基因克隆载体上的各种常用蛋白标签 蛋白标签(proteintag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。随着技术的不断发展，研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。目前，这些蛋白标签已在基础研究和商业化产品生产等方面得到了广泛的应用。 美国GeneCopoeia(复能基因)为客户提供50多种蛋白标签，可以满足客户的不同需求，包括各种最新型的标签，如：SNAP-Tag?、Halo Tag?、AviTag?、Sumo等;也提供齐全的各种常用标签，如eGFP、His、Flag等等标签。 以下是部分蛋白标签的特性介绍，更加详细的介绍可在查询产品的结果列表里面看到各种推荐的蛋白标签和载体。 TrxHIS His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测;二是构成独特的结构特征(结合配体)利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。使用His-tag有下面优点： 标签的量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD，一般不影响目标蛋白的功能; His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性; His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究; His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。 可应用于多种表达系统，纯化的条件温和; 可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。 Flag标签蛋白 Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽(DYKDDDDK)，同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。FLAG作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点： FLAG作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。 融合FLAG的目的蛋白，可以直接通过FLAG进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高。 FLAG作为标签蛋白，其可以被抗FLAG的抗体识别，这样就方便通过Western Blot、ELISA等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测、鉴定。
3、λ噬菌体载体的优缺点：?优点：包装的λ噬菌体感染大肠杆菌要比 质粒转化细菌的效率高。 ?缺点：λ噬菌体载体的克隆操作要比质粒载体复杂。 ?用途：λ噬菌体载体比质粒载体能插入的DNA长得多，常用于构建cDNA文库或基因组文库。 第一章 分子克隆的工具酶和载体?第八节噬菌体载体 ?一、λ噬菌体 ?（一）λ噬菌体 ?（二）λ噬菌体载体的改造 ?（三）λ噬菌体载体举例 （三）λ噬菌体载体举例?Lambda gt10 ?Lambda gt11 ?EMBL3和EMBL4Lambda gt10 概述： ?Lambda gt10是一种插入载体。 ?在噬菌体阻遏基因cI 内有单一的EcoRⅠ克隆位点。用于插入小的cDNA片段(约6kb)，构建cDNA文库或基因文库。 ?该载体克隆效率很高。 ?在构建cDNA文库时，利用Oligo(dT)或随机引物合成的cDNA经过EcoRⅠadaptors或Linkers修饰后，就可以和λgt10连接起来。?克隆到λgt10的噬菌体，可用核酸探针进行筛选。 Lambda gt10map 宿主： ?建议用C600 and C600hf1作受体菌。 筛选： ?如果有外源DNA插入，cI基因失活，该噬 菌体进入裂解生长途径，在培养皿形成噬 菌斑。反之，若无插入，cI基因表达，噬 菌体进入溶原生长途径，不形成噬菌斑。 ?核酸探针杂交。
Insertional cloning ?Insertional cloning into the cI gene of the lambda -gt10 cDNA cloning vector (DNA inserts of ~1-5 kb) can be selected in hfl (high frequency of lysogeny ) mutant strains of E. coli. In hflA strains of E. coli, expression of the lambda cII gene is elevated, resulting in transcriptional induction of the lambda cI repressor gene which promotes lysogeny . Disruption of the lambda cI coding sequence by DNA insertion into the unique EcoRI site of the lambda gt10 cDNA cloning vector, blocks the lysogenic pathway leading to cell lysis and plaque formation. Lambda gt11 ?