作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA 2009, 35(9): 1620?1627https://www.doczj.com/doc/e62748126.html,/zwxb/ ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw@https://www.doczj.com/doc/e62748126.html,
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2009.01620
黏类小麦细胞质雄性不育相关基因cMDH的克隆与表达分析
张龙雨李红霞张改生*王俊生韩艳芬袁正杰牛娜马守才
西北农林科技大学 / 陕西省作物杂种优势研究与利用重点实验室 / 教育部小麦育种工程研究中心, 陕西杨凌712100
摘要: 为深入研究黏类小麦雄性不育的分子遗传机制, 利用抑制差减杂交技术构建了黏类小麦育性相关基因的二
核期SSH文库。经文库筛选后, 得到一个在可育文库中表达的与胞质苹果酸脱氢酶基因同源的EST序列。以该EST
序列为信息探针, 经电子克隆、RT-PCR、PCR克隆与序列分析, 获得了小麦胞质苹果酸脱氢酶(cytosolic malate de-hydrogenases, cMDH)基因的cDNA与DNA序列, 利用荧光定量PCR技术对该基因在不育株和可育株花药中的表达
进行了分析, 并比较了MDH在小麦不育株和可育株中的活性变化。结果表明, 该基因的cDNA序列长1 213 bp, 编
码333个氨基酸; DNA序列长2 908 bp, 含有7个外显子和6个内含子; 该基因在不育株和可育株花药发育3个时期(单核、二核和三核)的表达均表现为先升后降的模式, 而且该基因在不育株花药发育的二核期和三核期的表达相对于
可育株被明显抑制; MDH在小麦不育株和可育株中的活性变化趋势与定量结果一致。推测该基因在花粉发育早期表达, 它的下调表达可能影响了小麦雄蕊发育过程中的能量供应而导致雄性不育。
关键词:小麦; 胞质苹果酸脱氢酶基因; 克隆; 荧光定量PCR
Cloning and Expression Analysis of cMDH Gene Related to Cytoplasmic Male Sterile Wheat with Aegilops kotschyi Cytoplasm
ZHANG Long-Yu, LI Hong-Xia, ZHANG Gai-Sheng*, WANG Jun-Sheng, HAN Yan-Fen, YUAN Zheng-Jie, NIU Na, and MA Shou-Cai
Key Laboratory of Crop Heterosis of Shaanxi Province, Northwest A&F University / Wheat Breeding Engineering Research Center, Ministry of Edu-cation, Yangling 712100, China
Abstract: Male sterility with Aegilops kotschyi cytoplasm has a great application potential in hybrid wheat (Triticum aestivum L.) breeding for its stable sterility and broad-spectrum of restoring gene resources. To further reveal the genetic mechanism of male sterile with Ae. kotschyi cytoplasm, we employed a male sterile line ms (Kots)-90-110(A) and its near isogenic line BC4F1 (ferti- lity restored by rk5451) to construct sterile and fertile cDNA libraries by suppression subtractive hybridization (SSH) in binucle-ate stage of anther development. Comparative analysis of differentially expressed EST sequences revealed that one EST highly similar to cytosolic malate dehydrogenases gene was identified from the fertile SSH-cDNA library. Then, the EST sequence was used as a querying probe to blast the Genbank databases. Based on the assembled homologous cDNA sequence, both cDNA and DNA sequences encoding a cytosolic malate dehydrogenases were isolated and characterized by PCR and sequence analysis. Fur-thermore, expression characteristics of the gene between male sterile and fertile anthers were analyzed via real-time PCR. In this study, the cDNA sequence was 1 213 bp in length and the open reading frame encoded a peptide of 333 amino acids. The DNA sequence was 2 908 bp in length, which contained seven extrons and six introns. According to expression analysis, the expression
of this gene in fertile anthers was much higher than that in sterile anthers at binucleate and trinucleate stage during anther devel-opment. The trend of MDH activity was consistent with the quantitative results between fertility and sterility. Therefore, the gene
is conjectured to be an early expression gene and its down-regulated expression may affect energy supply during stamen growth in sterile line anthers resulting in male sterility in wheat.
