研究蛋白质凝聚凝胶的技术进展
摘要由于蛋白质形成的凝胶会影响食品的质构和品质,所以研究蛋白质凝胶对于食品科学有极其重要的意义。然而,蛋白质形成凝胶的机理过于复杂,需要更先进的技术来研究。介绍了用于蛋白质凝胶研究的最新技术进展,如原子力显微镜(AFM),共聚焦激光
显微镜(CSLM)和漫射波光谱(DWS)。与传统研究凝胶的方法如动态流变仪和扫描电子
显微镜(SEM)相比,这些新方法简化了样品的预处理,有实现在线测定的可能。由于样品
处于天然状态,所以反映的信息更具有真实性,加上高分辨率,可以实现蛋白形成凝胶过
程分子水平的可视化。因此,采用以上的新技术可以为研究蛋白凝胶的形成提供更多的
信息。
凝聚和凝胶过程对食品加工起着重要的作用,它们能形成食品所需要的质构,也
会带来不需要的沉淀或是分层现象。因此,研究胶体形成的特性对于稳定和形成食品所需结构十分重要,并且通过控制凝胶反应优化食品加工过程,提高食品品质。对于食品体系的凝胶和凝聚已经有了深入的研究,但凝聚凝胶现象还鲜有报道。因为研究凝胶过程有以下困难:首先,蛋白和多糖是大分子,三维结构描述和定量困难。其次,凝胶过程是一
个复杂的反应体系[1]。例如,球蛋白的凝胶过程,通常分为蛋白分子展开,解聚和聚合,凝聚[2]的步骤。在热变性的过程中,天然蛋白分子伸展,暴露出功能性基团(如巯基和疏水基团)。随后,为了降低体系的能量,蛋白通过形成二硫键或疏水相互作用发生凝聚[3-4]。当蛋白浓度高于形成凝胶的临界点时,凝聚继续发展形成凝胶结构。在整个反应过程中,最终的凝胶和凝聚体的结构受环境因素影响(蛋白浓度、pH、离子强度、温度等)很大。食品是个复杂的体系,一些成分会影响蛋白凝聚凝胶的过程如蛋白—蛋白的相互作用,通过改变二硫键形成、疏水相互作用、氢键或是范德华力,改变形成凝胶体的凝胶特性[5]。此外,采用传统的分析手段难以获得更加深入真实的凝胶形成信息。尽管采用动态流变仪、显微镜和动态光散射技术可以分析凝胶形成过程,但是这些方法主要通过分析凝聚发生过程时粒子尺寸或是弹性模量G′的变化来进行研究[6-9],通常需要复杂繁琐的样品前处理过程,如稀释、机械变形、干燥、冻干等,这些处理会破坏易破碎的弱凝胶,影响
亚稳定体系。因此,保持体系接近原始天然状态对于考察物理化学因素对于凝胶最终质构的影响十分重要。理想的分析方法应该是非破坏性的、非干扰性的技术,可以让样品处于天然状态下测定,从而获得处于软凝胶状态下,凝胶相互作用的信息[10]。伴随科技的发展,一些新的非破坏性的技术应用于蛋白质凝胶和凝聚的研究中。文章论述了原子
力显微镜(AFM),激光共聚焦显微镜(CSLM)和散射光波谱(DWS)用于食品蛋白质凝聚凝
胶的研究。在我国,虽然原子力显微镜已经广泛用于多糖结构的研究[11-13],但是用于
蛋白质凝胶和凝聚的研究报道还很少。
1AFM用于蛋白质凝聚凝胶
AFM起源于隧道扫描显微镜技术,它广泛应用于生物、物质结构、分子生物学等领域。AFM用于食品科学中以下六个方面[14]:AFM可以定性描述食品大分子的结构;
通过AFM成像提供的结构参数描述食品加工和储存过程中定量分析分子结构变化;显
示不同分子之间的相互作用;为操控食品大分子提供条件;描述食品表面因物理特性变化而带来的细微变化;加工纳米食品的工具。
1. 1AFM的原理
AFM的成像是通过“感觉”而非“观察”样品。在AFM观测样品时,一个安装
在悬臂上的尖端扫描样品表面,通过记录悬臂的偏斜,通过激光二极管发出的激光照射在悬臂的末端,经过镜面反射把激光发射到光电二极管检测器上,得到悬臂偏斜的信号。当扫描样品时,样品表面的拓扑结构通过尖端和样品力的变化使悬臂发生偏斜。通过电脑处理悬臂偏斜变化形成样品表面三维结构[15]。
AFM的观测模式有三种:接触、非接触和轻敲。在接触模式中,尖端始终与样品
表面接触,而非接触模式中,悬于空气中的尖端仅于样品表面吸附水层接触而不与样品接触。轻敲模式中,尖端与样品间歇接触,通常每秒接触300 000次,减少接触模式中产生
的剪切力对于样品的破坏,这种模式通常适宜那些质地偏软的食品和生物样品。
1. 2AFM的特点
与传统的电子和普通光学显微镜相比,AFM具有以下优点[14, 16]。
①具有高分辨率和大的放大倍数。AFM没有透镜,因此不受衍射极限或者球面像差的限制,对于某些样品可以实现原子级别的分辨率。
②简化样品处理的过程。AFM是非破坏的分析方法,不需要染色或是覆膜处理,也不用高能量的粒子流,不需要导电衬底,不受样品稠度的影响,观测时样品可以处于溶液中,基本
达到在天然状态下或是近似天然状态下观测样品。
③可同时得到样品的二维和三维成像。
④可以连续的观测样品变化,所以可以直接观测正在进行的反应过程。如酶反应的过程。
⑤为操控大分子和调查大分子之间的相互作用提供了可能。
然而,目前AFM也有以下缺点:相对较小的扫描面积,较慢的扫描速度,对于过于
软的样品成像困难等
1. 3AFM在蛋白凝聚和凝胶上的应用
AFM能有效地提供凝胶结构信息,进而补充流变仪或化学分析蛋白凝聚结构信息。AFM可以成功的反映乳清蛋白热凝聚现象,研究发现乳清蛋白凝聚体显示了同β-乳球蛋白凝聚体相似的微观结构[17]。在pH 7时,无论NaCl浓度如何变化,乳清蛋白凝聚体主要由椭球形微粒构成。以上研究结果对于理解不同条件下得到的热导致乳清蛋白凝胶
特性差异提供了基础。
采用轻敲模式AFM观察到加热后β-乳球蛋白,发现它形成一种有规律的纤维结构,长度约25nm,厚度是1或2个蛋白单体[14]。这证明在低pH低离子强度下,形成的
热导致β-乳球蛋白纤维体需要进行两步以上的反应。
Iwasaki等[14]采用AFM分析加热对于肌浆球蛋白丝形态的影响,发现在70℃时原来的串珠结构变成绳子结构,但是少量蛋白丝的结构没有明显变化。
Yang等[18]使用AFM观察鲶鱼凝胶结构,发现鲶鱼凝胶中具有平均直径为118 nm的环形孔洞球形凝聚体的平均直径为267 nm。他们认为球状凝聚体和环形孔洞的
形成与水和离子渗透过正在水解胶原质时的方式有关。
AFM能从分子水平上解释食品流变学特性的差异,从力学的角度揭示蛋白凝聚特性。Iwasaki等[19]报道了采用AFM分析由热导致和压力导致的细丝状肌浆球蛋白凝
胶中的串珠结构和弹性之间的关系。近期出现的阶段成像,力调制模式等新技术,使AFM 能够定量测定物质弹性。
