二苯乙烯苷对氧糖剥夺星形胶质细胞凋亡的影响及其机制的
研究＊
张琰1 ，宋志刚2，张会如1（272067，山东济宁，济宁医学院医学影像系1；250012，山东济南，山东大学药学院在读博士研究生2）
摘要目的探讨2，3，5，4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(TSG) 对大鼠大脑皮层星形胶质细胞（AS）缺氧、缺糖损伤所致凋亡的影响，观察内质网应激相关因子Caspase-12、Caspase-3 的表达变化，探讨TSG产生脑保护作用的可能机制。方法原代培养Sprague-Dawley大鼠大脑皮层AS，建立缺氧、缺糖损伤模型，以流式细胞术检测细胞凋亡率，以透射电镜观察细胞超微结构尤其是凋亡小体的变化，研究氧糖剥夺（OGD）对不同组AS的影响；通过钙离子敏感的荧光探针Fura-2/AM负载细胞，荧光双波长分光光度计检测细胞内钙离子浓度的变化；免疫细胞化学染色和RT-PCR方法观测Caspase-12和Caspase-3在OGD前后的变化。结果与正常对照组相比，缺氧缺糖损伤可使细胞内游离钙离子浓度显著增高，TSG预处理后可明显降低钙离子浓度，调节钙稳态失衡。RT-PCR和免疫细胞化学染色结果显示，缺氧缺糖可使AS内Caspase-12、Caspase-3的表达增加，TSG预处理后可显著抑制两者的表达。结论凋亡因子Caspase-12、Caspase-3在缺氧缺糖处理后表达明显增加，提示内质网应激机制在氧糖剥夺所致AS细胞凋亡的发生发展中具有重要作用。TSG可抑制OGD诱导的AS凋亡，其机制可能通过抑制内质网应激发挥作用。
关键词星形胶质细胞；二苯乙烯苷；氧糖剥夺；细胞凋亡；内质网应激
Effects and mechanisms of
2,3,5,4’-tetrahydroxystibene-2-O-β-D-glucoside(TSG) against oxygen- glucose deprivation indused apoptosis in rat astrocytes＊Zhang Yan1,Song Zhigang2,Zhang Huiru1(1Department of Medical Imaging, Jining Medical University,Jining,272067;2School of Pharmaceutical Sciences Shandong
University,Jinan, 250012)
Abstract：Objective To investigate the effects of TSG on the apoptosis of rat cerebral cortical astrocytes induced by oxygen-glucose deprivation．To observe the endoplasmic reticulum stress related factors Caspase-12,Caspase-3 expression in AS and explore the possible mechanism of brain protection by TSG．Methods Primary cultured cerebral cortical astrocytes were prepared from Sprague-Dawley rats, and a cell damage model was induced by oxygen-glucose deprivation (OGD). The change of cell morphology was observed by transmission electron microscope,and the detection of apoptotic cells was determined by the flow cytometry. Intracellular calcium concentration was monitored using the fluorescent Ca2+indicator fura-2/AM by fluorescence duel wavelength spectrophotometer. The expressions of apoptosis-related proteins,Caspase-12 and Caspase-3, were observed by Immunocytochemistry and the Caspase-12 and Caspase-3 mRNA were evaluated by semi-quantitative reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR). Results The concentration of intracellular Ca2+ was increased by OGD, and the application of TSG can decrease it. RT-PCR and immunocytochemistry analysis demonstrated that the level of Caspase-12,Caspase-3 mRNA and protein increased by OGD, and the application of TSG can inhibit these expression.Conclusion The expressions of Caspase-12 and Caspase-3 increases dramatically after OGD,which indicates that the endoplasmic reticulum stress could contribute to the occurrence and development of cell apoptosis induced by OGD in AS. TSG could inhibit the cell apoptosis induced by OGD in AS, its mechanisms might be associated with the inhibition of the endoplasmic reticulum stress．
Key words: Astrocytes, TSG, Oxygen-Glucose Deprivation, Cell apoptosis, Endoplasmic reticulum stress
Supported by the Foundation of the Young Scholars of Jining Medical University
TSG是从何首乌中提取分离得到的一种多酚结构的水溶性成分，是何首乌的主要有效成分。大量研究表明，TSG具有抗炎、抗氧化、清除自由基、抑制动脉粥样硬化等多种作用[1]。随着TSG研究的不断深入，发现其在神经细胞损伤中具有显著
保护作用。研究表明，TSG对Aβ或谷氨酸诱导的神经细胞损伤均有明显的保护作用。TSG还能减少缺血、缺氧损伤等诱导的神经元细胞凋亡[2,3]等作用；课题组前期研究表明TSG对OGD诱导损伤的AS具有保护作用，且呈剂量依赖性[4]。但TSG 抑制AS凋亡的确切机制尚未见文献报道。因此，本实验采用OGD诱导AS损伤、凋亡，观察TSG对OGD诱导AS凋亡的影响，并检测AS内质网应激凋亡相关分子Caspase-12、Caspase-3的表达，探讨其作用机制，为明确TSG在脑缺血缺氧中的作用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1药品与试剂TSG( C20H22O9)，分子量: 406，纯度大于98%，购自中国药品生物制品检定所( 编号110844)；兔抗GFAP多克隆抗体（美国Sigma公司）；Cleaved Caspase-3多克隆抗体（美国Cell Signaling公司）；Caspase-12多克隆抗体（美国Chemicon公司）；羊抗兔IgG试剂盒（武汉博士德公司产品）；逆转录试剂盒及Taq DNA聚合酶（立陶宛Fermentas公司）；内参照物GAPDH（上海生工生物公司）；DNA Marker（大连宝生物工程有限公司）；钙离子荧光探针Fura-2/AM （美国Biotium公司）；鼠尾胶原、D-hanks、PBS、Earle平衡盐溶液自制。
