“有机污染物——苯酚的生物降解特性研究”设计方案
丁霞
一、实验目的
酚类化合物为原生质毒物，毒性较大。焦化、煤气、石油、木材防腐、造纸、合成氨等工业废水中都含有高浓度的苯酚。含酚废水在我国水污染控制中被列为重点解决的有害废水之一。利用降解菌来控制苯酚的污染，越来越受到人们的重视。本项目拟采用微生物培养、苯酚生物降解的途径及其降解关键酶的分析、微生物DNA的提取、分光光度计测定、PCR、TA克隆等实验技术，阐明苯酚降解菌株的生长特性和苯酚的生物降解特性，苯酚降解菌的系统发育。对学生从事有机污染工业废水的生物处理以及有机污染的土壤或水体的生物原位修复方面的科学研究具有深远的意义。
二、实验原理
利用以苯酚为唯一碳源和能源的无机盐溶液作为驯化液，对某废水处理厂活性污泥进行驯化培养，从中分离筛选出苯酚降解菌。利用比浊法测定微生物生长量，4-氨基安替比林直接光度法测定苯酚浓度，分析苯酚生物降解的途径及其降解关键酶，PCR扩增细菌的16s RNA进行苯酚降解菌的系统发育分析。
1）微生物生长量的测定方法——比浊法
比浊法是实验室中常用的用来测定微生物生长量的方法，以反映微生物数量或浓度的一种指标。该方法是根据当某一波长的光线通过混浊的液体后，光的强度将被减弱。入射光与透过光的强度比与样品液的浊度和液体的厚度相关。根据所测得的吸光值，就可以得到微生物的生长量。本实验采用的波长为600nm，使用空白培养基作为对照。
2) 苯酚浓度的测定方法
见后面附录。
3）苯酚降解菌的系统发育分析
16S rRNA基因是细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的染色体基因组中。16S rRNA具有高度的保守性和特异性。随着PCR技术
的出现及核酸研究技术的不断完善，16S rRNA基因检测技术已成为微生物检测和鉴定的一种强有力工具。该技术主要有三个步骤：首先，基因组DNA的获得；其次，16S rRNA基因片段的PCR扩增，并进行TA克隆用于测序分析；最后，进行16S rRNA基因序列的系统发育分析。
三、实验所需仪器设备及台套数、实验用具与消耗品清单及数量
1.实验设备
分光光度计（6台），PCR仪（2台），双层摇床（3台），恒温培养箱（1台），普通显微镜（3台），超净工作台（2台），灭菌锅（2个），琼脂糖凝胶电泳系统（2套），凝胶成像系统（1台），微波炉（1台），水浴锅（2台），干燥箱（1台），离心机（3台），磁力搅拌器（3台），电子天平（3台）。
四、实验用具
250ml三角瓶（300个），平板（60），试管（100），移液器（10套），100mL 的分液漏斗（10个），接种环（4支），枪盒、枪头、EP管（若干），酒精灯（10），玻片和载玻片（各3盒）。
五、消耗品（未注明数量的均为1瓶）
苯酚（5瓶），酵母粉，蛋白胨，氯化钠，葡萄糖，柠檬酸，氯化铵，氨水，盐酸，氢氧化钠，4-氨基安替比林，铁氰化钾，氯仿（10瓶），饱和酚，异戊醇，无水乙醇（3瓶），氨苄霉素，ITPG，X-gal，苯，萘，蒽，二甲苯，菲，硝基苯，氯苯，多氯联苯，2-氯甲苯，苯甲酸，邻苯二胺，Na2HPO4，NaH2PO4，K2HPO4，CaCl2，MgSO4 7H2O，硫酸铵，醋酸钠，Tris，HCl，EDTA，结晶紫，番红，碘液，pH试纸，琼脂粉（2瓶），琼脂糖（2瓶），蛋白酶K（2瓶），溶菌酶（2瓶），RNA酶，DNA marker，DNA加样缓冲液（6x），硼酸，TA载体（2盒），Taq酶（4支），dNTP(2支)，引物，感受态细胞（20支），PCR产物回收试剂盒（1盒），琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒（1盒）。
实验一苯酚浓度的测定方法（8课时）
方法一：
所用溶液
1）苯酚标准液
精确称取0.1g 苯酚溶于蒸馏水中，移入1000ml 容量瓶中，稀释至标线，并贮存于密封良好的棕色瓶中。置冰箱内保存，可使用一个月。
2）20%氨性氯化铵缓冲溶液
称取20.00g 氯化铵溶于浓氨水中，用浓氨水定溶于100ml，此缓冲液pH9.8，贮存在具橡皮塞的瓶中，在冰箱内保存备用。
3）2%（m/V）4-氨基安替比啉溶液
精确称取4-安替比啉 2.00g 溶于蒸馏水中，并用蒸馏水定容至100ml，贮存于棕色瓶中，此液应临时配制。
4）8%（m/V）铁氰化钾溶液
精确称取8.00g 铁氰化钾溶于蒸馏水中，并定融至100ml，此试剂最好临用时配制。
测定步骤
(1)标准曲线的绘制
于一组8支50ml比色管中，分别加入0、0.50、1.00、3.00、5.00、7.00、10.00、12.50ml的酚标准液，加水至50ml标线。加0.5ml缓冲液，混匀，此时pH值为10.0左右。加4-氨基安替比啉溶液lml，混匀。再加lml铁氰化钾溶液，充分混匀后，放置10min后，以水为空白，用分光光度计测定OD510值(用光程为20nm 比色皿)。经空白校正后，绘制吸光度值对苯酚含量(mg)的标准曲线(图2-1)。
(2)培养液中苯酚浓度的测定
将分离得到的降酚菌分别接种在苯酚浓度为500mg/L 的无机盐培养液中，每隔24 小时测定培养液中苯酚的浓度，最后分析数据，判断每个菌株降解苯酚能力的大小。具体培养液中苯酚测定方法是首先将培养液以1000rpm离心10min，取上清0.5ml 置于50ml 的比色管中，加入无酚蒸馏水到50ml 标线，加入0.5ml缓冲液混合均匀。加入1ml 2%的4-氨基安替比啉，混匀。再加入lm1 8%的铁氰化钾溶液，混匀。10-15min 后，在510nm 处读取吸光度。若读数过大则进行适当的稀释，使其读数介于0.2-0.8 之间。根据苯酚标准曲线得出相应的苯酚浓度，起始苯酚浓度与终点苯酚浓度的差反映每株降酚菌株降解苯酚能力的大小。
注意：测量苯酚浓度时，苯酚要根据标准曲线和测试组苯酚的浓度，进行相应稀释，使得OD值在有效区间内。
方法二4-氨基安替比林直接光度法
（1）原理
4-氨基安替比林直接光度法是测量溶液中酚类浓度常用的方法。苯酚在碱性条件（pH=10±0.2）并有铁氰化钾存在的情况下，能与4-氨基安替比林发生化学反应，生成橙红色的安替比林吲哚酚染料，其水溶液在波长510nm处有最大吸收，利用这一特性，可以测定溶液中苯酚的浓度。
（2）溶液配制
①苯酚标准储备溶液(1.0000g/L ) : 准确称取1.0000g苯酚,用新煮沸并冷却的蒸馏水溶解并定容至1000mL;
②苯酚标准工作溶液(10mg/L) : 移取10. 00mL苯酚标准储备溶液,用新煮沸并冷却的蒸馏水定容至1000mL (临用前配制) ;
③NH3?H2O: 取35mL NH3?H2O稀释至1000mL;
④K2HPO4 - KH2 PO4缓冲溶液: 溶解104. 5g K2HPO4和72. 3g KH2 PO4 于无酚水中,稀释至100mL;
⑤ 4 - 氨基安替比林溶液(每周新配制) : 20g/L;
⑥K3〔Fe (CN) 6〕溶液: 80g/L;
⑦三氯甲烷。
注：实验所用水均为无酚水,化学试剂为分析纯。
（3）实验方法
准确移取4. 0mL酚标准工作溶液于100mL烧杯中, 加入2. 0mL 0. 5mol/L 的NH3?H2O, 稀释至20mL, 用磷酸缓冲溶液调节pH为8. 0。将调好pH值的溶液转入100mL 的分液漏斗中, 加入0.4 mL 4 - 氨基安替比林,混匀; 再加入0.6 mL K3〔Fe (CN) 6〕溶液充分混匀后, 放置10min。准确加入4. 00mL三氯甲烷进行萃取,闭塞、剧烈振摇2min, 静置分层。将氯仿层放入1cm比色皿,以试剂空白为参比测定其吸光度。
（4）制作苯酚浓度的标准曲线
将标准苯酚溶液稀释成不同浓度，按实验方法，测定吸光值，绘制标准曲线。得曲线如下：
图2-1苯酚标准曲线
思考题：
比较两种测量苯酚的方法，哪种方法更好，说明理由。
实验二：各种因素对菌株降解苯酚的影响（16课时）
一、实验目的
采用单因子分析，分别考查苯酚浓度、温度、pH 值、NaCl浓度，溶氧量（摇床转速）、碳源、等环境因素对降酚菌生长和降解苯酚能力的影响。进而确定菌株的最佳生长和苯酚降解特性。
二、材料、试剂及器具
1、材料
降解菌
2、试剂
苯酚，琼脂粉，淀粉，葡萄糖，乳糖，柠檬酸，氨水，盐酸，氢氧化钠，乙醇，氯化钠，4-氨基安替比林，铁氰化钾，氯仿，水杨酸苯酯，对氨基苯磺酸，对羟基苯甲酸甲酯，对硝基苯酚，水杨酸甲酯，甲萘胺，苯，萘，蒽，二甲苯，菲，硝基苯，氯苯，多氯联苯，2-氯甲苯，苯甲酸，邻苯二胺，NaH2PO4，NaH2PO4，K2HPO4，CaCl2，MgSO4 7H2O，硫酸铵，pH试纸等。
磷酸缓冲溶液(pH8. 0)：
NaH2PO4?2H2O 94.7g，NaH2PO4?2H2O 5.3g，溶解，定容至1L；
无机盐培养基（g·L-1）