AFM也应用于分析蛋白凝聚动力学。Yay等[20]使用AFM分析采用GDL导致不同大豆蛋白凝聚的过程。将11S、7S、2S在100℃加热10 min后,加入GDL,采用AFM 观测它们形成不同的凝聚曲线。单位时间内, 11S形成体积最大的凝聚团, 2S形成的凝聚团其次, 7S的凝聚团最小,所以可以推测11S的凝聚速度最快, 7S最小。
虽然AFM已经成功地运用于食品蛋白凝胶领域,但是对于观测高度复杂的真实
食品体系,还存在不足,有太多其他组分和组分间相互作用会干扰对调查对象的分析。但是随着技术的发展,AFM必然会广泛的应用于真实的食品体系。
2CSLM用于蛋白凝聚凝胶
与传统的荧光显微镜相比,由于采用自动的显微镜技术、荧光探针技术、高容量和高强度的图片处理软件等先进技术,CSLM具有很高的放大倍数和高的分辨率。CSLM 已经广泛的应用于分子生物学[21]、免疫学、药剂学[22]、基因学、生理学[23]等领域。
2. 1CSLM的原理
利用激光束通过光栅针孔形成点光源,在荧光标记标本的焦平面上逐点扫描,采
集点的光信号通过探测针孔到达光电倍增管(PMT) ,再经过信号处理,在计算机监视屏上形成图像。CLSM采用共聚焦技术在物镜的焦平面上放置了1个带有小孔的挡板,平面
以外的杂散光被挡住,消除了球差,并进一步消除了色差,且可将样品分解成二维或三维
空间上的无数点,用十分细小的激光束(点光源)逐点逐行扫描成像,再通过微机组合成1
个平面的或立体的图像[24-25]。
2. 2CSLM的特点
CSLM已经逐渐用于食品微结构的研究,有如下特点[26]:避免固定或者脱水操作,避免破坏样品,因此减少了样品制备的时间和对样品性质的改变;荧光探针的使用可以特定观察食品的某种成分,提高检测的灵敏性和特异性;食品结构的变化可以连续的监测;“光切片”技术可以确保不破坏微观结构的条件下,观测表面以下不同深度切面的微观结构。虽然CSLM有诸多优点,但是CSLM还有以下缺点:受衍射极限的限制, CSLM观测某些蛋白和酪蛋白胶束的分辨率最高达到0. 2μm以上;同时某些与样品采用共价键结
合的荧光探针会改变样品结构的影响[27]。此外,荧光信号逐渐减弱,会影响测定结果;
扫描速度慢,并且目前CSLM不能检测静止的食品体系。
2. 3CSLM在蛋白凝聚凝胶中的应用
由于CSLM适宜观察处于天然状态下食品体系[28],所以CSLM已经用于分析食
品胶体,如蛋白-多糖相分离,蛋白凝胶结构,乳化和泡沫稳定性[29-34]。
CSLM可以用于测定胶体形成动态过程[26]。CSLM已经观测了采用凝乳酶导致全脂牛奶和低脂牛奶形成凝胶的过程。起初,酪蛋白呈现出粒径小于0. 5μm细微分散
的小颗粒, 15 min后,酪蛋白颗粒开始发生凝聚,最终凝胶形成三维网络结构。从CSLM
分析发现,除了在低脂牛奶中脂肪球个数远少于全脂牛奶和凝胶速度低于全脂牛奶以外,低脂牛奶和全脂牛奶凝胶过程相似。采用CSLM观测GDL导致的凝胶过程时,发现在加入GDL后1-20 min(pH 6. 51~5. 64),一些粒径小于1μm蛋白微粒在各个方向上随机
快速运动, 30 min后, pH下降到5. 58时,粒径小于2μm牛奶蛋白的凝聚体成为体系
的主体。开始发生凝胶化并形成可见的蛋白网络是在pH 5. 4,而此时蛋白已经完全静止。
CSLM能够清楚的描述在凝聚凝胶过程中大分子之间的相互作用,如多糖—蛋白、蛋白—蛋白。Sittikijyothin等[35]使用CSLM研究由β-乳球蛋白和他拉胶形成的混合胶。单纯的β-乳球蛋白凝胶呈现均质性,而混合胶具有两个相。β-乳球蛋白发生凝聚后,形成富含蛋白的连续相,他拉胶构成分散相。他拉胶浓度显著影响混合胶的微观结构,当增加他拉胶浓度时,会产生更具有开放性和不均匀的混合胶结构。GonCalves等[36]研究由β-乳球蛋白和刺槐豆胶形成混合胶也具有相似的结构[36]。Schmitt等[37]采用CSLM研究发现:总浓度为1%的β-乳球蛋白和阿拉伯胶,与总浓度1%的全溶β-乳球蛋白和阿拉
伯树胶形成的凝胶完全不同。球状混合聚集物的沉淀平衡系数受构成聚集层的两种物
质比例的影响。当蛋白浓度上升时,产生尺寸巨大、数量众多沉淀,这些沉淀由阿拉伯树胶包围的蛋白质凝聚团组成。而凝聚团由含有单个小泡颗粒(气泡表观直径4~10μm)
和含有泡沫颗粒(气泡大小相对均一,直径在2~4μm)构成。在全溶β-乳球蛋白和阿拉伯树胶形成分散体系中主要是含有单个气泡的颗粒团。产生不同微粒的原因是:β-乳球蛋白和全溶β-乳球蛋白的分散性不同造成的。CSLM提供了加热乳清蛋白和β-乳球蛋白可以形成复杂的凝胶网络的证据。疏水相互作用和氢键诱导β-乳球蛋白分子吸附到乳清
蛋白上[39]。这一点在CSLM的照片上可以清楚地看到二者的荧光信号重合在相同的
区域。此外,CSLM还显示β-乳球蛋白对于乳清蛋白凝胶结构的影响,当降低β-乳球蛋白
的含量时,形成的混合凝胶网络更均匀。动态CSLM也成功地用于分析环境因素如离子
强度、pH、时间等对于凝胶结构的影响。采用动态CSLM可以清楚地观测到离子强度
和pH对蛋白网络结构的影响。在低离子强度和高pH条件下, CSLM观测到酪蛋白形成带有大孔洞的粗糙网络结构,而在高的离子强度和低的pH条件下,形成蛋白网络比较均匀,孔洞尺寸较小[39]。这是由于酪蛋白在高离子强度下的去稳定化要慢于低离子强度,并且需要更低的pH条件来减少胶束表面的电荷,所以形成凝胶的速度较慢,容易形成结构精细的凝胶网络结构。
3DWS用于蛋白凝聚凝胶
DWS起源于传统的激光散射技术。由于多散射光子叠加,使传统的静态或是动
态激光散射技术都不能用于高浓度的胶体体系,只能分析稀释的悬浊体系,其浓度大约0. 01%。而凝胶化、相分离和絮凝现象发生的浓度,都高于激光散射测量的浓度范围[40]。但DWS却可以用于混浊的胶体体系,因此,DWS可以用于研究乳化剂、胶体、化妆品等领域。
3. 1DWS的原理
当激光照射到组成胶体的颗粒上时,导致发生共振和散射,而且散射光受颗粒运
动状态的影响[41]。DWS测定的是在颗粒间发生多次散射光子,这时光子的运动途径可以看作随机运动或是散布运动。因此,随时间变化的散射光强度直接与样品中颗粒运动状态有关,测定散射光变化,即可推出颗粒运动状态,进而得出凝聚的状态。