1.2方法
1.2.1鼠脑AS的分离培养参照McCarthy KD和De Vellis J的方法加以改进。具体步骤简述如下：取出生3天内的新生SD大鼠，在75%乙醇浸泡5min后，断头取脑，分离出双侧大脑皮层，用钟表镊仔细剥离脑膜和血管，用D-hanks平衡盐液冲洗2次，剪碎后加入0.25%的胰蛋白酶,37℃消化15min,中止消化后移入离心管中，以1500 r/min离心5 min，去上清，加入含20%新生小牛血清的DMEM 培养基后混匀，放入37℃、5%CO2饱和湿度培养箱孵育30 min（差速贴壁，去除成纤维细胞）,翻转培养瓶，取出尚未贴壁的细胞悬液，调整细胞密度，以1. 0 ×106 /ml接种于预先涂有自制鼠尾胶原的培养瓶内,放入培养箱内继续培养，以后每2~3天换1次液，并逐渐降低血清浓度至10%，培养至9~12天时，细胞铺满瓶底后，胰蛋白酶消化法传代，取生长状态良好的第4代细胞用于实验。
1.2.2AS缺氧、缺糖损伤模型的建立首先将AS培养液换为预先通以缺氧混和
气体(95% N2 + 5% CO2)30min的无糖Earle平衡盐溶液，液体量为原培养液的一半，置于37℃的缺氧密闭室内,继续通以缺氧混合气(流量为1. 8 ～2 L /min) , 30 min 后封闭,37℃饱和湿度条件下培养，此时开始计缺氧缺糖损伤处理时间，根据前期工作，取缺氧缺糖12小时，记为OGD12。
1.2.3实验分组分为３组：①正常组，普通培养箱37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养，DMEM中葡萄糖含量4.5g/L；②缺氧缺糖组,缺氧密闭室饱和湿度条件下培养，Earle液中葡萄糖浓度为0 g/L,缺氧缺糖损伤处理12 h; ③TSG预处理组，根据前期研究结果取缺氧缺糖前24小时，给予TSG预处理，使其终浓度为50μmol / L组。
1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡率及透射电镜观察细胞超微结构变化将第4代AS接种于事先涂有鼠尾胶原的培养瓶内，待细胞铺满瓶底后，分组进行相应处理，实验结束后，胰蛋白酶消化、1000rpm离心10min收集细胞，用PBS洗1遍，同样条件离心后，去上清加入－20℃预冷的70%乙醇于4℃固定24 h，调整细胞浓度为1×106个/ml取1ml胞悬液，用PBS洗3次，细胞重悬于含RNase A的PI染液中，37℃孵育30min，以流式细胞仪检测凋亡细胞。收集各组细胞经取样、固定、脱水、浸泡、包埋后切片染色，日产/H-7500型透射电镜观察、照相。
1.2.5细胞内游离钙离子浓度的测定应用钙离子敏感的荧光探针Fura-2/AM 负载细胞，荧光双波长分光光度计检测细胞内钙离子浓度的变化；Fura-2/AM检测细胞内游离钙离子浓度计算公式为：〔Ca2＋〕=Kd(FD/FS)×〔(R-Rmin)/(Rmax-R)〕Kd为Fura-2与Ca2＋反应的解离常数，为224nm；R为各测定点F340/F380荧光强度比值；Rmax为Fura-2全部为钙饱和时的荧光比值，Rmin是Fura-2完全未结合钙时的荧光比值，FD和FS分别代表无钙和钙饱和状态下380nm处的荧光强度。
1.2.6 凋亡因子Caspase-3、Caspase-12的免疫细胞化学染色（SABC法）第4次传代后AS按每孔１×10５个细胞种于24孔培养板内，孔内置有预先涂有鼠尾胶原的盖玻片，待细胞铺满瓶底后，分组进行相应处理，实验结束后，进行相应免疫细胞化学染色。
1.2.7RT-PCR检测凋亡因子Caspase-3、Caspase-12 mRNA的表达收集各组细胞，提取细胞总RNA，检测RNA 完整性及纯度; 以RT-PCR法检测Caspase-3、Caspase-12mRN的表达。Caspase-3正向引物：5’－AGAACTTGAATCCACGAGCA
－3’，反向引物：5’－TTTTCTGAAGACGTGCCCAT－3’，产物大小：475bp；Caspase-12: 正向引物：5’－AGGGAATCCAGAGCACAGAA－3’，反向引物：5’－CTTTGCTTGTGGATACCCAA－3’，产物大小：537bp；按照RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas公司，立陶宛)说明进行逆转录反应：70℃5 min，37℃5 min，42℃ 60 min，70℃10 min。PCR 反应条件：预变性95℃1 min；变性95℃30 s，退火60℃30 s，延伸68℃1 min30s，30个循环；再延伸68℃10 min。取PCR产物进行1.8% 琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析系统扫描。
1.2.8统计学方法采用SPSS11.0统计分析软件处理实验数据,所得数据以均数±标准差(x±s)表示,组间比较用方差分析, P＜0.05为有统计学意义。
2结果
2.1 TSG对缺氧缺糖大鼠AS凋亡的影响AS正常对照组凋亡率为（2.32±0.3）%，缺氧缺糖损伤处理12 h后，AS凋亡率升高至（27.05±
3.0）%。TSG (50μmol/L) 预处理细胞12 h可显著降低AS细胞凋亡率至（
4.05±1.1）%（与OGD组比较，P＜0.01）。
透射电镜下见对照组细胞核大、清晰、均染，胞质内细胞器完整。缺氧、缺糖组细胞大多数体积缩小，胞质浓缩，胞核皱缩、核内染色质浓缩边集，胞质内细胞器退变，胞膜上出现小泡但连续性完整，有凋亡小体，呈现凋亡细胞特征。缺氧、缺糖加TSG组，正常超微结构细胞数较多，部分细胞也呈现凋亡特征，但程度较轻（图1）。
图1 电镜下细胞超微结构改变(×10000)
(A)对照组；(B)OGD12组；(C)TSG (50μmol/L) +OGD12组
2.2TSG对缺氧缺糖大鼠AS细胞内钙离子浓度的影响如图2所示，经荧光
双波长分光光度计监测已负载Fura-2的细胞内钙离子荧光值，OGD 12组细胞内钙离子明显高于对照组，差异具有统计学意义(P ＜0.05)。TSG (50μmol/L)预处理后，细胞内钙离子浓度较前明显降低，接近正常水平。
﹟
图2 TSG 对缺氧缺糖损伤AS 细胞内钙离子浓度的影响
注：n ＝6，x ±s ,,与对照组相比＊P <0.05，与OGD 12组比较，﹟P <0.05
2.3 免疫细胞化学染色显示Cleaved Caspase-3、Caspase-12在AS 内的表达变化 如图3所示, Cleaved Caspase-3、Caspase-12阳性染色主要位于胞浆。Cleaved Caspase-3的表达：正常对照组细胞极少着色，细胞透明，胞体饱满，突起粗大（A 图）；缺氧缺糖组细胞大部分着色，细胞染色较深，呈棕褐色，胞体缩小，突起回缩、细长（B 图）；TSG (50μmol/L)预处理组细胞染色较浅，呈棕黄色，细胞胞体和突起回缩较轻（C 图）。Caspase-12的表达：正常对照组细胞染色较浅，细胞较透明，胞体饱满、突起粗大（D 图）；缺氧缺糖组细胞染色呈棕褐色，胞体缩小，突起回缩（E 图）；TSG (50μmol/L)预处理组细胞染色较浅、胞体和突起回缩轻，接近正常组。
我们以透光度来测定灰度值高低，阳性产物越低则透光度越高，计算出的灰度值就越高，所以灰度值高低与阳性产物多少成反方向变化。Cleaved Caspase-3和Caspase-12免疫细胞化学染色结果，经过灰度值扫描，与对照组相比，缺氧缺糖组平均灰度值显著降低，差异有统计学意义（P ＜0.01，P ＜0.05）。经TSG (50μmol/L)预处理后，平均灰度值均升高，TSG (50μmol/L)预处理组与缺氧缺糖组相比，差异均有统计学意义（P ＜0.05，P ＜0.05）。
图3-1免疫细胞化学显示Cleaved Caspase-3在胞浆的表达（×400）注：(A)对照组(B)OGD12组(C)TSG (50μmol/L)+ OGD12组
C
20
40
60
80
100
120
140
160
180
control OGD OGD+TSG
l
e
a
v
e
d
c
a
s
p
a
s
e
-
3
灰
度
值
＊
﹟
图3-2 不同处理因素对Cleaved Caspase-3蛋白表达的影响注：n＝３，x±s,与对照组相比＊P <0.05，与OGD12组比较，﹟P <0.05
