分子生物学实验室工作常识
支原体污染
支原体污染的鉴别。一个非常困难，但却无处不在的问题！支原体是最小的能自我复制的微生物，它约0.3μm, 在倒置显微镜下一般看不到。这些细菌没有细胞壁，对通常使用的抗生素不敏感。研究者们通常不知道他们的细胞感染了支原体，直到细胞的活性降低或者不能发挥正常的功能才发现。
怀疑有支原体污染，如果没有特殊染色的帮助，或者细胞受到严重的污染明显能观察到，唯一解决的方法是停止实验。检查和处理支原体污染的唯一办法是常规筛选细胞去除污染，这是一种简单的方法。
防止支原体污染。只使用没有支原体污染的培养基和血清。大多数公司的产品都能达到这个要求。只要没有支原体污染的细胞。如果是定购，这个要求容易达到。但如果是从一个研究者那里得到细胞，这个要求很难满足。直接询问细胞是否进行过支原体污染检查。 常规筛选是一项繁琐的工作。用细胞做短期实验的研究
者和实验室人员都不愿费事去筛选细胞。他们或许永远不知道：不能增加抗一个细胞表面蛋白抗体的效价或者不能有效表达一个蛋白的原因是应为他们使用了支原体污染的
细胞。
支原体污染的筛选。如果细胞的完整性对你非常重要，
每4-6星期常规筛选细胞。有许多这样的方法：
支原体的荧光染色是最容易、最廉价、最常用的筛选方法。
如果你的实验室在进行凝胶和PCR 实验，用支原体的特异性引物进行PCR 检测或许是最容易的方法。你可以制备自己的引物，或者从公司定购它们（和合适的对照）。
把样品寄到可以进行支原体检测的公司。公司会提供邮递递送服务，但是没有你自己做得快（尽管这样更容易些，但是费用更高。）
如果你发现了支原体污染，那么你非常幸运！
最好的办法是把细胞扔掉，重新解冻细胞。
你或许会忽略被支原体污染的细胞。
有一些处理支原体培养物的方法，但是这些方法很困难，只
应该用于那些不可替代的细胞。最好的办法是与生产除去支
原体试剂盒的公司联系，ICN 和Boehringer-Mannheim 有好
的试剂盒。
交叉污染
细胞能够感染其他的细胞培养物。这种交叉污染十分普遍，许多研究者在培养、使用和冻存污染细胞是时不是非常小心，而是不在意交叉污染。应该防止这种现象。
从一个有名的地方获得你所需要的细胞，或者你自己检查细胞的特性。有一些公司可以做这些工作。
不要一次培养多于一个细胞系，也不要同时把不同的细胞放在超净台中。
不同的细胞系不要使用相同的加样枪头。
相同的细胞系不要使用同一瓶培养基和胰蛋白酶。
吸取细胞后的加样枪不要再伸回到培养基的瓶中。
培养细胞把瓶盖塞紧。
如果你培养的细胞突然与正常细胞生长不一样，或正功能与正常细胞不同，检查是否有交叉污染，而且也要排除支原体污染。（细胞的变化也可以由突变或遗传漂变引起。）
11 细 菌
人们把细菌看作是自然界非常奇特的生命形式，研究它们怎样生长繁殖，为什么它们会引起疾病，它们的繁殖需要什么。或者你也可以把它看作是许多敌人中唯一对基因操作和蛋白表达有用的工具。如果这样，要小心。细菌实际上是一个有生命的敌人，必须正确的培养和处理才能得到可靠的和没有污染的结果。
微生物在功能上根据它们感染个体引起疾病能力的程度进行分类。微生物的类型影响用微生物进行研究的方式和地方。
在分子生物学实验中通常使用细菌，比如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的一些不致病菌，它们是一类菌（没有危险），还有一些如沙门氏菌和志贺氏菌，它们是二类菌（低危险性）。大部分目录中的细菌并没有区分一类和二类细菌。你可以在实验台上进行大部分操作（BL1）, 能够产生气溶胶的实验在一个生物安全橱中进行（BL2）。
由于吸入而引起疾病的高危险的第三类微生物必须只在BL3防范的实验室中进行。一些第三类微生物比如：分支杆菌属，肺结核杆菌，分枝杆菌属的灰球菌，francisella
tularens is 。带有防范的实验室在物理上与周围的房间是分开的，没有管子或通风设备与其他房间进行空气交换。这种房间是负压的，如果房间漏气，只要有空气能进来，来自污染实验室的可能有污染的空气仍然在实验室内。所有的工作都在安全橱中进行，如果防护服破损了，不允许进入实验室。
工 作 规 则
遵守常规实验室的安全规则（第一章）。不要在实
烂脚指头的鞋，不要把实验室外的工作服穿进实验室。
至少一天洗一次工作服，当细菌洒出来时也要洗工
早晨开始工作之前先用消毒剂比如70%
的酒精清洗实验台面。如果有任何菌液洒出来或滴出来立刻清除并消毒该区域。
在处理前消毒所有的污染物。
在离开实验室和处理污染物后必须洗手。
即使你工作时带手套也应该这样做，由于其
液体废物
在液体废物中加入大约终浓度10%
的次氯酸钠。放置30min 。倒入水槽，打开水龙头冲走。
固体废物
把固体废物当作生物危险的废物处理。高压灭菌。这是一个实验室的责任或者是一种应该遵守的制度，而且也必须适当的保存和标记好这些废物（看第八章）。
在实验时尽可能减少气溶胶。避免产生气溶胶是减少通过肺部传染的最好途径，也可们也会通过吸取、倾倒液体和打开离心管的盖子产生。不要猛烈打开离心管，缓慢轻柔地打开离心管。到液体时不要洒出来。吸出最后一滴液体，用带有枪头的加样枪靠近液体的表面尽可能减少溅出使离心管干燥。
不要积累平板和管子。一旦得到你所需要的细菌，保存样品后扔掉所有旧培养物。即生长介质。
获 得 菌 种
实验室成员。大部分菌种可以从实验室的同伴中得到，因为他们可能正在使用这种菌种工作。索要冷冻的培养物（最新获得的细胞），如果你不耐烦了也要坚持。但是不能随便问一个人要。负责实验室菌种保存的人是最佳的人选。否则，试着问负责人要。
其他研究人员。如果你偶然在一篇文献中看到了有关你需要菌种的描述，发电子邮件2周内没有收到回信，可以打电话。但是不要问别人要商业上使用的菌种，到文章的材料和方法部分可能提到的地
方寻找，或者给这个地方打电话。 一些公司。是你进行基因操作时用噬菌体和细
与公司的技术部门核对确保得到的菌株就是你需要的菌株。 细菌突变：经过一定时间和反复培养，某些特征被选择，菌种的表型和基因型就会与以前的菌种不同。避免得到连续传代的菌种。有一种偏见认
为：表型漂移只存在于外来的细菌（对于一些实验室，这种漂移不会是大肠杆菌和沙门氏菌），但是任何买来的储存物和增加蛋白表达的大肠杆菌在反复培养后也会发生漂移，不能进行你所需要的研究工作。
生 长 和 维 持
细菌生长以各种方式进行，根据细菌生长的需要，需氧或厌氧而选择振荡或静止培养，有一些根据方便进行液体培养或半固体培养。 细菌液体培养的主要优点是能够产生足够的数量的细菌并且容易收获。
半固体培养基是在液体培养中加入了琼脂作为硬化剂，让培养基保持凝胶物的坚固性。在变硬前它能方便地被分成所需要大小的平板。细菌可以掺入培养基中，或者能够在培养基的表面生长。由于在半固体培养基上生长的每一个单菌落都来自一个细菌，平板培养是分离和选择特殊菌落和菌株的理想办法。
还应该有一些所培养细菌的生理知识，以便使它更好生长。比如，大肠杆菌是一种特异的厌氧菌， 能够在存在或缺乏分子氧的条件下生长。在利用时，它把分子氧作为一种终端氧化剂，当没有分子氧时它通过发酵获得能量。然而，在有氧条件下它会生长的更快更好。这就是为什么当培养大肠杆菌时要摇瓶培养，而且应该在瓶中留一定的空间换气。
在液体培养基中细菌有一种特征性的生长模式，它能够分成明显的生长阶段（如图
1）。当细菌刚被接种到培养基中时，它们不生长，在滞后期，细菌质量增加，因为细菌要适应新的环境，合成一些生长必需的成分。
培养物进入指数生长期，也是通常所说的对数生长期，这样命名是因为细胞数量有一个指数增长。