DWS有两种构造类型:同侧型和穿透型,同侧型,收集器和检测器与激光发射源在同一侧;穿透型收集器和检测器与激光发射源在异侧,所以散射激光必须穿过整个悬浊样品,散射激光的强度较高。同侧型的缺点是有时收集的散射光没有发生足够散射,但是它具有激光能量低并且易于安装设备的优点,因此用于食品凝聚凝胶化的研究。
3. 2DWS的特点
DWS可以在线测定未稀释或是未预处理过样品,得到凝聚颗粒的尺寸、空间相
关性的信息。但缺点是:DWS不能用于已经完全形成的凝胶,因为此时颗粒已经完全静止,体系中没有微粒移动,就不能用复杂的相关函数来推导凝胶的信息。目前没有商业
化DWS设备,只是一些实验室自制的DWS设备。因此,DWS的发展受软件和硬件的限制。
3. 3DWS在蛋白质凝胶凝聚中的应用
目前,DWS主要用于研究初始状态下的食品凝聚凝胶化过程,如通过添加凝乳酶
或酸化导致牛奶凝胶化过程,并测定凝胶网络的黏弹性[42-44]。研究表明,DWS能够准
确测定凝结时间,并且能找到散射光强度变化和形成结构弹性之间的联系。DWS通过测定光子运动平均自由行程(l*)的变化,发现使用凝乳酶和酸凝固的酪蛋白凝胶差异明显。参数l*是穿透性DWS特有的表征微观结构发展变化和不同类型凝胶形成机理的指标。凝胶化过程中,l*的变化要早于颗粒凝聚尺寸变化和流变学变化。在酸化和凝乳酶诱导
的凝胶体系中,随时间变化,两者的l*不同,所以证明在两种凝胶化过程中蛋白质间不同
的相互作用类型[45]。
即使在发生凝结之前,DWS显示在光子平均自由行程上加热和未加热的牛奶有
明显的差别[46]。在加热后的牛奶体系中,从加入酸化剂到pH下降到5. 5时,酪蛋白胶束表观半径逐渐呈现线性下降了20 nm。当pH到达5. 4时,颗粒的表观半径开始逐渐
缓慢上升,直到pH到达5后,颗粒的表观半径爆炸性增长。而在未加热牛奶中在pH 5.
4就已经有相当大的增加,而此时颗粒尺寸并没有较大的变化,这就意味着在这个体系中,颗粒间存在力的相互作用早于形成凝聚。这种相互作用在加热后的牛奶中表现更为明显,当开始酸化pH为6. 0以上,颗粒的尺寸没有变化时,颗粒间的相互作用就已经表现
出来了。以上结果表明,加热牛奶中的酪蛋白胶束在未发生凝聚时,已经被乳清蛋白和κ-酪蛋白形成的微弱的凝胶网络限制了移动,并最终发生凝聚。这一假设通过使用改变牛奶中酪蛋白胶束和乳清蛋白比例,得以验证[47]。
采用DWS研究酪蛋白胶束表明,只有当凝乳酶水解掉90%以上的κ-酪蛋白后,酪蛋白胶束才开始凝聚[48]。只要有少量“毛发”κ-酪蛋白存在,以及体系中残留乳清蛋白的存在,就能阻止酪蛋白胶束的凝聚。DWS研究发现:转谷氨酰胺酶处理过的酪蛋白胶束通过分子内部的相互作用,也能阻止凝乳酶导致的凝聚发生[49]。
4结论
概括了AFM、CSLM和DWS在食品蛋白质凝聚凝胶研究中的应用。这些技术简化样品预处理过程,甚至不需要预处理就可以分析蛋白凝聚凝胶的动力学,用于发现不同加工条件对于形成的凝胶特性的影响。但是现在依然不能直接用于真实的复杂的食品体系,伴着随仪器设备的发展,它们必将为人类提供更多有关食品蛋白质凝聚凝胶化的有用信息。
蛋白质组学的应用研究进展 蛋白质组学的应用研究进展 尹稳1 伏旭2 李平1 （1. 兰州大学第二医院，兰州 730030 ；2. 兰州大学第二医院急救中心，兰州730030） 摘要：蛋白质组学（Proteomics）是一门大规模、高通量、系统化的研究某一类型细胞、组织或体液中的所有蛋白质组成 及其功能的新兴学科。虽然基因决定蛋白质的水平，但是基因表达的水平并不能代表细胞内活性蛋白的水平，蛋白质组学分析是对蛋白质翻译和修饰水平等研究的一种补充，是全面了解基因组表达的一种必不可少的手段。蛋白质组学相关技术的发展极大地推动了蛋白质组学的研究进展，使其在各研究领域得到了广泛的应用。对蛋白质组学相关技术及其在各领域的应用进行了综述，最后对蛋白质组学的发展趋势和应用前景作出展望。 关键词：蛋白质组学双向凝胶电泳 质谱 生物信息学 应用现状 Application Research Progress of Proteomics （1. Lanzhou University Second Hospital，Lanzhou 730030 ；2. Department of Emergency，Lanzhou University Second Hospital，Lanzhou 730030） Abstract: Proteomics is an emerging discipline for studying proteins composition and function in a type of cell, tissue or body fluids in a large-scale, high-throughput and systematic level. While genes determine the level of protein, but the level of gene expression can not represent the intracellular reactive protein levels. Proteomic analysis is a complement to the study of translation and modification and also an indispensable tool for a comprehensive understanding of genome expression. The development of proteomic technologies has greatly promoted the progress of proteomic research, and it has been widely used in various research fields.This paper revieweded the proteomic technologies and the applications in various fields are also briefly reviewed. Finally, some future issues are presented.