图3-3免疫细胞化学显示Caspase-12在胞浆的表达（×400）
注：(D)对照组(E)OGD12组(F)TSG (50μmol/L)+ OGD12组
10
20
30405060708090
control OGD OGD+TSG
C a s p a s e -12灰度值＊﹟
图3-4不同处理因素对Caspase-12蛋白表达的影响
注：n ＝３，x ±s ,,与对照组相比＊P <0.05，与OGD 12组比较，﹟P <0.05
2.4 TSG 对缺氧缺糖大鼠AS 内Caspase-3、Caspase-12 mRNA 水平的影响 RT-PCR 结果显示，缺氧缺糖损伤处理后，AS 的Caspase-3、Caspase-12 mRNA 水平明显上调，TSG (50μmol/L)预处理后可明显下调相应凋亡相关分子mRNA 的表达水平（图4）。
１ ２ ３ ４
图4 -1 Caspase-3 RT-PCR 扩增片断琼脂糖电泳图
注：(1) marker (2)对照组 (3)OGD 12组 (4) TSG +OGD 12
0.05
OGD12OGD12+E2
120
160
control
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
control
C
a
s
p
a
s
e
-
3
m
R
N
A
比
值
（
与
内
参
照
相
比
）
20
40
60
80
100
140
180
OGD OGD+TSG
＊
﹟
图4-2不同处理因素对AS表达Caspase-3mRNA影响
注：n＝３，x±s,与对照组相比＊P <0.05，与OGD12组比较，﹟P <0.05 １２３４
图4-3 Caspase-12 RT-PCR扩增片断琼脂糖电泳图
注：(1)marker (2)对照组(3)OGD12组(4)TSG+OGD12
OGD12OGD12+E2
160
control
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
control
C
a
s
p
a
s
e
-
1
2
m
R
N
A
比
值
（
与
内
参
照
相
比
）
20
40
60
80
100
120
140
OGD OGD+TSG
﹟
＊
图4-4 不同处理因素对AS表达Caspase-12mRNA影响
注：n＝３，x±s,与对照组相比＊P <0.05，与OGD12组比较，﹟P <0.05
3讨论
缺氧、缺糖是脑缺血产生损伤的两种基本因素，脑细胞的损害在本质上主要是脑组织氧、糖缺乏而引发的一系列事件的结果。在本实验中，用体外缺氧缺糖处理即氧糖剥夺模拟AS的缺血性损伤。据文献报道缺氧缺血后AS死亡的主要形式是凋亡。其机制可能与钙离子超载、氧化应激、线粒体功能障碍、转录信号的激活等因素有关。由于AS的功能状态对于损伤应激中神经元的存活有重要影响，因此抑制AS凋亡可能为缺氧缺血性脑损伤的治疗提供一种新的神经保护策略。
本实验利用流式细胞仪检测细胞凋亡率，透射电镜观察细胞超微结构尤其是凋亡小体的变化，发现OGD可致AS发生凋亡，TSG预处理可显著降低细胞凋亡率，改善细胞超微结构。
内质网( endoplasmie reticulum，ER) 是真核细胞内重要的亚细胞器，含多种酶系统，参与脂类代谢过程。多种生理或病理条件会引起未折叠蛋白或错误折叠蛋白在ER 聚集，损伤ER 的正常生理功能，称为内质网应激[5,6]。最近的研究表明，内质网是细胞凋亡调节中的重要环节[7]。ERS可以介导与死亡受体和线粒体途径不同的一条新的凋亡通路。早期的ERS是机体自身代偿的过程，对细胞具有保护作用；当严重或长时间ERS 损伤了内质网的功能时，细胞发生凋亡，以去除损伤的细胞[8,9]。
钙超载是许多原因引起细胞损害的“最后共同通路”，也是细胞损伤的重要标志之一[10]。缺氧、缺血再灌注、氧化性应激等多种损伤因素都能导致细胞内钙超载。钙离子既是凋亡信号的传导分子又是凋亡效应分子。在ERS时，ER钙平衡打乱，细胞内钙离子水平升高引起钙蛋白酶（calpain）活化，剪切定位于ER膜上的Caspase-12前体，使之活化并释放入细胞质。进入细胞质的活化的Caspase-12启动ERS反应性凋亡级联反应，从而诱导细胞凋亡。
Caspase-12是Caspase家族中较新的成员，正常是以前体形式存在，位于内质网的胞质面，也是这个家族中唯一定位于ER的成员，国外学者的研究发现，Caspase-12在死亡受体或线粒体介导的凋亡途径中不被活化。Caspase-12缺陷鼠能抵抗ERS引起的凋亡而其他死亡刺激仍可发生凋亡。这表明Caspase-12与ERS介导的凋亡密切相关，与不涉及ER的凋亡信号通路无关[11]。因此Caspase-12被誉为是
介导ERS致凋亡通路的关键分子。Caspase-12仅特异性地被ERS信号通路裂解激活[12]，而活化的Caspase-12通过激活其下游的Caspase-9，进一步激活细胞凋亡的执行分子Caspase-3，从而导致细胞凋亡。
本实验研究结果显示，经缺氧、缺糖诱导的AS细胞内游离钙离子明显增多，Caspase-12、Caspase-3mRNA和蛋白的表达显著增加，与对照组比较差异均具有统计学意义( P＜0.05) 表明氧糖剥夺可能是通过ERS 反应性凋亡通路来介导信号转导，进一步导致缺血性脑损伤的发生。TSG预处理后，细胞内游离钙离子浓度显著降低接近正常水平，Caspase-12和Caspase-3mRNA和蛋白的表达较OGD组明显下调(P＜0.05)，提示TSG可以通过阻断细胞内钙离子介导的内质网应激或直接抑制内质网应激特有的凋亡起始因子Caspase-12而减少缺氧缺糖损伤AS凋亡的发生，其具体的分子机制和信号通路尚需进一步的研究，以便为缺血性脑病的临床干预提供更多的理论依据。
参考文献
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星形胶质细胞在脑缺血中的双重作用 2013-03-29 18:09 来源：国际脑血管病杂志 作者：吴政政等 脑缺血可诱发从细胞能量耗竭到细胞死亡的一系列级联事件，包括兴奋性氨基酸过度释放、自由基形成、炎症反应等。以往研究多局限于脑缺血对神经元的损伤，但由于人大脑中的星形胶质细胞数量是神经元的数倍，因此，在脑缺血后保护与维持星形胶质细胞功能同样重要。目前，由神经元、胶质细胞和毛细血管构成的“神经血管单元”（neurovascularunit，NVU）日益得到认可和关注，其在包括缺血性卒中在内的多种神经系统疾病中发挥重要作用。缺血性卒中的治疗策略应致力于挽救整个NVU的功能，而星形胶质细胞正是NVU的重要组成部分。大量证据表明，星形胶质细胞在脑缺血中具有多方面的复杂作用，一方面可促进神经元存活，另一方面也可加重缺血性损伤。现对星形胶质细胞在脑缺血中的保护与损害作用做一综述，探讨其调控机制，旨在为缺血性卒中的治疗提供新的思路。 1 星形胶质细胞的生物学特性 星形胶质细胞是胶质细胞的一类，其数量为神经元的5倍，是整个中枢神经系统（central nervous system，CNS）的主要组成部分之一，在CNS的生理和病理学中发挥着关键作用。星形胶质细胞终足同时包绕着血管壁和神经突触，参与调控细胞代谢、血流、离子平衡、神经递质水平、神经传输和突触可塑性以及血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）。星形胶质细胞和神经元通过缝隙连接相互作用，对神经元的存活至关重要。神经元、胶质细胞和毛细血管构成的NVU在缺血性卒中的病程进展中具有重要作用，其中，星形胶质细胞作为NVU 的重要成分，一方面伸出大量终足参与BBB，另一方面参与形成神经元突触，被看作是继突触前和突触后成分之后的突触第三成分。脑缺血时，由于缺血核心区葡萄糖和氧供应完全终止，致使包括神经元和星形胶质细胞在内的所有神经细胞发生不可逆性损伤。但是，缺血半暗带内的葡萄糖和氧供应尚部分维持，使星形胶质细胞可存活较长时间。利用氧一葡萄糖剥夺（oxygen-glucose deprivation，OGD）模型进行的研究显示，星形胶质细胞对OGD 的耐受性好于神经元；进一步的研究表明，星形胶质细胞在OGD时能利用糖酵解产生ATP 供能，从而发挥神经保护作用。然而，缺血性卒中时由于持续和严重的缺氧缺糖，星形胶质细胞的调控功能受损，严重影响着脑组织功能，如谷氨酸动态平衡、水平衡、BBB稳定、脑血流量调节、细胞外离子平衡、神经保护因子分泌等。 2 脑缺血与星形胶质细胞的活化 CNS发生的多种病理学变化，如卒中、外伤、肿瘤、变性性疾病等，均会导致星形胶质细胞活化。这种活化具有特征性的结构和功能变化，然而具体过程尚不清楚。星形胶质细胞是CNS的重要组成部分，在脑缺血时，缺血程度、血脑屏障破坏、炎症反应、代谢失衡、细胞兴奋毒性以及氧化应激均会影响星形胶质细胞活化程度。 虽然普遍认为星形胶质细胞活化是CNS疾病的病理学标志，但对星形胶质细胞活化的定义却并未能达成共识。目前认为，星形胶质细胞活化包括4个特征：（1）由任何形式及程度的CNS损伤和病变引起的一系列分子、细胞和功能水平的变化；（2）随着损伤程度的加重，其分子表达进行性变化，细胞进行性肥大，严重时发生细胞增生和癍痕形成；（3）其变化