化学、生理和环境的变化是进入静止期的信号。尽管细胞数没有净增长，这个阶段的细菌仍然需要能量维持生命。当能量被耗尽时，培养物进入死亡期。这个时期细胞数实际在减少。
不同的实验需要细菌在一个特殊的生长阶段：通常是对数生长期或静止期。忽略细菌的生长阶段会对一个步骤或实验的成功产生严重有害的影响。细菌生长最好通过培养物浑浊度的改变来监测。
抗 生 素
基因工程质粒中通常含有一些基因，至少还有一个抗生素基因。这可以让研究者用其他无
存。
几乎所有的质粒通常都含有一个或几个抗性基因，比如氨苄青霉素、四环素、氯霉素和卡钠霉素（新霉素）。
抗生素是热不稳定物质，它被灭菌冷却后再加入到培养基中。常用冷冻的分装好的抗生素，但是只有当其他人需要时再配制抗生素。
如果不经常使用一个特殊的抗生素，购买时就按照使用的规格买，这样不用称量；例如，100mg 。这样购买比批量购买更贵一些，但是还是比最终到期后扔掉便宜。
抗生素有一个有效的浓度范围，不同的资料上可能会有不同的推荐浓度，所有这些都可以。抗生素使用的浓度应该选用使用相同菌株的研究者所使用的浓度，或者与你做相似研究工作的人员使用的浓度。
获得分离的克隆
将细菌培养物划线分离单克隆非常重要。在半固体培养基的平板上单菌落是一个小岛群，一个克隆来自一个单个的细菌：如果你没有用一个单
菌落开始培养，你的得到的培养物是一个混合培养物或者是一个污染物，而不是你要的菌株。你应该会制
备和挑取单菌落，否则你永远也不能保证你分离到的
和正在使用的是正确的细菌。
细 菌 保 存
短期保存
对大多数细菌来说，培养皿或液体培养基中的菌落在4℃可以储存几个星期。对平板培养非常有用，因为分离的单菌落可以作为反复的接种体。为了延长平板上的菌落生命，可以用一些石蜡封口膜将平皿的底部封起来。
长期保存
长期保存取决于你使用的细菌。在一些条件下，有些细菌不能很好存活，有些却能旺盛生长。当得到菌株时，要看看推荐的保存程序。除非有可靠的信息，否则应该对培养物用特别的储存方法保存生存能力，以便保证在使用时有活的细菌存在。你自己方便使用的一些说明，多长时间用保存的菌株，以及菌株的相对替代性也有助于决定怎样保存一个特殊的菌株。没有完美的保存方法。下面有一些方法可以参考：
接种一个培养物，生长，保存。隔一定时间重复这个过程，以便在细菌死亡
优点：可以很快得到培养物。廉价。
缺点：生活力丧失，污染机会增加，表型的稳定性受到影响
将水分除去防止再水化。尽管用这种方法保存的细菌可以生存许多年，但这种
优点：廉价，污染少。
缺点：用这种方法保存特定菌株的信息少。
通过升华将冷冻的细菌样品中的水份除去。干燥后，在玻璃安瓿瓶中的样10年，有一些可以保存50年。
优点：可以长期保存。
缺点：不是所有实验室都有所需要的设备。对于经常使用的菌株用这种方法保存不方便。一些菌株也会丧失生活力。
在低温冰箱中冷冻和保存菌种。细菌中不应该有水，脱水的细胞可以储存在低温。它们可以储存在-70℃，-140℃低温冰箱中或-196℃的液氮罐中。
优点：大多数细胞都能保存，这是维持长期细菌培养物的最好选择。
缺点：冰箱成本高，维修费用高。冻融会损害细胞。
细菌冻存
在培养细菌进行保存前应该考虑下列问题：
尽量减少次培养的次数。重复培养会使菌种出现突变、选择性变异和污染。因此只要得到你所需要的菌种，就赶快冻存菌种。
使细胞在理想的状态下生长。使用生长状态处在早期的细胞，让它生长在理想的状态下，使用推荐的培养基、湿度和温度。总之，基本培养基可以使细菌处在最好的生长状态。
找到你所使用的菌种的最佳冻存条件。许多细菌冻存条件是不同的，在冻存前找到你所使用的菌种的最佳冻存条件。
制备新鲜的冻存培养基。冻存培养基与生长培养基不同。要确保甘油无菌。
做好菌种保存记录也是非常重要的。必须准备一个本子，记录下保存的菌种，生长条件、保存日期、你的名字和保存地方。这个记录要和冰箱的记录分开，当保存和取出菌种时要及时添加记录。
1 2 DNA、RNA和蛋白质
DNA 、RNA 和蛋白质是分子生物学实验室的基本材料。前几年，在“DNA 实验室”、“RNA 实验室”和“蛋白质实验室”工作的研究者需要这些领域的专门技能。现在，研究者们越来越熟悉涉及这三个领域的技术，建立了许多这些领域的实验室。现在甚至是一个小的研究项目也会涉及一点基因克隆，mRNA 的分离和Western blotting.
与DNA 、RNA 或蛋白质有关的研究问题并不相同，因为这些分子的特征完全不同。在用这些大分子研究时要在无菌条件下进行，这样可以避免一些麻烦。
分子生物学的小技巧
了解所作的每一项工作的原理。由于试剂盒和实验方法使用起来很方便，所以在分子生物学实验室做实验很方便。要知道试剂盒的组成和它能够做什么工作。要知道为什么用高盐而不用低盐，用离子而不用非离子去污剂。如果你不知道这些内容，你或许会改变实验方法而得不到好的实验结果。
不要不断的改变实验方法。分子生物学领域比其他学科更容易得到许多帮助。实验手册又多又好，在网上有很多方法供参考，许多实验技能就是大学里讲授的和实验室里用的。在这些极好的新技术面前很容易被诱惑。但是如果你的实验方法用起来很顺利，不要轻易改变。
购买试剂盒时要深思熟虑。这些试剂盒可能是无价的。但是如果购买时不明智，那会浪费很多时间。在订购试剂盒之前察看一下实验室的存货。例如，如果实验室已经有所需要试剂的90%，那就不要购买试剂盒。或者如果你所需要的试剂盒是由很容易制备的缓冲液、对照DNA 和酶组成，这时只需要购买酶，制备或购买对照，缓冲液自己制备。
向其他研究者咨询你的研究结果。由于周围有大量的参考资料，你或许感到不应该再问别人问题。但是，在所有的研究领域里，一点好的建议可以节省很多时间和财力。
注意观察试剂的效果。你买的试剂也是由人制作的，所以也可能无效，或标记错误，或者有一些其他错误。要保证试剂有完整的包装，标记正确，如果实验失败那一定是你自己的原因。（大多数情况是你自己的原因）包括对照应该适合所有的反应。如果怀疑试剂有问题不要犹豫，给厂家或供应商打电话说明情况。他们会提供一些建议测试试剂的功能，如果试剂有问题会马上寄新的试剂。
每一个结果都要做好标记。每一个样品要经过很多处理才能得到最终的结果，即使是中间产物也必须标记清楚。
实验在往前进行时及时清理用过的样品管。在冰箱和冷冻机中的离心管试架很快就会塞满，这样容易把结果弄乱。在取得满意的下一步研究结果之前只保留一管样品。
DNA
由于DNA 携带和转移大部分遗传信息，所以DNA 十分稳定。但是制备不能太随便。主要的问题是样品污染或被带有其他DNA 的试剂污染。
用紫外分光光度计测定核苷酸的浓度和纯度
限制性内切酶
一个实验室或一个部门或多个部门通常共用限制性内切酶。一些酶比较昂贵不太经常使用，一个研究者不可能负担得起买这样多的酶。由一个人负责，其他人可以通过签单来使用。
当你到保存酶的-20℃冰箱取酶时，应该有冰盒、记号笔、加样枪、灭菌枪头和一个垃圾盒（如果附近没有冰箱）。不要把含有DNA 的管子放到保存酶的冰箱中。 一次只取一个酶，把它放在冰盒上，把冰箱门立刻关上。不要站在冰箱门那里，也不要在冰箱附近加样。
只取你需要的酶。防止污染。
把用过的酶放回冰箱。
在使用记录上登记并注明你使用的酶和酶量。
取另一个需要的酶。 给负责人讲已经使用完和将要使用完的酶，不要只在
记录本上记录。
PCR 的基本规则：
制备样品时要远离PCR仪。大部分实验室都以单独制备样品的区域，物理上与PCR仪分
开，与PCR产物的处理区域分开。无论怎样应该有一个样品制备区域，永远不要在PCR 仪附近或者在样品的下游处理区制备样品，建立样品制备的严格操作规程。
PCR要有专用的加样枪和其他物品。专用的加样枪可以阻止气溶胶的产生，减少样品转移
的机会。带有滤器的加样枪头也可以阻止样品的转移。