《生物化学》课程论文 姓名：曹SS 学号：11310300SS 专业：SS教育 成绩： SS学院生命科学学院 2015年 1 月 1 日
文献综述 蛋白质结构与功能的研究进展 学生：曹SS 指导老师：杜SS 【摘要】人类基因组计划即将完成。虽然基因组的序列作为信息库拥有大量的、重要的生物信息资源，但并不是基因本身,而是基因组所编码的蛋白质才能够直接参与和指导绝大多数的生物学过程。毫无疑问，只有阐明蛋白质的作用机理，才能够真正理解基因的功能。蛋白质结构与功能关系的揭示将有助于人类对于如生殖、发育、疾病等生命活动的基本机理的了解。同时，将对于人类疾病的防治和药物的发明具有重要的指导意义。 【关键词】蛋白质；结构；功能 1.引言 在人类进人21世纪新纪元之际,生命科学也迎来一个崭新的时代,即“后基因组时代(Post一genome era)”。在这一时代中,生命科学的中心任务是揭示基因组及其所包含的全部基因的功能,并在此基础上阐明遗传、发育、进化、功能调控等基本生物学问题,以及进一步解决与医学、环境保护、农业密切相关的问题。由于基因的功能最终总是通过其表达产物—蛋白质来实现的,因此,要了解基因组全部功能活动,最终也必须回到蛋白质分子上来。现已知道,以蛋白质为主体的生物大分子的功能主要决定于它们的三维结构,所以也有人认为当代生物学研究已经进人了“结构基因组时代(structural genomics era)”。目前,我们还不可能只用基因组DNA的一维序列去确定生命活动的机理(mechanism)和途径(path-way),也难以仅用基因的信息去解释疾病发生与发展的分子机理。显然,在人类基因组之后的时代,在有关生命活动整合知识的指导下,以蛋白质及其复合物、组装体为主体的生物大分子的精细三维结构及其在分子、亚细胞、细胞和整体水平上的生物学功能的研究是生命科学的重大前沿课题,也是当前生物学领域中最具有挑战性的任务之一,在后基因组时代生物学发展中处于战略性的关键地位。因此,在从现在到今后的5到15年中,我国在重点基础研究发展的战略性规划中,不失时机地组织精干的结构生物学研究队伍,开展对重要功能基因表达产物—蛋白质及其复合物、组装体的结构与功能的研究具有重要的科学意义,是推动我国生物学研究在21世纪生物学领域占据一席之地的必要措施[1]。 另外，以蛋白质为主体的生物大分子及其复合物和组装体三维结构与功能关系研究是生
蛋白质组学研究方法选择及比较 目前研究蛋白组学的主要方法有蛋白质芯片及质谱法，本文将从多方面对两种研究方法进行了解与比较； 蛋白质芯片（Protein Array） 将大量不同的蛋白质有序地排列、固定于固相载体表面，形成微阵列。利用蛋白质分子间特异性结合的原理，实现对生物蛋白质分子精准、快速、高通量的检测。 主要类型： ●夹心法芯片(Sandwich-based Array) ●标记法芯片(Label-based Array) ●定量芯片(Quantitative Array) ●半定量芯片(Semi-Quantitative Array) 质谱（Mass Spectrometry） 用电场和磁场将运动的离子按它们的质荷比分离后进行检测，测出离子准确质量并确定离子的化合物组成，即通过对样品离子质荷比的分析而实现对样品进行定性和定量的一种方法。 主要类型：
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?综述与专论? 2014年第1期 生物技术通报 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 随着基因组计划的完成，生命科学研究开始进入以基因组学、蛋白质组学、营养组学、代谢组学等“组学”为研究标志的后基因组时代。蛋白质组（proteome）一词最早是由澳大利亚科学家Wilkins 和Williams 于1994年提出［1］，1995年7月最早见诸于Electrophoresis 杂志［2］，意指一个细胞或组织中由基因组表达的全部蛋白质。蛋白质组学（proteomics）是一门大规模、高通量、系统化的研究某一类型细胞、组织、体液中的所有蛋白质组成、功能及其蛋白之间的相互作用的学科。 虽然基因决定蛋白质的水平，mRNA 只包含了转录水平的调控，其表达水平并不能代表细胞内活 收稿日期：2013-09-05基金项目：甘肃省科技计划基金资助项目（0708NKCA129），兰州大学第二医院医学研究基金项目（YJ2010-08）作者简介：尹稳，女，硕士，研究方向：蛋白质组学；E -mail ：yinwen0508@https://www.doczj.com/doc/e04435248.html, 通讯作者：伏旭，男，硕士，研究方向：生物化学与分子生物学；E -mail ：fuxu0910@https://www.doczj.com/doc/e04435248.html, 蛋白质组学的应用研究进展 尹稳1 伏旭2 李平1 （1.兰州大学第二医院，兰州 730030；2.兰州大学第二医院急救中心，兰州 730030） 摘 要： 蛋白质组学（Proteomics）是一门大规模、高通量、系统化的研究某一类型细胞、组织或体液中的所有蛋白质组成及其功能的新兴学科。虽然基因决定蛋白质的水平，但是基因表达的水平并不能代表细胞内活性蛋白的水平，蛋白质组学分析是对蛋白质翻译和修饰水平等研究的一种补充，是全面了解基因组表达的一种必不可少的手段。蛋白质组学相关技术的发展极大地推动了蛋白质组学的研究进展，使其在各研究领域得到了广泛的应用。对蛋白质组学相关技术及其在各领域的应用进行了综述，最后对蛋白质组学的发展趋势和应用前景作出展望。 关键词： 蛋白质组学 双向凝胶电泳 质谱 生物信息学 应用现状 Application Research Progress of Proteomics Yin Wen 1 Fu Xu 2 Li Ping 1 （1. Lanzhou University Second Hospital ，Lanzhou 730030；2. Department of Emergency ，Lanzhou University Second Hospital ，Lanzhou 730030） Abstract: Proteomics is an emerging discipline for studying proteins composition and function in a type of cell, tissue or body fluids in a large -scale, high -throughput and systematic level. While genes determine the level of protein, but the level of gene expression can not represent the intracellular reactive protein levels. Proteomic analysis is a complement to the study of translation and modification and also an indispensable tool for a comprehensive understanding of genome expression. The development of proteomic technologies has greatly promoted the progress of proteomic research, and it has been widely used in various research fields.This paper revieweded the proteomic technologies and the applications in various fields are also briefly reviewed. Finally, some future issues are presented. Key words: Proteomics Two -dimensional gel electrophoresis Mass spectrometry Bio -informactics Application status 性蛋白的水平［3］，且转录水平的分析不能反应翻译后对蛋白质的功能和活性起至关重要作用的蛋白修饰过程［4］，如酰基化、泛素化、磷酸化或糖基化等。而蛋白质组学除了能够提供定量的数据以外，还能提供包括蛋白定位和修饰的定性信息。只有通过对生命过程中蛋白质功能和蛋白质之间的相互作用以及特殊条件下的变化机制进行研究，才能对生命的复杂活动具有深入而又全面的认识。近年来，蛋白质组学技术取得了长足的发展，随着新技术的不断涌现，其应用范围也不断扩大。本文对蛋白质组学相关技术及其在各研究领域的应用进行了简要的归纳和评述，并对蛋白质组学的发展趋势和应用前景