脑胶质瘤诊疗规范（2018年版） 一、概述 脑胶质瘤是指起源于脑神经胶质细胞的肿瘤，是最常见的原发性颅内肿瘤，世界卫生组织（WHO）中枢神经系统肿瘤分类将脑胶质瘤分为Ⅰ-Ⅳ级，Ⅰ、Ⅱ级为低级别脑胶质瘤，Ⅲ、Ⅳ级为高级别脑胶质瘤。本规范主要涉及星形细胞、少突胶质细胞和室管膜细胞来源的高、低级别脑胶质瘤的诊治。 我国脑胶质瘤年发病率为5-8/10万，5年病死率在全身肿瘤中仅次于胰腺癌和肺癌。脑胶质瘤发病机制尚不明了，目前确定的两个危险因素是：暴露于高剂量电离辐射和与罕见综合征相关的高外显率基因遗传突变。此外，亚硝酸盐食品、病毒或细菌感染等致癌因素也可能参与脑胶质瘤的发生。 脑胶质瘤临床表现主要包括颅内压增高、神经功能及认知功能障碍和癫痫发作三大类。目前，临床诊断主要依靠计算机断层扫描（CT）及磁共振成像（MRI）检查等影像学诊断，磁共振弥散加权成像（DWI）、磁共振弥散张量成像（DTI）、磁共振灌注成像（PWI）、磁共振波谱成像（MRS）、功能磁共振成像（fMRI）、正电子发射计算机断层显像（PET）等对脑胶质瘤的鉴别诊断及治疗效果评价有重要意义。 脑胶质瘤确诊需要通过肿瘤切除或活检获取标本，进行组织和分子病理学检查，确定病理分级和分子亚型。目前主要的分子病理标记物包括：异柠檬酸脱氢酶（IDH）突变、染色体1p/19q联合缺失状态（co-deletion）、O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT）启动子区甲基化、α地中海贫血伴智力低下综合征X连锁基因（ATRX）突变、端粒酶逆转录酶（TERT）启动子突变、人组蛋白H3.3（H3F3A）
K27M突变、BRAF基因突变、PTPRZ1-MET基因融合、miR-181d、室管膜瘤RELA基因融合等1，2。这些分子标志物对脑胶质瘤的个体化治疗及临床预后判断具有重要意义。 脑胶质瘤治疗以手术切除为主，结合放疗、化疗等综合治疗方法。手术可以缓解临床症状，延长生存期，并获得足够肿瘤标本用以明确病理学诊断和进行分子遗传学检测。手术治疗原则是最大范围安全切除肿瘤，而常规神经导航、功能神经导航、术中神经电生理监测和术中MRI实时影像等新技术有助于实现最大范围安全切除肿瘤。放疗可杀灭或抑制肿瘤细胞，延长患者生存期，常规分割外照射是脑胶质瘤放疗的标准治疗。胶质母细胞瘤（GBM）术后放疗联合替莫唑胺（TMZ）同步并辅助化疗，已成为成人新诊断GBM的标准治疗方案。 脑胶质瘤治疗需要神经外科、神经影像科、放射治疗科、神经肿瘤科、病理科和神经康复科等多学科合作，遵循循证医学原则，采取个体化综合治疗，优化和规范治疗方案，以期达到最大治疗效益，尽可能延长患者的无进展生存期（PFS）和总生存期（OS），提高生存质量。为使患者获得最优化的综合治疗，医师需要对患者进行密切随访观察，定期影像学复查，兼顾考虑患者的日常生活、社会和家庭活动、营养支持、疼痛控制、康复治疗和心理调控等诸多问题。 二、影像学诊断 （一）脑胶质瘤常规影像学特 神经影像常规检查目前主要包括CT和MRI。这两种成像方法可以相对清晰精确地显示脑解剖结构特征及脑肿瘤病变形态学特征，如部位、大小、周边水肿状态、病变区域内组织均匀性、占位效应、血脑屏障破坏程度及病变造成的其他合并征象等。在图像信息上MRI 优于CT。CT主要显示脑胶质瘤病变组织与正常脑组织的密度差值，
小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方 案 经过相关文献阅读，参考了众多对于小胶质细胞培养方案，对比了不同方案的利弊优缺，整合了相对符合本实验室条件和实验要求的方法，如有其他变更方案，以修改后为准。 1.实验材料与试剂 剪刀、小镊子、小毛刷、DMEM/F12培养液、胎牛血清、马血清、0.25%，0.05%胰蛋白酶、PBS液、青霉素、链霉素、培养皿离心管、50 mL 细胞培 恒温细胞培养箱、倒置相差显微镜、细胞板、荧光标记二抗、0.4% 养瓶、CO 2 Trypan Blue染色液、抗小鼠OX42单克隆抗体和新生SD小鼠等 试剂配比： (1)DMEM 10:10:1 DMEM, 10%FBS, 10%Horse Serum, 1% Penicillin/Streptomycin (P/S)? (2)DMEM 5:5:1 DMEM, 5% FBS, 5% of Horse Serum, 1% P/S? (3)SERUM FREE MEDIUM + GROWTH FACTORS （DMEM/F12无血清培养基+生长因子） 25μg/ml转铁蛋白，10nM生物素，30 nM亚硒酸钠，1μg/ml putrescine（腐胺），5μg/ml胰岛素， 20 nM hydrocortisone（氢化可的松），20 nM progesterone（孕激素），1％P / S+生长因子（5ng/ ml的血小板衍生生长
因子PDGF-AA和5ng / ml碱性成纤维细胞生长因子bFGF）胰蛋白酶/ EDTA溶液0.05％胰蛋白酶+0.02％EDTA在W / O内Ca2+ / Mg2 +的HBSS DMEM/F12 containing 25 μg/ml transferrin, 10 nM biotin, 30 nM sodium selenite, 1 μg/ml putrescine, 5 μg/ml insulin, 20 nM hydrocortisone, 20 nM progesterone, 1% P/S + Growth Factors (5 ng/ml PDGF-AA and 5 ng/ml bFGF)?Trypsin/EDTA solution 0.05% Trypsin + 0,02% EDTA in HBSS w/o Ca2+/Mg2+ Laminar flow hood Dissecting magnifying glass Water bath at 37oC Humidified tissue culture incubator (37oC, 5% CO2) Sterilized microdissecting instruments: large dissecting scissors, mouse-teeth forceps, curved forceps and fine Dumont forceps Orbital Shaker (Boeco OS 20) Tabletop centrifuge 50 ml plastic conical tubes (Sarstedt, 62.547.004) T75 cm2 tissue culture flasks with plug-seal (BD Falcon, 137787) Tissue culture plates (Falcon) Petri dishes (Sterilin) 30 μm sterile nylon mesh (Saatilene, Hitech) 2.实验步骤 2.1星形胶质细胞的混合培养