NH4NO3 1.0，KH2PO4 0.5，K2HPO4 1.5，NaCl 0.5，MgSO4·7H2O 0.2，pH 7.2；苯酚0.5（培养基灭菌后，再加入苯酚）；
3、器具
摇床、恒温培养箱、灭菌锅、电子天平、超净工作台、磁力搅拌器、分光光度计、三角瓶。
三、实验步骤
1）苯酚浓度的测定——4-氨基安替比林直接光度法
见实验一的方法
2）降酚菌生长与降解特性的研究
1. 各种不同碳源下菌株的生长情况
取2%接种量，500mg/L苯酚的无机盐培养基中。分别接入含有其它碳源（不含苯酚）的无机盐培养基中，观察菌株在各种不同碳源上的生长情况。
参考碳源：葡萄糖，苯酚，淀粉，水杨酸苯酯，对氨基苯磺酸，对羟基苯甲酸甲酯，对硝基苯酚，水杨酸甲酯，甲萘胺，苯，萘，蒽，二甲苯，菲，硝基苯，氯苯，多氯联苯，2-氯甲苯，苯甲酸，邻苯二胺等；
2. 苯酚浓度对菌株降酚能力的影响
取2%接种量，苯酚浓度分别为100，250，500，750，1000，1 500mg/L 的培养基中，37度，150 r/min下进行培养，测定菌液的生长量和苯酚的降解率。
3. pH对菌株生长和降解苯酚能力的影响
取2%接种量，500mg/L苯酚的无机盐培养基中。pH值分别为3、5、7、9、11，37度，150 r/min下进行培养，测定菌液的生长量和苯酚的降解率。
4. NaCl对菌株生长和降解苯酚能力的影响
取2%接种量，500mg/L苯酚的无机盐培养基中。NaCl浓度分别为0.05%，0.1%，0.5%，1%，3%，15%，150 r/min下进行培养，测定菌液的生长量和苯酚的降解率。
思考题：
确定菌株的最佳生长和苯酚降解特性时，上面的因子分析是否充分，实验结果表明哪种因素的影响最大？还有哪些因子需要考虑？
实验三降解菌生长和降解曲线的测定（8个学时）
一、实验目的
学习微生物生长曲线的测定，掌握苯酚降解菌苯酚降解曲线的测试。
二、材料、试剂及器具
1、材料
降解菌
2、试剂
苯酚，琼脂粉，淀粉，葡萄糖，乳糖，柠檬酸，氨水，盐酸，氢氧化钠，乙醇，氯化钠，4-氨基安替比林，铁氰化钾，氯仿，NaH2PO4，NaH2PO4，K2HPO4，CaCl2，MgSO4 7H2O，硫酸铵，pH试纸等。
磷酸缓冲溶液(pH8. 0)：
NaH2PO4?2H2O 94.7g，NaH2PO4?2H2O 5.3g，溶解，定容至1L；
无机盐培养基（g·L-1）
NH4NO3 1.0，KH2PO4 0.5，K2HPO4 1.5，NaCl 0.5，MgSO4·7H2O 0.2，pH 7.2；苯酚0.5（培养基灭菌后，再加入苯酚）；
3、器具
摇床、恒温培养箱、灭菌锅、电子天平、超净工作台、磁力搅拌器、分光光度计、三角瓶。
三、实验步骤
1）苯酚浓度的测定——4-氨基安替比林直接光度法
见实验一的方法
2）降解菌生长和降解曲线的测定
取2%接种量，500mg/L苯酚的无机盐培养基中，共培养两天。理论上每隔4小时（此次实验周二下午2点接种，第二天上午10点和下午2点，第三天上午10点和下午2点共测试四次），0D600测定降解菌生长曲线的测定，同时测定苯酚浓度，并绘制生长和苯酚降解曲线。
思考题：
测定了其生理生化的特性指标和生长曲线, 对其降解特性进行了初步了解, 如何对菌株的降解条件进行优化？
实验四苯酚生物降解的途径及其降解关键酶（8学时）
一、实验原理
苯酚的降解基因通常排列成簇，位于大质粒上，部分位于染色体上。在好氧菌中，苯酚羟化酶基因是降解苯酚的关键基因，编码苯酚降解途径的第一个酶，将苯酚转化成邻苯二酚，邻苯二酚进一步开环裂解为三羧酸(TCA)循环产物，从而进入物质和能量的代谢。
邻苯二酚的开环裂解是在不同酶的作用下，经过不同的降解途径实现的。
其中，以邻苯二酚2，3双加氧酶(C23O)催化的开环途径称为间位裂解途径，邻苯二酚通过间位开环产生黄色的2-羟基粘糠酸半醛以及α-酮基己二酸中间物。假单胞菌主要通过这个途径降解苯酚。
以邻苯二酚1，2加氧酶(CatA，C120)催化的开环途径称为邻位裂解途径，邻苯二酚邻位开环裂解产生粘康酸，以及内脂和琥珀酸等无色的中间物。醋酸不动杆菌等以此途径降解苯酚。由上述两途径中形成的乙酰辅酶A、琥珀酸、丙酮酸等可以进入三羧酸循环(TCA)，继续被微生物利用。一部分生成细胞物质，另一部分则被氧化分解为二氧化碳和水，提供微生物新陈代谢所需的能量。在微生物降解苯酚的过程中，需要其多酶系统和氧的辅助来共同完成。
二、实验材料
⑴50mM磷酸缓冲液（pH 7.0，K2HPO4 14.022g/L；KH2PO4 5.236g/L）
⑵50mM磷酸缓冲液（pH 7.6，K2HPO4 19.745g/L；KH2PO4 1.822g/L）
⑶邻苯二酚（儿茶酚）20μmol/L
三、实验步骤
3.1 粗酶液制备
①分别接种PD，DX，QY三种菌落于50ml无机盐培养基中，37℃震荡培养过夜。
②培养液于4℃，4000r/min离心，沉淀在缓冲液中洗涤一次并重悬。
③将重悬液在冰浴中超声波破壁50个循环（5秒工作，10秒停顿）。
④将悬液在4℃，12000r/min离心20min，上清转入新管得粗酶液。
3.2 测定方法
500μl测定体系如下（实际操作时可加6个体系使比色皿中液层厚度为3cm）：
①邻苯二酚1,2-双加氧酶（C120）
50mM磷酸缓冲液（pH 7.0）440μl；儿茶酚（20μmol/L）10μl；粗酶液50μl；测定在OD260下的变化。
②邻苯二酚2,3-双加氧酶（C230）
50mM磷酸缓冲液（pH 7.6）440μl；儿茶酚（20μmol/L）10μl；粗酶液50μl；测定在OD375下的变化。
3.3 蛋白标准曲线的绘制
所用试剂：
1）考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50ml95%的乙醇中，加入100ml85%的磷酸，用蒸馏水稀释至1L，滤纸过滤。最终试剂含有0.01%考马斯亮蓝G-250,4.7%乙醇，8.5%磷酸。
2）标准蛋白溶液：牛血清蛋白（PBS）用0.15mol/L的NaCl配成1mg/ml蛋白溶液
3）50mM磷酸缓冲液：PH7.0，K2HPO4 14.022g/l，KH2PO4 5.236g/l
取7组三角瓶，分别按下表平行操作
表2-2 蛋白标准曲线测定组分表
试管编号0 1 2 3 4 5 6
标准蛋白溶液（ml）0 1 2 3 4 5 6
0.15mol/lNaCl（ml）10 9 8 7 6 5 4
5 5 5 5 5 5 5
考马斯亮蓝试剂
（ml）
摇匀，20min内以0号管为空白对照，在595nm处比色。以A595为纵坐标，标准蛋白浓度为横坐标，绘制标准曲线。
3.4 测定细胞裂解液蛋白质浓度
测定方法同上，取合适体积的裂解液，使其测定值在标准曲线的直线范围内，根据所测定的A595值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出裂解液的蛋白质浓度，在计算出提取液（粗酶液）中蛋白质的质量mg。
思考题：
实验五：微生物基因组的提取（4课时）
一、实验目的
掌握微生物总DNA的抽提方法和基本原理。
二、材料、试剂及器具
耗材：吸头塑料制品（包括吸头、EP管等），EP管架
试剂：TE溶液（10mM Tris-HCl，1mM EDTA，PH=8.0），醋酸钠溶液（3mol/ L，pH5.2），酚/氯仿/异戊醇，氯仿/异戊醇，醋酸钠溶液（3mol/L，pH5.2），无水乙醇，溶菌酶（20mg/ml 无菌水配置，-20°store），RNA酶（10mg/ml，in 1 0 mM Tris-HCl, pH7.5, 15mM NaCl, 100℃加热5min，冷却，-20°store），蛋白酶K（20mg/ml，in 10 mM Tris-HCl, pH7.5, 2.9mg/ml CaCl2, 50% 甘油，-20°store）
仪器：高速冷冻离心机，-20o C冰箱，移液器，恒温水浴锅
三、实验步骤
1. 将细菌接单菌落接种于培养基中，30o C，150r/min培养过夜。
2. 5000r/min离心2min，TE洗涤一次，再次离心，重悬菌体于0.5mlTE中。
3. 加入20μL 20mg/ml的溶菌酶和20μL 10mg/ml RNA酶，混匀，于37o C保
温1h。
4. 加入20μL 20mg/ml的蛋白酶K于37o C保温1h。
5. 加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，10000r/min离心5min，将上清液转入
一新1.5ml EP管中。
6. 加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，10000r/min离心5min，将上清液转入
