一、仪器的保养
1、整机保养
（1）短期停机
在完成一天工作以后，都要停机等第二天再继续工作，则可按以下步骤停机。
A）关闭二次仪表（记录仪、积分仪或色谱工作站）。
B）关闭检测器电源（同时切断柱箱温度检测器的电源）。
C）停止恒流泵工作，然后切断其电源。
D）用二次蒸馏水冲洗进样阀的进样孔（在“LOAD” 和“INJECT”两个位置）。
E）切断实验室工作电源，加满盛液瓶中的流动相，待第二天使用。
F）将仪器罩上防尘罩。
（2）长期停机
仪器须数周或数月暂不使用，这时除按《短期停机》的A）～D）步骤处理外，还须完成以下步骤：
A）拆下恒流泵的流动相盛液瓶，换上色谱柱指定的保护试剂（例：甲醇、去离子水等），开启泵数分钟（流速0.5 mL/min ~ 1.5 mL/min）后停泵。B）从系统中拆下色谱柱，用专用的密封螺帽将柱管两端密封后保存。C）用普通φ1.6导管替代分离柱联结。
D）用二次蒸馏水或去离子水输入输液泵，开启泵，流量1mL/min~2mL/ min，冲洗泵体、进样阀、检测器流通池数分钟，在冲洗过程切换六通阀数次，使定量管得到清洗。
E）拆除替代柱的导管、泵输入端和出口的导管和流通池输入、输出口导管，分别用螺帽密封输液泵出口和流通池输入、输出口。
F）拨下总电源接线板的插头，贮存好专用的流动相和样品，用干布擦洗仪器，罩上防尘罩。
G）检测器存放地点应干燥。
2、输液泵的保养
输液泵是液相色谱仪的心脏部件，品质再好的泵，若不注意日常保养，其损坏的几率是极高的，将大大降低仪器的使用价值。
a)使用甲醇作流动相，请注意自身保护和环境保护，废液注入空瓶内，集中处理，不得倒入下水道内。
b)输液泵使用前，先注意探漏检查，视各密封点和泵体有否漏液。
c)在无流动相通入的情况下，严禁启动泵体电机，以免柱塞密封环磨损。
d) 测试泵流量性能时，用于收集液体的容器，应选用小口瓶颈的容器，防止收集过程中，溶液蒸发，影响测量精度。必要时应将其密封存放在干燥容器内，以预防光学系统霉变。
e)金属泵体的输液泵，应尽量避免使用含有卤离子（如KCL、NaCL、NH 4CL）的流动相或能产生卤离子的流动相，若必须使用此类流动相，建议使用泵体用非金属材料制造的输液泵。方则使用后，应立即使用去离子水清洗泵体和整个色谱系统的管路。
f)使用的流动相必须是HPLC级或分析纯级，特别是配置的流动相，在使用前，必须过滤掉其中的颗粒状杂质和其他物质（使用0.45μm的滤膜过滤）
g) 长期不使用输液泵，应在最后分析结束时，用注射器吸取去离子水通过专用的泵头清洗孔清洗泵体和柱塞杆。以延长密封圈和宝石柱塞杆的寿命。
h) 输液泵液路在维修或保养时，应切断仪器电源。非专业维修人员请不要打开机箱罩。
3、清洗单向阀和阀体
可以按下图来清洗（仅供参考）：
——非专业仪器维修人员不得装拆输液泵的泵体和单向阀。
——各种不同型号的输液泵机械结构有所不同，维修人员清洗或更换柱塞棒和密封环时，须严格按照该仪器厂商提供的资料（维修说明书）的程序进行。
清洗单向阀可以参考下图:
单向阀不易损坏，但长期运行，会有污染物粘在阀芯中的宝石球和宝石座上，为此须拆开阀体，进行清洗。
4、六通阀的保养
六通进样阀是确保分析精度的重要部件，在高压液体的压力下阀面旋转6 0度，并确保不漏液，这就要求输液孔的密封面上不能有一点微小的固体杂质。因此进入六通阀的样品必须进行过滤处理，以保证分析样品中呈完全的液体状态。
样品的处理方法和需用器具如以下所示：过滤样品的器具为：
测试样品的处理：
专用注射器：
若进样量小于20微升，可使用50微升的微量平头注射器（液相专用）。