文章编号:1009-4237(2007)02-0160-03 论 著 原浆型和纤维型星形胶质细胞调控神经干细胞 定向分化的比较研究 曾 琳,李 民,刘 媛,龙在云,李书林,伍亚民 (第三军医大学大坪医院野战外科研究所三室,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室,重庆 400042)摘要: 目的 探讨原浆型星形胶质细胞(pro t op l as m ic astrocy t e ,PAS )和纤维型星形胶质细胞(fi brous astrocy t e ,FA S )对神经干细胞(neura l ste m ce ll ,N SC )定向分化的调控作用。方法 将4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-D ia m i dino -2-phenyindo l e ,dilac t a t e ,DAP I )标记的NSC 分别与PAS 、FAS 共培养,10天后免疫组化法对分化神经元进行鉴定,显微镜下随机选取20个视野,每次计数100个细胞,计算NSC 分化为神经元的比 例。结果 N SC 与PA S 共培养后分化成的神经元比例较高,与胶质细胞的比例约为61%:39%;FA S 与N SC 共培养后分化神经元数量相对较少,以胶质细胞居多,其比例约为41%∶59%。结论 PA S 与FA S 相比更能促进NSC 向神经元分化。 关键词:星形胶质细胞;神经干细胞;分化 中图分类号:R 338 文献标识码:A Stud ies on regulatory effects of t he protoplas m ic and fi b rous astrocytes to the d irectional differentiation of neura l st e m cell Z ENG lin ,LI M in ,L I U Y uan ,et al . (S tate K ey L aboratory of T rau m a ,Bu rns and Co m bined In j ury ,D epa rt m entN o.3,Institute of Su rgery R esearch , Daping H ospit a l ,ThirdM ilitary M ed ica l Un i ve rsit y ,Chongqi ng 400042,Chi na )Ab stract : O b jective To study t he regula t o ry eff ec t o f pro toplas m ic astrocy te (PAS )and fibrous astrocy t e (FAS )on differentiation of neural ste m ce ll (N SC ).M ethod s I mmunohist o che m isty w it h DA P I wa s taken to cal -cu l a t e the proporti on of neurons w it h i n 100cells by 20fie l ds of v isi on chosen random ly fo r 10days .The da t a w ere analyzed in statistics by co -cu lt u re of N SC w it h PAS and FAS respec tiv l y .Resu lts The percentage of neurons in PA S group (61%)w asm uch m ore t han t hat of FA S g roup (41%).Con clusion The result sugge sted t ha tPA S w as m ore eff ec tive t o induce NSC diff e renti a ting into neuron in vitro . K ey word s :astrocy t e ;neu ra l st em cell ;d iffe rentia tion 基金项目:国家自然科学基金(30300364) 重庆市院士基金(7671) 收稿日期:2006-08-06;修回日期:2006-11-03通讯作者:伍亚民(第三军医大学大坪医院野战外科 研究所三室,重庆 400042) 星形胶质细胞(astrocyte ,AS )能分泌多种细胞因子[1-3] ,调控神经干细胞(neura l ste m ce ll ,NSC )分 化,而原浆型(protoplas m ic astrocy t e ,PAS )和纤维型星形胶质细胞(fibrous astrocy t e ,FAS )又存在一定的 功能差异[4] ,对NSC 分化可能产生不同的作用。为此,本实验探讨以上两种AS 对NSC 向神经元分化的不同作用,从而为细胞联合移植治疗脊髓损伤奠定基础。 材料与方法1 实验动物 孕13～14天的大鼠和新生2天的大鼠。2 试剂与材料 胎牛血清(FBS ,H yclone ),2mm o l /L L -谷氨酰胺 (Sig m a ),0.6%葡萄糖,DME M /F 12培养基(H y -clone ),多聚赖氨酸,0.25%胰蛋白酶(S i g m a ),10mm o l /L L -l e uc i n e -m e t h y l -este r (S ig m a ),0.15mm o l / L E DT A ,H anks 液(自备),兔抗大鼠GF AP (Sig -m a ),小鼠抗大鼠NF -200(S i g m a ),羊抗兔TRI TC 、羊抗小鼠TR I TC 、0.4%Triton -X -100、甲醇、30%H 2O 2、0.01M PBS (北京中山公司)。3 实验方法 3.1 PAS 和FAS 的纯化培养参见Raff 等[4] 的培养方法。 3.2 PAS 和FAS 的鉴定 将上述细胞固定后,用0.5%H 2O 2/纯甲醇灭活内源性过氧化物酶,0.4%Trit o n -X -100处理,滴加正常山羊血清封闭,加入 GFAP 抗体37℃孵育2小时,用羊抗兔TRI TC Ig G 荧光抗体显色后DPX 封片,激光共聚焦显微镜观察,激发波长为543nm ,呈红色。 3.3 NSC 的培养和鉴定 参见本单位刘媛等建立的方法 [5] 。
星形胶质细胞瘤病理变化介绍 星形胶质细胞瘤是常见的胶质瘤，尤其好发于30到40岁的年龄阶段，所以对它的病理特征必须注重了解，可以用右眼观察了解是否有结节或者具它的状况，或者是在光镜下检查。 1，肉眼观察：肿瘤大小可为数厘米大的结节至巨大肿块不等，一般境界不清，在肿瘤组织出现坏死出血时，似与周边组织境界分明，但边界外仍有瘤组织浸润。瘤体灰白色，质地视瘤内胶质纤维多少而异，或硬、或软、或呈胶冻状外观，并可形成大小不等的囊腔。由于肿瘤的生长，占位和邻近脑组织的肿胀，脑的原有结构因受挤压而扭曲变形。 2，光镜下：肿瘤细胞形态多种多样，肿瘤细胞核的多形性，核分裂像，瘤细胞密度，血管内皮增生程度以及瘤组织坏死。
3，星形细胞瘤预后较好，按瘤细胞形态又分为纤维型、原浆型、肥胖型和混合细胞型等亚型。其中以纤维型星形细胞瘤（fibrillary astrocytome）最常见，瘤细胞分化好，但呈浸润性生长，瘤细胞之间可见红染的原纤维性背景。原浆型星形细胞瘤（protoplasmic astrocytoma）较少见，瘤细胞体积小，形态较一致，胞突少而短。肥胖细胞型星形细胞瘤（gemistocytic astrocytoma）瘤细胞体积较大，胞浆丰富，半透明，核偏位。电镜下在瘤细胞胞浆中可见成束排列的中间丝。星形细胞瘤胞浆均表达胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）、S-100蛋白和波形蛋白（Vimentin）。 4，间变性星形细胞瘤（anaplastic astrocytoma）预后较差，光镜下表现为瘤细胞密度增加，核异型性明显，核深染可见核分裂像，血管内皮细胞增生等，为恶性肿瘤的征象。 5，胶质母细胞瘤（glioblastoma）又分为多形性胶质母细胞瘤（glioblastoma multiform, GBM）和巨细胞型胶质母细胞