λgt 载体系列：是插入型载体。插入了大肠 杆菌β-半乳糖苷酶基因片段，可以表达外源cDNA 而形成β-半乳糖苷酶融合蛋白。?λgt18/19 、λgt20/21和λgt 22/23 是λgt 11的衍生载体。?重组体筛选： ?未重组的噬菌体载体转入lac -宿主后，在X-gal 平板上形成淡蓝色噬斑；而外源DNA 片段插入载体后，重组噬菌体形成无色噬斑，很容易辩别。 ?常常用免疫学方法对噬班或菌落进行筛选。 Lambda gt10 map Lambda gt11 map Lambda gt11 概述： ?Lambda gt11是一个克隆和表达载体。 ?用于小的插入（7.2 kb ）片断构建cDNA 文库或基因文库。 ?在其β-半乳糖苷酶翻译终止位点上游的LacZ 基因内，有单一的EcoR Ⅰ位点。 ?如果外源DNA 的阅读框与lacZ 吻合，即可表达融合蛋白。 ?在构建cDNA 文库时，利用Oligo (dT)或随机引物合成的cDNA 经过EcoR ⅠAdaptors 或Linkers 修饰后，可以和λgt11连接起来。 宿主： ?建议用Y1089(r-) and Y1090(r-)作受体菌。筛选： ?利用特异的抗体进行筛选。 EMBL3和EMBL4 ?EMBL3/4是由λ1059衍生的λ置换型载体。?是常用的基因组克隆载体，克隆的DNA 片 段大小为9-23kb 。 ?多克隆位点分别位于一个14 kb 填充片段的两侧。 ?两载体均在填充片段内含有red 及gam 基因，可由Spi 表现型筛选重组子。 ?除多克隆位点的顺序相反外，EMBL3和EMBL4的其余特征相同。
病原微生物名词解释与解答题 噬菌体的分类:毒性噬菌体温和噬菌体 沙门菌肠热证胃肠炎败血症病 毒复制T：吸附穿入脱壳生物合成装配与释放 乙肝颗粒：大小球形颗粒管型颗粒 梅毒分期硬性下疳全身和皮肤黏膜出现梅毒疹皮肤黏膜溃疡性坏死和内脏器官肉芽肿样变（梅毒骝） 细菌的致病性物质:毒素（外神经毒素细胞毒素肠毒素内） 霍乱弧菌致病因子：霍乱肠毒素鞭毛菌毛及其他毒力因子内毒素 细胞壁保护细菌物质交换决定抗原性与致病性染色性药物敏感性有关 真菌培养基沙保弱(G 蛋白胨） 病毒培养法细胞培养鸡胚接种动物接种 AIDS性接触血源性母婴垂直 IMVIC：I吲哚M甲基红VP C枸橼酸盐 病毒自然条件入侵机体呼吸道消化道皮肤黏膜 病毒抗原变异类型抗原漂移抗原性转变 细菌生繁条件水碳源氮源无机盐生长因子（有些）温度：37℃ pH：7.2～7.6 气体：对O2要求(专性需氧菌、微需氧菌、兼专性厌氧菌）对CO2求： 5~10% CO2 渗透压 革兰染色初染媒染脱色复染将细菌涂片标本固定，初染加结晶紫，约一分钟，水洗。滴加碘液媒染，约一分钟，水洗，形成结晶紫—碘复合物，成深紫色。用95 ％酒精脱色，30 秒钟，用水冲净酒精。用稀释复红复染1 分钟，水洗。镜检干燥后，置油镜观察．革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。 链球菌所致脓疾病：化脓性感染（淋巴管炎淋巴结炎蜂窝组织炎痈等局部皮肤和皮下组织感染）毒素性疾病（猩红热）超敏反应性疾病（风湿病急性肾小球肾炎）
狂犬病：管理传染源（捕杀野犬多犬预防接种对咬过人的猫犬隔离观察7·10发病处死取脑组织检查病毒抗原和內基小体）伤口处理和注射抗体（用3%·5%肥皂水0.1%苯扎溴铵或清水洗再用75%乙醇或碘酒注射高效价抗狂犬病毒血清于伤口周围与底部）预防接种（咬后和接触病毒危险的人及早接种疫苗） 真原核差异：无典型细胞结构核质无核膜核仁仅核糖体DNA RNA 细菌生长曲线分期定义将一定量的细菌接种于合适的培养基和T 过程有规律数目对数纵T横的曲线a迟缓期（最初准备代谢活跃V大储蓄E 中间代谢产物不繁殖1-4h 对数期（最快先短暂的加速期后对数期活细菌快增细菌形态染色性生理活性典型）稳定期（繁殖减慢死活相等活细菌保持稳定典型小改变代谢产物产生）衰退期（更慢死大于活典型大改变生理活动停滞出现衰退形菌体自溶） 内外毒素差异1（来源阳及部分阴分泌于菌体外或菌体自溶阴细胞壁裂解释放）2化学成分（蛋白质脂多糖）3稳定性（不稳定60死160 2-4h死）3抗原性（强产抗毒素经甲醛脱毒成类毒素4毒性作用强选择性毒害较弱引起发热休克DIC） 病毒感染类型隐性感染（无明显症状获得免疫力显性感染感染靶细胞大量增殖造成细胞结构域功能损伤急性感染持续性感染（慢性感染潜伏感染慢病毒感染） 微生物是存在于自然界的一群体形微小、结构简单、肉眼直接看不见，必须借助于光学显微镜或电子显微镜放大数百倍、数千倍，甚至数万倍才能观察到的微小生物 消毒消除和杀灭物体上或环境中的病原微生物及其它有害因子，但不一定能杀死全部非病原微生物的方法 灭菌杀死物体上所有微生物的方法，包括杀死芽胞 无菌操作防治病原微生物进入人体或其他物品上的方法 热原质是细菌合成的一种注入人体或动物体内能引起发热反应的物质，产生它的dad是阴，其细胞壁的脂多糖是热原质 正常菌群正常下人动物体表及呼吸道消化道泌尿生殖道德微生物种类数量稳定与机体平衡 致病菌少数正常菌在条件下致病 病原菌：少数微生物引起人动植物具有致病性
根据GB3469-83《文献类型与文献载体代码》规定，以单字母标识：M——专著（含古籍中的史、志论著） C——论文集 N——报纸文章 J——期刊文章 D——学位论文 R——研究报告 S——标准 P——专利 A——专著、论文集中的析出文献 Z——其他未说明的文献类型 电子文献类型以双字母作为标识： DB——数据库 CP——计算机程序 EB——电子公告 非纸张型载体电子文献，在参考文献标识中同时标明其载体类型：DB/OL——联机网上的数据库 DB/MT——磁带数据库 M/CD——光盘图书