一新管中。
7. 加入1/5体积的醋酸钠溶液（3mol/L，pH5.2），两倍体积的无水乙醇，颠
倒几次离心管混匀。-20o C放置2h，10000r/min，4o C离心5min，倾去上
清液。
8. 70%乙醇洗涤沉淀两次，室温下晾干后，溶于0.1ml TE中，置于4o C冰箱
中，待用。
思考题：
1. 本实验中所用到的各试剂的作用是什么? 氯仿, 乙醇。
2. DNA提取过程中应注意什么?
实验六：PCR扩增16s RNA（4课时）
以细菌的总DNA为模板，以16S rRNA通用引物对16S rRNA基因片段进行扩增。琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果。
一、实验目的：
PCR和琼脂糖凝胶电泳是常用的分子生物学的方法，具有操作方便、经济快速等优点。本实验学习PCR扩增、DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术，掌握有关的技术和识读电泳图谱的方法。
二、材料、试剂及器具
1、材料
微生物基因组，引物
2、试剂
Taq DNA聚合酶；dNTP；灭菌的去离子水；100ul EP管；加样缓冲液（6×）；琼脂糖；溴化乙锭（EB）；0.5×TBE电泳缓冲液(每升含有54g的Tris，27.5g的硼酸和20ml的0.5mol/L的EDTA（pH8.0）)；DNA Marker。
3、器具
（1）PCR扩增：PCR仪、吸头塑料制品（包括吸头、EP管等）
（1）电泳系统：电泳仪、水平电泳槽、制胶板等
（2）紫外透射仪
三、实验步骤：
1）PCR扩增
以基因组为模板，利用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增。向PCR反应管中依次加入：去离子水16.75μl
PCR缓冲液 2.5μl
dNTPs 1μl
上游引物1μl
下游引物1μl
DNA 1μl
Taq DNA聚合酶0.25μl
反应条件为：
95°C 5 min
95°C 30s
34 cycles 54°C 30s
72°C 1.5min
72°C 10min
2）琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果
1、按所分离的DNA分子的大小范围，称取适量的琼脂糖粉末，放到一锥形瓶
中，加入适量的0.5×TBE电泳缓冲液。然后置微波炉加热至完全溶化，溶液透明。稍摇匀，得胶液。冷却至60℃左右，在胶液内加入适量的溴化乙锭至浓度为0.5μg/ml。
2、取有机玻璃制胶板槽，有透明胶带沿胶槽四周封严，并滴加少量的胶液封好
胶带与胶槽之间的缝隙。
3、水平放置胶槽，在一端插好梳子，在槽内缓慢倒入已冷至60℃左右的胶液，
使之形成均匀水平的胶面。
4、.待胶凝固后，小心拔起梳子，撕下透明胶带，使加样孔端置阴极段放进电泳
槽内。
5、在槽内加入0.5×TBE电泳缓冲液，至液面覆盖过胶面
6、把待检测的样品，按以下量在洁净载玻片上小心混匀，用移液枪加至凝胶的
加样孔中。1μl加样缓冲液（6×）+5μl待测DNA样品（+0.5μlE B液（10mg/ml）（注：若胶内未加EB，可选用此法）。）
7、接通电泳仪和电泳槽，并接通电源，调节稳压输出，电压最高不超过5V/cm，
开始电泳。点样端放阴极端。根据经验调节电压使分带清晰。
8、观察溴酚兰的带（蓝色）的移动。当其移动至距胶板前沿约1cm处，可停止
电泳。
9、染色：把胶槽取出，小心滑出胶块，水平放置于一张保鲜膜或其他支持物上，
放进EB溶液中进行染色，完全浸泡约30min。
10、在紫外透视仪的样品台上重新铺上一张保鲜膜，赶去气泡平铺，然后把已染
色的凝胶放在上面。关上样品室外门，打开紫外灯（360nm或254nm），通过观察孔进行观察。
思考题：
1. 退火温度Tm是如何计算得到?
2. PCR循环次数是否越多越好?
实验七：TA克隆（8课时）（备选）
1）实验目的
TA克隆是常用的分子生物学的方法，具有操作方便、快速等优点。本实验学习TA克隆的使用技术，掌握有关的技术。
2）实验原理
TA克隆方法（Original TA Cloning Kit）把PCR片断与一个具有3‘-T突出的载体DNA连接起来的方法。因为PCR反应中所适用的聚合酶具有末端转移的活性，通常在3'加上A。例如：Taq聚合酶同时具有的末端连接酶的功能，PCR反应时在每条PCR扩增产物的3`端自动添加一个3`-A突出端。只有用经过特殊处理的具有3’-T突出末端的DNA片断才能通过T/A配对进行连接。通过PCR 的方法扩增目的基因片断的过程中，由于往往不清楚目的基因的DNA序列，获得的目的片断通常需要通过TA克隆的方法，重组到T-载体中，通过序列测定清楚DNA序列。由于在PCR过程中，使用的DNA聚合酶不同，往往分为2种情况：（1）使用不同的Taq酶，在PCR扩增循环结束后，加上72℃10分钟一个过程，Taq酶可以在扩增产物的3末端加上A，因此PCR产物回收纯化后可以和T载体直接连接。（2）使用高保真的DNA聚合酶，如pfu酶，由于其不能在扩增产物的3末端加上A，得到的DNA序列为钝端，因此，需要在回收纯化后进行加A的过程，通常是以PCR回收产物为模板，加上一定量的普通Taq酶和反应液，加入dATP（或dNTP），72℃10分钟，然后将加A产物直接用于TA连接。
3）实验步骤
1、PCR产物的纯化
琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增为单一条带，用PCR产物纯化试剂盒进行
纯化。具体步骤参照试剂盒说明书。
2、TA克隆
连接：纯化后的PCR产物与T载体混匀，并加入5μL的Solution I（含连接酶），置于PCR管中，16o C下过夜连接。
转化：取5μL的连接产物置于eppendorf管中，加入DH5α感受态细胞混匀，冰上放置30min；将管放到42o C水浴热激90s，冰浴2min后，加入800μl LB液体培养基，37o C，200r/min培养1h，稍离心吸取适当体积菌液涂布在含有氨苄青霉素、IPTG\X-gal的LB培养基平板上，37o C倒置培养12-16h。
蓝白斑筛选：将平板上长出的白色菌落随机挑选若干于含LB培养基（加有氨苄霉素）的试管中培养，培养到一定的时间后，以菌细胞为模板进行PCR检测。从检测呈阳性的克隆送往公司进行序列测定。将测序结果用BLAST软件与GenBank已经录入的16S rRNA基因序列进行同源性比较。
实验一苯酚降解菌的分离及降解性测定 实验原理：在污染环境中，大部分微生物由于受到毒害而死亡，少数微生物具有较强的降解能力或通过诱变改变其基因型或诱导产生某些酶而能在污染的环境中存活，成为有机污染物的高效降解菌或耐性菌株。 从污染环境中取样，通过在选择性培养基上培养，可筛选出目的性微生物。本实验取青年湖水样作为菌种的来源，在以苯酚为唯一碳源的无机盐培养基进行培养，分离苯酚降解菌。实验步骤： 1. 从污染地区取样品（污水，污泥或受污染的土壤）。 2. 配制无碳源的无机盐培养基，加入苯酚储备液，使培养基中苯酚浓度达100 mg/L。 121℃灭菌20 min。 3. 吸取1 ml活性污泥，加入灭菌培养基，同时做空白对照，28℃恒温摇床培养24 h（160 rmp/min）. 4. 测定苯酚降解率。 苯酚降解率的测定方法： a.标准曲线的绘制分别吸取0、1、2、3、4、5mL 酚标准溶液（100 mg/L） 于50mL容量瓶中，加蒸馏水稀释成20 mL。加入2 mL pH9.8缓冲溶液，4 mL 4％4－氨基安替比林溶液，摇匀后加入4 mL 8％铁氰化钾溶液，显色10min 后，加蒸馏水稀释至刻度。用722型分光光度计460nm波长处比色测定。 b.以不加酚的试剂作空白对照，以浓度为横坐标，以光密度为纵坐标绘制标准 曲线。 c.培养液中苯酚降解率的测定吸取培养液2mL于50mL容量瓶中，加蒸馏水 稀释成20 mL。加入2 mL pH9.8缓冲溶液，4 mL 4％4－氨基安替比林溶液， 摇匀后加入4 mL 8％铁氰化钾溶液，显色10min后，加蒸馏水稀释至刻度。 用722型分光光度计460 nm波长处比色测定。 d.根据标准曲线求出苯酚含量以分解苯酚的百分数表示酚分解作用强弱。
上海师范大学 硕士学位论文 苯酚降解菌的筛选、鉴定及其降解特性的研究 姓名：何小丽 申请学位级别：硕士 专业：微生物学 指导教师：肖明 20090501