蛋白质工程的现状发展及展望 摘要: 蛋白质工程是用分子生物学手段对蛋白质进行分子改造的技术。介绍了蛋白质工程的几种常用方法及其基本原理和研究进展。 关键词: 蛋白质工程;定点诱变; 定向进化 20世纪70年代以来, 对蛋白质的分子改造渐渐进入研究领域, 通过对蛋白质分子进行突变, 得到具有新的表型和功能或者得到比原始蛋白相对活力更高的突变体,对蛋白质的分子改造技术逐渐纯熟。蛋白质工程的主要技术分为理性进化和非理性进化,已经在农业、工业、医药等领域取得了较大的进展。 1.理性进化 理性进化主要是利用定点诱变技术, 通过在已知DNA序列中取代、插入或缺失一定长度的核苷酸片段达到定点突变氨基酸残基的目的。运用该技术已有不少成功改造蛋白质的例子。Markus Roth通过同源性比对和定点突变技术, 对EcoR DNA甲基化酶进行改造,使其对胞嘧啶的亲和性增加了22倍。定点突变还主要应用于蛋白质结构和功能的研究方面。酰基载体蛋白(ACP)的主要作用是在单不饱和脂肪酸的特定位置引入双键, Caho通过定点突变研究, 发现将五个氨基酸残基置换之后的酶, 由6- 16 : 0- ACP脱氢酶变成9- 18 : 0- ACP脱氢酶。Van den Burg利用蛋白同源建模和定点突变技术结合的方法将从Bacillus stear other mophilus分离出来的嗜热菌蛋白酶突变, 得到的突变体稳定性提高了8倍, 100 在变性剂存在的情况下还能发挥作用,但是大部分单个氨基酸的改变对于整个蛋白的影响比较小,很难在高级结构上改变蛋白质的三级结构, 从而造成很大的影响, 所以在定点突变的基础上又出现了许多新的技术, 用于改造蛋白质分子。[1] 2.非理性进化 非理性蛋白质进化, 又称定向进化或者体外分子进化,在实验室中模拟自然进化过程, 利用分子生物学手段在分子水平增加分子多样性, 结合高通量筛选技术, 使在自然界中需要千百万年才能完成的进化过程大大缩短,在短期内得到理想的变异。这种方法不用事先了解蛋白质结构、催化位点等性质, 而是人为地制造进化条件, 在体外对酶的编码基因进行改造, 定向筛选, 获得具有预期特征的改良酶, 在一定程度上弥补了定点诱变技术的不足, 具有很大的实际应用价值。一个比较成功应用定向进化的例子是对红色荧光蛋白的改造。绿色荧光蛋白由于
蛋白质工程及其应用研究进展 摘要：蛋白质工程是生物工程中五大工程之一，本文对蛋白质工程作了简要概述，介绍了蛋白质工程的特点，并从蛋白质结构分析结构、功能的设计和预测、蛋白的创造和改造等方面对蛋白质工程研究内容进行详细论述，并以实例作了蛋白工程的应用。 关键词：蛋白质工程特点；研究内容；实际应用；展望 蛋白质是生命的体现者，离开了蛋白质，生命将不复存在。可是，生物体内存在的天然蛋白质，有的往往不尽人意，需要进行改造。由于蛋白质是由许多氨基酸按一定顺序连接而成的，每一种蛋白质有自己独特的氨基酸顺序，所以改变其中关键的氨基酸就能改变蛋白质的性质。而氨基酸是由三联体密码决定的，只要改变构成遗传密码的一个或两个碱基就能达到改造蛋白质的目的。蛋白质工程的一个重要途径就是根据人们的需要，对负责编码某种蛋白质的基因重新进行设计，使合成的蛋白质变得更符合人类的需要。这种通过造成一个或几个碱基定点突变，以达到修饰蛋白质分子结构目的的技术，称为基因定点突变技术。 蛋白质工程是在基因重组技术、生物化学、分子生物学、分子遗传学等学科的基础之上，融合了蛋白质晶体学、蛋白质动力学、蛋白质化学和计算机辅助设计等多学科而发展起来的新兴研究领域。其内容主要有两个方面：根据需要合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质；确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功能之间的关系。在此基础之上，实现从氨基酸序列预测蛋白质的空间结构和生物功能，设计合成具有特定生物功能的全新的蛋白质，这也是蛋白质工程最根本的目标之一。 目前，蛋白质工程尚未有统一的定义。一般认为蛋白质工程就是通过基因重组技术改变或设计合成具有特定生物功能的蛋白质。实际上蛋白质工程包括蛋白质的分离纯化，蛋白质结构和功能的分析、设计和预测，通过基因重组或其它手段改造或创造蛋白质。从广义上来说，蛋白质工程是通过物理、化学、生物和基因重组等技术改造蛋白质或设计合成具有特定功能的新蛋白质。 1概念 按人们意志改变蛋白质的结构和功能或创造新的蛋白质的过程。包括在体外改造已有的蛋白质，化学合成新的蛋白质，通过基因工程手段改造已有的或创建新的编码蛋白质的基因去合成蛋白质等。为获得的新蛋白具备有意义的新性质或新功
蛋白质工程的主要研究方法和进展 李 强 施碧红* 罗晓蕾 左祖祯 邢佩佩 刘 璐 (福建师范大学生命科学学院,福建福州 350108) 摘 要:蛋白质工程是用分子生物学手段对蛋白质进行分子改造的技术。介绍了蛋白质工程的几种常用方法及其基本原理和研究进展。 关键词:蛋白质工程;定点诱变;定向进化 中图分类号 Q816 文献标识码 A 文章编号 1007-7731(2009)05-47-02 Advances in The Techni q ues of P rotein Engineering L i Q iang et al (Co llege o f L ife Sc iences,Fu jian N or m a lU n i versity,Fuzhou350108,Chi na) Ab strac t:P ro tein eng ineer i ng is a techn i que used to i m prove prote i n m o l ecular In th i s paper,seve ra l m ethods and t he ir pr i nci p les and their advantag es f o r m olecu lar m odifica ti on have been rev ie w ed K ey words:P rote i n eng i neer i ng;site-d i rected m utag enesis;d irected evoluti on 20世纪70年代以来,对蛋白质的分子改造渐渐进入研究领域,通过对蛋白质分子进行突变,得到具有新的表型和功能或者得到比原始蛋白相对活力更高的突变体,对蛋白质的分子改造技术逐渐纯熟。蛋白质工程的主要技术分为理性进化和非理性进化,已经在农业、工业、医药等领域取得了较大的进展。 1 理性进化 理性进化主要是利用定点诱变技术,通过在已知D NA序列中取代、插入或缺失一定长度的核苷酸片段达到定点突变氨基酸残基的目的。运用该技术已有不少成功改造蛋白质的例子。M arkus Rot h通过同源性比对和定点突变技术,对E c o R DNA甲基化酶进行改造,使其对胞嘧啶的亲和性增加了22倍[1]。定点突变还主要应用于蛋白质结构和功能的研究方面。酰基载体蛋白(ACP)的主要作用是在单不饱和脂肪酸的特定位置引入双键,Cahoo 通过定点突变研究,发现将五个氨基酸残基置换之后的酶,由 6-16:0-ACP脱氢酶变成 9-18:0-ACP脱氢酶[2]。Van den Burg利用蛋白同源建模和定点突变技术结合的方法将从Bacill us stear other m oph il us分离出来的嗜热菌蛋白酶突变,得到的突变体稳定性提高了8倍,100在变性剂存在的情况下还能发挥作用[3],但是大部分单个氨基酸的改变对于整个蛋白的影响比较小,很难在高级结构上改变蛋白质的三级结构,从而造成很大的影响[4],所以在定点突变的基础上又出现了许多新的技术,用于改造蛋白质分子。 2 非理性进化 非理性蛋白质进化,又称定向进化或者体外分子进化,在实验室中模拟自然进化过程,利用分子生物学手段在分子水平增加分子多样性,结合高通量筛选技术,使在自然界中需要千百万年才能完成的进化过程大大缩短,在短期内得到理想的变异。这种方法不用事先了解蛋白质结构、催化位点等性质,而是人为地制造进化条件,在体外对酶的编码基因进行改造,定向筛选,获得具有预期特征的改良酶,在一定程度上弥补了定点诱变技术的不足,具有很大的实际应用价值。一个比较成功应用定向进化的例子是对红色荧光蛋白的改造。绿色荧光蛋白由于本身独特的发光性质,被应用到细胞生物学当中,作为体内原位跟踪蛋白质的一个极其有效的工具。