星形胶质细胞 *导读：星形胶质细胞是哺乳动物脑内分布最广泛的一类细胞，也是胶质细胞中体积最大的一种。…… 星形胶质细胞是哺乳动物脑内分布最广泛的一类细胞，也是胶质细胞中体积最大的一种。用经典的金属浸镀技术(银染色)显示此类胶质细胞呈星形，从胞体发出许多长而分支的突起，伸展充填在神经细胞的胞体及其突起之间，起支持和分隔神经细胞的作用。细胞突起的末端常膨大形成脚板(footplate)或称终足(endfoot)，有些脚板贴附在邻近的毛细血管壁上(图1-2)，因 此这些脚板又被称为血管足或血管周足，靠近脑脊髓表面的脚板则附着在软膜内表面，彼此连接构成胶质界膜(glia limitans)。在用尼氏法等一般染色组织切片中，星形胶质细胞的核比其他胶质细胞的核大，呈圆形或卵圆形，常染色质多，异染色质少而分散，故染色浅，核仁不明显。胞质中没有尼氏体，但具有一般的细胞器。胞质中含有大量交错排列的原纤维，伸人到胞突中并与胞突平行行走，是构成细胞骨架的主要成分。原纤维的超微结构是一种中间丝，称为胶质丝(glial filament)，其直径介于微管(25μm)和微丝(6μm)之间，由相对分子质量为47000—50000的蛋白质组成，此类蛋白质被称作为胶原原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acid protein，GFAP)。利用细胞免疫法证明GFAP 仅存在于星形胶质细胞的胞体中，因此可利用GFAP的特异性抗
体来检测星形胶质细胞。 根据胶质丝的含量以及胞突的形状可将星形胶质细胞分为两种：纤维性星形胶质细胞(fibrous astrocyte)多分布在脑脊髓的皮质，突起细长，分支较少，胞质中含大量胶质丝，又称蜘蛛细胞(spider cell);原浆性星形胶质细胞(protoplasmic astrocyte)，多分布在灰质，细胞突起粗短，分支多。胞质内胶质丝较少，又称苔状细胞(mossycell)。电镜下星形胶质细胞的胞核有缺刻， 胞质较清亮，游离核糖核蛋白体和粗面内质网均很少，糖原颗粒丰富，有大量的胶质丝。纤维形星形胶质细胞的突起呈长圆柱形，而原浆性星形胶质细胞的突起呈薄片状，并常包裹着神经细胞及其突触(不伸人突触间隙)。星形胶质细胞的脚板与血管内皮细胞之间相隔一层基板，脚板质膜与基板接触处有半桥粒结构。 相邻星形细胞之间以及相邻脚板之间有缝隙连接。星形胶质细胞之间的细胞间隙狭窄，仅约3nm，内含组织液。缝隙连接又称缝管连接或接合膜(nexus)，是由大量连接小体(connexon)有规律 地成平板状排列的连接。每个连接小体又由6个亚单位镶嵌蛋白组成，这种蛋白被称为连接蛋白或接合素(connexin)。连接小体的中央有一中央小管(centralcanaliculum)通连相邻细胞。星形胶质细胞之间的缝隙连接主要由接合素43(CX43)构成。而少突 胶质细胞的缝隙连接由CX32构成。 星形胶质细胞比脑内其他任何类型的细胞具有更广泛的缝隙连接，由此使得星形胶质细胞类似于合胞体样结构。这种缝隙连接
星形胶质细胞在调节突触可塑性中的作用 【摘要】突触传递的可塑性被认为是学习和记忆的神经生物学基础，其取决于不同的神经元突触前和突触后机制。然而，最近有越来越多的研究涉及可塑性的第三个要素——突触周围的胶质细胞。传统观念一直认为星形胶质细胞(astrocyte，AS)仅是被动的辅助角色, 起支持和营养等作用。近年的研究发现，无论在中枢还是外周神经系统，星形胶质细胞都主动参与了信息的传递与整合，并通过其释放的神经胶质递质等直接影响突触的可塑性。本文结合近年来的研究结果，对AS在突触可塑性中的研究进展作一综述。 【关键词】AS；突触可塑性；神经递质；突触传递 在由神经元和胶质细胞构成的神经系统中，胶质细胞数量占90%，其中星形胶质细胞(astrocyte，AS)是体积最大，也是分布最为广泛的胶质细胞。过去认为AS主要是对神经元起支持和营养作用。然而，近年来越来越多的证据表明AS 在维持神经系统的正常生理活动、脑的发育和神经病理等过程中发挥着重要作用［1］。突触是神经元之间信息传递过程中的重要结构。最新观点认为，AS与突触前和突触后神经元共同构成三重突触(tripartite synapses)结构，参与信号的传导和整合［2］。 1 突触可塑性 突触可塑性是指突触在一定时期，一定条件下突触数目、结构和功能的改变，既包括突触传递效能的变化，又包括突触形态结构以及亚微结构的变化，来调节神经传导和神经分泌等［3］。 根据作用时间，突触可塑性可分为短时效的和长时效的。根据接收条件刺激的突触前纤维与传递效应改变的突触之间的对应关系，可分为同突触型，即条件刺激和可塑性改变发生在同一条突触通路上；和异突触型，指条件刺激作用于传入神经，而可塑性改变发生在没有接受刺激的突触通路上［4］。 2 AS与突触可塑性 AS与突触前、后神经元的位置关系密切，在神经系统内与突触结构紧密相连。早在1997年，Barres等［5］就报道，胶质细胞可以促进突触间的联系。与胶质细胞共同生长的神经元突触的活跃程度是独自生长的神经元突触的10 倍。后来，Barres 实验室又发现，去除视网膜神经节细胞(RGCs)中的AS后，电生理记录反映突触的活性很小；将AS加入后, 即使没有与胶质细胞接触, 神经元对多种刺激的反应程度也比那些独自生长的高出7倍, 且很少出现突触传递障碍。为解释上述现象,Mauch等［6］使用层析、2 d电泳和质谱分析等方法进行了细致的研究。结果表明，AS在突触囊泡的释放和再循环过程中也有重要作用。AS 释放的载脂蛋白/ 胆固醇被神经元内吞入胞内, 使RGCs的自身突触(autapse) 数目增加了8倍, 量子含量(quantal content)增加了10倍。近年来，使用细胞培
目录一、星形胶质细胞的生物学特性 (一) 星形胶质细胞的异质性 (二) 胶质网络二、星形胶质细胞的功能 (一)分泌功能 (二)星形胶质细胞与神经的发育及再生 (三)星形胶质细胞具有对神经元微环境调控的能力 (四)免疫功能与血脑屏障调控三、星形胶质细胞功能的新近进展 (一)星形胶质细胞也具有可兴奋性 (二)星形胶质细胞与神经元的通讯或对话 (三)在突触形成和突触可塑性中的作用 (四)星形胶质细胞与神经发生胶质细胞是神经系统内数量众多的一大类细胞群体,约占中枢神经系统(CNS)细胞总数的90%,星形胶质细胞(astrocyte)是其中主要的组成成分 目的从新生鼠皮层中分离、培养并鉴定原浆型星形胶质细胞(protoplasmic astrocyte,PAS)和纤维型星形胶质细胞(fibrous astrocyte,FAS).方法新生大鼠皮层分离的混合星形胶质细胞,经差速振荡法得到纯化的PAS和FAS;用免疫组化法分别对两种细胞进行鉴定.结果观察到两种细胞均特异性的标记为阳性.PAS外观扁平似圆盘状,细胞体 较大,突起宽而扁,分支少,均匀排列生长;FAS细胞体较小,呈圆形、卵圆形或多角形,突起较多,细长并有分支,呈交错生长.结论采用差速振荡法体外纯化培养两种AS,方法可行、有效,同时纯度达95%以上. 脑星形胶质细胞是中枢神经系统(CNS)内在数目占绝对优势的一类大胶质细胞,被认为在神经元的整个发育过程中起重要作用.本文主要就参与星形胶质细胞调节神经元活动的主要功能分子,星形胶质细胞在中枢神经系统的生物学功能,及其与疾病的关系作一简要回顾. 目的观察星形胶质细胞(AST)分泌雌激素的规律,研究AST对大脑皮层神经元突触形成的影响及可能的分子机制.方法取新生大鼠大脑皮层进行AST原代及传代培养,分别于传代培养的第0 d、7 d、14 d、21 d进行细胞计数,同时用ELISA方法测定AST条件培养液(ACM)中雌二醇(E2)的浓度.以新生大鼠皮层神经元纯培养为模型,实验分成6组:神经元纯培养 组;ACM培养组;AST和神经元混合培养组;雌激素培养 组;ACM+Tamoxifen(雌激素受体阻断剂)培养组;Tamoxifen培养组.应用 免疫荧光技术和突触计数方法观察各组突触形成数量的差别.结果AST数量分别为1×104/ml、1.1×106/ml、1.4×106/ml、1.5×106/mi;ACM中雌二醇浓度分别为(ng/L):0、117±22、266±22、252±27.第0 d培养液中未检测出雌二醇,随着培养时间的延长雌激素浓度迅速增加,14 d左右达高峰,以后逐渐降低,但21 d时培养液中雌二醇仍保持较高浓度.各实验组突触荧光颗粒数分别为(个/细胞,培养第9 d):14±3;79±5;83±8;80±6;32±3;29±3.显示ACM能增加培养神经元突触形成的数目近6倍,外源性雌激素可基本模拟ACM的效应.Tamoxifen 能阻断ACM促突触形成效应的75%左右.结论体外培养新生大鼠大脑皮层AST能合成并分泌雌激素,分泌的雌激素可能参与了胶质细胞调节神经元突触形成的过程,而胶质源性的雌激素可能通过雌激素受体发挥促突触形成的作用. 星形胶质细胞(AS)是神经系统的重要组成部分,目前认为AS是构成突触结构的第三种成分.AS对突触的数量、形态结构、成熟过程以及突触传递都有影响.AS能够以多种方式和神经元相互作用,如通过谷氨酸-谷氨酰 胺循环、细胞内Ca2+浓度的改变等环节影响神经元的生物活性,进而发挥对神经突触可塑性的影响.最新研究表明,AS亦能够通过分泌多种介质,