上海师范大学硕士学位论文摘要论文题目：苯酚降解菌的筛选、鉴定及其降解特性的研究 学校专业：微生物学 学位申请人：何小丽 指导教师：肖明 摘要 酚类化合物为细胞原浆毒物，属高毒性物质。这类物质来源广泛，通常污染水源，毒死鱼虾，危害农作物，并严重威胁人类的健康。含酚有机物的毒性还在于其只能被少数的微生物分解。从自然界中筛选分离出能够降解特定污染物的高效菌种，有针对性的投加到已有的污水处理系统中的生物强化技术，能够快速提供大量具有特殊作用的微生物，在有毒有害污染物治理中显示出巨大的潜力。 1、本研究从胜利油田河口采油厂的飞雁滩油田土壤样品中分离得到10株能够利用并降解苯酚的菌株P1-P4、P7、P9-P13。该10株苯酚降解菌能够在以苯酚为唯一碳源和能源的培养基上生长，经16S rDNA分子鉴定和生理生化检测，该10株降酚菌分别被鉴定到属或种。其中降酚菌株P1、P3和P4这3株菌株分别属于劳尔氏菌属(Ralstonia)、贪噬菌属（Variovorax）和节杆菌属（Arthrobacter）里的种。其它7株降酚菌株P 2、P7、P9-P13都属于假单胞菌属（Pseudomonas）里的种。这4个属里的细菌在国内外都已被报道有降解苯酚的特性，其中有关假单胞菌降解环境有机物的报道较多。 2、培养液中的苯酚含量通过4-氨基安替比啉分光光度法测定，通过苯酚降解效率的比较，菌株P2降解苯酚的能力较其它9株菌株要强。于是将菌株P2作为本研究中进一步研究的对象，研究了不同的环境条件下该菌株降解苯酚和菌体生长的情况。 3、通过苯酚羟化酶特异性引物的设计，从菌株P2扩增出苯酚羟化酶大亚基基因，该基因片段编码对苯酚有催化活性的多肽，催化苯酚代谢的第一步反应；表明菌株P2能降解苯酚是由于细胞具有降解苯酚的遗传基础。 I
目录 目录 (1) 摘要 (2) Abstract (3) 第一章绪论 (4) 1.1 苯酚降解菌的定义及分类 (4) 1.2苯酚降解菌的性质及其用途 (4) 1.3苯酚降解的研究现状 (5) 1.4苯酚降解菌生产菌的筛选 (6) 1.5本课题的研究思路及意义 (6) 第二章材料与方法 (7) 2.1试验材料 (7) 2.2试验方法 (8) 2.2.2苯酚降解菌的驯化 (8) 2.2.3菌种在不同条件下的降解能力 (9) 2.2.4最优菌种的鉴定 (9) 3.1苯酚降解菌筛选结果及性状初步研究 (11) 3.11筛选结果 (11) 3.1.1.1初步筛选的结果 (11) 3.1.1.2 菌种驯化中的结果 (11) 3.1.2 H-1菌株的性状初步结果 (13) 3.2 H-1菌株分类鉴定结果 (13) 第四章结论 (14) 4.1菌种的筛选结果 (14) 4.2菌种的鉴定 (14) 参考文献 (15) 致谢.......................................................................................... 错误!未定义书签。
一株苯酚降解菌的分离和鉴定 摘要 为了寻找能高效降解苯酚的微生物, 从土壤中筛选得到了一株苯酚降解菌,通过逐渐增加苯酚的浓度,然后驯化出一株高效降解苯酚的细菌H-1. 当在30 ℃培养48h 时其降解率高达92.11%. 经理化特征测定及外观鉴定,将其初步鉴定为假单胞菌属.再经过对比实验测各种因素(碳源、温度、pH、通气) 对该菌生长及降解苯酚能力的影响,得知该菌能以苯酚作为唯一碳源,最适生长温度为32 ℃,最适pH 为7.0. 该菌为好氧菌,在空气充足的条件下可提高降解能力. 该菌菌落较小，菌落呈微黄色。菌体呈直或微弯的杆装，没有菌柄也没有鞘。不产芽孢。对该菌做生化鉴定，可知该菌革兰氏染色为阴性，可水解苯酚，生长温度为32℃，生长pH为pH 6.5～7.5。参照东秀珠,蔡妙英的《常见细菌系统鉴定手册》等文献方法，以形态和培养特征为主，生理生化特性及生态特性为辅，经初步鉴定为假单胞菌属，命名为H-1，具体确定到种则需要进一步的研究。 【关键词】：筛选苯酚降解鉴定
苯酚 （1）化学品及企业标识 化学品中文名苯酚；石炭酸 化学品英文名 phenol carb01icacid 分子式 C6H60 相对分子质量 94.12 （2）成分／组成信息 √纯品混合物 有害物成分浓度 CAS No. 苯酚 108—95—2 （3）危险性概述 危险性类别第6.1类毒害品 侵入途径吸入、食入、经皮吸收 健康危害苯酚对皮肤、黏膜有强烈的腐蚀作用，可抑制中枢神经和损害肝、肾功能。急性中毒：吸入高浓度蒸气可致头痛、头晕、乏力、视物模糊、肺水肿等。误服引起消化道灼伤，出现烧灼痛，呼出气带酚味，呕吐物或大便可带血液，有胃肠穿孔的可能，可出现休克、肺水肿、肝或肾损害，出现急性肾功能衰竭，可死于呼吸衰竭。眼接触可致灼伤。可经灼伤皮肤吸收引起中毒，表现为心律失常、休克、代谢性酸中毒、肾损害等，甚至引起急性肾功能衰竭。有引起高铁血红蛋白血症的报道。慢性中毒：可引起头痛、头晕、咳嗽、食欲减退、恶心、呕吐，严重者引起蛋白尿。可致皮炎。 环境危害对水体、土壤和大气可造成污染 燃爆危险可燃，其粉体与空气混合，能形成爆炸性混合物
（4）急救措施 皮肤接触立即脱去污染的衣着，用大量流动清水彻底冲洗。冲洗后即用浸过30％～50％酒精的棉花反复擦拭创面至无酚味为止(注意不能将 患处浸泡于酒精溶液中)，再继用4％～5％碳酸氢钠溶液湿敷创面2～4h。也可用浸过聚乙二醇-300或聚乙二醇和变性酒精混合液(2：1)的棉花擦拭创面，然后用水彻底清洗。就医。 眼睛接触立即提起眼睑，用大量流动清水或生理盐水彻底冲洗10～15min。如有不适感，就医。 吸入迅速脱离现场至空气新鲜处。保持呼吸道通畅。如呼吸困难，给输氧。呼吸、心跳停止，立即进行心肺复苏术。就医。 食入立即给饮植物油15～30ml。催吐。口服活性炭，导泻。就医。不能使用石蜡油或酒精。 （5）消防措施 危险特性遇明火、高热可燃 有害燃烧产物一氧化碳 灭火方法用水、泡沫、干粉、二氧化碳灭火 灭火注意事项及措施消防人员必须佩戴空气呼吸器、穿全身防火防毒服，在上风向灭火。尽可能将容器从火场移至空旷处。喷水保持火场容器冷却，直至灭火结束。 （6）泄漏应急处理 应急行动隔离泄漏污染区，限制出入。消除所有点火源。建议应急处理人员戴防尘口罩，穿防毒服，戴防化学品手套。穿上适当的防护服前严禁接触破裂的容器和泄漏物。尽可能切断泄漏源。用塑料布覆盖泄漏物，
实验三高效苯酚降解菌的筛选及其性能测定 一、实验目的 1、掌握微生物分离纯化的基本操作； 2、掌握用选择性培养基从环境中分离苯酚降解菌的原理和方法； 3、掌握微生物对酚降解能力的测定方法； 4、掌握4-氨基安替比林法测定苯酚含量的方法。 二、实验原理 在工业废水的生物处理中，对污染成分单一的有毒废水，可以选育特定的高效菌株进行处理。这些高效菌株以有机污染物作为其生长所需的能源、碳源或氮源，从而使有机污染物得以降解，具有处理效率高、耐受毒性强等优点。 苯酚是一种在自然条件下难降解的有机物，其长期残留于空气、水体、土壤中，会造成严重的环境污染，对人体、动物有较高毒性。本实验通过筛选苯酚降 解菌来处理含酚废水，将苯酚降解为为二氧化碳和水，消除对环境的污染。 + COOHCH2CH2COOH CH3COOH C O2+H2O 从环境中采样后，在以苯酚为唯一碳源的培养基中，经富集培养、分离纯化、降解实验和性能测定，可筛选出高效酚降解菌。 三、实验器材与试剂 1、样品 实验土样采自校园污水处理厂。 2、器材 恒温培养箱、恒温摇床、分光光度计、比色皿、试管、250mL三角瓶、100mL 容量瓶、培养皿、涂布玻棒、量筒、天平、灭菌锅、酒精灯、接种环、棉花、棉 线、牛皮纸、pH 试纸。 3、试剂 葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、苯酚、四硼酸钠（Na2B4O7）、4-氨基安替比林、过硫酸铵（（NH4）2S2O8）、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、琼脂。