D i sc oso m a红色荧光蛋白(Ds R ed)在荧光共振能量转移技术(fl uoresce nce resonance e ner gy tr ansfer)中可以和绿色荧光蛋白一起作用,作为研究两种蛋白质相互作用的有效工具,但是野生型的D s Red由于显色速率较慢,而且稳定性较差,B r oo ke B evi s建立随机突变文库,在103-105个转化子中筛选到了大大提高显色效率的突变体,使显色效率提高了10-15倍[5-6]。 易错PCR是利用DNA聚合酶不具有3!-5!校对功能的性质,在PCR扩增待进化酶基因的反应中,使用低保真度的聚合酶,改变四种d NTP的比例,加入锰离子并增加镁离子的浓度,使DNA聚合酶以较低的比率向目的基因中随机引入突变,并构建突变库。M oor e等对鼠伤寒沙门菌Sal m onella t yph m i uri u m产生的门冬氨酰二肽酶(asp art yld i pepti dase)进行改良,经两次易错PCR引入随机突变,并结合D NA改组和正向选择筛选,得到的pepEm3074突变株,其酶活力比野生菌提高47倍[7]。 D NA改组(DNA shuffli ng)技术克服了随机突变的随机性较大的限制,能够直接将多条基因的有利突变直接重组到一起,它的原理是使用D N ase?酶切或超声波断裂多条具有一定同源关系的蛋白编码基因,这些小片段随机出现部分片段的重叠,产生的片段在不加引物的情况下进行几轮PCR,通过随机的自身引导或在组装PCR过程中重 47 安徽农学通报,Anhu iAgri Sci Bu ll 2009,15(5) 作者简介:李强(1983-),男,辽宁抚顺人,硕士研究生,研究方向:分子遗传育种。*通讯作者 收稿日期:2009-01-15
进展评述 比较蛋白质组学研究中的稳定同位素标记技术 刘新1,2 应万涛1,2 钱小红1,23 (1军事医学科学院放射与辐射医学研究所 北京 100850;2北京蛋白质组研究中心 北京 102206) 摘 要 比较蛋白质组学是指在蛋白质组学水平上研究正常和病理情况下细胞或组织中蛋白质表达变化,以期发现具有重要功能的生物标识物,为疾病的早期诊断提供依据。近年来它正成为蛋白质组学研究的热点和发展趋势。比较蛋白质组学的研究方法和策略有多种,本文就最近几年来稳定同位素标记技术(体内代谢标记技术和体外化学标记技术)在比较蛋白质组学研究中的进展进行综述。 关键词 比较蛋白质组学 稳定同位素标记 体内代谢标记 体外化学标记 Application of Stable Isotope Labeling in Comparative Proteomics Liu X in1,2,Y ing Wantao1,2,Qian X iaohong1,23 (1Beijing Institute of Radiation Medicine,Beijing100850; 2Beijing Proteome Research Center,Beijing102206) Abstract C omparative proteomics is the research of protein expression changing between normal and pathological cell or tissue on the proteome level.P otential biomarkers w ould be discovered from the research by comparative proteomics, which will be helpful to the diagnosis and therapy of diseases.In the recent years,it has been becoming the hot spot of the proteomics research and many strategies used in comparative proteomics have been developed.During those approaches,the strategies based on stable is otopic labeling coupled with mass spectrometry have been extensively used and lots of success ful applications have been reported.In contrast to the traditional radioactive is otope labeling method,stable is otope labeling technique was not radioactive and the operation is simple.Metabolic labeling in viv o and chemical labeling in vitro are tw o parts of stable is otope labeling technique,which both have various advantages and disadvantages.This paper reviewed the progress of stable is otope labeling technique in comparative proteomics. K ey w ords C omparative proteomics,S table is otope labeling,Metabolic labeling in viv o,Chemical labeling in vitro 随着人类基因组精确图谱的公布,基因组功能的阐明已经成为生命科学研究中一项极重要的任务[1]。蛋白质是基因的最终产物同时也是基因功能的最终执行体,因而人类基因的表达及其功能有待于在蛋白水平上揭示。蛋白质组学的研究目的是分离和鉴定组织或细胞中的所有蛋白质。生物体在生长发育过程中,基因组是相对稳定的,而蛋白表达是高度动态变化的,并且具有严格调控的时间和空间特异性[2]。为了研究生物体在不同状态下表达的所有蛋白质的动态变化,比较蛋白质组学应运而生,即在蛋白组学水平上,研究在正常生理和病理状态,或受到不同的外部环境刺激下,或在突变等因素影响下,蛋白质表达的变化情况,以期发现生物体内关键的调控分子及与疾病相关的蛋白质标志物,最终为疾病的防诊治、新型疫苗的研发等提供理论依据。 为了研究蛋白质表达的动态变化,基因表达检测技术,如微阵列法[3]、DNA(脱氧核糖核酸)芯片法[4]等曾被广泛使用。这些方法虽然能够实现对mRNA(信使核糖核酸)进行定性和定量分析,但 刘新 男,27岁,博士生,现从事比较蛋白质组学研究。 3联系人,E2mail:qianxh1@https://www.doczj.com/doc/e04435248.html, 国家自然科学基金(20505019、20505018)、国家重点基础研究发展规划项目(2004C B518707)和北京市科技计划重大项目(H030230280190)资助项目 2006207220收稿,2006209221接受
《蛋白质结构解析研究进展》 一、蛋白质结构分类 人类对于进化的认识及蛋白质结构相似性比较的研究使蛋白质结构分类成为可能，而且近年来取得的研究进展表明，大部分蛋白质可以成功的分入到适当数目的家族中。目前国际上流行的蛋白质结构分类数据库基本上采取两种不同的思路，一种是数据库中储存所有结构两两比较的结果；第二种思路是致力于构建非常正式的分类体系。由于所有分类方法反映了各研究小组在探究这个重要领域的不同角度，所以这些方法是同等有效的。目前，被广泛应用的四种分类标准是：手工构造的层次分类数据库SCOP，全自动分类的MMDB和FSSP，和半手工半自动的CATH。 蛋白质结构自动分类问题可以被纳入机器学习的范畴，通过提取分析蛋白质结构的关键特征，构造算法来学习蕴含于大量已知结构和分类的数据中的专家经验知识，来实现对未知蛋白质结构的分类预测。目前，对蛋白质结构的不同层次分类，结果比较好的机器学习方法是：神经网络多层感知器、支持向量机和隐马尔可夫模型。支持向量机应用于分类问题最终归结于求解一个最优化问题。上世纪90 年代中期，隐马尔可夫模型与其他机器学习技术结合，高效地用于多重比对、数据挖掘和分类、结构分析和模式发现。多层感知器即误差反向传播神经网络，它是在各种人工神经网络模型中，在机器学习中应用最多且最成功的采用BP学习算法的分类器。 二、蛋白质结构的确定 蛋白质三维空间结构测定方法主要包括X射线晶体学分析、核磁共振波谱学技术和三维电镜重构，这三种方法都可以完整独立地在原子分辨水平上测定出蛋白质的三维空间结构。蛋白质数据库PDB中80%的蛋白质结构是由X射线衍射分析得到的，约15%的蛋白质结构是由核磁共振波谱学这种新的结构测定方法得到。 1、X射线晶体学