每次进样保持20微升，可使用1毫升的注射器，但必须使用特殊的平头注射针头，每次注射量约0.05～0.1毫升，可一次吸取0.9～1毫升的分析样品，多次进样。（转动进样阀时，不必拔出注射器）
5、六通阀的清洗
当多次进样，特别是注射过高浓样品或黏度较大的样品后，很容易污染阀体。因此当使用久后，必须进行清洗。
可采用阀体专用的清洗接头（下图），按图所示接在2ml~5ml的注射器上，吸取酒精溶液，然后从进样口注射进去，余液从排液管导出，在“LOAD”和“INJECT”两个位置各进行数次。
最后再用二次蒸馏水冲洗数次用干净的压缩空气或氮气吹净进样口及定
量管、废液管中的余液，待用。
当六通阀污染严重或通孔有异物进入而堵塞时，则必须将阀拆开，取出其中定子、定子组件、转子密封圈，浸入酒精溶液中清洗，然后再用超声波清洗器在二次蒸馏水浸洗中进行清洗，用干净气体冲洗各通孔后，烘干，重新组合装配。
6、液相色谱柱的保养
重新安装时，可稍稍削去柱管输入端管口一薄层固定相（最好削后用同类固定相填补）然后装上过滤片，拧紧柱接头，封闭两端螺口。
色谱柱常期不使用时，除了进行清洗处理外，还必须在其中充入该柱规定的贮藏液（甲醇、去离子水等）后再密封保存，重新启用时，应用流动相冲洗数分钟后，再接入检测器，以免贮藏液进入流通池。
注：液相色谱柱的种类繁多，不同的分析对象，应选用不同的分离柱、流动相和操作波长。在实际应用中用户可参阅专业液相色谱仪文献和书籍中介绍的内容结合本仪器的特点，选择最佳的分析条件，以达到您的分析目的。
7、液相检测器的保养
微小的颗粒杂质或薄膜沉积在流通池里，会导致基线噪声的增加或降低灵敏度。此时必须进行清洗处理。一般常规清洗不必拆下流通池，可直接在流通池入口处（即检测器输入端），接上一个专用的注射器接头，依次用去离子水、酒精和3M HNO3冲洗流通池，最后用去离子水反复冲洗数次。检测器出口用玻璃瓶盛接流出的废液。
若检测器已长期使用或受到高浓度样品的污染，经上述方法还不能除去污垢，就得取下流通池，按以下步骤拆开进行清洗：
1)卸下紫外检测器侧面遮盖流通池的盖板，松开固定流通池支架的螺钉，小心地取出流通池支架。
2) 拆下连接流通池输入、输出端的不锈钢导管（或PEEK导管），卸下流通池体。仔细拧下石英窗和透镜的护圈。小心取下垫圈、石英窗、透镜、护圈，放在一个盛有乙醇的烧杯内，用超声波清洗机处理5min~10min。3) 用蒸馏水、乙醇冲洗流通池，并用超声波清洗，最后用去离子水冲洗数次，除去池内杂物。
4）烘干各部件（注意：避免用手直接接触透镜及石英窗）。
5）重新装配流通池体。
6) 按原样装在流通池支架上，并接好导管，并进行试漏。（方法：池体输入端与恒流泵连接，开启恒流泵（流动相用蒸馏水），视各密封点及石英窗口是否有漏液溢出。
7）装入紫外检测器机箱内，盖上盖板，并用原螺钉、螺帽固定。
注：上述拆洗应有经培训过的专业维修人员进行。
8、使用液相色谱仪应注意的事项
（1）开启输液泵后，应放空泵的输出端，排除泵体内的气泡再与进样阀、色谱柱相接，方能使流速稳定。
（2）第一次使用的色谱柱或进样过高浓度样品的色谱柱，应在设置流量
下，将柱出口放空，老化数小时后，再与检测器的流通池输入端相连接。（3）开启柱箱温度控制器后，应注意色谱柱的最高使用温度，防止过温。（4）检测器开启后，请勿带电搬动位置，防止机内氘灯损坏。
（5）流通池流出的废液必须集中收集处理，防止污染环境。
（6）必须使用平头专用注射针进入样品，严禁使用普通针尖针头进样。若进样量小于定量管的容量时,可使用微量平口注射器注入六通阀后(不要拔出注射器)，立即转动六通阀，完成一次进样。