Keywords: Wheat; Cytosolic malate dehydrogenases gene;Cloning; Real-time PCR
本研究由国家高技术研究发展计划(863计划)重大专项(2009AA101102), 陕西省13115科技创新工程重大科技专项(2007ZDKG-02), 国家杨凌农业生物技术育种中心专项(99-1A), 西北农林科技大学拔尖人才支持计划项目资助。
*通讯作者(Corresponding author):张改生, E-mail: zhanggsh@https://www.doczj.com/doc/e62748126.html,
Received(收稿日期): 2009-02-24; Accepted(接受日期): 2009-04-08.
第9期张龙雨等: 黏类小麦细胞质雄性不育相关基因cMDH的克隆与表达分析1621
苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenases, MDH)广泛分布于生物体内, 是生物糖代谢中的关键酶之一。在植物细胞中存在着多种MDH同工酶, 根据其辅酶专一性, 亚细胞定位和生理功能, 这些同工酶可分为线粒体NAD-MDH (mMDH)、微体NAD- MDH、叶绿体NADP-MDH、叶绿体NAD-MDH和细胞质NAD-MDH (cMDH)[1]。其中, 胞质苹果酸脱氢酶(cytosolic malate dehydrogenases, cMDH) 存在于细胞胞质内, 可催化草酰乙酸形成苹果酸。草酰乙酸是生物体内生化反应的一个非常重要的中间产物, 连接多条重要的代谢途径, 是氨基酸形成所必需的碳骨架的主要来源之一[2]。此外, 细胞质苹果酸脱氢酶与线粒体的能量代谢密切相关, 参与三羧酸循环的主要底物草酰乙酸不能由细胞质基质直接进入线粒体, 必须首先在细胞质中经胞质苹果酸脱氢酶催化还原为苹果酸, 后者可以直接进入线粒体, 在线粒体苹果酸脱氢酶的作用下催化进入线粒体基质的苹果酸再生成草酰乙酸从而进入三羧酸循环[3]。因此, 细胞质苹果酸脱氢酶在植物的中枢代谢途径(糖酵解及三羧酸循环)、线粒体能量代谢底物供应中均占有重要地位, 对胞质苹果酸脱氢酶基因的研究具有十分重要的意义。在禾谷类作物中, 胡建广等[4]从玉米杂种幼苗cDNA文库中筛选到编码胞质苹果酸脱氢酶基因全长序列的cDNA克隆, 并完成了该基因编码区的全序列分析; 姜瑞华等[5]以玉米苹果酸脱氢酶的基因为探针, 从水稻幼苗cDNA文库筛选得到一条水稻苹果酸脱氢酶基因; 蔺占兵等[6]报道从小麦中克隆了一类依赖于NAD的细胞质苹果酸脱氢酶cDNA的部分序列。有关黏类小麦胞质苹果酸脱氢酶基因的研究, 除本课题外还未见相关报道。
黏类小麦是指小麦黏型(K型)和偏型(Ven型)等一类既易保持又易恢复, 且种子饱满、保持系与恢复系来源都分布在普通小麦推广品种(系)内的小麦雄性不育系的总称。黏类小麦细胞质雄性不育(CMS)系是小麦杂种优势利用中很有应用潜力的不育类型[7]。为了揭示黏类小麦细胞质雄性不育的分子机理, 李红霞等[8]以该类型不育系ms(Kots)-90-110(A)和其近等基因系BC4F1为材料, 利用抑制消减杂交技术分别构建了不育和可育条件下基因特异表达的SSH-cDNA文库, 比较分析了两文库EST序列, 探讨了不育和可育条件下基因表达的种类、功能及其参与的生化代谢途径的异同, 从SSH-cDNA可育文库中发现一个与胞质苹果酸脱氢酶高度同源的基因。本研究以该基因的EST序列为模板, 应用电子克隆技术拼接了该基因的序列, 据此设计引物, 采用RT-PCR技术扩增该基因, 对扩增到的基因片段进行克隆和序列分析, 采用实时荧光定量PCR技术对该基因在小麦不育系及其近等基因系不同发育时期花药中的表达模式进行分析, 并比较了MDH在小麦不育株和可育株中的活性变化, 以进一步探讨该基因的表达与小麦雄性不育的关系。