第35卷 第1期2011年1月 南京林业大学学报(自然科学版) Journa l o fN anji n g Forestry Un i v ersity (Natural Sc ience Ed ition) V o.l 35,N o .1Jan .,2011 htt p ://www.n l dxb .com [do :i 10.3969/.j issn .1000-2006.2011.01.024] 收稿日期:2009-12-31 修回日期:2010-10-26 基金项目:国家自然科学基金项目(31000287);江苏省高校自然科学基础研究项目(10KJ B220002) 作者简介:甄艳(1976)),副教授,博士。*施季森(通信作者),教授。E-m ai:l js h @i n jfu .edu .cn 。 引文格式:甄艳,施季森.质谱技术在蛋白质组学研究中的应用[J].南京林业大学学报:自然科学版,2011,35(1):103-108. 质谱技术在蛋白质组学研究中的应用 甄 艳,施季森 * (南京林业大学,林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室,江苏 南京 210037) 摘要:随着蛋白质组学研究的迅速发展,质谱技术已成为应用于蛋白质组学研究中的强有力工具和核心技术。质谱技术的先进性在于为蛋白质组学研究提供的通量和分子信息。笔者重点概述了基于质谱路线的蛋白质组学研究,介绍了基于质谱的定量蛋白质组学﹑翻译后修饰蛋白质组学、定向蛋白质组学、功能蛋白质组学以及基于串联质谱技术的蛋白质组学数据解析的研究 进展。 关键词:质谱;蛋白质组学;定量蛋白质组学;翻译后修饰;定向蛋白质组学;功能蛋白质组学中图分类号:Q81 文献标志码:A 文章编号:1000-2006(2011)01-0103-06 Application of m ass spectro m etry i n proteo m ics studies Z HEN Yan ,SH I Jisen * (K ey Labo ra t o ry o f F orest G eneti cs and B i o techno l ogy M i n istry o f Educati on , N an ji ng Forestry U n i versity ,N an ji ng 210037,Chi na) Abstrac t :W ith the rap i d develop m ent o f pro teo m i cs ,m ass spec trom etry i s m aturi ng to be a po w erfu l too l and core tech -nology fo r proteo m ics st udies dur i ng the recen t years .The super i or ity o fm ass spectrom etry lies i n providi ng the through -pu t and the m olecu lar infor m ati on ,w hich no other techno logy can be m a tched i n proteom ics .In th i s rev ie w,w e m ade a g lance on the outli ne o fm ass spectrome try -based proteo m ics .A nd then w e addressed on t he advances o f data ana l y si s o f m ass spec trom etry -based proteom ics ,quantitati ve m ass spectro m etry -based pro teom i cs ,post -translati onal m odificati ons based m ass spectrom etry ,targeted proteo m ics and functiona l proteo m ics based -mass spectrome try .K ey word s :m ass spectrome try;proteo m ics ; quantitative pro teom i cs ; post -trans l ation m odifica ti on ; targ eted pro - teo m i cs ;f uncti ona l proteom ics 蛋白质组学(Pr o teo m ics)是从整体水平上研究细胞内蛋白质的组成、活动规律及蛋白质与蛋白质的相互作用,是功能基因组学时代一门新的学科。 目前蛋白质组学的研究主要有两条路线:一是基于双向电泳的蛋白质组学;二是基于质谱的蛋白质组学,其中基于双向电泳的蛋白质组学研究路线最终也离不开质谱技术的应用。自20世纪80年代末,两种质谱软电离方式即电喷雾电离(electro spray ion izati o n,ESI )和基质辅助激光解析离子化(m a -tri x assisted laser desorpti o n i o nization ,MALD I)的发明和发展解决了极性大、热不稳定蛋白质和多肽分 析的离子化和分子质量大的测定问题[1] ,蛋白质组学研究中常用的质谱分析仪包括离子阱(ion trap ,I T),飞行时间(ti m e of fli g h,t TOF),串联飞行时间(TOF -TOF),四级杆/飞行时间(quadr upo le /TOF hybrids),离子阱/轨道阱(I T /orbitrap hybri d )和离子阱/傅里叶变换串联质谱分析仪(I T /Four i e r transfor m ioncyclotron resonance m ass spectro m eters hybr i d s ,I T /FT M S),这些质谱仪具有不同的灵敏度、分辨率、质量精确度和产生不同质量的M S /M S 谱[2] 。质谱作为蛋白质组学研究的一项强有力的工具日趋成熟,并作为样品制备及数据分析的信息学工具被广泛地应用。因此,有学者指出质谱技术 已在蛋白质组学研究中处于核心地位[3] 。目前在通量及所包含的分子信息内容上,基于质谱的蛋白质组学技术在细胞生物学研究中可以鉴定和量化
蛋白质工程的基本原理蛋白质工程的研究与进展 蛋白质工程的研究与进展摘要: 蛋白质是生命的体现者，离开了蛋白质，生命将不复存在。蛋白质工程开创了按照人类意愿改造、创造符合人类需要的蛋白质的新时期。它所取得的进展向人们展示出诱人的前景。 关键词:蛋白质工程；研究；进展；蛋白质工程汇集了当代分子生物学等学科的一些前沿领域的最新成就，它把核酸与蛋白质结合、蛋白质空间结构与生物功能结合起来研究。蛋白质工程将蛋白质与酶的研究推进到崭新的时代，为蛋白质和酶在工业、农业和医药方面的应用开拓了诱人的前景。 1、蛋白质工程 1.1蛋白质工程的定义所谓蛋白质工程，就是利用基因工程手段，包括基因的定点突变和基因表达对蛋白质进行改造，以期获得性质和功能更加完善的蛋白质分子。 1.2蛋白质工程的由来蛋白质工程是在基因工程冲击下应运而生的。基因工程的研究与开发是以遗传基因，即脱氧核糖核酸为内容的。这种生物大分子的研究与开发诱发了另一个生物大分子蛋白质的研究与开发。这就是蛋白质工程的由来。它是以蛋白质的结构及其功能为基础，通过基因修饰和基因合成对现存蛋白质加以改造，组建成新型蛋白质的现代生物技术。这种新型蛋白质必须是更符合
人类的需要。因此，有学者称，蛋白质工程是第二代基因工程。其基本实施目标是运用基因工程的ＤＮＡ重组技术，将克隆后的基因编码加以改造，或者人工组装成新的基因，再将上述基因通过载体引入挑选的宿主系统内进行表达，从而产生符合人类设计需要的“突变型”蛋白质分子。这种蛋白质分子只有表达了人类需要的性状，才算是实现了蛋白质工程的目标。 1.3蛋白质工程的原理由于基因工程的发展，人们已经可以运用基因重组等理论和方法去设计并制造出预想的各种性能的蛋白质。这种改变蛋白质的操作可以在蛋白质水平上，也可以在基因水平上。如基因水平的改变，是在功能基因开发的基础上，对编码蛋白质的基因进行改造，小到可改变一个核苷酸，大到可以加入或消除某一结构的编码序列。蛋白质水平的改变则主要是对制造出的蛋白质进行加工、修饰，如磷酸化、糖基化等。蛋白质的化学修饰条件剧烈，无专一性，而基因操作则比较方便，在实施基因操作时，必须预先知道是哪个氨基酸或哪几个氨基酸影响着蛋白质的性状。就现代生物技术发展水平看，大量新蛋白质通过检测，来确定改变的蛋白质是否具有预期的性状，技术上已是可行的。 1.4蛋白质工程的基本途径目前，在蛋白质工程中最常采用的技术是定点诱变技术，即在特定的位点改变基因上核苷酸的种类，从而达到改变蛋白质性状的目的。蛋白质工程发展至当代，利用专一改