最后将DNA加入到反应管中。
RNA
RNA 降解是一个严重的问题，很多年以来人们一直在避免RNA的降解给RNA的研究带来的麻烦。但是有一些规则与无菌技术相同，可以保证工作的顺利进行。
基本规则：
高压灭菌所有的与RNA接触的塑料和玻璃器皿。
DEPC（嶣碳酸二乙酯）处理的水用来制备的缓冲液。加入DEPC到终浓度0.1%，在室温
过夜，高压灭菌15min。不要用DEPC配制Tris缓冲液，因为DEPC会分解成乙醇和二氧化碳。
避免使用碱性缓冲液，因为RNA中的羟基使RNA分子对碱性非常敏感。
RNA缓冲液要与其它缓冲液分开，所以它们不会被错用或被RNase污染。
蛋白质
降解在蛋白质研究中无处不在。
基本规则：
冰、冰、冰。在进行蛋白质的研究时手边一直要有一个冰盒，当从冰箱、离心机等中取出
离心管时立刻把它放在冰上。
低温离心。因为离心会使离心管温度升高。
要了解你所研究的蛋白质的特性。每个蛋白质的性质有很大差异。通过加热是否会变性？
是否含有二硫键？能否被反复冻融？如果你不了解，不要反复冻融以免蛋白质热变性。
细胞裂解后，在所有的缓冲液中加入合适的蛋白酶抑制剂。
蛋白质的分离
通过细菌或者杆状病毒表达系统可以很容易得到大量的蛋白质，但是分离你所需要的蛋白质却不是一件容易的事。尽管有一些方法可以纯化结合某种物质的融合蛋白质，但是被纯化的蛋白质的特性也会使所使用的纯化系统不同。在大量表达之前，要确保你能有效分离所需要的
蛋白质。
有许多分离蛋白质的窍门。尽管DNA甚至RNA都能根据手册操作规程进行分离，但是蛋白质的分离更加复杂。每一个蛋白质都有自己的结构和特征。向在蛋白质实验室的工作人员寻求帮助。
细胞裂解
分离蛋白质时，含有蛋白质的细菌或细胞首先必须裂解。
物理裂解。细胞裂解可以用物理的方法。用各种破碎仪器。
去垢剂。去垢剂可以裂解许多真核细胞。去垢剂的选择取决于所要裂解的细胞。仔细检查得到的去垢剂的来源，因为去垢剂的质量和纯度对成功裂解蛋白质有重要的作用。
蛋白酶抑制剂。当细胞裂解内容物释放时，蛋白酶和其他有降解活性的酶就会释放出来。
分子生物学技术信息 关于筹建一个分子生物学实验室所需的仪器 一、上游分子克隆 分子克隆技术是分子生物学的核心技术，这项技术的主要目的是获得某一基因或DNA片段的大量拷贝，从而可以深入分析基因结构与功能，并可达到人为改造细胞及物种个体的遗传性状的目的。 1. 分子克隆的基本技术路线： 1) 分离制备目的基因或DNA片段； 2) 目的DNA与载体在体外进行连接； 3) 重组DNA分子转入宿主细胞； 4) 筛选及鉴定阳性重组体； 5) 重组体的扩增。 2. 分子克隆常用仪器：
二、核酸分子杂交 核酸分子杂交技术是分子生物学领域中最常用的技术之一。其基本原理是具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下可按碱基互补原则形成双链。由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的高度灵敏性，使其在分子生物学领域中被广泛应用于分子克隆的筛选，基因组中特定基因序列的定量定性检测，基因表达和基因突变分析及疾病的基因诊断等。根据核酸种类分为Southern印迹法和Northern印迹法。 核酸分子杂交中常用的仪器： 三、下游蛋白的表达及分离纯化 目的基因能否发挥其效应,只能通过其表达有功能的蛋白质来实现,因此蛋白质的表达及分析方法成为分子生物学中必不可少的组成部分。 1. 蛋白的表达 大肠杆菌是自然界中最为人知的生物体之一。由于其具有操作简易，产量高和成本低廉等优点，使其成为蛋白质表达的首选宿主。缺点是：表达缺乏翻译后加工，得到的蛋白可能缺乏某些天然蛋白所具有的活性。 酵母作为单细胞低等真核生物，具有易培养，繁殖快，便于基因操作等优点，渐渐被开发作为目的基因的表达系统。其中甲基酵母作为外源基因的表达
实验一分子生物学实验室常用仪器设备简介 实验室主要仪器，设备的简介及使用方法 微量移液器 微量移液器是连续可调的、计量和转移液体的专用仪器，其装有直接读数容量计。 微量移液器有多种规格，在移液器量程范围内能连续调节读数。移液器常见的四种规格分 别是： 0.5～10μl(读数窗显示0.5～10.0,每转1档为0.1μl); 10～100μl(读数窗显示10.0～100, 每转1档为1μl); 20～200μl(读数窗显示20～200, 每转1档1μl); 100～1000μl(读数窗显示100～1000, 每转1档为5μl). 量液的操作步骤： 1．将微量移液器装上吸头（不同规格的移液器用不同的吸头） 2．将微量移液器按钮轻轻压至第一停点； 3．垂直握持微量移液器，使吸嘴浸入液样面下几毫米，千万不要将吸嘴直接插到液体底部；4．缓慢、平稳地松开控制按钮，吸上样液。否则液体进入吸嘴太快，导致液体倒吸入移液 器内部，或吸入体积减少； 5．等一秒钟后将吸嘴提离液面 6．平稳地把按钮压到第一停点，再把按钮压至第二停点以排出剩余液体； 7．提起微量移液器，然后按吸嘴弹射器除去吸嘴。 量液操作注意问题： 1．未装吸嘴的微量移液器绝对不可用来吸取任何液体。 2．一定要在允许量程范围内设定容量，千万不要将读数的调节超出其适用的刻度范围，否则会造成损坏。 3．不要横放带有残余液体吸嘴的移液器。 4．不要用大量程的移液器移取小体积样品。 5. 移液器使用完后，将刻度调到最大刻度，收藏。 低温台式高速离心机 离心机的分类 低速：每分钟几千转 高速：每分钟 1 ~ 3万转 超速：每分钟3万转以上 离心机的功能：分离，纯化 低速：细胞等大分子 高速：DNA，蛋白等 超速: 病毒，蛋白等，根据用途又可分为分析超速离心机和制备超速离心机。 低温分离技术是分子生物学研究中必不可少的手段 基因片段的分离、酶蛋白的沉淀和回收以及其它生物样品的分离制备实验中都离不开低温离 心技术 本实验室所用离心机为台式高速离心机（IBM），配有角式转头：24×1.5ml；极限转速20000rpm 台式高速离心机使用步骤 1、把离心机放置于平面桌或平面台上，目测使之平衡，用手轻摇一下离心机，检查离心机 是否放置平衡。
实验指导 目录 实验一分子生物学实验室常用仪器及使用方法实验二质粒DNA的提取－碱裂解法 实验三琼脂糖凝胶电泳 实验四限制性内切核酸酶的酶切与鉴定 实验五大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 实验六动物组织细胞基因组 DNA提取 实验七 DNA的定量 实验八 PCR基因扩增 实验九琼脂糖凝胶电泳分离与纯化目的DNA 实验十 DNA重组 实验十一动物组织细胞总RNA的提取 实验一分子生物学实验室常用仪器及使用
