (5) 2.2动物细胞培养的特殊条件 (5) 2.2.1 血清 (6) 2.2.2 支持物 (6) 2.2.3 气体交换 (6) 2.3植物细胞培养的特殊条件 (6) 2.3.1 光照 (6) 2.3.2 激素 (6) 2.4微生物细胞培养的特殊条件 (6) 3小结 (7) 参考文献 (7)
细胞培养技术的发展史及培养条件 学生姓名：黄璐学号：20095071126 生命科学学院生物科学专业 指导教师：卢东升职称：教授 摘要：19世纪英国生理学家Sydney Ringer研制出可维持离体动物心脏跳动的盐溶液，1885年德国人Roux用温生理盐水在体外培养鸡胚组织并存活数月，从而开始了组织培养。1907-1912年，人们创建了悬滴培养法，由此建立了体外培养组织。从50年代起，细胞培养进入了迅速发展的阶段并渗透到其他学科中，目前细胞培养技术已广泛用于生物学和医学研究的各个领域。细胞的生长需要一定的营养环境，细胞培养是指从体内组织取出细胞摹拟体内出现环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使期生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。因此离体的细胞培养需要在温度、pH、营养物、无菌环境、气体等方面进行设置。而动植物细胞和微生物细胞的培养均有其自身的特殊培养条件。关键词：组织培养；细胞培养；细胞生长；培养条件 Abstract:The 19th century British physiologist Sydney Ringer developed from the body can maintain the salt solution animal the beating of the heart, in 1885 German Roux with warm saline the in vitro culture of chicken embryos organization and live for months, and thus began the tissue culture. 1907 - 1912, people created suspended drops culture method, creating the in vitro organization. From the 1950s on, cell culture into the rapid development stage and spread to other disciplines, currently cell culture technology has widely used in biology and medicine for different areas of study. Cell growth need certain nutrients environment, cell culture refers to remove cells from body organization in the presence of the environment, echoing the ph and sterile, proper temperature conditions, with certain nutrients that period, and maintain its to grow the structure and function of a culture technology. So the cells from the body in need of cultivation temperature, ph, nutrients, sterile environment, gas, etc Settings. But animals and plants cells and microbial cells cultured in all has its own special cultivation condition.
名词解释： 细胞组织培养：细胞（组织）培养是指从生物体内取出细胞（组织），模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存、生长并维持其结构和功能的方法。 二倍体细胞株：具有二倍体染色体数的细胞株。 细胞组织培养选材：根据实验目的、观察指标确定所选组织器官。培养选材一般来自胚胎组织的培养物；比成体组织更易生存和生长。这主要是因为胚胎组织有更多的胚胎组织干细胞，它们具有更高的自我更新和多能分化能力。 原代培养：一般指从组织中分离在体外生长至传代之前的细胞培养。这种培养通常是异质性，生长缓慢，但比较能代表原组织的类型并表达原组织特性。缺点是在培养过程中会失去许多原组织的细胞。 传代细胞：原代细胞生长物或细胞系生长到一定阶段，分散成单个细胞，按一定比例接种于新的培养容器内称之传代。传代细胞称之细胞系，可分为两类：有限细胞系和连续细胞系。传代形成的具有各自生物特性或标志的细胞系称之为细胞株。 世代：指细胞经过一次分裂后完成后至下次分裂的过程。 细胞富集：当细胞分离纯化并不完全彻底，培养物中能达到以某种细胞为主（占绝大多数）的程度。 细胞纯化：是指从原代培养前成分混杂的异质性细胞悬液中或者从培养物中获得单一类型细胞的过程。通过细胞分离和纯化得到细胞株或系。 传代：也称为再培养，把一瓶培养细胞全部或分成几份再培养的过程。 组织工程：组织工程是应用生命科学和工程学的原则及方法，在正确认识哺乳动物的正常及病理两种状态下的组织结构与功能关系的基础上，研究、开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物的一门新兴学科。 Density inhibition:密度抑制，由于细胞密度过大，培养液营养耗尽、代谢产物过多和生存空间消失所引起细胞增殖的抑制现象。 消化液：在原代细胞培养和细胞传代时，都要用消化液，最常用的是胰蛋白酶和二乙烯四乙酸二钠（EDTA），其次是一些特殊的组织细胞培养用的各型胶原酶。在原代细胞培养中，使用消化液从组织块中分离（散）出单个的细胞；在进行细胞传代时，消化液使细胞脱离生长表面并离散成单个细胞。 平衡盐溶液（BSS）：集缓冲能力、生理盐水的等渗性以及培养液的营养供应特点于一体，兼具维持渗透压、缓冲和调节溶液的酸碱度，同时供给细胞生存所需的能量和无机离子成分的作用，常用的BSS有PBS、Hanks等。 清洁液：是一种不含磨蚀性物质，能迅速清除物品上污垢,分解脏污，令物品透明亮如的清洁用品。 去分化：指已分化成熟的细胞和组织倒退分化，返回原始幼稚的状态。但去分化并不意味着完全返回胚胎时期的原始细胞状态，可重新表现出分化特点。 接触抑制：指细胞相互接触后失去运动（移动）的现象。 细胞融合：细胞融合是指两个或更多个相同或不同细胞通过膜融合形成单个细胞的过程。可在自发或人工诱导下发生。它可使两个不同来源的细胞核在同一细胞中表达相应的功能，这样的细胞称异核体，若异核体出现有丝分裂时，则可使两个不同来源的细胞核的染色体汇聚，形成合并有亲本的大核，这样的细胞称为杂种细胞或杂交细胞。 转化细胞系：通过某个转化过程形成的，常由于染色体断裂变成异倍体，失去正常细胞特点，而获得无限增殖能力。转化细胞系具有长期培养，倍增时间短，对培养条件和生长因子等要求较低的特点，适于大规模工业化生产。 Stem cell:干细胞，是指一类具有自我更新能力和分化潜能的细胞。