CP/DK——磁盘软件 J/OL——网上期刊 EB/OL——网上电子公告 一、参考文献著录格式 1 、期刊作者．题名〔J〕．刊名，出版年，卷(期)∶起止页码 2、专著作者．书名〔M〕．版本(第一版不著录)．出版地∶出版者，出版年∶起止页码 3、论文集作者．题名〔C〕．编者．论文集名，出版地∶出版者，出版年∶起止页码 4 、学位论文作者．题名〔D〕．保存地点．保存单位．年份 5 、专利文献题名〔P〕．国别．专利文献种类．专利号．出版日期 6、标准编号．标准名称〔S〕 7、报纸作者．题名〔N〕．报纸名．出版日期(版次) 8 、报告作者．题名〔R〕．保存地点．年份 9 、电子文献作者．题名〔电子文献及载体类型标识〕．文献出处，日期 二、文献类型及其标识 1、根据GB3469 规定，各类常用文献标识如下： ①期刊〔J〕 ②专著〔M〕
③论文集〔C〕 ④学位论文〔D〕 ⑤专利〔P〕 ⑥标准〔S〕 ⑦报纸〔N〕 ⑧技术报告〔R〕 2、电子文献载体类型用双字母标识，具体如下： ①磁带〔MT〕 ②磁盘〔DK〕 ③光盘〔CD〕 ④联机网络〔OL〕 3、电子文献载体类型的参考文献类型标识方法为：〔文献类型标识/载体类型标识〕。例如： ①联机网上数据库〔DB/OL〕 ②磁带数据库〔DB/MT〕 ③光盘图书〔M/CD〕 ④磁盘软件〔CP/DK〕 ⑤网上期刊〔J/OL〕 ⑥网上电子公告〔EB/OL〕
第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体 吴乃虎 中国科学院遗传与发育生物学研究所
第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体 一、单链噬菌体的一般生物学 1．单链噬菌体的优越性 2．M13噬菌体的生物学特性 二、M13克隆体系 1．M13克隆体系 2．M13克隆体系-半乳糖苷酶的显色反应原理 3．M13载体系列的发展 4．M13载体系列的优点 三、噬菌体展示载体 1．噬菌体展示载体的构建原理 2．噬菌体展示载体 3．噬菌体表面展示文库 4．应用噬菌体展示载体分离有关蛋白质的实例 四、噬菌粒载体
1．M13噬菌体载体克隆的若干难点2．噬菌粒 3．若干常用的噬菌粒载体4．pBluescript噬菌粒载体5．pUC118和pUC119噬菌粒载体
第八讲单链噬菌体载体 一、单链噬菌体一般生物学 大肠杆菌丝状单链DNA噬菌体有M13噬菌体、f1噬菌体及fd 噬菌体，它们均含有分子量约为6400个核苷酸的单链闭环DNA分子。 1．单链DNA phage的优越性 A．具有双链的复制型DNA(RF DNA)，可如质粒质粒一样进行遗传操作；RF DNA：Replication Form DNA。 B．RF DNA和ssDNA均可感染感受态的寄主细胞——形成phaque或colony。 C．不受包装的限制。因为单链DNA phage的大小是受其DNA 多寡制约的。 D．可容易地测出外源DNA的插入取向。 E．可产生大量的含有外源DNA的单链DNA分子，这种单链DNA分子有如下用途(作为模板)： *1用作双脱氧链终止法进行DNA测序
*2制备单链的放射性标记的杂交用DNA探针 *3利用寡核苷酸进行定点突变 2．M13 phage的生物学特性 A．M13 phage同f1 phage亲缘关系十分密切，例如： ①基因组组织形式相同； ②病毒颗粒大小、形状相近； ③DNA同源性高达98%以上。 B．在M13 phage颗粒中只有(+)链DNA，感染具F性须的大肠杆菌菌株，因此M13噬菌体是雄性E.coli特有的；M13噬菌体的(+)链DNA，又称为感染性单链DNA。 C．复制型双链DNA(RF DNA=Replication Form DNA) 感染过程：当感染的M13 phage颗粒穿过性须时，其外层主要 衣壳蛋白质脱落，M13 DNA及附着其上的Gene Ⅲ 蛋白进E.coli细胞内， ↓ 感染性单链DNA(正链DNA)在细菌胞内酶的作用 下转变为双链DNA，称复制型DNA。通过结构 进行几轮复制。
参考文献的类型 根据GB3469-83《文献类型与文献载体代码》规定，以单字母标识：M——专著（含古籍中的史、志论著） C——论文集 N——报纸文章 J——期刊文章 D——学位论文 R——研究报告 S——标准 P——专利 A——专著、论文集中的析出文献 Z——其他未说明的文献类型 电子文献类型以双字母作为标识： DB——数据库 CP——计算机程序 EB——电子公告 非纸张型载体电子文献，在参考文献标识中同时标明其载体类型： DB/OL——联机网上的数据库 DB/MT——磁带数据库 M/CD——光盘图书 CP/DK——磁盘软件 J/OL——网上期刊 EB/OL——网上电子公告 一、参考文献著录格式 1 、期刊作者．题名〔J〕．刊名，出版年，卷(期)∶起止页码 2、专著作者．书名〔M〕．版本(第一版不著录)．出版地∶出版者，出版年∶起止页码 3、论文集作者．题名〔C〕．编者．论文集名，出版地∶出版者，出版年∶起止页码 4 、学位论文作者．题名〔D〕．保存地点．保存单位．年份 5 、专利文献题名〔P〕．国别．专利文献种类．专利号．出版日期 6、标准编号．标准名称〔S〕 7、报纸作者．题名〔N〕．报纸名．出版日期(版次) 8 、报告作者．题名〔R〕．保存地点．年份 9 、电子文献作者．题名〔电子文献及载体类型标识〕．文献出处，日期 二、文献类型及其标识 1、根据GB3469 规定，各类常用文献标识如下： ①期刊〔J〕 ②专著〔M〕 ③论文集〔C〕 ④学位论文〔D〕