万方数据
１８４ 物中心提供；ＤＭＥＭ干粉购自Ｇｉｂｃｏ公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所；胰蛋白酶（Ｔｒｙｐ－ｓｉｎ）、青霉素一链霉素均为Ｓｉｇｍａ公司产品；Ｄ—Ｈａｎｋｇ液为实验室自配；ＭｏｕｓｅＡｎｔｉ－ＧＦＡＰ单克隆抗体及ＣＹ５Ａｎｔｉ．Ｍｏｕｓｅ荧光二抗购自Ｃｈｅｍｉｃｏｎ公司；Ｈｏｅｃｈｓｔ为Ｓｉｇｍａ公司产品。 ２．原代培养①取１—３ｄ的新生ＩＣＲ小鼠，将其断头处死，在无菌条件下由腹侧取出脊髓，置盛有Ｄ—Ｈａｎｋｇ液的小皿中，在解剖显微镜下剔除脊膜，随后换到另一干净的小皿中。②在小皿内剪碎脊髓，大小为１×１×１，再将其移人尖底离心管中，加２～３倍体积的０．２５％胰蛋白酶，在３７℃下消化１５ｍｉｎ，加入等体积的含血清培养基（不含抗生素）终止消化；轻吹２０次左右，静置片刻，将上清吸人另一离心管中，原离心管中加入１ｍｌＤ—Ｈａｎｋｇ轻吹洗脊髓后将上清移入另一离心管中，在原离心管中加入ｌ～２ｍｌ的０．２５％胰蛋白酶再次消化１５ｍｉｎ，终止后连同上次消化的上清液一起１５００ｒｐｍ离心５ｍｉｎ，弃上清液，再加入含１０％血清的ＤＭＥＭ培养基，机械吹打使细胞分散，制成单细胞悬液。③血细胞计数板计数后调整密度到ｌ×１０５接种于无底物黏附的２５ｃｍ２玻璃培养瓶，在３７℃，５％ＣＯ：培养箱中培养。④每天倒置显微镜下对细胞进行观察，接种２４～４８ｈ后细胞第一次换液，以后每周换液两次。 ３．星形胶质细胞的纯化细胞培养７～１０ｄ待细胞分层生长后，置于３７。Ｃ摇床中２００ｒ／ｍｉｎ振荡６ｈ，弃含脱落细胞的细胞悬液，Ｄ－Ｈａｎｋｇ液洗３次，加入含１０％血清的ＤＭＥＭ培养基，放入３７℃，５％ＣＯ：培养箱中继续培养。为提高星形胶质细胞的纯度，可在传代后约５—７ｄ细胞融合时，再次放人摇床中振荡，重复上述操作。 ４．传代培养①取已培养１５ｄ左右的原代培养物，吸去旧培养基，用Ｄ—Ｈａｎｋ童液洗２次，然后滴加 ４００１ｚｌ０．１２５％胰酶一ＥＤＴＡ，倒置显微镜下观察，待细胞回缩，细胞间隙增加时用不含抗生素的培养基终止消 化，并轻轻左右摇动培养瓶，随后用弯吸管轻轻吹打制成细胞悬液，分别接种于另两个２５ｃｍ２的培养瓶，在３７℃，５％Ｃ０２条件下培养。②每天进行倒置显微镜下观察，根据细胞的生长情况及液体颜色改变加补液体或换液。 ５．星形胶质细胞的鉴定取第三代培养物接种于 六孔板内，２４ｈ后待细胞恢复后取出，吸去培养液，用ＰＢ快速洗两次，每孔分别加入少许４％多聚甲醛，室温下固定３０ｍｉｎ，去除固定液，用０．０１ｍｏｌ／ＬＰＢＳ洗三遍，以含１０％马血清的０．Ｏｌｍｏｌ／ＬＰＢＳ液在３７℃条件下封闭２０ｍｉｎ。加鼠抗ＧＦＡＰ的一抗（１：５００），放入４。Ｃ冰箱过夜，次日用０．０１ｍｏｌ／ＬＰＢＳ清洗三遍后同时加入ＣＹ５标记的抗小鼠二抗（１：１００）和Ｈｏｅｃｈｓｔ（１：４００），避光放人３７。Ｃ水浴孵箱ｌｈ，再用０．０１ｍｏＬ／ＬＰＢＳ洗三遍后晾干，用抗荧光衰减的封片剂封片，Ｏ．１ｙｍｐｕｓＦＶｌ０００激光共聚焦显微镜下观察。 结果 倒置相差显微镜下活体观察见星形胶质细胞的分离纯化过程中细胞生长情况良好。分离的小鼠脊髓细胞在培养（种植）４ｈ后，部分细胞即可长出细小的胞突；３６ｈ后，所有细胞均已贴壁，光晕明显，并长出突起，培养４—５ｄ后，细胞数量增多，约ｌＯｄ左右细胞达到８０—９０％会合，可进行摇床纯化。随着培养时间的延长，培养物中的星形胶质细胞的比例越来越大，而神经元、少突胶质细胞的比例越来越少。 传代后细胞生长更活跃，培养５～７ｄ便可长满瓶壁，星形胶质细胞的比例增多，形态结构更加突出。相差显微镜下形态学特征：胞体较大而扁，形状不规则，胞质较丰富，细胞核圆形或卵圆形，常偏于胞体的一侧，内有１—２个核仁，星形胶质细胞的胞突尤其是初级胞突较多较长，呈放射状（图１，２），经ＧＦＡＰ特异性抗体的免疫荧光染色证实９８％为星形胶质细胞（图３）。 圈１．２倒置显微镜下传代培养８ｄ的胶质细胞（×１００，ｘ２００） 图３ｇ玳ｄｇ，养星形胶质细胞ｘ１０（激光共聚焦显微镜图象ｂａｒ＝４０ｔｔｍ）ｇＧＦＡＰ免疫荧光染色ｂＨｏ∞ｈｓｌ染色ｃ Ｃ，ＦＡＰ和Ｈｏｅｅｈｓｔ共定位图象 万方数据
[收稿日期]2002-09-10;[修回日期]2003-04-30 [作者简介]刘杰波(1968-),男,博士,主治医师。主攻方向:小儿神经系统疾病。[通讯作者]刘杰波,深圳市罗湖区人民医院儿科,邮编:518000。#论著# 炎症因子诱导星形胶质细胞凋亡及机制探讨 刘杰波 (深圳市罗湖区人民医院儿科,广东深圳518000) [摘要]目的探讨L PS,I L-1B,T N F-A所致星形胶质细胞(AC)凋亡的机制及途径。方法原代培养的新 生SD大鼠前脑AC分为正常对照组、炎症组(L PS+I L-1B+T N F-A)与预处理组(L-N M M A预处理30min后加入 L PS+T N F-A+I L-1B)。培养72h后,M T T测定AC活力;分光光度仪测定细胞培养上清中N O2-/N O3-含量;电 镜、流式细胞术检测细胞凋亡;Wester n Blot检测胞浆内细胞色素C的表达;原位杂交检测A C Caspase-3mRNA表 达。结果预处理组细胞活力明显高于炎症组(0.81?0.29vs0.46?0.15),差异有显著性(P<0.01)。炎症组 AC活力与其分泌的一氧化氮(NO)呈负相关(r=-0.604,P<0.05)。预处理组凋亡率[(15.2?7.9)%]低于炎 症组[(29.7?10.4)%],P<0.05。预处理组胞浆内细胞色素C的含量较炎症组明显减少(14784?2096vs 31049?3784),P<0.01。炎症组的Caspase-3mRNA表达强于预处理组。结论1L PS,I L-1B,T N F-A可导致细 胞活力下降。其细胞活力的下降与其分泌的NO增多有关。o增多的N O可导致AC凋亡;NO导致的A C凋亡可 能与细胞色素C凋亡途径有关。[中国当代儿科杂志,2003,5(4):339-342] [关键词]星形胶质细胞;凋亡;一氧化氮 [中图分类号]Q813[文献标识码]A[文章编号]1008-8830(2003)04-0339-04 Mechanism of Cytokine-Induced Apoptosis of Astrocytes in Rats Jie-Bo LI U.Dep ar tment of Pediatr ics,L uohu District H osp ital of Shenz hen,S henz hen,G uangdong518000,China (Email:j ieboliu@https://www.doczj.com/doc/e216358874.html,) Abstract:Objective T o study the mechanism of L PS,I L-1B and T NF-A-induced apoptosis of astro cytes in r ats. Methods T he astrocytes of the neonatal rat were cultur ed in vitr o and randomely assigned into the inflammation group (tr eated w ith L PS,IL-1B and T N F-A),pre-treatment group(L-NM M A was administr ated half an hour before treatment with L PS,IL-1B and T N F-A)and normal control group.T he cell viability was assayed by M T T;apoptosis was evaluated by electr on micr oscope and flow cytometry;nitric ox ide(N O)content was measured by spectrophotometer;cytochrome C co ntent in cy toplasm was measured by Western Blot and Caspase-3mRN A ex pression was detected