苯酚标准溶液：称取分析纯苯酚 1.0g，溶于蒸馏水中，稀释至1000mL，摇 匀。此溶液溶度为1000mg/L。测定标准曲线时将苯酚浓度稀释至100mg/L。 Na2B4O7 饱和溶液：称取N a2B4O7 40g，溶于1L 蒸馏水中，冷却后使用，此 溶液的pH值为10.1。 3% 4-氨基安替比林溶液：称取分析纯4-氨基安替比林3g，溶于蒸馏水中， 并稀释至100mL，置于棕色瓶中，冰箱保存，可用两周。 2% （NH4）2S2O8 溶液：称取分析出（NH4）2S2O8 2g，溶于蒸馏水中，并稀 释至100mL，置于棕色瓶中，冰箱保存，可用两周。 4、培养基 富集培养基：蛋白胨0.5g，K2HPO4 0.1g，MgSO4 0.05g，水1000mL，调节pH 7.2-7.4，高压蒸汽灭菌，冷却后视需要添加适量的苯酚。 基础培养基：K2HPO4 0.6g，KH2PO4 0.4g，NH4NO3 0.5g，MgSO4 0.2g，CaC2l 0.025g，水1000mL，调节pH 7.0-7.5，高压蒸汽灭菌，冷却后视需要添加适量的苯酚。 四、实验步骤 （一）富集培养和驯化 采集活性污泥或土样，接种于装有100mL 富集培养基和玻璃珠并加有适量 苯酚（50mg/L）的三角瓶中，30℃振荡培养。待菌生长后，用无菌移液管吸取 1mL 转至另一个装有100mL 富集培养基和玻璃珠并加有适量苯酚的三角瓶中， 如此连续转接2-3 次，每次所加的苯酚量适当增加，最后可得酚降解菌占绝对优 势的混合培养物。 （二）平板分离和纯化 1、用无菌移液管吸取经富集培养的混合液10mL，注入90mL无菌水中，充 分混匀，并继续稀释到适当浓度。 2、取适当浓度的稀释菌液，加一滴于固体平板（由富集培养基加入2%的琼 脂组成，倒平板时添加适量的苯酚，浓度达到200 mg/L。）中央，用无菌玻璃涂 棒把滴加在平板上的菌液涂平，盖好皿盖，每个稀释度做2-3 个重复。 3、室温放置一段时间，待接种菌液被培养基吸收后，倒置于30℃恒温箱中 培养2-3d。 4、挑选不同菌落形态，在含适量苯酚的固体平板上划线纯化。平板倒置于
乙苯的理化及危险特性表 标识中文名：乙苯；苯基乙烷英文名：Ethylbenzene 分子式：C8H10 分子量：106.16 CAS号：100-4l-4 RTECS号：DA0700000 UN编号：1175 危险货物编号：32053 IMDG规则页码：3222 理化性质外观与性状：无色液体，有芳香气味。 主要用途：用于有机合成和用作溶剂。 熔点：-94．9 沸点：136．2 相对密度(水=1)：0．87 相对密度(空气=1): 3．66 饱和蒸汽压(kPa)：1．33／25．9℃ 溶解性：不溶于水，可混溶于醇、醚等多数有机溶剂。可产生易燃，刺激性蒸气。临界温度(℃)：343．1 临界压力(MPa)：3．70 燃烧热(kj/mol)：无资料 燃烧爆炸危险性避免接触的条件： 燃烧性：易燃 建规火险分级：甲 闪点(℃)：15℃ 自燃温度(℃)：432 爆炸下限(V%)：1．0 爆炸上限(V%)：6．7 危险特性：其蒸气与空气形成爆炸性混合物，遇明火、高热能引起燃烧爆炸。与氧化剂能发生强烈反应。其蒸气比空气重，能在较低处扩散到相当远的地方，遇火源引着回燃。 若遇高热，容器内压增大，有开裂和爆炸的危险。流速过快，容易产生和积聚静电。 使橡胶溶胀、变软。 易燃性(红色)：3 反应活性(黄色)：0 燃烧(分解)产物：一氧化碳、二氧化碳。 稳定性：稳定 聚合危害：不能出现 禁忌物：强氧化剂。 灭火方法：泡沫、二氧化碳、干粉、砂土。用水灭火无效。如果该物质或被污染的流体进入水路，通知有潜在水体污染的下游用户，通知地方卫生、消防官员和污染控制部门。 包装与储运危险性类别：第3．2类中闪点易燃液体 危险货物包装标志：7 包装类别：Ⅱ 储运注意事项：储存于阴凉、通风仓间内。远离火种、热源。仓温不宜超过30℃。防止阳光直射。 保持容器密封。应与氧化剂分开存放。储存间内的照明、通风等设施应采用防爆型， 开关设在仓外。配备相应品种和数量的消防器材。桶装堆垛不可过大，应留墙距、 顶距、柱距及必要的防火检查走道。罐储时要有防火防爆技术措施。禁止使用易产 生火花的机械设备和工具。灌装时应注意流速(不超过3m／s)，且有接地装置，防 止静电积聚。搬运时要轻装轻卸，防止包装及容器损坏。 废弃：处置前参阅国家和地方有关法规。废物储存参见“储运注意事项”。用控制 焚烧法处置。 包装方法：小开口钢桶；螺纹口玻璃瓶、铁盖压口玻璃瓶、塑料瓶或金属桶（罐） 外木板箱。 ERG指南：129 ERG指南分类：易燃液体(极性的／与水混溶的／有毒的) 毒接触限值：中国MAC：未制定标准
高效苯酚降解菌的分离及降解性能的研究 引言 石油、化工、煤气、焦化及酚类等生产厂排放的废水当中含有大量的苯酚[1]。未经净化的含酚废水可导致水源被污染，致使鱼类死亡，危害农作物，最终威胁人类的健康。许多国家将苯酚列为重要的污染物之一。目前，国内外处理含酚废水的方法主要有物理法、化学法、微生物法及各种结合法[2]。其中微生物法主要利用微生物的代谢活动去除废水中的有毒物，处理方法无2次污染且安全、经济。目前，已鉴定具有降解苯酚能力的微生物主要有假单胞菌（Pseudonomonas.sp）[3]、芽孢杆菌（Bacillus.sp）[4]、酵母菌（Yeast trichosporon）[5]、根瘤菌（Rhizobia）[6]、醋酸钙不动杆菌（A. calcoaceticus）[7]等，降酚菌株多存在于酚类污染物企业排放的废水、污泥和被废水污染的土壤中[8]。本课题拟从被苯酚废水污染的污泥中进行菌株筛选，得到耐酚菌后在以苯酚为唯一碳源的无机盐培养上筛选降酚菌株，进一步测定苯酚降解的影响因素。对特定菌株降解含酚废水的应用价值进行研究。 1 实验材料和方法 1.1 菌株来源 采集原黑龙江省佳木斯东郊黑龙农药化工集团废弃排污口
处污泥进行菌株筛选。 1.2 培养基 基础培养基：NaCl 5.0g/L，蛋白胨10g/L，琼脂15～20g/L，酵母浸膏5.0g/L，调节pH为7.0。 以苯酚为唯一碳源的无机盐培养基：CaCl2 0.1 g/L ，FeSO4.7H2O 0.01 g/L，K2HPO4 0.5g/L，MnSO4.7H2O 0.05 g/L，NaCl 0.2 g/L，KH2PO4 0.5g/L，MgSO4.H2O 0.01 g/L，NH4NO3 1.0 g/L苯酚按实验需要量添加，调节pH为7.0 [8]。 富集培养基：葡萄糖10.0g/L，营养琼脂33.0g/L，酵母浸粉10.0g/L，调节pH为7.5。 1.3 研究内容与方法 1.3.1 菌株和的驯化和分离 在超净工作台中，将10mL含0.1g/L苯酚的基础培养基倒入培养皿，取10 g污泥加90mL蒸馏水搅拌15min，静置5min后取上层清液为菌原液[8]。取1mL菌原液加入无菌水中分别制成100、10- 1、10- 2、10- 3、10-4等梯度的菌液，然后分别从各菌液试管中取1mL用涂布法接种于基础培养基平板上。在pH 值为7、25℃情况下培养24～48h。挑取单一菌落于富集培养基平板上划线、扩繁。编号，将平板置于25℃的恒温培养箱中培养24～48h后放于4℃冰箱保存。依据革兰氏染色进行微生物鉴定。 1.3.2 降酚菌的筛选
降解苯酚微生物的选育 一、实验目的 1. 学习从含酚工业污水、活性污泥中筛选苯酚降解菌。 2. 学习通过活性污泥驯化分离耐酚菌。 二、实验原理 酚类化合物是化工、造纸、钢铁等工业废水的主要有害成分，含酚污水的排放，污染水源、毒死鱼虾、危害庄稼、严重危害人类健康，是各国研究关注的污染物之一。 含酚废水中分离出的生物降解酚能力强的菌为：假单胞菌、白乳杆菌、假丝酵母和野丝膜菌等。含酚废水生物处理目前主要采用活性污泥法。 三、实验材料 1.菌源含酚工业废水或含酚废水曝气池中的活性污泥。 2.培养基耐酚真菌培养基(固体、液体和斜面)，耐酚细菌培养基(固体、液体和斜面) ，碳源对照培养液a，苯酚培养液b。 3.试剂2% 4-氨基安替比林溶液，8%铁氰化钾溶液，氯仿，氨性氯化铵缓冲液，溴酸钾-溴化钾溶液，硫代硫酸钠溶液, 1%淀粉溶液。 4.其他稀释分离所用的无菌水，无菌培养皿，无菌移液管，测定酚所用的移液管，容量瓶，试剂瓶，酸式滴定管等。 四、实验方法 1.采样 自焦化厂、钢铁公司化工厂、造纸厂处理含酚工业污水的曝气池中取活性污泥和含酚污水，装于无菌瓶中，带回实验室，记录采样日期、地点，曝气池的水质分析包括：挥发酚、可溴化物、BOD5五日生化需氧量、COD化学需氧量、焦油、硫化物、氰化物、总氮、氨态氮、磷、pH、水温等。采集的样品应迅速稀释分离。 2.分离纯化 一般微生物在含酚培养基上不能生长。苯酚耐受菌株的筛选，可采用药物抗性菌株一样的梯度平板法。即在培养基中加入一定量的药物，使大量细胞中的少数抗性细胞在平板上的一定剂量药品的部位长成菌落，从而判定该菌耐受酚的能力。