⑤专利〔P〕 ⑥标准〔S〕 ⑦报纸〔N〕 ⑧技术报告〔R〕 2、电子文献载体类型用双字母标识，具体如下： ①磁带〔MT〕 ②磁盘〔DK〕 ③光盘〔CD〕 ④联机网络〔OL〕 3、电子文献载体类型的参考文献类型标识方法为：〔文献类型标识/载体类型标识〕。例如： ①联机网上数据库〔DB/OL〕 ②磁带数据库〔DB/MT〕 ③光盘图书〔M/CD〕 ④磁盘软件〔CP/DK〕 ⑤网上期刊〔J/OL〕 ⑥网上电子公告〔EB/OL〕 三、举例 1、期刊论文 〔1〕周庆荣，张泽廷，朱美文，等．固体溶质在含夹带剂超临界流体中的溶解度〔J〕．化工学报，1995(3)：317—323 〔2〕Dobbs J M, Wong J M. Modification of supercritical fluid phasebehavior using polor coselvent〔J〕. Ind Eng Chem Res, 1987,26:56 〔3〕刘仲能，金文清.合成医药中间体4-甲基咪唑的研究〔J〕.精细化工，2002(2)：103-105 〔4〕Mesquita A C, Mori M N, Vieira J M, et al ．Vinyl acetate polymerization by ionizing radiation〔J〕．Radiation Physics and Chemistry,2002, 63:465 2、专著 〔1〕蒋挺大．亮聚糖〔M〕．北京：化学工业出版社，2001．127 〔2〕Kortun G．Reflectance Spectroscopy〔M〕．New York: Spring-Verlag,1969 3、论文集 〔1〕郭宏，王熊，刘宗林．膜分离技术在大豆分离蛋白生产中综合利用的研究〔C〕．//余立新．第三届全国膜和膜过程学术报告会议论文集．北京：高教出版社，1999．421-425 〔2〕Eiben A E, vander Hauw J K．Solving 3-SAT with adaptive genetic algorithms 〔C〕．//Proc 4th IEEE Conf Evolutionary Computation．Piscataway: IEEE Press, 1997．81-86 4、学位论文 〔1〕陈金梅．氟石膏生产早强快硬水泥的试验研究（D）．西安：西安建筑科学大学，2000
克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。 克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA 分子。) 其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。 是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。 表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。 表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。 （RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3—9bp组成的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。根据发现者的名字，命名为Shine-Dalgarno序列，简称S-D序列。 由于它正好与30S小亚基中的16s rRNA3’端一部分序列互补，因此S-D序列也叫做核糖体结合序列。 真核生物存在于真核生物mRNA的一段序列，其在翻译的起始中有重要作用。加Kozark sequence(GCCACC), Kozak sequence是用来增强真核基因的翻译效率的。是最优化的ATG环境，避免ribosome出现leaky scan） 克隆载体目的在于复制足够多的目标质粒，所以常带有较强的自我复制元件，如复制起始位点等，往往在菌体内存在多拷贝，所以抽质粒会抽出一大堆。但不具备表达元件。而表达质粒有复杂的构成，为的是控制目标蛋白的表达，如各种启动子（T7），调节子（LacZ）等，而且以pET为代表的表达载体在菌体内都是低拷贝的，防止渗漏表达。 克隆载体只是把你要的基因片段拿到就可以了，不管读码框什么的，但是表达载体是不但要你的目的基因连在上面，而且要表达蛋白，所以就要求你的读码框不能乱了，否则就不能得到你想到的表达产物。 1.载体即要把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。 2. 载体的分类 按功能分成：（1）克隆载体: 都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体。（2）表达载体:具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,Mcs等）还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体。 按进入受体细胞类型分：（1）原核载体（2）真核载体（3）穿梭载体（sbuttle vector）指在两种宿主生物体内复制的载体分子，因而可以运载目的基因（穿梭往返两种生物之间）. 克隆载体顾名思义就是质粒拷贝数比较高,在做上游克隆时比较方便, 其重点在于质粒的复制.