by hybridization in situ.Results T he cell v iability in the pr e-tr eatment gr oup was significantly hig her than t hat of the inflammation group (0.81?0.29vs0.46?0.15),P<0.01.T here w as a neg at ive co rrelation between the cell v iability and NO content produced by astr ocytes in the inflammation g roup(r=-0.604,P<0.05).T he apoptosis rate of the pr e-treatment group was lower t han that of the inflammation g roup[(15.2?7.9)%vs(29.7?10.4)%;P<0.05].T he cytochrome C content in cytoplasm of astrocytes of the pre-treatment g roup(14784?2096)decreased compared wit h that of the inflammation group(31049?3784)(P<0.01).T he expression of Caspase-3mRNA in the inflammatio n group was intensified compared with that of the pr e-treatment group.C onclusions Cytokines may lead to decrease of viability of astrocytes through increasing N O content produced by astrocytes.T he incr ease of N O content can induce astrocyte apoptosis,w hich is related to the r elease of the cytochrome C from mitochondria to cell plasma,and activating the ex pression of Caspase-3mRNA.[C hin J Contemp Pediatr,2003,5(4):339-342] Key words:Astrocyte;A poptosi s;N itric ox ide 星形胶质细胞(astrocyte,AC)在中枢神经系统中占有非常重要的地位。它通过对各种神经生长因
如对您有帮助，可购买打赏，谢谢 星形胶质细胞瘤的组织分类有哪些 导语：星形胶质瘤的最常见并发人群，是儿童和青少年，他们的体质比较虚弱，正处在一个发育的状况当中，所以容易受到恶性细胞的攻击，星形胶质细胞 星形胶质瘤的最常见并发人群，是儿童和青少年，他们的体质比较虚弱，正处在一个发育的状况当中，所以容易受到恶性细胞的攻击，星形胶质细胞瘤，可以分为多种类型，下面我们就看一下，主要分为哪几种组织类型？ 1，星形细胞瘤预后较好，按瘤细胞形态又分为纤维型、原浆型、肥胖型和混合细胞型等亚型。其中以纤维型星形细胞瘤（fibrillary astrocytome）最常见，瘤细胞分化好，但呈浸润性生长，瘤细胞之间可见红染的原纤维性背景。原浆型星形细胞瘤（protoplasmic astrocytoma）较少见，瘤细胞体积小，形态较一致，胞突少而短。肥胖细胞型星形细胞瘤（gemistocytic astrocytoma）瘤细胞体积较大，胞浆丰富，半透明，核偏位。电镜下在瘤细胞胞浆中可见成束排列的中间丝。星形细胞瘤胞浆均表达胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein， GFAP）、S-100蛋白和波形蛋白（Vimentin）。 2，间变性星形细胞瘤（anaplastic astrocytoma）预后较差，光镜下表现为瘤细胞密度增加，核异型性明显，核深染可见核分裂像，血管内皮细胞增生等，为恶性肿瘤的征象。 3，胶质母细胞瘤（glioblastoma）又分为多形性胶质母细胞瘤（glioblastoma multiform，GBM）和巨细胞型胶质母细胞瘤（giant cell glioblastoma），为高度恶性的星形胶质细胞瘤，多见于成人。肿瘤常发于额叶、颞叶、浸润范围广，常可穿过胼胝体到对侧，或挤压周围组织）。瘤体常因出血坏死而呈红褐色。镜下，瘤细胞密集，有明显异型 预防疾病常识分享，对您有帮助可购买打赏
大鼠大脑皮层星形胶质细胞原代培养及传代 、试剂 Poly-L-lysine (Sigma,P2636) DMEM (Invitrogen,11995-065) 二、器械 手术器械：眼科剪x2、眼科镊直、弯各x2、显微镊x2 （金钟，WA3050）、显微剪 x1 3ml 移液管( Biologix, 30-0138A1) 南京军区总院神经内科实验室 许丽丽 2012-12-01 1) 2) 3) FBS (Invitroge,10099-141) 4) HBSS, no Calcium, no Magnesium (Invitrogen, 14170-112) 5) 0.25% Trypsin-EDTA ( Invitrogen, 25200-056) 6) DPBS (HyClone ，SH30028.01B ) 7) dd H 2O 8) 75％酒精 1) 2) 100 ml 小烧杯 3) 200 目不锈钢筛 4) 细胞计数器（求精） 5) 50ml 离心管( Corning ， 430828)、 15ml 离心管( Corning ， 430790) 6) 25ml 培养瓶( Corning ， 430639)或 75ml 培养瓶( Corning ， 430641) 7) 100ml 玻璃瓶（蜀牛） 8) 直径为 60mm 的培养皿 LabServ,310109010) 9)
10) 过滤器( Millex-GP, SLGP033R)B 11) 注射器：50ml、5ml 各1 12) Pipette and pipette tips 13) 冰袋、手套、口罩
胶质细胞原代培养及纯化 2.1原代胶质细胞培养 1）于细胞培养前1d，用0.05% PLL(or PLO)包被培养瓶，置5% CO2培养箱中6 h以上，使用前用HBSS液冲洗3次，备用； 2）1d内的新生C57小鼠4只，置入75%乙醇中消毒后断头处死，75%乙醇中漂洗一次，迅速转移至预冷的HBSS（可加入双抗）中，弯镊从鼻部固定住头部，迅速剪开皮肤，换剪刀，从正中线剪开颅骨，弯镊向两边剥去颅骨，去小脑，将脑组织置于含预冷的HBSS的60mm培养皿中； 3）解剖显微镜下仔细剥离皮层表面脑膜和血管后置于含预冷的HBSS的60mm 小皿中，用HBSS洗3次，留少量刚好盖过组织，用眼科弯剪剪碎组织（越碎越好），加入0. 25%胰酶2mL，于37℃水浴中消化7 min，消化过程中摇晃离心管数次，使消化均匀； 4）加入含有血清DMEM/F12完全培养基10mL(1:1)终止消化； 5）使用玻璃滴管或1mL枪头吹打（可将其头部略剪一部分，以扩大口径），若一次取的动物只数多，由于液体过多，可使用5mL枪头进行吹打，但因其吹打力度较大，操作时要尽量轻且吹打次数不宜过多； 6）吹打过程采用分步吹打法，每吹打15~20下，静置1~2min，吸取上清，以避免已消化出的单细胞被过多吹打，该过程重复3次； 7）200目筛网过滤至50mL离心管中，去除残余的组织块； 8）1000 r/min×5min，弃上清； 9）调整细胞数为1～2×106/mL,接种到25cm2培养瓶中,每瓶5mL； 10）接种24 h后换以新鲜完全培养基，以除去悬浮死亡的细胞及碎片； 11）细胞每3 d更换培养液，培养10～12d左右细胞基本铺满瓶壁，进行纯化分离。分离根据胶质细胞间贴附性不同进行，将培养瓶放入恒温振荡器中，37℃180rpm振荡5 h，上层疏松贴壁的为小胶质细胞；底层即是纯度较高的星形胶质细胞，收集小胶质细胞，离心重悬，接种于35mm圆皿中；星形胶质细胞用0.25%胰酶消化按1：2传代，待长满后用于实验。一般使用17～30d内的星形胶质细胞。