1材料与方法
1.1试验材料
2007年获得黏类小麦细胞质雄性不育系及其近等基因系[8]。以细胞质雄性不育系ms(Kots)-90-110及其恢复系rk5451(均由本实验室保存)为试材, 先以ms(Kots)-90-110为母本, 与rk5451杂交, 将恢复系的核内恢复基因导入不育系, 使育性得以恢复; 然后在后代中筛选其他农艺性状与不育系ms(Kots)- 90-110相同, 但为可育的植株作父本, 与不育系连续回交5代, 获得BC5F1; 最后对该BC5F1群体的花药进行观察, 发现花药饱满, 药室增大, 花粉发育、减数分裂均表现正常, 能够形成正常花粉粒。因此, 用于本研究的不育系ms(Kots)-90-110与其近等基因系BC5F1除育性有差别外, 其他质核遗传背景相当一致。
试材按正常秋播在西北农林科技大学农场试验田种植, 2008年4月中旬借助光学显微镜镜检, 分别取不育系ms(Kots)-90-110(A)和其近等基因系BC5F1处于不同发育时期的花药(单核、二核和三核), 在低温下剥取后迅速在液氮中冷冻, 以尽量减少分离后基因表达的变化。每天相同时间内采集不同时期的花药样本, 以避免时间差异对基因表达的影响, 所有试验材料于?80℃冰箱中保存备用。
1.2小麦花药总RNA提取与cDNA合成
用BIOZOI试剂(杭州博日科技有限公司), 按说明书方法提取不同发育时期花药的总RNA, 并用DNase I (TaKaRa公司, 大连)进行纯化处理。用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳和核酸蛋白检测仪检测总RNA 质量。总RNA纯化后进行cDNA的合成, cDNA第一链合成采用M-MLV (TaKaRa公司, 大连)反转录酶, 引物为来自Clontech公司的CDSIII和SMART, 引物序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.3 小麦cMDH基因的电子克隆及引物设计
从本实验室构建的黏类小麦育性相关基因cDNA
1622作物学报第35卷
可育文库中筛选到与cMDH高度同源的EST序列, 以此EST序列为模板进行Blast检索, 得到多条与之高度同源的EST序列, 将获得的EST序列利用CAP3 (Sequence Assembly Programe)进行首尾拼接, 获得新的重叠群contig, 将contig反复对GenBank 的EST公共数据库进行Blast检索、拼接, 直至没有新的匹配序列入选, 从而生成最后的新生序列, 作为EST的延伸产物。根据contig序列, 利用Primer Premier 5.0软件设计引物cMDH-F: 5′-CCTCCTCCT AAACCACTCTC-3′, cMDH-R: 5′-GCTACAAGCCT CATTCATACAC-3′。
1.4小麦cMDH基因cDNA及基因组序列的分离
以黏类小麦细胞质雄性不育系的近等基因系BC5F1双核期花药的cDNA及基因组DNA为模板, 以cMDH-F和cMDH-R为引物进行扩增。采用50 μL 反应体系, 含cDNA 3 μL (DNA 1 μL)模板, 10×PCR buffer (含Mg2+) 5 μL, 2.5 mmol L?1 dNTP Mixture 4 μL, 5 U μL?1Taq酶(TaKaRa) 0.5 μL, 10 μmol L?1 cMDH-F 2 μL, 10 μmol L?1 cMDH-R 2 μL, ddH2O补足至50 μL。PCR程序为94℃预变性3 min; 94℃变性1 min, 59℃退火1 min, 72℃延伸1 min, 35个循环; 72℃延伸10 min; 反应后4℃保存。2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。将扩增得到的目的片段回收纯化, 与PMD19-Vector (TaKaRa公司, 大连)载体连接。连接产物转化DH5α感受态细胞, 涂于含有Amp/X2gal/IPTG的LB培养基上进行蓝白斑筛选。挑取白色菌落, 通过菌落PCR, 质粒提取, Eco RI和Hin dIII (TaKaRa公司, 大连)双酶切等多重鉴定, 将阳性克隆送北京三博远志生物有限责任公司测序。