第三章噬菌体载体 一、填空题 1．噬菌体之所以被选为基因工程载体，主要有两方面的原因：一是—-----------—；二是----------——。 2．第一个报道的全测序的单链DNA噬菌体是ФX174，DNA长5386个碱基对，共一个基因，为一环状DNA分子，基因组的最大特点是—----------—。 3．λ噬菌体的基因组DNA为———————kb，有——多个基因。在体内，它有两种复制方式，扩增时(早期复制)按—-----—复制，成熟包装(晚期复制)则是按—--------—复制。它有一个复制起点，进行—-------—向复制。λ噬菌体的DNA既可以以线性存在又可以环状形式存在，并且能够自然成环。其原因主要是在λ噬菌体线性DNA分子的两端各有一个——个碱基组成的天然黏性末端。这种黏性末端可以自然成环。成环后的黏性末端部位就叫做——————位点。 4．根据噬菌体的包装能力，将野生型λ噬菌体的基因组DNA改造成插入型载体，该载体的最小分子大小约为————kb，插入的外源片段最大不超过——————kb。 5．野生型的M13不适合用作基因工程载体，主要原因是————和--------------—。 6．黏粒(cosmid)是质粒—噬菌体杂合载体，它的复制子来自——、C OS位点序列来自—--------—，最大的克隆片段达到—----------—kb。
7．有两类改造型的λ噬菌体载体，即插入型和取代型。从酶切点看，插入型为——个，取代型为——个。 8．野生型的λ噬菌体DNA不宜作为基因工程载体，原因是：(1)---------------——(2)——————————(3)—---------------------—。 9． M13单链噬菌体的复制分为三个阶段：(1)————————(2)—-------------—， (3)———————————。 10．噬菌粒是由质粒和噬菌体DNA共同构成的，其中来自质粒的主要结构是—-----—，而来自噬菌体的主要结构是—-------------------—。 11．M13单链噬菌体基因2和基因4之间的IG区有三个最重要的功能，即(1)—————(2)—------------—(3)—-------------—。 12．野生型的M13有10个基因，分为三个功能集团，其中与复制有关的两个基因是： ——------------------和——-----------------。 13．以丸噬菌体载体和黏粒载体构建文库时，起始DNA的长度是不同的，前者为—----— kb，后者为————kb。 14．λ噬菌体载体由于受到包装的限制，插入外源DNA片段后，总的长度应在噬菌体基因组的—---------------—的范围内。 二、判断题
3 参考文献类型及其标识 (1) 根据GB3469规定，以单字母方式标识以下各种参考文献类型： 对于其他未说明的文献类型，建议采用单字母“Z”。 (3) 对于数据库(database)、计算机程序(computer program)及电子公告(electronic bulletin board)等电子文献类型的参考文献，建议以下列双字母 对于非纸张型载体的电子文献，当被引用为参考文献时需在参考文献类型标识中同时标明其载体类型。本规范建议采用双字母表示电子文献载体类型：磁带(magnetic tape)——MT，磁盘(disk)——DK，光盘(CD-ROM)——CD，联机网络(online)——OL，并以下列格式表示包括了文献载体类型的参考文献类型标识： [文献类型标识/载体类型标识] 如：[DB/OL]——联机网上数据库(database online) [DB/MT]——磁带数据库(database on magnetic tape) [M/CD]——光盘图书(monograph on CD-ROM) [CP/DK]——磁盘软件(computer program on disk) [J/OL]——网上期刊(serial online) [EB/OL]——网上电子公告(electronic bulletin board online) 以纸张为载体的传统文献在引作参考文献时不必注明其载体类型。 4 文后参考文献表编排格式 参考文献按在正文中出现的先后次序列表于文后；表上以“参考文献：”(左顶格)或“[参考文献]”(居中)作为标识；参考文献的序号左顶格，并用数字加方括号表示，如[1]、[2]、…，以与正文中的指示序号格式一致。参照ISO690及ISO690-2，每一参考文献条目的最后均以“.”结束。各类参考文献条目的编排格式及示例如下： a.专著、论文集、学位论文、报告 [序号]主要责任者.文献题名[文献类型标识].出版地：出版者，出版年.起止页码(任选). [1] 刘国钧，陈绍业，王凤翥.图书馆目录[M].北京：高等教育出版社，1957.15-18. [2] 辛希孟.信息技术与信息服务国际研讨会论文集：A集[C].北京：中国社会科学出版社，1994. [3] 张筑生.微分半动力系统的不变集[D].北京：北京大学数学系数学研究所，1983. [4] 冯西桥.核反应堆压力管道与压力容器的LBB分析[R].北京：清华大学核能技术设计研究院，1997. b.期刊文章 [序号]主要责任者.文献题名[J].刊名，年，卷(期)：起止页码.