（7）当信号电压超过1V或满量程信号超过量程范围时，有可能出现“平头峰”，其积分面积及保留时间会产生很大的误差，此时应稀释样品或扩大量程范围后再进样。
二、液相色谱仪常见故障排除
液相色谱仪结构复杂，且不同型号的色谱仪，出故障时产生的现象有可能不同，以下罗列的现象仅供参考：
1、现象：输液泵压力指示为零(或＜0.5 MPa)且柱后无液体流出。
原因：（1）柱前导管接头漏液；（2）泵柱室内有大量气泡存在；（3）贮液瓶内试剂用完；（4）输液泵未工作。
对应排除方法：（1）检查各接口是否有漏液；（2）放开泵出口接头；
用“清洗”键冲洗泵体；（3）添加流动相；（4）按输液泵操作方法，检查其工作状态。
2、现象：输液泵压力指示超过规定的范围，且柱后无液体流出。
原因：（1）分离柱阻力过大(陈旧柱子)；（2）柱前导管堵塞；（3）泵柱塞内有少量气泡存在；（4）柱子进口处过滤膜堵塞；（5）进样阀手柄未旋到底(处于中间状态)；（6）导管中有颗粒状固体堵塞。
对应排除方法：（1）更换柱子；（2）从柱后开始逐级向上拆开接头检查；（3）拆开泵接头，用“清洗”档赶尽气泡。；（4）拆开柱前接头、更换或清洗过滤膜；（5）左右旋动六通阀至极限位置；（6）逐级检查，并更换导管。
3、现象：柱前压力逐渐升高。
原因：（1）流动相中存在大颗粒的物质；（2）样品未经过过滤处理；（3）柱子输入端滤片污染。
对应排除方法：（1）流动相经＜5μ的真空抽滤瓶过滤后再使用；（2）样品须经滤膜过滤；（3）拆下柱的滤片用超声波清洗,同时刮去柱口表面被污染的固定相。
4、现象：基线大幅度波动(即紫外检测器的输出电平值极不稳定)。
原因：流通池内留有大量的气泡；流通池漏液；紫外检测器有故障。
对应排除方法：排除气泡；检修流通池；停止恒流泵工作，检查紫外检测器。
5、现象：组分峰极小或不出峰。
原因：（1）波长选择不正确；（2）检测器输出衰减太大；（3）进样口漏液；（4）进样阀样品废液管堵塞，样品未进入定量管；（5）进样后未按启动键；（6）定量管容积过小；（7）样品浓度过稀；（8）检测器灯源老化或失效；（9）流动相不纯。
对应排除方法：（1）按标准重新选择波长；（2）重新选择输出量程范围；（3）修理进样阀；（4）拆下六通阀上废液管(5#,6#)重新安装；（5）进样后立即按启动键；（6）更换大容量定量管；（7）浓缩样品后再进样；（8）更换灯源；（9）选择高纯度的流动相。
6、现象：温度指示波动＞±1℃。
原因：（1）设置温度值过低；（2）柱箱密封盖未盖好；（3）温度控制器未启动；（4）柱箱升过高温后，再设置低温；（5）温控部件有故障；（6）控温铂电阻接触不良。
对应排除方法：（1）设置最低温度应室温以上10℃；（2）检查柱安装过
程；（3）按起始键(指示灯亮)；（4）开机后会逐渐稳定(正常现象)；（5）修理温度控制器；（6）拧紧固定铂电阻引线的螺钉。
7、现象：检测器开机时屏幕显示不正常，出现缺字、坐标图形异样、光标无法移动等象。
原因：工作电源不正常或仪器附件有强干扰源存在。
排除方法：检查工作电源电压，采取稳压措施；关机后重新开机；检测器微机系统故障。
实验七高效液相色谱(HPLC)法测定邻苯二甲酸酯 一.实验目的 1、学习高效液相色谱仪的基本操作方法。 2、了解高效液相色谱仪原理和条件设定方法。 3、了解高效液相色谱法在日常分析中的应用。 二.实验原理 高效液相色谱法是以液体作为流动相，借助于高压输液泵获得相对较高流速的液流以提高分离速度、并采用颗粒极细的高效固定相制成的色谱柱进行分离和分析的一种色谱方法。 在高效液相色谱中，若采用非极性固定相，如十八烷基键合相，极性流动相，即构成反相色谱分离系统。反之，则称为正相色谱分离系统。