1.5小麦cMDH基因的序列分析
采用NCBI (https://www.doczj.com/doc/e62748126.html,/Structure/ cdd/wrpsb.cgi)在线进行序列保守功能区的分析; 采用ExPASy网站的Compute PI/Mw tool (http://www. https://www.doczj.com/doc/e62748126.html,/tools/pi_tool.html)计算蛋白质的等电点和分子量; 多序列比对以及进化树构建采用Clustalw 和MEGA2.0软件在默认参数下进行; 利用NCBI的在线分析软件(https://www.doczj.com/doc/e62748126.html,/spidey/ spideyweb.cgi)对序列进行外显子和内含子结构的分析。
1.6利用荧光定量PCR技术分析cMDH基因在不同发育时期花药中的表达
根据RT-PCR扩增得到的cMDH的cDNA序列在其保守序列区域设计一对特异引物, 上游引物序列为cMDH-F1: 5′-TGTGCCTGCTGGTCTTATCTA CTC-3′, 下游引物序列为cMDH-R1: 5′-GGTCGCA TCCATCTTCTTCC-3′, 预期产物长度112 bp。内参根据小麦18S rRNA (GenBank登录号为AY049040)基因的序列, 在其保守序列区域设计了一对特异性引物, 上游引物序列为18S-F: 5′-CGTCCCTGCCCT TTGTACAC-3′, 下游引物序列为18S-R: 5′-AACAC TTCACCGGACCATTCA-3′, 预期产物长度80 bp。两对引物在大连TaKaRa公司合成。为提高荧光定量PCR的可靠性和准确性, 以目的基因cMDH和内参基因18S rRNA的荧光定量引物, 不加入荧光染料进行普通RT-PCR扩增, 并用2%琼脂糖凝胶电泳检测引物的特异性, 然后再进行实时荧光定量PCR。
为了构建cMDH基因和18S rRNA基因C t值的标准曲线, 以可育双核期花药的cDNA为模板, 按照1~55倍稀释, 每个样品设置3次重复, 进行实时荧光定量PCR反应。根据模板起始拷贝数的对数和临界循环数(threshold cycle, C t)值制作标准曲线, 并得到标准方程。
实时荧光定量PCR按照SYBR Premix Ex Taq 试剂盒(TaKaRa公司, 大连)说明书进行操作, 同时设置无模板对照, 每个反应设定3次重复。采用两步法PCR, 95℃预变性10 s, 95℃变性5 s, 60℃退火31 s, 40个循环。设定在每个循环中60℃ 31 s时读取荧光值, 最后添加荧光PCR产物进行熔解曲线分析。反应在ABI Prism 7300定量PCR仪上进行。1.7荧光定量PCR结果分析方法
采用双标准曲线法引入斜率, 根据张驰宇等[9]的公式进行计算。F=10ΔCT,T/AT?ΔCT,R/AR, 式中, F代表目的基因的相对表达量, ΔC T,T代表实验组减去对照组目的基因C T值的差, ΔC T,R代表实验组减去对照组参照基因C T值的差。A T代表目的基因扩增的标准曲线的斜率, A R代表内参照基因扩增的标准曲线的斜率。利用PEMS3.1统计分析软件, 对实验数据进行差异显著性检验。
1.8酶液制备及小麦MDH活性测定
以不育系ms(Kots)-90-110和其近等基因系BC5F1为试验材料, 通过镜检取处于减数分裂期的幼穗、单核期、二核期及三核期的花药, 参照并适当改进欧阳光察[10]和朱广廉等[11]的方法测定MDH 活性。取0.5 g新鲜材料, 放入预冷研钵中, 再加入