λ噬菌体载体 λ噬菌体，一种大肠杆菌双链RNA噬菌体。 是一种中等大小的温和噬菌体。迄今已经定位的λ噬菌体的基因至少有61个，其中有一半左右参与了噬菌体生命周期的活动，我们称这类基因为λ噬菌体的必要基因；另一部分基因，当它们被外源基因取代之后，并不影响噬菌体的生命功能，我们称这类基因为λ噬菌体的非必要的基因。 一．λ噬菌体的分子生物学概述 （1）λ噬菌体基因组的结构 在λ噬菌体线性双链 DNA分子的两端，各有一条由12个核劳酸组成的彼此完全互补的5′单链突出序列，即通常所说的粘性末端。注入到感染寄主细胞内的λ噬菌体的线性DNA分子，会迅速地通过粘性末端之间的互补作用，形成环形双链DNA分子。随后在DNA连接酶的作用下，将相邻的5′-P和3′-OH基团封闭起来，并进一步超盘旋化。这种由粘性末端结合形成的双链区段称为cos 位点（略语cos，系英语cohesive-end site的缩写，即粘性末端位点之意）（如图）。 在环化的状态下，λ噬菌体DNA分子的长度为48 502碱基对。
（2）λ噬菌体DNA的复制 在λ噬菌体感染的早期，环形的λ DNA分子按θ形式从双向进行复制。到了感染的晚期，控制滚环复制机理的开关被启动了，合成出了由一系列线性排列的人基因组oxA组成的长多连体分子。 （3）λ噬菌体DNA的整合与删除 λ噬菌体基因组的整合作用，是通过它的附着位点att，同大肠杆菌染色体DNA的局部同源位点之间的重组反应实现的。整合作用需要int基因的表达，它是一种可逆的过程。的复制子，这种过程叫做原噬菌体的删除作用。λ噬菌体的删除，需要噬菌体xis基因和bio基因的协同作用才能实现。 （4）λ噬菌体DNA的转录与转译 在溶菌周期，λ噬菌体DN A的转录是在三个时期，即早期、中期和晚期发生的。大体的情况是，早期基因转录确立起溶菌周期；中期基因转录的结果导致DNA进行复制和重组；晚期基因的转录最终使DNA被包装为成熟的噬菌体颗粒。 二．λ噬菌体载体的构建及其主要类型 （1）构建λ噬菌体载体的基本原理 构建λ噬菌体载体的基本原理是多余限制位点的删除。 按照这一基本原理构建的λ噬菌体的派生载体，可以归纳成两种不同的类型： 一种是插入型载体（insertion vectors），只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点(如图)。 另一种是替换型载体（rePlacement vectors），具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的人 DNA区段可以被外源插入的 DNA片段所取代。
文献类型及载体类型标志 对于其他未说明的文献类型，采用单字母“Z”。 对于数据库、计算机程序及电子公告等电子文献类型的参考文献， 1.电子文献的载体类型及其标志 对于非纸张型载体的电子文献，当被引用为参考文献时需在参考文献类型标志中同时标明其载体类型。一般用双字母表示电子文献载体类型：磁带——MT，磁盘——DK，光盘——CD，联机网络——OL，并以[文献类型标志/载体类型标志]表示包括了文献载体类型的参考文献类型标志。 如：[M/CD]——光盘图书(monograph on CD-ROM)； [DB/MT]——磁带数据库(database on magnetic tape)； [CP/DK]——磁盘软件(computer program on disk)； [J/OL]——网上期刊(serial online)； [DB/OL]——网上数据库(database online)； [EB/OL]——网上电子公告(electronic bulletin board online)。 2.中文文献 a. 普通图书(包括教材等)、会议论文集、资料汇编、学位论文、报告(包括科研报告、技术报告、调查报告、考察报告等)、参考工具书(包括手册、百科全书、字典、图集等) [1]邹申，杨任明.简明英语测试教程[M].北京:高等教育出版社,2002. [2][美]登哈特J V,登哈特R B.新公共服务:服务,而不是掌舵[M].丁煌，译.北京:中国人民大学出版社,2004：7. [3]朱一玄.聊斋志异资料汇编[G].郑州:中州古籍出版社,1985:177-178.
[4]张筑生.微分半动力系统的不变集[D].北京:北京大学数学系数学研究所,19 83:26. [5]冯西桥.核反应堆压力管道与压力容器的LBB分析[R].北京:清华大学核能技术设计研究院,1997:89. [6]张永录.唐代长安词典[K].西安:陕西人民出版社,1980:55. 3. 期刊文章 文献题名[J] [2]金显贺,王昌长,王忠东,等.一种用于在线检测局部放电的数字滤波技术[J].清华大学学报:自然科学版,1993,33(4):62－67. 4.报纸文章 文献题名[N]. 报纸名，出版日期(版次). [1]谢希德.创造学习的新思路[N].人民日报,1998-12-25(10). 5.标准(包括国际标准、国家标准、规范、法规等) 标准名称[S]. 出版地(任选):出版者(任选),出版年(任选). [1] GB/T 7714-2005,文后参考文献著录规则[S]. [2]JT/T 623-2005,集装箱吊具[S].北京:人民交通出版社出版,2005. 6. 析出文献 [文献类型标志] // [1]钟文发.