反相色谱系统所使用的流动相成本较低，应用也更为广泛。 定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。分离度（R）的计算公式为： R＝ 2[t (R2)-t (R1) ] /1.7*(W 1 ＋W 2 ) 式中 t (R2)为相邻两峰中后一峰的保留时间； t (R1) 为相邻两峰中前一峰的保留 时间； W 1及W 2 为此相邻两峰的半峰宽。除另外有规定外，分离度应大于1.5。 本实验对象为邻苯二甲酸酯，又称酞酸酯，缩写PAE，常被用作塑料增塑剂。它被普遍应用于玩具、食品包装材料、医用血袋和胶管、乙烯地板和壁纸、清洁剂、润滑油、个人护理用品，如指甲油、头发喷雾剂、香皂和洗发液等数百种产品中。但研究表明，邻苯二甲酸酯在人体和动物体内发挥着类似雌性激素的作用，是一类内分泌干扰物。待测物性质见表1。 表1色谱柱测试条件 如果要检测不同条件对谱图分离的影响，可按表1配制几种物质的混合溶液，在不同条件下进行HPLC分离检测。
三.仪器与试剂 1、仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪，50ul微量注射器。 2、试剂 甲醇（色谱专用），高纯水 四.实验步骤 1、色谱条件 色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶（C8） 柱温：室温 流动相：初始为高纯水：30％，甲醇：70％ 检测器：DAD检测器; 检测波长：220nm； 进样体积：100μl定量环，实际注射每次可控制在200μl。 2、待测溶液的配制 首先用甲醇做溶剂配制储备液：邻苯二甲酸二甲酯（0.3880g/L），邻苯二甲酸二乙酯（0.2770g/L），邻苯二甲酸二丁酯（0.3776g/L）。然后各取1mL储备液用水和甲醇（20：80）稀释至10mL，作为待测溶液。 3、色谱测定 (1) 按操作规程开启电脑，开启脱气机、泵、检测器等的电源，启动Agilent 1100在线工作软件，设定操作条件。流量为1.000ml/min。 (2) 待仪器稳定后，开始进样。将进样阀柄置于“LOAD”位置，用微量注射器吸取混合物溶液50ul，注入仪器进样口，顺时针方向扳动进样阀至“INJECT”位置，此时显示屏显示进样标志。 (3) 记下各组分色谱峰的保留时间及峰面积及分离比。 (4) 实验完毕，清洗系统及色谱柱。依次用甲醇-水（60：40）、甲醇-水（70：30）……直到纯甲醇作流动相清洗，每次清洗至基线走稳，至少清洗15min。 五.实验结果
高效液相色谱仪（HPLC）校正方法 0.1输液系统： 0.1.1梯度误差G C不超过±3% 0.1.2泵流量设定值误差 S s＜±2% 0.1.3流量稳定性误差 S R＜±2% 0.2紫外检测器性能 0.2.1基线噪声不超过5×10-4AU，基线漂移不超过5×10-3AU 0.2.2定量测量重复性误差（6次进样）RSD≤1.5% 0.2.3最小检测浓度不超过1×10-7g/ml萘/甲醇溶液 0.2.4可调波长紫外可见光检测器波长示值不超过±2nm(HP1100高效液相色谱仪可由仪器自身完成) 1校正条件 1.1环境温度10-30℃，相对湿度低于65% 1.2校正设备 1.2.1秒表分度值小于0.1 s 1.2.2分析天平最大称量200g,最小分度值0.1mg 1.2.3容量瓶 1.2.4微量注射器 1.3标准物质和试剂 1.3.1HPLC用甲醇、纯水，分析纯的丙酮 1.3.21×10-4g/ml，1×10-7g/ml的萘甲醇溶液 1.3.3紫外波长标准溶液 