事实证明，在科学飞速发展的今天，无论从事哪个领域的研究，要想突破，除了有良好的理论基础外，更重要的是依赖于先进的技术和优良的仪器设备以及良好的研究环境。一个标准的分子生物学实验室除了具有一般生物学实验室的常规仪器设备外，还具有一些特殊用途的仪器，这些仪器一般较精密，价格昂贵。下面介绍这些仪器的使用方法和注意事项。 一、冷冻离心机 低温分离技术是分子生物学研究中必不可少的手段。基因片段的分离、酶蛋白的沉淀和回收以及其它生物样品的分离制备实验中都离不开低温离心技术，因此低温冷冻离心机成为分子生物学研究中必备的重要仪器。在国内，有多个厂家生产冷冻离心机，本实验室的高速冷冻离心机为GL-20G-Ⅱ型（上海安亭），落地式。配有角式转头：6×50ml、12×10ml和12×1.5ml。极限转速20000rpm。 1. 安装与调试 离心机应放置在水平坚固的地面上，应至少距离10cm以上且具有良好的通风环境中，周围空气应呈中性，且无导电性灰尘、易燃气体和腐蚀性气体，环境温度应在0～30℃之间，相对湿度小于80%。试转前应先打开盖门，用手盘动转轴，轻巧灵活，无异常现象方可上所用的转头。转子准确到位后打开电源开关，然后用手按住门开关，再按运转键，转动后立即停止，并观察转轴的转向，若逆时针旋转即为正确，机器可投入使用。 2. 操作程序 （1）插上电源，待机指示灯亮；打开电源开关，调速与定时系统的数码管显示的闪烁数字为机器工作转速的出厂设定，温控系统的数码管显示此时离心腔的温度。 （2）设定机器的工作参数，如工作温度，运转时间，工作转速等。 （3）将预先平衡好的样品放置于转头样品架上，关闭机盖。 （4）按控制面板的运转键，离心机开始运转。在预先设定的加速时间内，其运速升至预先设定的值。 （5）在预先设定的运转时间内（不包括减速时间），离心机开始减速，其转速在预先设定的减速时间内降至零。 （6）按控制面板上的停止键，数码管显示dedT，数秒钟后即显示闪烁的转速值，这时机器已准备好下一次工作。 3. 注意事项 （1）离心机应始终处于水平位置，外接电源系统的电压要匹配，并要求有良好的接地线，机器不使用，要拔掉电源插头。
分子生物学实验室需要的仪器配置 令狐采学 (1)培养箱在分子生物学试验中，有很多反应都是在特定温度下进行的，这时就需要一个控温的装置。例如：用于细菌的平板培养，我们通常设定为37℃于培养箱倒置培养；其他分子生物学实验如酶切等需要25℃，30℃，37℃等条件。 (2)冰箱冰箱是实验室保存试剂和样品必不可少的仪器。分子生物学实验中用到的试剂有些要求是4度保存，有些要求是负20度保存，实验人员一定要看清试剂的保存条件，放置在恰当的温度下保存。具体来说，不同温度下保存的物品如下： a. 4℃适合储存某些溶液、试剂、药品等。 b.-20℃适用于某些试剂、药品、酶、血清、配好的抗生素和DNA、蛋白质样品等。 c.-80℃适合某些长期低温保存的样品、大肠杆菌菌种、纯化的样品、特殊的低温处理消化液，感受态等的保存。 d.0-10℃的层析冷柜适合低温条件下的电泳、层析、透析等实验。 (3)摇床摇床是实验室常用仪器，一般有常温型和低温型两种。对于分子生物学实验室，如果能配置低温型摇床，就可以适应
不同的实验需求。例如：用于大肠杆菌，酵母菌等生物工程菌种的振荡培养及蛋白的诱导表达，培养通常为28度和37度，诱导表达需要20-37度；在感受态的制备过程中，需要有18度的温度控制；用于蛋白凝胶的染色脱色时振荡，常温使用；用于大肠杆菌常规转化时振荡复苏，常为37度。对于控制温度低于室温时，我们需要低温型摇床来控温。 (4)水浴锅水浴锅也是一种控温装置，水浴控温对于样品来说比较快速且接触充分。例如，用于42度的大肠杆菌转化时的热激反应；用于DNA杂交过程中水浴控温。 (5)烘箱烘箱是用于灭菌和洗涤后的物品烘干。烘箱有不同的控温范围，用户可以根据实验需求进行选择。例如，有些塑料用具只能在42-45℃的烤箱中进行烘干；用于RNA方面的实验用具，需要在250℃烤箱中烘干。 (6)纯水装置纯水装置包括蒸馏水器和纯水机。蒸馏水器的价格便宜，但在造水过程中需要有人值守；纯水机价格高些，但是使用方便，可以储存一定量的纯水。纯水使用也有不同的级别，一般实验用水需要纯水，用于PCR、DNA测序、酶反应均需要超纯水。 (7)灭菌锅分子生物学所用到的大部分实验用具都应严格消毒灭菌。包括实验物品、试剂、培养基等。灭菌锅也有不同大小型号，有些是手动的，有些是全自动的。用户需要根据自己的
分子生物学实验室需要的仪器配置 (1)培养箱在分子生物学试验中，有很多反应都是在特定温度下进行的，这时就需要一个控温的装置。例如：用于细菌的平板培养，我们通常设定为37℃于培养箱倒置培养；其他分子生物学实验如酶切等需要25℃，30℃，37℃等条件。 (2)冰箱冰箱是实验室保存试剂和样品必不可少的仪器。分子生物学实验中用到的试剂有些要求是4度保存，有些要求是负20度保存，实验人员一定要看清试剂的保存条件，放置在恰当的温度下保存。具体来说，不同温度下保存的物品如下： a. 4℃适合储存某些溶液、试剂、药品等。 b.-20℃适用于某些试剂、药品、酶、血清、配好的抗生素和DNA、蛋白质样品等。 c.-80℃适合某些长期低温保存的样品、大肠杆菌菌种、纯化的样品、特殊的低温处理消化液，感受态等的保存。 d.0-10℃的层析冷柜适合低温条件下的电泳、层析、透析等实验。 (3)摇床摇床是实验室常用仪器，一般有常温型和低温型两种。对于分子生物学实验室，如果能配置低温型摇床，就可以适应不同的实验需求。例如：用于大肠杆菌，酵母菌等生物工程菌种的振荡培养及蛋白的诱导表达，培养通常为28度和37度，诱导表达需要20-37度；在感受态的制备过程中，需要有18度的温度控制；用于蛋白凝胶的染色脱色时振荡，常温使用；用于大肠杆菌常规转化时振荡复苏，常为37度。对于控制温度低于室温时，我们需要低温型摇床来控温。 (4)水浴锅水浴锅也是一种控温装置，水浴控温对于样品来说比较快速且接触充分。例如，用于42度的大肠杆菌转化时的热激反应；用于DNA杂交过程中水浴控温。 (5)烘箱烘箱是用于灭菌和洗涤后的物品烘干。烘箱有不同的控温范围，用户可以根据实验需求进行选择。例如，有些塑料用具只能在42-45℃的烤箱中进行烘干；用于RNA方面的实验用具，需要在250℃烤箱中烘干。 (6)纯水装置纯水装置包括蒸馏水器和纯水机。蒸馏水器的价格便宜，但在造水过程中需要有人值守；纯水机价格高些，但是使用方便，可以储存一定量的纯水。纯水使用也有不同的级别，一般实验用水需要纯水，用于PCR、DNA测序、酶反应均需要超纯水。 (7)灭菌锅分子生物学所用到的大部分实验用具都应严格消毒灭菌。包括实验物品、试剂、培养基等。灭菌锅也有不同大小型号，有些是手动的，有些是全自动的。用户需要根据自己的需要选购。 (8)天平天平用于精确称量各类试剂。实验室常用的是电子天平，电子天平按照精度不同有不同的级别。
分子生物学实验室有毒常用药品 1.溴化乙锭（：具有强诱变致癌性，使用时一定要戴一次性手套，注意操作规范，不要随便触摸别的物品。 2（焦碳酸二乙酯：闻起来香香甜甜的，可是害人不眨眼！一种强有力的蛋白质变性剂，而且怀疑是致癌剂.开瓶时将瓶子远离你，内压可导致溅泼.操作时戴合适的手套，穿工作服，并在化学通风橱里进行. 3（苯甲基磺酰氟：老板说是神经毒!!!是一种高强度毒性的胆碱酯酶抑制剂.它对呼吸道黏膜，眼睛和皮肤有非常大的破坏性.可因吸入，咽下或皮肤吸收而致命.戴合适的手套和安全眼镜，始终在化学通风橱里使用.在接触到的情况下，要立即用大量的水冲洗眼镜或皮肤，已污染的工作服丢弃掉. 4. 乙腈，易挥发易燃，是一种刺激物和化学窒息剂，通风橱中远离热、火。 5. 放线菌素D ,是一种致畸剂和致癌剂，通风橱中操作。 6鹅膏蕈毒环肽，具有强毒性,可能致命。 7亚甲双丙烯酰胺,有毒，影响中枢神经系统，切勿吸入粉末。 8. 甲醇,有毒,能引起失明。 9. 乙酸（浓的：可能因为吸入或皮肤吸收而受到伤害，要戴手套和护目镜，最好在化学通风橱中操作。 10. 过硫酸酸铵:对粘膜和上呼吸道、眼睛和皮肤又较大危害性，吸入可致命。操作时戴手套、护目镜。始终在通风橱中操作。