非线性规划在可燃毒物配置中的应用[C]//赵玮.运筹学的理论与应用—中国运筹学会第五届大会论文集.西安：西安电子科技大学出版社,1996:468－471. [2]王家益.1995年湖南省交通肇事逃逸案件[G]//公安部交管局.49～99五十年交通事故统计资料汇编.北京:群众出版社,2000. [3]林穗芳.美国出版业概况[M]//陆本瑞.世界出版概观.北京中国书籍出版社，1991:1-23. [4]钟文发.非线性规划在可燃毒物配置中的应用[C]//赵玮.运筹学的理论与应用中国运筹学会第五届大会论文集.西安:西安电子科技大学出版社，1996 ：4 68-471. 7.电子文献 [文献类型标志/载体类型标志].(更新日期)[引用日期]. 电子文献网址. [1]萧钰.出版业信息化迈入快车道[EB/OL].(2001-12-19)[2002-04-15]. https://www.doczj.com/doc/e114160364.html,/news/20011219/200112190019.html. 注：如为网上图书、杂志等，如有印刷载体，则最好按印刷版本格式著录。如只是在网上发行，则需要在文献题名后著录相应项目，如期刊年限期数等。
第四节单链丝状噬菌体载体 一、M13 噬菌体的生物学 1．M13 噬菌体的组成和结构 M13 噬菌体颗粒是丝状的，只感染雄性大肠杆菌。感染宿主后不裂解宿主细胞，而是从感染的细胞中分泌出噬菌体颗粒，宿主细胞仍能继续生长和分裂。 M13 噬菌体的基因组为单链 DNA ，由 6407 的碱基组成（GenBank 注册号为 V00604）。基因组 90% 以上的序列可编码蛋白质，共有 11 个编码基因，基因之间的间隔区多为几个碱基。较大的间隔位于基因Ⅷ 和基因Ⅲ 以及基因Ⅱ 和基因Ⅳ 之间，其间有调节基因表达和 DNA 合成的元件。 M13 噬菌体基因组可编码 3 类蛋白质，包括复制蛋白（基因Ⅱ，Ⅴ 和Ⅹ），形态发生蛋白（基因Ⅰ，Ⅳ 和Ⅺ），结构蛋白（基因Ⅲ 、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ 和Ⅸ）。所有结构蛋白在形态发生之前都插入在宿主细胞的质膜中。基因组 DNA 为正链，按基因Ⅱ 至基因Ⅳ 方向合成，与噬菌体的 mRNA 序列同义。图 3-20 是 M13 噬菌体的遗传图谱。 M13 噬菌体颗粒为丝状长管状结构，长 880nm ，直径 6-7nm 。噬菌体颗粒的核心由 2700 个基因Ⅷ 编码的结构蛋白呈管状排列而成（图 5-32），成熟的基因Ⅷ 的产物为由 50 个氨基酸残基组成的α螺旋蛋白。顶端由 5 个基因Ⅶ 和 5 个基因Ⅸ 产物组成，作用于间隔区中的包装信号。 5 个基因Ⅲ 蛋白和5 个基因Ⅵ 蛋白位于丝杆的末端，参与对性纤毛的吸咐。图 3-21 是 M13 噬菌体结构模型。 2．M13 噬菌体的增殖 吸附是噬菌体感染的第一步， M13 噬菌体只感染具有性纤毛的菌株，携带 F 质粒的菌株可产生性纤毛。在吸附过程中，噬菌体的基因Ⅲ 蛋白与性纤毛发生作用。随后丝状噬菌体穿入到性纤毛，基因Ⅲ 蛋白与宿主的 TolQ 、TolR 和 TolA 蛋白发生作用，去除外壳蛋白，致使病毒 DNA 及附着于其上的基因Ⅲ 蛋白进入宿主菌体内。
文献类型及载体代码 根据GB3469-83《文献类型与文献载体代码》规定，以单字母标识：M——专著（含古籍中的史、志论著） C——论文集 N——报纸文章 J——期刊文章 D——学位论文 R——研究报告 S——标准 P——专利 A——专著、论文集中的析出文献 Z——其他未说明的文献类型 电子文献类型以双字母作为标识： DB——数据库 CP——计算机程序 EB——电子公告 非纸张型载体电子文献，在参考文献标识中同时标明其载体类型：DB/OL——联机网上的数据库 DB/MT——磁带数据库 M/CD——光盘图书
CP/DK——磁盘软件 J/OL——网上期刊 EB/OL——网上电子公告 一、参考文献著录格式 1 、期刊作者．题名〔J〕．刊名，出版年，卷(期)∶起止页码 2、专著作者．书名〔M〕．版本(第一版不著录)．出版地∶出版者，出版年∶起止页码 3、论文集作者．题名〔C〕．编者．论文集名，出版地∶出版者，出版年∶起止页码 4 、学位论文作者．题名〔D〕．保存地点．保存单位．年份 5 、专利文献题名〔P〕．国别．专利文献种类．专利号．出版日期 6、标准编号．标准名称〔S〕 7、报纸作者．题名〔N〕．报纸名．出版日期(版次) 8 、报告作者．题名〔R〕．保存地点．年份 9 、电子文献作者．题名〔电子文献及载体类型标识〕．文献出处，日期 二、文献类型及其标识 1、根据GB3469 规定，各类常用文献标识如下： ①期刊〔J〕 ②专著〔M〕 ③论文集〔C〕 ④学位论文〔D〕
⑤专利〔P〕 ⑥标准〔S〕 ⑦报纸〔N〕 ⑧技术报告〔R〕 2、电子文献载体类型用双字母标识，具体如下： ①磁带〔MT〕 ②磁盘〔DK〕 ③光盘〔CD〕 ④联机网络〔OL〕 3、电子文献载体类型的参考文献类型标识方法为：〔文献类型标识/载体类型标识〕。例如： ①联机网上数据库〔DB/OL〕 ②磁带数据库〔DB/MT〕 ③光盘图书〔M/CD〕 ④磁盘软件〔CP/DK〕 ⑤网上期刊〔J/OL〕 ⑥网上电子公告〔EB/OL〕