1、梯度平板制备：在无菌培养皿中，先倾倒7～l0mL不含苯酚的无菌细菌或真菌固体培养基，将培养皿一侧置于木条上，使皿中培养基倾斜成斜面，且刚好完全盖住培养皿底部，待培养基凝固后，将培养皿放平，再倒入无菌7～l0mL(刚好完全盖住下层斜面)含70mL/l00mL苯酚的无菌耐酚细菌或耐酚真菌固体培养基，刚好完全盖住下层斜面，放置过夜。由于苯酚的扩散作用，造成上层培养基由厚到薄的药物浓度递减的梯度。 2、涂布法分离：将采集的样品作10倍梯度稀释，按涂布法分离，30℃培养2 天后，平板上生长的菌落也形成密度梯度，苯酚低浓度区形成菌苔，苯酚高浓度区出现稀少菌落，将此菌落在含耐酚细菌或真菌培养基平板上连续划线分离，最后挑取单菌落接种到耐酚斜面培养基上，30℃培养2天。 3、耐酚菌驯化 先将从含酚废水采集的活性污泥放入苯酚无机培养液中（苯酚终浓度25mg/L，MgSO4.7H2O终浓度0.3%, KH2PO4终浓度0.3%），30℃振荡培养6～7天，使苯酚降解菌大量增殖，淘汰对酚不适应的微生物；再添加苯酚无机培养液（苯酚终浓度增加至100mg/L）30℃振荡培养4～6天；再流加苯酚无机培养液（苯酚终浓度增加至200mg/L）30℃振荡培养4～6天，再提高到流加250mg/L苯酚无机培养液，30℃培养4天，从中选出对酚耐受力强的菌株。 4、性能测定。 初筛：制备不同含酚浓度的耐酚平板培养基，苯酚浓度为0.025%、0.045%、0.060%、0.075%，将选出的耐酚力强的菌株在以上平板培养基上划线分离，自高酚浓度平板上长出的菌落，即为酚降解力高的菌株。 复筛：将初筛纯化的菌种分别接入碳源对照培养液a和苯酚培养液b中，30℃振荡培养48h，0、12、24、36、48h取样测A600光密度值，绘制生长曲线，以不含酚的碳源(葡萄糖)培养液为对照。若与对照相比，在250mg/L苯酚浓度培养液中生长速度下降不明显，同时，用4-氨基安替比林法检测发酵初时发酵液和发酵终止时发酵液苯酚浓度，计算降解率，若苯酚降解率达>80%，表明确系分离到有效苯酚降解菌。 五、实验报告 1．记录分离得到的苯酚降解菌情况于表4-1。 2．根据复筛耐酚试验，绘制对照组与试验组生长曲线。 3．记录在平板上和显微镜下观察的苯酚降解菌的菌落特征和镜检特征。
苯酚降解菌2,3-邻苯二酚双加氧酶基因克隆和序列分析 一．摘要： 环境中的酚污染主要指酚类化合物对水体的污染，通常含酚废水中又以苯酚和甲酚的含量最高。目前环境监测常以苯酚和甲酚等挥发性酚作为污染指标。苯酚广泛存在于石油、化工、煤气、焦化、钢铁及酚类生产厂排放的废水中。含酚废水的排放导致水源污染,毒死鱼虾,危害农作物,并严重威胁人类的健康,在我国水污染控制中已被列为重点解决的有害废水之一。含酚有机物的毒性还在于其只能被少数微生物所分解。在油田地层水中分离出苯酚降解菌BF80，并且从BF80中克隆出编码2，3-邻苯二酚双加氧酶(参与苯酚降解所必须的一种酶)的基因序列；采用基因克隆的策略是通过PCR进行片段克隆，并用UNIQ-10柱形DNA 回收试剂盒回收产物，采用NCBI BLAST序列分析表明该基因片段长1207bp,序列比较分析表明该基因片段与2-苯酚羟化酶A相似度达88%，氨基酸序列分析表明其与2,3-邻苯二酚双加氧酶相似度达96%。本实验研究编码降解苯酚的2,3-邻苯二酚双加氧酶的基因克隆及序列分析，为构建高效降解苯酚的基因工程菌奠定了基础。 Phenol degrading bacteria 2 - phenol hydroxylase gene sequence analysis Abstract: Phenol pollution in the environment mainly refers to phenolic compounds on water pollution, waste water containing phenol is usually turned around the highest levels of phenol and cresol. Often present environmental monitoring such as phenol and cresol Phenol as pollution indicators. Phenol widespread in the petroleum, chemical, gas, coke, steel and phenolic wastewater plant emissions. Phenolic wastewater emissions of water pollution, poisoned fish, damage crops, and a serious threat to human health, water pollution control in China has been a key to solve one of the harmful waste. The toxicity of phenol organics still only a small number of micro-organisms, their decomposition. In oilfield water of phenol degrading bacteria isolated from BF80, and BF80 was cloned from the 2,3 - catechol dioxygenase (involved in phenol degradation of an enzyme necessary) of the gene sequence; using gene cloning strategy were cloned by PCR, with UNIQ-10 column DNA extraction kit recycling products, using NCBI BLAST sequence analysis showed that the gene fragment was 1207bp, Sequence analysis showed that the gene fragment and 2 - A similarity to phenol hydroxylase 88% amino acid sequence analysis showed that with 2,3 - catechol dioxygenase similarity of 96%. This study coded degradation of phenol 2,3 Catechol Dioxygenase Gene Cloning and sequence analysis, in order to build efficient genetic engineering of bacteria degrading phenol basis 关键词：苯酚苯酚降解菌基因克隆基因序列分析