第35卷 第1期2011年1月 南京林业大学学报(自然科学版) J o u r n a l o f N a n j i n g F o r e s t r y U n i v e r s i t y (N a t u r a l S c i e n c e E d i t i o n ) V o l .35,N o .1 J a n .,2011 h t t p ://w w w .n l d x b .c o m [d o i :10.3969/j .i s s n .1000-2006.2011.01.024] 收稿日期:2009-12-31 修回日期:2010-10-26 基金项目:国家自然科学基金项目(31000287);江苏省高校自然科学基础研究项目(10K J B 220002) 作者简介:甄艳(1976—),副教授,博士。＊施季森(通信作者),教授。E -m a i l :j s h i @n j f u .e d u .c n 。 引文格式:甄艳,施季森.质谱技术在蛋白质组学研究中的应用[J ].南京林业大学学报:自然科学版,2011,35(1):103-108. 质谱技术在蛋白质组学研究中的应用 甄 艳,施季森 ＊ (南京林业大学,林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室,江苏 南京 210037) 摘要:随着蛋白质组学研究的迅速发展,质谱技术已成为应用于蛋白质组学研究中的强有力工具和核心技术。质谱技术的先进性在于为蛋白质组学研究提供的通量和分子信息。笔者重点概述了基于质谱路线的蛋白质组学研究,介绍了基于质谱的定量蛋白质组学﹑翻译后修饰蛋白质组学、定向蛋白质组学、功能蛋白质组学以及基于串联质谱技术的蛋白质组学数据解析的研究 进展。 关键词:质谱;蛋白质组学;定量蛋白质组学;翻译后修饰;定向蛋白质组学;功能蛋白质组学中图分类号:Q 81 文献标志码:A 文章编号:1000-2006(2011)01-0103-06 A p p l i c a t i o n o f m a s s s p e c t r o m e t r y i n p r o t e o m i c s s t u d i e s Z H E NY a n ,S H I J i s e n ＊ (K e y L a b o r a t o r y o f F o r e s t G e n e t i c s a n d B i o t e c h n o l o g y M i n i s t r y o f E d u c a t i o n , N a n j i n g F o r e s t r y U n i v e r s i t y ,N a n j i n g 210037,C h i n a ) A b s t r a c t :W i t ht h e r a p i d d e v e l o p m e n t o f p r o t e o m i c s ,m a s s s p e c t r o m e t r y i s m a t u r i n g t o b e a p o w e r f u l t o o l a n dc o r e t e c h -n o l o g y f o r p r o t e o m i c s s t u d i e s d u r i n g t h e r e c e n t y e a r s .T h e s u p e r i o r i t y o f m a s s s p e c t r o m e t r y l i e s i n p r o v i d i n g t h e t h r o u g h -p u t a n d t h e m o l e c u l a r i n f o r m a t i o n ,w h i c hn o o t h e r t e c h n o l o g y c a n b e m a t c h e di np r o t e o m i c s .I nt h i s r e v i e w ,w e m a d e a g l a n c e o n t h e o u t l i n e o f m a s s s p e c t r o m e t r y -b a s e d p r o t e o m i c s .A n dt h e nw e a d d r e s s e d o n t h e a d v a n c e s o f d a t a a n a l y s i s o f m a s s s p e c t r o m e t r y -b a s e dp r o t e o m i c s ,q u a n t i t a t i v em a s ss p e c t r o m e t r y -b a s e dp r o t e o m i c s ,p o s t -t r a n s l a t i o n a l m o d i f i c a t i o n s b a s e d m a s s s p e c t r o m e t r y ,t a r g e t e d p r o t e o m i c s a n df u n c t i o n a l p r o t e o m i c s b a s e d -m a s s s p e c t r o m e t r y . K e yw o r d s :m a s ss p e c t r o m e t r y ;p r o t e o m i c s ;q u a n t i t a t i v ep r o t e o m i c s ;p o s t -t r a n s l a t i o n m o d i f i c a t i o n ;t a r g e t e d p r o -t e o m i c s ;f u n c t i o n a l p r o t e o m i c s 蛋白质组学(P r o t e o m i c s )是从整体水平上研究细胞内蛋白质的组成、活动规律及蛋白质与蛋白质的相互作用,是功能基因组学时代一门新的学科。目前蛋白质组学的研究主要有两条路线:一是基于双向电泳的蛋白质组学;二是基于质谱的蛋白质组学,其中基于双向电泳的蛋白质组学研究路线最终也离不开质谱技术的应用。自20世纪80年代末,两种质谱软电离方式即电喷雾电离(e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n ,E S I )和基质辅助激光解析离子化(m a -t r i x a s s i s t e d l a s e r d e s o r p t i o n i o n i z a t i o n ,M A L D I )的发明和发展解决了极性大、热不稳定蛋白质和多肽分 析的离子化和分子质量大的测定问题[1] ,蛋白质组学研究中常用的质谱分析仪包括离子阱(i o n t r a p ,I T ),飞行时间(t i m e o f f l i g h t ,T O F ),串联飞行时间(T O F -T O F ),四级杆/飞行时间(q u a d r u p o l e /T O F h y b r i d s ),离子阱/轨道阱(I T /o r b i t r a ph y b r i d ) 和离子阱/傅里叶变换串联质谱分析仪(I T /F o u r i e r t r a n s f o r m i o n c y c l o t r o nr e s o n a n c em a s s s p e c t r o m e t e r s h y b r i d s ,I T /F T M S ),这些质谱仪具有不同的灵敏度、分辨率、质量精确度和产生不同质量的M S /M S 谱[2] 。质谱作为蛋白质组学研究的一项强有力的工具日趋成熟,并作为样品制备及数据分析的信息学工具被广泛地应用。因此,有学者指出质谱技术 已在蛋白质组学研究中处于核心地位[3] 。目前在通量及所包含的分子信息内容上,基于质谱的蛋白质组学技术在细胞生物学研究中可以鉴定和量化