11. 氯化铯:可因吸入、咽下或皮肤吸收而危害健康。操作时戴手套和护目镜。 12:很强的还原剂，散发难闻的气味。可因吸入、咽下或皮肤吸收而危害健康。当使用固体或高浓度储存液时，戴手套和护目镜,在通风橱中操作。13.甲醛:毒性较大且易挥发，也是一种致癌剂，易通过皮肤吸收，对眼睛、粘膜和上呼吸道有刺激和损伤作用。避免一如其挥发的气雾。戴手套和护目镜。始终在通风橱中操作。远离热、火花及 明火。 14 ,对眼睛有刺激性，腐蚀皮肤。有一次不小心溅出一小滴在脸上，马上就红了，过一会儿感觉到疼，一周之后才好。如果溅上，马上用大量的水冲洗。 大家在实验室里，接触到的化学试剂多半都有危害性，紫外灯，如果离心机不是很好的话的噪声污染，会导致手指需要震动，等等,所以每个人都应该注意保护自己，而不能因为图省事或者别的什么原因而放松对安全的注意。 另外就是注意规范操作，搞微生物的尤其要注意，不要实验室感染。 15. 叠氮钠,有毒,阻断细胞色素电子运送系统 16. 氟化钠,有毒可致命,通风橱中操作 17. 放射性物质（同位素标记时，要戴手套,护目镜,穿工作服,最好买试剂盒（如果有商品化的 18巯基乙醇，可致命,对呼吸道、皮肤和眼睛有伤害 19. 氨甲蝶呤,致癌和致畸
分子生物学实验室的构建方案 分子生物学作为基因工程的上游技术，其实验的成果和准确性将决定下游所有的步骤和最终的实验结果。所以构建一个完备的分子生物学实验室是非常重要的，以下就让我们来看看构建一个分子生物学实验室需要哪些仪器。 1. 冰箱: 根据药品、试剂及多种生物制剂保存的需要，必须具备不同控温级别的冰箱，最常使用的有：4℃、-20℃、-80℃冰箱。4℃适合储存某些溶液、试剂、药品等。-20℃适用于某些试剂、药品、酶、血清、配好的抗生素和DNA、蛋白质样品等。-80℃适合某些长期低温保存的样品、大肠杆菌菌种、纯化的样品、特殊的低温处理消化液等的保存。0-10℃的层析冷柜适合低温条件下的电泳、层析、透析等实验。 2. 培养箱：37℃恒温箱用于细菌的平板培养及分子生物学实验。 3. 恒温培养摇床：用于大肠杆菌等生物工程菌种的扩增。 4. 水浴锅：用于保温并进行各类实验。 25-100℃水浴摇床可用于分子杂交试验，各种生物化学酶反应等试验的保温。
含低温的水浴槽可以用于分子生物学的质粒与基因片段的连接等实验及用于42度的大肠杆菌感受态的热激。 5. 烘箱：主用于烘干实验器皿，有些需要温度高些，有些需要温度低些。用于RNA方面的实验用具，需要在250℃烤箱中烘干，有些塑料用具只能在42-45℃的烤箱中进行烘干。 6. 超纯水机：随着分子生物学的飞速发展，许多实验对水纯度的要求越来越高，用自来水、蒸馏水、离子交换水、反渗透纯水做为供水，磁铁耦合齿轮泵作用使水循环。用于PCR、PCR氨基酸分析、DNA测序、酶反应、组织和细胞培养等。 7. 蒸汽消毒锅：分子生物学所用大部分试剂，而且实验用具都应严格消毒灭菌。用于小批量物品的随时消毒。大批实验物品、试剂、培养基可使用大型消毒且定时进行消毒。 8. 滤器滤膜：不耐高温、高压的试剂用其处菌。 9.各种天平：台秤、精密电子分析天平，用于精确称量各类试剂。 10.液体体积的度量：量筒、移液管、微量取液器、刻度试管、烧杯、锥形瓶等。
常用分子生物学软件 一、基因芯片： 1、基因芯片综合分析软件。 ArrayVision 7.0 一种功能强大的商业版基因芯片分析软件，不仅可以进行图像分析，还可以进行数据处理，方便protocol的管理功能强大，商业版正式版：6900美元。 Arraypro 4.0 Media Cybernetics公司的产品，该公司的gelpro, imagepro一直以精确成为同类产品中的佼佼者，相信arraypro也不会差。 phoretix?Array Nonlinear Dynamics公司的基因片综合分析软件。 J-express 挪威Bergen大学编写，是一个用JAVA语言写的应用程序，界面清晰漂亮，用来分析微矩阵（microarray）实验获得的基因表达数据，需要下载安装JAVA运行环境JRE1.2后(5.1M)后，才能运行。 2、基因芯片阅读图像分析软件 ScanAlyze 2.44 ，斯坦福的基因芯片基因芯片阅读软件，进行微矩阵荧光图像分析，包括半自动定义格栅与像素点分析。输出为分隔的文本格式，可很容易地转化为任何数据库。 3、基因芯片数据分析软件 Cluster 斯坦福的对大量微矩阵数据组进行各种簇（Cluster)分析与其它各种处理的软件。 SAM Significance Analysis of Microarrays 的缩写，微矩阵显著性分析软件，EXCEL软件的插件，由Stanford大学编制。 4．基因芯片聚类图形显示 TreeView 1.5 斯坦福开发的用来显示Cluster软件分析的图形化结果。现已和Cluster成为了基因芯片处理的标准软件。 FreeView 是基于JAVA语言的系统树生成软件，接收Cluster生成的数据，比Treeview增强了某些功能。 5．基因芯片引物设计 Array Designer 2.00 DNA微矩阵（microarray）软件，批量设计DNA和寡核苷酸引物工具 二、RNA二级结构。 RNA Structure 3.5 RNA Sturcture 根据最小自由能原理，将Zuker的根据RNA一级序列预测RNA二级结构的算法在软件上实现。预测所用的热力学数据是最近由T urner实验室获得。提供了一些模块以扩展Zuker算法的能力，使之为一个界面友好的RNA折叠程序。允许你同时打开多个数据处理窗口。主窗口的工具条提供一些基本功能：打开文件、导入文件、关闭文件、设置程序参数、重排窗口、以及即时帮助和退出程序。RNAdraw中一个非常非常重要的特征是鼠
分子生物学实验室的器材配置 分子生物学作为基因工程的上游技术，其实验的成果和准确性将决定下游所有的步骤和最终的实验结果。所以构建一个完备的分子生物学实验室是非常重要的，以下就让我们来看看构建一个分子生物学实验室需要哪些仪器？ 1. 冰箱：根据药品、试剂及多种生物制剂保存的需要，必须具备不同控温级别的冰箱。 最常使用的有：4℃、-20℃、-80℃冰箱。4℃适合储存某些溶液、试剂、药品等。-20℃适用于某些试剂、药品、酶、血清、配好的抗生素和DNA、蛋白质样品等。-80℃适合某些长期低温保存的样品、大肠杆菌菌种、纯化的样品、特殊的低温处理消化液等的保存。0-10℃的层析冷柜适合低温条件下的电泳、层析、透析等实验。 2. 培养箱：37℃恒温箱用于细菌的平板培养及分子生物学实验。 3. 恒温培养摇床：用于大肠杆菌等生物工程菌种的扩增。 4. 水浴锅：用于保温并进行各类实验。 25-100℃水浴摇床可用于分子杂交试验，各种生物化学酶反应等试验的保温。 含低温的水浴槽可以用于分子生物学的质粒与基因片段的连接等实验及用于42度的大肠杆菌感受态的热激。 5. 烘箱：主用于烘干实验器皿，有些需要温度高些，有些需要温度低些。用于RNA方面的实验用具，需要在250℃烤箱中烘干，有些塑料用具只能在42-45℃的烤箱中进行烘干。 6. 超纯水机：随着分子生物学的飞速发展，许多实验对水纯度的要求越来越高，用自来水、蒸馏水、离子交换水、反渗透纯水做为供水，磁铁耦合齿轮泵作用使水循环。用于PCR、PCR氨基酸分析、DNA测序、酶反应、组织和细胞培养等。 7. 蒸汽消毒锅：分子生物学所用大部分试剂，而且实验用具都应严格消毒灭菌。用于小批量物品的随时消毒。大批实验物品、试剂、培养基可使用大型消毒且定时进行消毒。 8. 滤器滤膜：不耐高温、高压的试剂用其处菌。 9.各种天平：台秤、精密电子分析天平，用于精确称量各类试剂。 10.液体体积的度量：量筒、移液管、微量取液器、刻度试管、烧杯、锥形瓶等。 11.pH计：测定溶液中H+的直接电位的仪器，主要通过一对电极，在不同的pH溶液中产生不同的电动势用pH 值表示出来；pH试纸：只适用于培养液、酚饱和液、缓冲液或其它试剂溶液的pH值的粗略估计。而大部分试剂的配制要求严格的pH值，需精确度高（小数点后两位）的pH计。 12. 分光光度计：光密度、分光光度计是利用物质在可见光和紫外线区域中的吸收光谱来鉴定该物质的性质及其含量的一种仪器。它是由光源、单色器、吸收池、接收器、测量仪表或显示屏幕所组成。OD值是许多溶液中溶质定量的方便指标之一，通过所产生的单色光而测定某一溶液对该单色光的吸收值，利用它可进行核酸溶液定量和纯度的初步判断。OD值也可以作为菌浓的检测指标。 13. 高速离心机：最大转速25000 r/m ，最大离心力89000g。有冷冻和常温两种，多用于制备和手收集微生物、