苯的理化性质表 标识中文名：苯；纯苯；安息油英文名：Benzene 分子式：C6H6 分子量：78.11 CAS号：71-43-2 RTECS号：CYl400000 UN编号：1114 危险货物编号：32050 IMDG规则页码：3185 理化性质外观与性状：无色透明液体，有强烈芳香味。冰点为6℃ 主要用途：用作溶剂及合成苯的衍生物、香料、染料、塑料、医药、炸药、橡胶等。熔点：5．5 沸点：80．1 相对密度(水=1)：0．88 相对密度(空气=1): 2.77 饱和蒸汽压(kPa)：13．33／26．1℃ 溶解性：不溶于水，溶于醇、醚、丙酮等多数有机溶剂。 临界温度(℃)：289.5 临界压力(MPa)： 4.92 燃烧热(kj/mol)：3264.4 燃烧爆炸危险性避免接触的条件： 燃烧性：易燃 建规火险分级：甲 闪点(℃)：-11 自燃温度(℃)：560℃ 爆炸下限(V%)：1．2 爆炸上限(V%)：8．0 危险特性：其蒸气与空气形成爆炸性混合物，遇明火、高热能引起燃烧爆炸。与氧化剂能发生强烈反应。其蒸气比空气重，能在较低处扩散到相当远的地方，遇吹源引 着回燃。若遇高热，容器内压增大，有开裂和爆炸的危险。流速过快，容易产 生和积聚静电。 燃烧(分解)产物：一氧化碳、二氧化碳。 稳定性：稳定 聚合危害：不能出现 禁忌物：强氧化剂。 灭火方法：泡沫、二氧化碳、干粉、砂土。用水灭火无效。如果该物质或其被污染的流体进入水路，通知有潜在水体污染的下游用户，通知地方卫生、消防官员和污染 控制部门。在安全防爆距离以外，使用雾状水冷却暴露的容器。若冷却水流不 起作用(排放音量、音调升高，罐体变色或有任何变形的迹象)，立即撤离到安 全区域。 包装与储运危险性类别：第3．2类中闪点易燃液体 危险货物包装标志：7 包装类别：Ⅱ 储运注意事项：储存于阴凉、通风仓间内。远离火种、热源。仓温不宜超过30℃。防止阳光直射。保持容器密封。应与氧化剂分开存放。储存间内的照明、通风等设施应采 用防爆型，开关设在仓外。配备相应品种和数量的消防器材。罐储时要有防火 防爆技术措施。禁止使用易产生火花的机械设备和工具。灌装时应注意流速(不 超过3m／s)，且有接地装置，防止静电积聚。搬运时要轻装轻卸，防止包装及 容器损坏。夏季应早晚运输，防止日光曝晒。运输按规定路线行驶。 ERG指南：130 ERG指南分类：易燃液体(非极性／不溶于水／有毒) 毒性接触限值：中国MAC：40mg／m3[皮] 苏联MAC：5mg／m3[皮]
第三章烃的含氧衍生物 第一节醇酚 （第二课时苯酚） 一、教学内容分析 本节内容是安排在乙醇后面的又一种烃的衍生物，教材在这一基础上紧接着安排入苯酚有其独有的作用。因苯酚的结构中也含羟基，通过苯酚性质的学习可进一步加强学生对羟基官能团性质的掌握，而苯酚性质与乙醇性质的又有一定的不同之处，让学生理解官能团的性质与所处“氛围”有一定的相互影响，让学生学会全面的看待问题，能更深层次的掌握知识。在学生掌握苯酚性质的同时，又为后面烃的衍生物的学习提供了方法。教材的这一安排以及本节内容的知识特点使在教学中培养学生探究能力成为可能。 苯酚结构中与乙醇的相同点（都有羟基）为学生对苯酚性质的探究提供了基础；而苯酚结构中与乙醇的不同点（羟基与苯基相连）又为学生的进一步的探究提供了空间。因此，将该节的内容设计成探究式教学模式极佳。根据教材和学生情况本节课的探究可以分为两个部分，一是苯酚中羟基和苯基性质的探讨（官能团共性），在这一过程中学生的知识迁移的能力得到了锻炼，也使学生体会到探究的一般方法和技能；二是苯基和羟基性质的相互影响的探讨（官能团特性），在这一过程中学生的创造能力得到了最大限度的激发。 二、学情分析 通过前面内容的学习，学生已经基本了解研究有机化学的方法及有机化合物的结构与性质的关系。学生在学习乙醇的过程中已初步掌握了官能团对有机物主要性质的决定性作用，对乙醇中官能团羟基的性质也已有较深的理解和掌握。通过烃的学习，已掌握了苯的结构与性质关系；同时通过醇的学习，已学会羟基的结构与性质关系，认识了羟基的化学性质。因此，学生在苯酚的学习时，学习方法和知识基础上已具有适当的铺垫；但对酚羟基的酸性相对强弱（与碳酸和碳酸氢根的比较）及苯酚的三溴取代还是具有一定困难；对显色反应缺少支持等。所以，学生对本课时的学习的较好策略应该是进行比较（苯、醇）分析、讨论猜想、实验探索的方式。 三、教学目标 【知识与技能】 1. 了解苯酚的物理性质和用途; 2. 掌握苯酚的结构和苯酚的酸性、与溴的反应等重要化学性质和化学反应方程式。 3. 了解苯酚的用途, 掌握苯酚的检验方法。 【过程与方法】 1. 运用实验探究的方法研究苯酚的性质; 2. 培养学生实验操作、观察、分析能力, 加深对分子中原子团相互影响的认识, 培养学生辩证唯物主义观点; 3. 通过实验活动观察、记录、总结，培养学生实验能力和表达能力； 4. 通过差异性比较，使学生树立由官能团着手学习有机化合物的方法和官能团相互影响的事实。 【情感态度与价值观】 1. 通过对苯酚及酚类物质的学习及应用，认识酚类物质在生产生活中的价值。 2. 通过工业中酚类物质对环境的影响，培养学生的环保意识。 3. 激发学生学习兴趣, 培养学生求实进取的品质。
“有机污染物——苯酚的生物降解特性研究”设计方案 丁霞 一、实验目的 酚类化合物为原生质毒物，毒性较大。焦化、煤气、石油、木材防腐、造纸、合成氨等工业废水中都含有高浓度的苯酚。含酚废水在我国水污染控制中被列为重点解决的有害废水之一。利用降解菌来控制苯酚的污染，越来越受到人们的重视。本项目拟采用微生物培养、苯酚生物降解的途径及其降解关键酶的分析、微生物DNA的提取、分光光度计测定、PCR、TA克隆等实验技术，阐明苯酚降解菌株的生长特性和苯酚的生物降解特性，苯酚降解菌的系统发育。对学生从事有机污染工业废水的生物处理以及有机污染的土壤或水体的生物原位修复方面的科学研究具有深远的意义。 二、实验原理 利用以苯酚为唯一碳源和能源的无机盐溶液作为驯化液，对某废水处理厂活性污泥进行驯化培养，从中分离筛选出苯酚降解菌。利用比浊法测定微生物生长量，4-氨基安替比林直接光度法测定苯酚浓度，分析苯酚生物降解的途径及其降解关键酶，PCR扩增细菌的16s RNA进行苯酚降解菌的系统发育分析。 1）微生物生长量的测定方法——比浊法 比浊法是实验室中常用的用来测定微生物生长量的方法，以反映微生物数量或浓度的一种指标。该方法是根据当某一波长的光线通过混浊的液体后，光的强度将被减弱。入射光与透过光的强度比与样品液的浊度和液体的厚度相关。根据所测得的吸光值，就可以得到微生物的生长量。本实验采用的波长为600nm，使用空白培养基作为对照。 2) 苯酚浓度的测定方法 见后面附录。 3）苯酚降解菌的系统发育分析 16S rRNA基因是细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的染色体基因组中。16S rRNA具有高度的保守性和特异性。随着PCR技术
苯酚理化性质与质量指标 1.1 苯酚的基本概况 苯酚：又名石炭酸；酚；羟基苯； 英文名：Phenol；Hydroxybenzene； 分子式：C6H6O； C A S：108-95-2； 结构式： 图1.1苯酚分子结构式 苯酚（俗称石炭酸）是一种常见的化学品，是重要的有机化工原料，是丙烯的重要衍生物之一，是生产某些树脂、杀菌剂、防腐剂以及药物（如阿司匹林）的重要原料。也是一种电解质。 苯酚用途广泛，产量大，工业上主要由异丙苯制得。第一次世界大战前，苯酚的唯一来源是从煤焦油中提取。目前绝大部分是通过合成方法得到。有磺化法、氯苯法、异丙苯法等方法。 1.2 苯酚的物化性质 苯酚又名石炭酸、羟基苯，是最简单的酚类有机物，一种弱酸。 物理性质：常温下为一种无色或白色的晶体，有特殊气味（有令人作呕的甜和辣的气味）。苯酚密度比水大，常温下微溶于水，可在水中形成白色混浊。当温度高于65℃时，能跟水以任意比例互溶，其溶液沾到皮肤上用酒精洗涤。暴露在空气中呈粉红色。易溶于醇、醚等有机溶剂；在乙醇、氯仿、乙醚、醋酸酯、甲苯、甘油中可溶解50%以上，在矿物油中的溶解度小。
苯酚为无色针状结晶或白色结晶，有特殊气味，遇空气和光变红，遇碱变色更快。分子式C6H6O。分子量94.11。相对密度1.071。熔点40.85℃(超纯，含杂质熔点提高)。沸点181.9℃。闪点79.44℃(闭杯)，85℃(开杯)。自燃点715℃。蒸气密度3.24。蒸气压0.13kPa(40.1℃)。蒸气与空气混合物燃烧限1.7～8.6% 。1克溶于约15ml水(0.67%，25℃加热后可以任何比例溶解)，12ml苯。易溶于醇、氯仿、乙醚、丙三醇、二硫化碳、凡士林、碱金属氢氧化物水溶液，几乎不溶于石油醚。水溶液pH值约为6.0。 表1.1 苯酚基本物理性质表 苯酚石炭酸外观与性状白色结晶，有特殊气味。 分子式C6H6O 分子量94.11 pH值 6.0 熔点(℃) 40.6(超纯，含杂质熔点提高) 沸点(℃) 181.9 闪点(℃) 79.44℃(闭杯) 85℃(开杯) 相对密度(水=1) 1.07 引燃温度715℃相对蒸气密度(空气=1) 3.24 饱和蒸气压0.13(40.1℃) (kPa) 辛醇/水分配系数的对数值 1.46 临界压力 6.13(MPa) 燃烧热(kJ/mol) 3050.6 临界温度(℃) 419.2 爆炸上限%(V/V) 1.7 爆炸下限%(V/V) 8.6 溶解性：可混溶于乙醇、醚、氯仿、甘油。 主要用途：用作生产酚醛树脂、卡普隆和己二酸的原料，也用于塑料和医药工业。 苯酚为易燃易爆物，空气中混有3～10%的苯酚可引起爆炸，有毒。有腐蚀性。 苯酚能腐蚀橡胶和合金。与碱作用生成盐。遇热、明火、氧化剂、静电可燃。与三氯化铝+硝基苯、丁二烯、过二硫酸、过一硫酸发生剧烈反应，引起燃烧爆炸。能与氧化剂发生反应。 化学性质： 1、酸碱反应：苯酚是一种弱酸，能与碱反应： 2、显色反应：苯酚遇三氯化铁溶液显紫色，原因是苯酚根离子与Fe3+形成了有颜色的络合物。 (紫色)