2校正方法 2.1梯度误差G C的校正 2.1.1进行梯度洗脱程序，A溶剂为水，B溶剂为0.1%丙酮的水溶液，B经5个阶段从0变到100%， 20%—40%—60%—80%—100%，重复测量两次，取平均值，求各段梯度误差Gci，取最大作为仪器梯度误差，公式：Gci=（Li—Lm）/Lm×100% Li：第i段信号值的平均值； Lm ：各段输出信号平均值的平均值 可接受标准： -3%≤Gci≤3% 2.2泵流量设定值误差Ss、流量稳定性误差S R的校正 2.2.1将仪器的输液系统、进样器、色谱柱和检测器联接好，以甲醇为流动相，按表一设定流量，待 流速稳定后，在流动相排出口用事先清洗称重过的容量瓶收集流动相，同时用秒表计时，准确的收集10-25
文件目录 一、目的 (2) 二、范围 (2) 三、责任者 (2) 四、内容 (2) 五、修订历史 (2) 六、相关记录 (12)
一、目的 1、建立一个日立Chromaster液相色谱仪操作、清洁、维护、保养规程。 二、范围 1、日立Chromaster液相色谱仪。 三、责任者 1、中心化验室主任，操作者。 四、内容 1、仪器型号及组成： 2、工作环境 3、操作规程 3.1使用前准备 a）每次开机前先检查电源连接情况,确保电源正确的连接。 b）每次开机前检验流动相,以保证足够量的流动相。 3.2 开机确认电源连接正确后，打开各使用模块电源。 3.3打开与设备连接的电脑，在电脑桌面双击图标，使操作系统与设备联机，进入登录窗口。 3.4 第一次使用仪器时应对仪器进行配置。选择配置，进入仪器配置界面 3.4.1 点击“增加”，选择连接的仪器
3.4.2 打开仪器，自动检测配置的仪器模块
3.4.3 确认自动检测所有模块，确认泵的信息、自动进样器的信息、柱温箱信息（选择control off at shutdown）、检测器信息（选择lamp off at shutdown） 3.4.4 配置仪器，点击向右箭头，命名仪器名称。 3.5 输入用户名、密码，选择创建新工程登录。 3.6 仪器准备 3.6.1 排空打开设备监视器，打开排空阀，设流速为5，流量100%，点击“清洗”，分别将四条管路排气泡，结束之后关闭排空阀。 3.6.2 自动进样器清洗点击“清洗”，依次对柱塞、注射器进行清洗 3.7方法设置 点击“新建方法”，在“方法”下选择“事件表”按照检测需要对自动进样器、LC梯度、液相色谱控制、测量、采集、恒温器、积分、计算进行设置，设置完成后点击“发送方法” 3.8 基线方法发送仪器运行稳定之后，点击“数据采集”查看基线 3.9 序列设置及运行点击“序列”，分别对样品起始位置“SV”、结束位置“EV”、样品
高效液相色谱方法的验证 ?方法验证的目的 ?方法验证的内容 ?方法验证的项目及测定方法
方法验证的目的 目的：证明采用的方法适合相应检测的要求。 方法验证是实验室针对特定方法的研究过程，通过设计方案，有步骤、系统地收集、处理实验数据，最终形成文件，以证明所用试验方法准确、灵敏、专属并重现。同一分析方法用于不同的检测项目会有不同的验证要求。
方法验证的内容 ?准确度 ?精密度 ?专属性 ?检测限 ?定量限 ?线性和范围 ?耐用性
准确度 定义：方法测定结果与真实值或参考值的接近程度。一般用回收率%表示。 1. 主成分含量测定 原料药：对照品或方法比对 2. 制剂、中药：标准加样回收 杂质定量 测定：加样回收（n 3 9） 杂质对照品 方法比对 回收率 C-A %=′ B 100% 杂质与主成分的相对含量 A:试验供试品中被测成分的量 （通常为含量测定量的50%） B: 试验供试品中加入的对照品的量 （通常为±20%） C:试验测定值