第9期张龙雨等: 黏类小麦细胞质雄性不育相关基因cMDH的克隆与表达分析1623
预冷的酶提取液(50 mmol L?1 Tris-HCl pH 7.5内含1% PVP), 冰浴研磨后, 于4℃下15 000×g离心15 min提取粗酶液。活性测定反应混合液为50 mmol L?1 Tris-HCl (pH 8.0)含0.167 mmol L?1 NADH, 用10 mmol L?1草酰乙酸启动反应, 25℃在340 nm下测定吸光值的变化。以下降1.0 OD min?1为一个酶活性单位, 每个指标重复测定4次, 取平均值。
2结果与分析
2.1 小麦cMDH基因的cDNA序列分析
以可育株双核期花药的总RNA反转录的cDNA 为模板, 进行PCR扩增, 得到1 213 bp的cDNA片段。测序结果显示, 该序列完整的开放阅读框从57 bp开始到1 058 bp终止, 编码333个氨基酸, 分子量为35.48 kD, 等电点为5.75(图1)。分析发现, 该序列具有典型的苹果酸脱氢酶功能区保守序列, 包括一个NAD结合位点 (NAD binding site), 一个苹果酸结合位点(malate binding site)以及一个二聚化接触功能区(dimerization interface)(图2)。以该序列编码的氨基酸序列与GenBank中的非冗余蛋白质数据库进行同源性搜索, 该序列与小麦(T. aestivum, AAT64932)、水稻(Oryza sativa, AAG13573)和玉米
图1小麦胞质苹果酸脱氢酶基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列
Fig. 1Nucleotide and putative protein sequences of cytosolic malate dehydrogenases in wheat 核苷酸序列中阴影及斜体的部分为6个内含子。
Six introns are indicated in italics and in the shadow.
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图2 cMDH保守结构域分析
Fig. 2 Conservative domain analysis of cMDH
(Zea mays, AAB64290)的cMDH氨基酸序列的一致性分别为99%、93%和94%。系统进化树分析表明, 该序列与小麦两个cMDH的关系最近(图3)。由此推测, 该序列为小麦胞质苹果酸脱氢酶的基因(GenBank登录号为FJ882049)。
图3 cMDH与其他cMDH蛋白的系统发生分析Fig. 3 Phylogenetic relationship of cMDH and some other
cMDH proteins
2.2小麦cMDH的基因组序列分析
以基因组DNA为模板进行PCR扩增, 得到2 908 bp的小麦cMDH的部分基因组DNA序列(图1)。结构分析显示, 该DNA序列含有7个外显子和6个内含子。在103~955位、1 115~1 216位、1 394~1 817位、2 097~2 185位、2 322~2 401位和2 516~2 660位各有一个内含子, 分子量分别为853、102、424、89、80和145 bp。内含子与外显子相邻碱基均为GT-AG, 符合典型的植物内含子剪切模式, 其作用有待进一步研究。2.3 定量PCR扩增产物的特异性确定
在实时定量中通过对熔解曲线的分析, 发现cMDH和18S rRNA基因的熔解曲线分别在82.8~ 83.6℃和83.1~83.6℃之间各有一个单峰(图4), 表明2个基因均可特异扩增。
2.4标准曲线的建立