分子生物学实验室常用有毒物质 1.DMSO： DMSO是二甲基亚砜， DMSO存在严重的毒性作用，与蛋白质疏水集团发生作用，导致蛋白质变性,具有血管毒性和肝肾毒性。DMSO是毒性比较强的东西，用的时候要避免其挥发，要准备1%-5%的氨水备用，皮肤沾上之后要用大量的水洗以及稀氨水洗涤. 最为常见的为恶心、呕吐、皮疹及在皮肤、和呼出的气体中发出大蒜、洋葱、牡蛎味。 吸入：高挥发浓度可能导致头痛，晕眩和镇静。 皮肤：能够灼伤皮肤并使皮肤有刺痛感，如同所见的皮疹及水泡一样。若二甲基亚砜与含水的皮肤接触会产生热反应。 2.EB：EB（Ethidium bromide，溴化乙锭） 溴化乙锭是一种高度灵敏的荧光染色剂，用于观察琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中的DNA。溴化乙锭溶液的净化处理：由于溴化乙锭具有一定的毒性，实验结束后，应对含EB的溶液进行净化处理再行弃置，以避免污染环境和危害人体健康。 （1）对于EB含量大于0.5mg/ml的溶液，可如下处理： ①将EB溶液用水稀释至浓度低于0.5mg/ml； ②加入一倍体积的0.5mol/L KMnO4，混匀，再加入等量的25mol/L HCl，混匀，置室温数小时； ③加入一倍体积的2.5mol/L NaOH，混匀并废弃。 （2）EB含量小于0.5mg/ml的溶液可如下处理： ① 按1mg/ml的量加入活性炭，不时轻摇混匀，室温放置1小时； ② 用滤纸过滤并将活性碳与滤纸密封后丢弃。 3.DEPC： DEPC即二乙基焦碳酸酯（diethylprocarbonate），可灭活各种蛋白质，是RNA酶的强抑制剂。DEPC是一种潜在的致癌物质，在操作中应尽量在通风的条件下进行，并避免接触皮肤。DEPC毒性并不是很强，但吸入的毒性是最强的，使用时戴口罩。不小心占到手上注意立即冲洗，RNaseAwayTM试剂可以替代DEPC，操作简单，价格低，且无毒性。只需将RNaseAwayTM直接倒在玻璃器皿和塑料器皿的表面，浸泡后用水冲洗去除，即可以快速去除器皿表面的RNase，并且不会残留而干扰后继实验。 4.丙烯酰胺： 属中等毒性物质。可通过皮肤吸收及呼吸道进入人体，因此，在搬运和使用中必须穿戴好防护用具，如防毒服，防毒口罩及防毒手套等。丙烯酰胺的危害主要是引起神经毒性，同时还有生殖、发育毒性。神经毒性作用表现为周围神经退行性变化和脑中涉及学习、记忆和其他认知功能部位的退行性变化，试验还显示丙烯酰胺是一种可能致癌物，职业接触人群的流行病学观察表明，长期低剂量接触丙烯酰胺会出现嗜睡、情绪和记忆改变、幻觉和震颤等症状，伴随末梢神经病如手套样感觉、出汗和肌肉无力。 累积毒性，不容易排毒。 具备以下任何一项者，可列为慢性丙烯酰胺中毒观察对象： a.接触丙烯酰胺的局部皮肤出现多汗、湿冷、脱皮、红斑； b.出现肢端麻木、刺痛、下肢乏力、嗜睡等症状； c.神经-肌电图显示有可疑神经源性损害。 治疗原则：
常用抗生素： 备注： （摘自《分子xx》第三版附录2） ①以水为溶剂的抗生素贮存液应使用 0.22μm滤器过滤除菌；②用乙醇溶解的抗生素溶液无须过滤除菌； ③所有抗生素贮液都应放于不透光的容器中保存。 氨苄青霉素（ampicillin）（100mg/ml） 溶解1g氨苄青霉素钠盐于足量的水(最好是高压后的灭菌水)中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以25ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 羧苄青霉素（carbenicillin）（50mg/ml） 溶解 0.5g羧苄青霉素二钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。 分装成小份于-20℃贮存。常以25ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 甲氧西林（methicillin）（100mg/ml） 溶解1g甲氧西林钠于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以 37.5ug/ml终浓度与100ug/ml氨苄青霉素一起添加于生长培养基。 卡那霉素（kanamycin）（10mg/ml） 溶解100mg卡那霉素于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。
氯霉素（chloramphenicol）（25mg/ml）溶解250mg氯霉素足量的无水乙醇中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以 12.5ug/ml～25ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 链霉素（streptomycin）（50mg/ml） 溶解 0.5g链霉素硫酸盐于足量的无水乙醇中，最后定容至10ml。 分装成小份于-20℃贮存。常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 萘啶酮酸（nalidixic acid）（5mg/ml） 溶解50mg萘啶酮酸钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以15ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 四环素（tetracyyline）（10mg/ml） 溶解100mg四环素盐酸盐于足量的水中，或者将无碱的四环素溶于无水乙醇，定容至10ml。分装成小份用铝箔包裹装液管以免溶液见光，于-20℃贮存。常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。
分子生物学实验室有相应的要求: 我提供一份关于建立实验室大标准: 临床基因扩增检验实验室基本设置标准 根据《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》，制定本标准。 一、临床基因扩增检验实验室区域设置原则 (一) 临床基因扩增检验实验室原则上分为四个分隔开的工作区域： 1、试剂贮存和准备区 2、标本制备区 3、扩增反应混合物配制和扩增区 4、扩增产物分析区 如使用全自动分析仪,区域可适当合并。 (二）各工作区域必须有明确的标记，避免不同工作区域内的设备、物品混用。 (三)进入各工作区域必须严格按照单一方向进行,即试剂贮存和准备区→标本制备区→扩增反应混合物配制和扩增区→扩增产物分析区。 (四)不同的工作区域使用不同的工作服(例如不同的颜色)。工作人员离开各工作区域时,不得将工作服带出。 二、工作区域仪器设备配置标准 (一)试剂贮存和准备区 1、2～8℃和-15℃冰箱 2、混匀器 3、微量加样器(覆盖l～1000ul) 4、移动紫外灯(近工作台面) 5、消耗品:一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头(带滤心) 6、专用工作服和工作鞋 7、专用办公用品 (二)标本制备区 1、2～8℃冰箱、-20℃或-80℃冰箱 2、高速台式冷冻离心机 3、混匀器 4、水浴箱或加热模块 5、微量加样器(覆盖1～1000ul) 6、可移动紫外灯(近工作台面) 7、超净工作台 8、消耗品:一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头(带滤心) 9、专用工作服和工作鞋 10、专用办公用品如需处理大分子DNA,应备有超声波水浴仪。 （三）扩增反应混合物配制和扩增区 1、核酸扩增仪 2、微量加样器(覆盖1～1000ul) 3、可移动紫外灯(近工作台面) 4、消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头(带滤心) 5、专用工作服和工作鞋 6、专用办公用品 （四）扩增产物分析区