参考文献类型及文献类型\电子文献载体类型及其标志代码 参考文献类型及文献类型，根据GB3469-83《文献类型与文献载体代码》规定，以单字母方式标识：专著(M)；论文集（C）；报纸文章（N）；期刊文章（J）学位论文（D）；报告（R）；标准（S）专利（P） a. 专著、论文集、学位论文、报告：[序号]主要责任者．文献题名[文献类型标识]．出版地：出版者，出版年． [1] 周振甫．周易译注[M]．北京:中华书局．1985． [2] 陈送．五四前后东西方文化问题论战文选[C]．北京:中国社会科学出版社，1985． [3] 陈桐生．中国史官文化与《史记》[D]．西安:陕西师范大学文学研究所，1992年． [4] 白永秀，刘敢，任保平．西安金融、人才、技术三大要素市场培育与发展研究[R]．西安:陕西师范大学西北经济研究中心，1998． b．期刊文章：[序号]主要责任者．文献题名[J]．刊名，年，卷(期)． [5] 何龄修．读顾城《南明史》[J]．中国史研究，1998(3)． c．论文集中的析出文献：[序号]析出文献主要责任者．析出文献题名[A]．原文献主要责任者(任选)．原文献题名[C]．出版地：出版者，出版年． [6] 瞿秋白．现代文明的问题与社会主义[A]．罗荣渠．从西化到现代化[C]．北京：北京大学出版社，1990． d．报纸文章：[序号]主要责任者．文献题名[N]．报纸名，出版日期(版次)． [7] 谢希德．创造学习的新思路[N]．人民日报，1998-12-25(10)． e．国际、国家标准：[序号]标准编号，标准名称[S]． [8] GB／T16159-1996，汉语拼音正词法基本规则[S]． f．专利：[序号]专利所有者．专利题名[P]．专利国别：专利号，出版日期． [9] 姜锡洲．一种温热外敷药制备方案[P]．中国专利：881056073，1989-07-26． g．电子文献：[序号]主要责任者．电子文献题名[电子文献及载体类型标识]．电子文献的出处或可获得地址，发表或更新日期／引用日期(任选)． [10] 王明亮．关于中国学术期刊标准化数据库系统工程的进展[EB／01]．http：//www．Cajcd．edu．cn／pub／wm1．txt／980810-2．htmI，1998-08-16／1998-10-04． [11] 万锦坤．中国大学学报论文文摘(1983一1993)．英文版[DB／CD]．北京：中国大百科全书出版社，1996．
第一章古典文献的载体和形式 文献的载体和形式 ?刻铸型载体(甲骨、金石) →书写型载体(简牍、缣帛、莎草纸、羊皮纸、贝叶等) →书写兼印刷型载体(纸) →感应性载体(胶片、磁带、磁盘、光盘数据库) ?汉代，我国发明了造纸术，纸张被广泛使用，成为各类文献的理想载体，而且使用时间最长。直至目前，我国仍以纸为文献的主要载体。新近出现的感光材料和磁性材料，即胶片和磁带，是一种新型的文献载体，颇受青睐，已被广泛采用，在某些领域，大有取代纸张的趋势。 第一节载体形式 1.甲骨 ?甲骨文在清光绪二十五年(1899)被发现，当时，住在北京的金石收藏家王懿荣因治病的一个偶然机会，发现中药中的“龙骨”，即甲骨上刻有古文字，他便四处搜求，其得约1500片。 ?不久，王懿荣去世，其甲骨为丹徒人刘鹗(铁云)收藏，刘又继续收集，共计约5000片。选出其中字迹完好的1058片，于1903年拓印成《铁云藏龟》，这是著录甲骨文的第一籍。 ?1904年朴学大师孙诒让据此写成《契文举例》二卷，可谓我国学者研究甲骨文的开始。 ?1907年上虞罗振玉开始收藏甲骨，并亲自前往调查，所得甲骨三万片以上。 ?罗振玉于1913年先后印行了《殷墟书契后编》等专著，成为研究甲骨文献的必读之书。
?王国维于1917年发表《殷先公先王考》，以实物为依据论证了《史记·殷 本纪》所载王世系为信史，是第一篇具有重大学术价值的论文。?从1928年至1937年，前中央研究院先后对河南殷墟进行了15次发掘， 获大批甲骨文，并编印出版了《殷墟文字甲编》、《殷墟文字乙编》。?1955年，由中国科学院考古研究所编成《殷墟文字缀合》，近年又编成《甲骨文合集》，洋洋大观，集甲骨文之大成。 ?2.金石 ?商代至秦汉时期，奴隶主贵族主要采用铜和锡的合金，铸造礼器、乐器、日用品等器物，因它呈青灰色，故称青铜器。青铜器其上常常铸上或刻有文字，简称“铭文”，又称“金文”。 ?青铜器中的礼器以鼎居多，乐器以钟居多，所以前人便把钟和鼎作为青铜器的别称，其铭文又习称“钟鼎文”。 ?石刻，比在青铜器上刻铸文字较为容易，秦汉以来，石刻逐渐取代了金刻的主要地位。我国现存最早的石刻文字是石鼓文，唐代初年发现于大兴县（今陕西宝鸡市南），在10个琢磨的鼓形石上，各刻四言诗一首，歌咏秦国君畋猎游乐生活，故又称“猎碣”。 ?关于石鼓的制作时代，争议颇多，或谓周宣王时所作，或谓周成王时所作。南宋郑樵因其文往往与秦器相合，定为秦刻。后世亦多从此说，公认石鼓石为秦刻石，石鼓经千余年的辗转流移，十石文字大多剥落，其中一石，字迹竟全然无存，原石今藏故宫博物院。 ?郭沫若有《石鼓文研究》一书，可资参考。 ?秦始皇统一六国后，多次巡行各地，到处刻石记功。计有泰山、峄山、琅琊、支罘、东观、碣石和会嵇等刻石。字体均为小篆，相传为李斯所书。这些石刻大都湮没，现仅琅琊石刻残存13行87字，陈列于中国历史博物院。司马迁将这些石刻文字收入《秦始皇本纪》，开创了以石刻文字为史料的先例。