cMDH基因和18S rRNA基因的标准曲线的斜率分别为?3.366和?3.534, 两标准曲线的相关系数R2分别为0.9986和0.9989, 反应效率都高于0.99, 表明该体系可用于荧光定量PCR体系(图5)。
2.5小麦cMDH基因在花药组织中的相对定量分析
以可育株单核期花药中的表达量为对照, 分析cMDH基因在可育株和不育株花药发育三个时期的相对表达量(图6)。在可育株中, cMDH基因在二核期表达量都显著高于单核期和三核期, 是单核期的143.4倍, 是三核期的8.9倍; 在不育株中, cMDH基因在二核期表达量最高, 是单核期的1.2倍, 但两者间并没有显著性差异, 而与三核期存在显著性差异, 是三核期的32.3倍; 二者相比, cMDH基因在不育株单核期花药中的表达量增加, 是可育株单核期的55.6倍, 有显著性差异, 但随后该基因在不育株二核期和三核期花药中的表达量都显著低于可育株, 仅是可育株二核期的0.5倍, 三核期仅达到可育株花药的0.1倍, 基因表达明显受到抑制。
图4cMDH基因(A)和18S rRNA基因(B)的熔解曲线
Fig. 4 Dissociation curves of cMDH gene (A) and 18S rRNA gene (B)
第9期张龙雨等: 黏类小麦细胞质雄性不育相关基因cMDH的克隆与表达分析1625
图5系列稀释的cDNA模板浓度与C t值的标准曲线
Fig. 5 Standard curve between C t and cDNA templates with gradient dilution
a: cMDH基因的标准曲线; b: 18S rRNA基因的标准曲线。
a: standard curve for cMDH; b: standard curve for 18S rRNA.
图6小麦cMDH基因在不育株和可育株花药发育中的相对表
达分析
Fig. 6 Analysis of relative expression of cMDH gene in the anther development of male sterile line and fertile line
2.6小麦不育株和可育株中的MDH活性分析
比较MDH在可育株和不育株中的活性, 具有类似的动态变化(图7)。随着花药的发育, MDH活性在可育株和不育株中均表现为先升后降, 至二核期均达最大值。二者相比, 在幼穗期和花药发育的单核期, MDH活性在不育株中较高, 其中在单核期,
图7小麦不育株和可育株中的MDH活性
Fig. 7 MDH activity between male sterile line and fertile line 不育株花药的MDH活性显著高于可育株, 是可育株花药的 1.5倍; 但在花药发育的二核期及三核期, 不育株花药的MDH活性则明显降低, 其中在三核期, 不育株花药的MDH活性显著低于可育株, 是可育株花药的82.6%。
3讨论
利用实时定量PCR分析基因的相对表达水平, 目前常用的结果分析方法多采用Livak等[12]的2–ΔΔC t 法, 但这种方法要求PCR的扩增效率为100%, 而实际的PCR扩增效率不可能达到100%, 并且通常会低于0.6[13]。此外, 在PCR扩增中, 目的基因和参照基因的扩增效率不可能完全相同, 也会影响结果的准确性[14]。而本试验使用双标准曲线引入斜率, 排除了扩增效率对计算结果的影响, 同时又引入看家基因作校正, 排除了RNA总量不均一的影响。因此该方法能更加准确地计算出基因的相对表达量。