生物化学与分子生物学实验室简介 生物化学（biochemistry）是研究生物体的化学组成和生命过程中化学变化规律的科学。它主要采用化学以及物理学和免疫学等原理和方法，从分子水平来探讨生命现象的本质，故又称生命的化学。通常将核酸、蛋白质等生物大分子的结构、功能及其表达调控等的研究，称为分子生物学（molecular biology）。生物化学既是重要的医学基础学科，又与其它学科有着广泛的联系与交叉。 一、概况 长沙医学院生物化学与分子生物学实验室成立于2008年6月，隶属长沙医学院基础医学系，生化实验室总面积为1979平方米，布局合理，学生实验直接用房面积为1300平方米，每次学生实验人均使用面积为10.8平方米。学科现有教师21人，其中高级职称3人（教授1人、副教授2人）。学历结构合理，博士2人，硕士研究生11人。学科负责人朱传炳教授。 学科设有生物化学实验室、分子生物学实验室、生物化学与分子生物学科学研究室、仪器室、生化实验技术研究室等，具备供教师和学生使用的多种仪器设备。 二、教学 生物化学与分子生物学是长沙医学院主干学科之一。生物化学和分子生物学实验室常年承担临床、护理、药学、预防、口腔、针推、中医、影像专业的《生物化学》、《分子生物学》等实验课课程，年平均完成3557学时实验教学任务。
在实验教学中我们不断更新教学内容，规范教学各环节，注重教师的教学质量，加强实验室的建设，培养学生的实践操作能力，使学生的生物化学学习质量一直处于优秀水平。 2007、2008、2009连续三年获长沙医学院先进集体，2010年获得“三育人”先进集体。还有多名教师获得长沙医学院教学优秀奖。 三、科研 实验室辅助教研室教师从事再生障碍性贫血能量代谢障碍的研究、血吸虫疫苗研究、心脏发育相关基因的蛋白质组学研究、肿瘤的单基因功能研究、动脉粥样硬化、原发性膝骨性关节炎的基因多态性、天然产物的提取纯化及其作用等七个方向的研究，目前共承担湖南省科技厅、教育厅等科研项目十余项，科研经费二十余万，发表论文三十余篇，主编参编学术著作、教材6部。获湖南医学科技奖二等奖一项。
实验室分子生物学实验基本操作规范及注意事项 一、酶与载体的分装 酶类与载体：T载体(50 ng/μl)用灭菌水稀释4倍（12.5 ng/μl）后分装成10 μl或20 μl； 连接酶（solutionΙ）按5 μl分装； dNTP（10 mM）分装成50 μl； 无菌水分装成1 ml； 注意：（1）所有分装都必须用已灭菌的管。 （2）所有工具酶和载体的使用过程均在冰浴中进行。 （3）工具酶、载体以及试剂盒等实验室共用物品，用完后必须及时放回原处，以免耽误他人使用。 （4）当你发现你使用的是最后一管（盒）公用物品时，请马上告知负责人购买，以免耽误使用。 （5）感受态，氨苄青霉素和IPTG由研究生轮流负责制备。每人负责六个月。其他试剂则由第一位使用新包装的同学分装。由于分子实验工具酶比较容易失活，必须在冰上进行分装。 二、常见抗生素及IPTG的配置 以氨苄青霉素为例： 1．准备足够量的1.5 ml的EP管、两个100 ml的离心管、0.22 μm水系滤器、注射器、蒸馏水，以上用品均要进行高压灭菌。 2. 洁净工作台紫外灭菌，然后进行以下操作。 3．称取2 g的氨苄青霉素粉末于离心管中，加入灭菌水至总体积为20 ml，轻摇离心管，至氨苄青霉素粉末完全溶解，以免过滤时堵塞滤膜。 4．用注射器吸取配制好的溶液，然后把滤器安在注射器上，缓缓推动注射器活塞，把溶液经滤膜推至100 ml的离心管中。 注意：动作要缓和，使滤出液出口正对着离心管，还要防止染菌。
5．把100 ml离心管中已除菌的氨苄青霉素溶液分装到1.5 ml的EP管中，每管 0.5 ml。在EP管上做好标记，包括名称、浓度、日期等。 6．把做好标记的盛有氨苄青霉素的EP管于-20℃保存。 注意：当你发现你使用的是最后一管抗生素时，请马上告知有关人员及时配制，以免耽误使用。 表1.常见抗生素的储存浓度及工作浓度 名称储存浓度工作浓度 氨苄青霉素（ampicillin）100 mg/ml 50 μg/ml～100 μg/ml 卡那霉素（kanamycin）10 mg/ml 10 μg/ml～50 μg/ml 氯霉素（chloramphenicol）25 mg/ml 12.5 μg/ml～25 μg/ml 链霉素（streptomycin）50 mg/ml 10 μg/ml～50 μg/ml 四环素（tetracyyline）10 mg/ml10 μg/ml～50 μg/ml IPTG 1 M 0.05-0.6 mM
实验一分子生物学实验室常用仪器设备简介 一、实验目的 熟悉分子生物学实验室常用仪器并熟练使用 二、实验原理 1、恒温气浴摇床：用于对温度和振荡频率有较高要求的细菌培养，发酵，杂交，生化反应及酶和组织研究等。 2、超净工作台：用于分子生物学无菌操作。 3、低温台式高速离心机：用于分离纯化DNA和蛋白质等，如基因片段的分离，蛋白酶的沉淀和回收等。 4、微量移液管：是连续可调的，计量和转移液体的专用仪器，其装有直接读数容量计。有多种规格：①0.5-10μL②10-100μL③20-200μL④100-1000μL。 5、电泳仪：用于确定大分子物质的分子量以及鉴定物种亲缘关系的仪器。 6、PCR仪：用于目的基因的扩增，是一对寡糖核苷酸引物结合到正负DNA链上的靶序列两侧，从而酶促合成拷贝数为百万倍的靶序列DNA片段。主要用于基础研究和应用研究等领域。 7、灭菌锅：用于细菌和细胞培养及核酸等有关实验使用的试剂，器皿及实验用具的严格灭菌。 三、实验仪器 恒温气浴摇床、超净工作台、低温台式高速离心机、微量移液管、灭菌锅、PCR仪、电泳仪。 四、实验步骤 （一）、恒温气浴要穿的使用： 1、样品瓶牢固放入弹簧夹中 2、接通电源开关，仪器进入准备状态 3、参数设定，（设定温度、时间、转速等参数） 4、按启动键仪器开始工作，按暂停键可暂停托盘的旋转； 5、按电源键，显示屏显示消失，关闭电源总开关 （二）、超净工作台的使用 1、使用工作台时，先经过清洁液浸泡的纱布擦拭台面，然后用消毒剂擦拭消毒。 2、接通电源，提前30分钟打开紫外灯照射消毒，处理净化工作区内工作台表面积 累的微生物，15分钟后，关闭紫外灯，开启送风机。 3、工作台面上，不要存放不必要的物品，以保持工作区内的洁净气流不受干扰。 4、操作结束后，清理工作台面，收集各废弃物，关闭风机及照明开关，用清洁剂 及消毒剂擦拭消毒。 5、最后开启工作台紫外灯，照射消毒30分钟后，关闭紫外灯，切断电源。（三）、低温台式高速离心机的使用 1、把离心机放置于平面桌或平面台上，目测使之平衡，用手轻摇一下离心机，检 查离心机是否放置平衡。 2、打开门盖，将离心管放入转子内，离心管必须成偶数对称放入，且要事先平衡， 完毕用手轻轻旋转一下转子体，使离心管架运转灵活。 3、关上门盖，注意一定要使门盖锁紧，完毕用手检查门盖是否关紧。