一株降解苯酚微生物的分离与鉴定 摘要：从武汉市某化工厂的活性污泥中分离1株能以苯酚为惟一碳源和能源生长的菌株，命名为CY1。通过逐级驯化，CY1可在含1 000 mg·L-1苯酚的培养基中降解苯酚并生长。经对该菌株进行形态特征以及16S rDNA序列比对分析，确认该菌株属于假单胞菌属(Pseudomonas)。 关键词：苯酚；降解；假单孢菌属 Isolation and Identification of A Phenol-degrading Bacterium Abstract：A strain CY1 was isolated from the sludge around a chemical plant in Wuhan，Hubei Province. It had ability of utilizing phenol as sole carbon and energy sources. By using step-by-step domesticating method，it could grow in the culture medium byusing 1 000 mg·L-1 phenol as sole carbon source. CY1 was considered to be belonged to Pseudomonas by morphological characteristics and the phylogenetical analysis of the 16S rDNA sequence. Key words：phenol；degradation；Pseudomonas 苯酚及其衍生物广泛应用于制药、农药、冶金、塑料等行业，它在环境中能与水中的氯作用生成毒性更大的氯代酚，对人类健康和动植物生长造成的危害不容忽视[1]。近年来，苯酚降解微生物的研究倍受关注，已鉴定和发现了多种具有苯酚降解能力的菌株，比如根瘤菌(Rhizobia)、乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)、假单胞菌(Pseudo-monas sp.)、真养产碱菌(Alcaligenes eutrophus)、酵母菌(Yeasttri-chosporon cutaneum)、反硝化菌等[2]。本研究从湖北武汉某化工厂的活性污泥中驯化、筛选到一株苯酚降解细菌，并根据其16S rDNA基因序列构建了系统发育树，对其进行了鉴定。同时对苯酚的存在对菌株生长的影响进行了研究。 1材料与方法 1.1材料 污泥样品：采自湖北武汉某化工厂污水排放口。培养基：富集培养基为牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，水1 000 mL，pH值
苯酚的性质 【学习目标】 1.掌握苯酚的主要化学性质； 2.了解酚类的结构特点、一般通性。 苯酚的性质 一、酚的定义：羟基与直接相连形成的化合物叫做酚。 二、酚的结构与物理性质 ①苯酚俗称分子式为结构简式官能团名称 酚类的结构特点 ②苯酚的物理性质 （1）常温下，纯净的苯酚是一种色晶体，从试剂瓶中取出的苯酚往往会因部分氧化而略带色，熔点为：40.9℃ （2）溶解性：常温下苯酚在水中的溶解度，会与水形成浊液；当温度高于65℃时，苯酚能与水。苯酚易溶于酒精、苯等有机溶剂 （3）毒性：苯酚有毒。苯酚的浓溶液对皮肤有强烈的腐蚀作用，如不慎将苯酚沾到皮肤上，应立即用清洗，再用水冲洗。 三、酚的化学性质 （1）弱酸性:由于苯环对羟基的影响，使苯酚中的羟基能发生微弱电离 所以苯酚能够与NaOH溶液反应： A．与NaOH溶液的反应 所以向苯酚的浊液中加入NaOH溶液后，溶液变。 苯酚的酸性极弱，它的酸性比碳酸还要，以致于苯酚使紫色石蕊试剂变红。B．苯酚的制备（强酸制弱酸） 注意：产物是苯酚和碳酸氢钠，这是由于酸性：H2CO3 > 苯酚> HCO3－ （2）苯酚的溴化反应 苯酚与溴水在常温下反应，立刻生成白色沉淀2，4，6－三溴苯酚 该反应可以用来 （3）显色反应：酚类化合物与Fe3＋显色，该反应可以用来检验酚类化合物。
通过上面的对比，可以看出苯环的存在同样对羟基也有影响，它能使羟基上的氢更容易电离，从而显示出一定的弱酸性。 五、苯酚的用途 苯酚是重要的 原料，其制取得到的酚醛树脂俗称 ；苯酚具有 ，因此药皂中掺入少量的苯酚，葡萄中含有的酚可用于制造 茶叶中的酚用于制造 另外一些农药中也含有酚类物质。 【反馈练习】 1、下列说法正确是 A B ．苯酚与苯甲醇（ ）分子组成相差一个—CH 2—原子团，因而它们互为同系物。 C ．在苯酚溶液中，滴入几滴FeCl 3溶液，溶液立即呈紫色。 D ．苯酚分子中由于羟基对苯环的影响，使苯环上5个氢原子都容易取代。 2、白藜芦醇 HO —CH=CH —广泛存在于食物中，它可能具有抗癌性，与1mol 该化 合物起反应的Br 2和H 2的最大用量是 A ．1mol ，1mol B ．3.5mol ，7mol C ．3.5mol ，6mol D ．6mol ，7mol 3、使用一种试剂即可将酒精、苯酚溶液、己烯、甲苯4种无色液体区分开来，这种试剂是 A ．FeCl 3溶液 B ．溴水 C ．KMnO 4溶液 D ．金属钠 4、下列化合物中，属于酚类的是 5、下列各组物质中，一定属于同系物的是 A ．乙二醇和丙三醇 B ． C 6H 5－OH 和C 6H 5－CH 2OH C ．C 3H 6和C 4H 8 D ．C 2H 6和C 10H 22 6、丁香油酚的结构简式为 它的结构简式可推测它不可能有的化 学性质是 A ．即可燃烧，也可使酸性KMnO 4的溶液褪色 B ．可与NaHCO 3溶液反应放出CO 2气体 C ．可与FeCl 3溶液发生显色反应 D ．可与溴水反应 7、下列关于苯酚的叙述中，正确的是 A ．纯净的苯酚是粉红色晶体 B ．苯酚有毒，因此不能用来制洗涤剂和软膏 2OH 3 2CH=CH 2
苯酚 苯酚（Phenol，C6H5OH） [1] 是一种具有特殊气味的无色针状晶体， [2] 有毒，是生产某些树脂、杀菌剂、防腐剂以及药物（如阿司匹林）的重要原料。也可用于消毒外科器械和排泄物的处理 [3] 皮肤杀菌、止痒及中耳炎。熔点43℃，常温下微溶于水，易溶于有机溶剂；当温度高于65℃时，能跟水以任意比例互溶。苯酚有腐蚀性，接触后会使局部蛋白质变性，其溶液沾到皮肤上可用酒精洗涤。 [4] 小部分苯酚暴露在空气中被氧气氧化为醌而呈粉红色。遇三价铁离子变紫，通常用此方法来检验苯酚。 中文名苯酚英文名Phenol 别称石炭酸、酚、羟基苯 化学式C6H5OH 分子量94.11 熔点40-42℃ 沸点181.9℃ 水溶性微溶于冷水，在65℃与水混溶。可混溶于乙醇、醚、氯仿、甘油 密度1.071g/mL（25℃） 外观无色或白色晶体，有特殊气味。在空气中及光线下变为
粉红色 闪点：185℉/85℃ 应用：化工合成、油田工业、电镀、溶剂，医学 安全性描述：S26，S28，S45，S24/S25，S36/S37/S39 危险性符号：F（易燃）,T（有毒）,C（腐蚀性） 危险性描述：R34，R68，R23/24/25，R48/20/21/22 危险品运输编号：UN 2821 6.1/PG 2 化学性质弱酸性，高毒类，突变原，还原性稳定性稳定禁配物强氧化剂、强酸、强碱 储存方法阴凉通风，低温避光，注意泄漏物PSA20.23000 LogP1.39220 折射率n20/D 1.5418 分子结构 苯酚分子由一个羟基直接连在苯环上构成。 由于苯环的稳定性，这样的结构几乎不会转化为酮式结构[5]。 苯酚共振结构如右上图。酚羟基的氧原子采用sp2杂化，提供一对孤电子与苯环的6个碳原子共同形成离域键。大π键加强了烯醇的酸性，羟基的推电子效应又加强了O-H键的极性，因此苯酚中羟基的氢可以电离出来。 苯酚盐负离子则有如右下图共振结构：