细胞质苹果酸脱氢酶在细胞质中运输反应底物和间接提供还原动力, 从而为植物的生长和发育提供能量和物质[15]。Mascarenhas[16]认为, 花粉发育中表达的基因可分为早晚两个时期, 早期基因的转录在减数分裂后即可被检测到, 在小孢子发育过程中逐渐被激活, 在花粉成熟前达到高峰, 然后迅速减少, 在成熟花粉中其mRNA水平下降或检测不到。一般认为, 早期基因可能编码细胞骨架蛋白和参与细胞壁形成、淀粉积累的蛋白质; 晚期基因在小孢子有丝分裂后启动, 并随着花粉的成熟继续积累, 在成熟花粉中表达程度最高, 晚期基因转录和翻译出来的蛋白在花粉成熟、花粉萌发中起重要作用。从本试验的定量结果来看, 在可育株和不育株花药发育的3个时期中, cMDH基因的表达量均呈现出在双核期表达量最高, 三核期显著下降的表达模式, 这与本试验酶活性测定的结果变化趋势相一致。推
1626作物学报第35卷
测小麦cMDH基因的表达有发育阶段的特异性, 是花粉发育早期表达的基因, 它的早期表达可以促进TCA 循环, 为花粉粒的成熟提供充足的能量。但cMDH基因在可育株和不育株花药中的表达量出现差异。一方面cMDH基因在不育株单核期花药中的表达量显著增多, 是可育株单核期的55.6倍, 该结果与其他一些基因在植物雄性不育系中的表达很相似。龚宏伟等[17]以K型小麦雄性不育系及保持系为材料, 对花粉发育过程中核糖核酸酶活性的研究表明, 不育系花药中核糖核酸酶活性在二核期之前显著高于保持系, 呈上升趋势, 二核期以后急剧下降。吴峰等[18]发现在辣椒细胞质雄性不育系花药不同发育阶段中, 过氧化物酶、多酚氧化酶、超氧化物歧化酶的比活力明显高于保持系, 且呈逐渐增强趋势。而本实验表明, 在单核期不育株花药的MDH活性明显高于可育株, 是可育株花药的1.5倍。由于酶是基因表达的直接产物, 酶活性的差异可反映基因表达的差异, 因此推测由于基因表达的异常变化可能会引起花粉内各种代谢的失调, 从而影响到花粉粒的发育。另一方面, cMDH基因在不育株二核期和三核期花药中的表达量急剧下降, 基因表达明显受到抑制。同时, 不育株花药的MDH活性明显降低。前人研究亦有相似报道, 例如李平等[19]研究幼穗发育过程中的NAD+-MDH同工酶活性的变化与籼型两用核不育系水稻培矮64S的育性表达的关系表明, 在不育系培矮64S的花粉完熟期花药中, NAD+- MDH的活性明显下降。张明永等[20]研究苹果酸脱氢酶在水稻细胞质雄性不育系与保持系呼吸途径中活性的变化, 发现在不育系的二核期花药中, 苹果酸脱氢酶的活性显著低于保持系, 仅为保持系的22%。推测由于cMDH基因的表达在不育系花粉发育的二核期和三核期的相对减弱, 不能催化草酰乙酸还原为足够的苹果酸, 使返回到线粒体基质中的苹果酸减少, 导致不育系中TCA 循环运行程度降低, 所提供的能量不能满足花粉成熟过程中的需求, 造成花粉在二核期和三核期的发育受阻而影响小麦的育性。梁承邺等[21]认为不育花药生活力衰退与活性氧代谢失控有密切的关系, 而这种失控可能主要源自能量代谢不能产生足够的还原力, 导致花药不育。姚雅琴等[22]发现, K型小麦不育系花粉粒败育的关键时期在二核期。本试验中cMDH基因的表达量下调就发生在不育系花药发育的二核期, 这进一步证明cMDH基因与不育系花粉败育有紧密关系。
对小麦cMDH基因的克隆为进一步通过反义RNA或RNAi技术来研究该基因的具体功能奠定了基础。此外, 对小麦cMDH基因的实时定量表达分析为探究该基因与小麦雄性不育的关系提供了一条重要线索。
4结论
获得了小麦cMDH基因的cDNA和DNA序列, cDNA序列长1 213 bp, 编码一段333个氨基酸的蛋白质; DNA序列长2 908 bp, 包含7个外显子, 6个内含子, 内含子与外显子相邻碱基均为GT-AG, 符合典型的植物内含子剪切模式。在可育株和不育株花粉发育的3个时期中, cMDH基因的表达均呈现先升后降的表达模式; 但与可育株相比, 该基因在不育株单核期花粉中的表达量显著提高, 之后在二核期花粉中表达量急剧下降, 且与酶活性的变化趋势一致。推测该基因是花粉发育早期表达的基因, 它可能是通过影响小麦雄蕊发育过程中的能量代谢而参与花粉发育调控。
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