分子生物学实验室所需试剂、耗材清单 1、普通化学试剂，共计约2.89万。 名称单位单价(元）购置数量金额（元）95%乙醇AR 瓶7 20 140 无水乙醇AR 瓶10 20 200 DEPC 瓶150 10 1500 EDTA二钠AR 瓶50 9 450 柠檬酸钠AR 瓶27 9 243 柠檬酸三钠AR 瓶15 9 135 L-精氨酸BR 瓶126 5 630 Tris 瓶220 10 2200 苯酚AR 瓶36 9 324 变色硅胶瓶19 18 342 冰乙酸AR 瓶10 9 90 丙酮AR 瓶18 5 90 二甲苯AR 瓶20 1 20 二乙醇胺cp 瓶38 1 38 甘露醇AR 瓶15 1 15 甘油AR 瓶28 2 56 高碘酸AR 瓶240 2 480 甲醇AR 瓶8.4 5 42 磷酸氢二钠AR 瓶11 1 11 硫酸AR 瓶14 3 42 硫酸铵AR 瓶10 17 170 硫酸镍AR 瓶102 1 102 氯仿AR 瓶28 10 280 氯化钾AR 瓶20 2 40 氯化镁瓶18 1 18 氯化钠AR 瓶10 10 100 氯金酸AR 瓶196 1 196 莽草酸瓶390 3 1170 明胶CP 瓶35 1 35 钼酸瓶290 1 290 钼酸铵AR 瓶380 1 380 尿素AR 瓶18 5 90 牛肉浸膏BR 瓶90 1 90 硼酸AR 瓶18 10 180 氢氧化钠AR 瓶10 10 100 去离子甲酰胺瓶780 4 3120 三乙醇胺瓶25 1 25 碳酸钙AR 瓶23 1 23
碳酸钠AR 瓶12 1 12 碳酸氢钠AR 瓶16 1 16 无水碳酸钾AR 瓶22 1 22 硝酸瓶10 1 10 硝酸银瓶350 5 1750 销酸钴瓶48 1 48 盐酸AR 瓶14 2 28 乙酸钾AR 瓶45 1 45 乙酸锌AR 瓶36 1 36 蔥酮AR 瓶68 1 68 消毒/双氧水30% AR 瓶11 4 44 Trypan Blue 瓶32 1 32 Tween-20 瓶20 1 20 硝酸钾瓶15 1 15 硫酸铁瓶15 1 15 氢氧化钾瓶15 1 15 甲醛500ml 瓶8 15 120 硼砂瓶12 5 60 乳酸500ml 瓶27 1 27 硝酸钙瓶12 1 12 乙酸钠瓶46 4 184 异丙醇AR 瓶10.45 8 83.6 异戊醇AR 瓶40 8 320 SDS 瓶38 40 1520 合计28890.6 2、分子生物学试剂, 共计约4.5万元。 名称单位单价(元）购置数量金额（元）La高保真酶支250 5 1250 高保真Taq HS 支700 2 1400 高保真Taq HS GC Buffer 支700 2 1400 DnaseI 支431 9 3879 Rnase A 支130 3 390 100bp maker 支250 9 2250 150bp Maker 支250 9 2250 Marker DL500 支80 10 800 Marker DL1000 支80 10 800 Marker r-ecot14 I digest 支500 1 500 去磷酸化酶支300 1 300 X-GLUC 瓶450 1 450
分子生物学实验室内部质量控制制度1 分子生物学实验室内部质量控制制度 1.目的 对分子生物学实验室开展的检测项目进行室内质量控制，是为了监测、控制本实验室测定工作的精密度，并监测其准确度的改变，提高常规测定工作的批间、批内标本检测结果的一致性。连续的评价本室测定工作的可靠程度，判断检验报告是否可发出的过程。规范实验室管理，保证室内质控工作能切实执行。 2.范围 检验中心分子生物学实验室检测项目。 3.职责 3.1组长负责具体项目室内质控程序及失控处理程序的制定、执行及监督指导工作，和质控监督员一起撰写室内质控月总结报告和年度总结报告。 3.2工作人员须掌握室内质控方法，遵守相关制度及操作程序，熟练操作。 4.程序 4.1质控品的选择 质控品是保证质控工作的重要物质基础，必须选择合适的质控品，理想的质控品至少具备以下条件：
（1）人血清基质，分布均匀 （2）添加剂和调制物的数量少，无传染性 （3）瓶间差异小 （4）稳定性好，在规定的条件下至少可以保存1-2年，冻干品复融后稳定，2-8℃保存稳定不少于24小时，-20℃保存不少于20天 （5）在使用定值或不定值质控品时，必须在本实验室的检测系统上确定自己的均值和标准差 4.2质控品的正确使用与保存 （1）严格按质控品说明书操作 （2）冻干质控品的复融要确保所用溶剂的质量 （3）冻干质控品复融时加溶剂的量要准确，并尽量保持每次加入量的一致性 （4）冻干质控品复融时应轻轻摇匀，使内容物完全溶解，切忌剧烈振摇 （5）质控品应严格按使用说明书规定的方法保存，不使用超过保质期的质控品 （6）质控品要在与患者标本相同测定条件下进行测定 4.3质控品分析的个数、浓度水平及频率
(1) 培养箱在分子生物学试验中，有很多反应都是在特定温度下进行的，这时就需要一个控温的装置。例如：用于细菌的平板培养，我们通常设定为37 C于培养箱倒置培养；其他分子生物学实验如酶切等需要25C, 30C, 37C等条件。 (2) 冰箱冰箱是实验室保存试剂和样品必不可少的仪器。分子生物学实验中用到的试剂有些要求是4度保存，有些要求是负20度保存，实验人员一定要看清试剂的保存条件，放置在恰当的温度下保存。具体来说，不同温度下保存的物品如下： a. 4 C适合储存某些溶液、试剂、药品等。 b. -20 C适用于某些试剂、药品、酶、血清、配好的抗生素和DNA 蛋白质样品等。 C.-80 C适合某些长期低温保存的样品、大肠杆菌菌种、纯化的样品、特殊的低温处理消化液，感受态等的保存。 d.0-10 C的层析冷柜适合低温条件下的电泳、层析、透析等实验。 (3) 摇床摇床是实验室常用仪器，一般有常温型和低温型两种。对于分子生物学实验室，如果能配置低温型摇床，就可以适应不同的实验需求。例如：用于大肠杆菌，酵母菌等生物工程菌种的振荡培养及蛋白的诱导表
达，培养通常为28度和37度，诱导表达需要20-37 度；在感受态的制备过程中，需要有18 度的温度控制；用于蛋白凝胶的染色脱色时振荡，常温使用；用于大肠杆菌常规转化时振荡复苏，常为37 度。对于控制温度低于室温时，我们需要低温型摇床来控温。 (4) 水浴锅水浴锅也是一种控温装置，水浴控温对于样品来说比较快速且接触充分。例如，用于42 度的大肠杆菌转化时的热激反应；用于DNA 杂交过程中水浴控温。 (5) 烘箱烘箱是用于灭菌和洗涤后的物品烘干。烘箱有不同的控温范围，用户可以根据实验需求进行选择。例如，有些塑料用具只能在42-45 C的烤箱中进行烘干；用于RNA方面的实验用具，需要在250C 烤箱中烘干。 (6) 纯水装置纯水装置包括蒸馏水器和纯水机。蒸馏水器的价格便宜， 但在造水过程中需要有人值守；纯水机价格高些，但是使用方便，可以储存一定量的纯水。纯水使用也有不同的级别，一般实验用水需要纯水，用于PCR DNA测序、酶反应均需要超纯水。 (7) 灭菌锅分子生物学所用到的大部分实验用具都应严格消毒灭菌。包括实验物品、试剂、培养基等。灭菌锅也有不同大小型号，有些是手动的，有些是全自动的。用户需要根据自己的需要选购。 (8) 天平天平用于精确称量各类试剂。实验室常用的是电子天平，电子天平按照精度不同有不同的级别。