精密度 定义：在规定测试条件下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。一般用偏差，相对偏差和相对标准偏差 1. 重复性（n 9） 3 2. 中间精密度 3. 重复性 测定：HPLC方法的精密度测试，应从样品制备开始，设计3个浓度， 分别平行制备3份，以测定含量计算相对标准偏差；或同一样品平行制备6份供试品，分别进样，以峰面积计算相对标准偏差。 同一份供试品连续进样6次，计算得到的相对标准偏差只能表征进样精密度，不能作为方法精密度。
专属性 定义：在其它成分可能存在下，方法能正确测定出被测物的特性。 1. 鉴别反应 2. 含量测定 杂质测定 测定： 限量检查 空白制剂，模拟复方 加速破坏试样测试 DAD峰纯度检查
Agilent 1260-LC液相色谱仪使用、维护 操作规程 目录 一、目的 (2) 二、适用范围 (2) 三、内容 (2) 四、附件 (18) 五、变更历史 (18)
一、目的 明确Agilent 1260 LC型液相色谱仪硬件使用、维护保养操作方法，使质量部检验人员有章可循。 二、适用范围 本规程适用于公司Agilent 1260-LC型液相色谱仪使用、维护保养操作。 三、内容 1.制定依据 《Agilent 1260 LC system Operating Manual》 《Agilent OpenLAB Control Operating Manual》 2.工作原理： 2.1.高效液相色谱法是用高压输液泵，将具有不同特性的单一溶液或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相，用泵压入装有固定相的色谱柱，经进样阀注入供试品，由流动相带入色谱柱内，在色谱柱内各成分被分离后，依次进入检测器，色谱信号由色谱工作站进行记录处理。利用色谱图色谱峰面积或峰高大小可对待测样品进行定性定量分析。 Agilent 1260 LC型液相色谱仪主要由G1329B四元泵、G1329B自动控温自动进样器、G1316柱温箱、G4212B二极管阵列检测器和Open LAB色谱工作站等部件组成。 3.基本操作步骤 3.1.开机准备 3.1.1.启动计算机：打开计算机电源，登陆windows操作系统。 3.1.2.启动工作站：打开Agilent 1260LC各模块电源。待Agilent 1260LC 各模块自检完成后(各模块右上角指示 灯为黄色或者无色)，点击屏幕左下角 “开始”，选择“所有程序”，选 择”Agilent Technologies”选择“Open LAB”，选择OpenLAB Control,或单击 桌面图标则会进入到上图的界面。上面步骤如果已经配置过，则不需要
高效液相色谱法测定含量示例的方法再确证作者：张建芝冯顺 来源：《维吾尔医药》2013年第07期 摘要：目的：确证用反相高效液相色谱法测定头孢氨苄含量的方法有效性和准确性。方法：以Diamonsil CLC-ODS（150mm x 6mm，10 lm）为色谱柱，水-甲醇- 3.89% 醋酸钠溶液- 4% 醋酸溶液（700：300：15：3）为流动相，检测波长为254 nm，外标法定量。结果：头孢氨苄浓度线性范围为0.02～0.20mg / ml，相关系数r= 0.9991，方法重复性试验 RSD为 1.42%。结论：该方法可简单高效地完成，结果准确性好、稳定可靠，确证高效液相色谱依然为头孢氨苄制剂的质量控制中有效可靠的方法。 关键词：头孢氨苄高效液相色谱法 头孢氨芐（Cefalexin，又译先锋霉素Ⅳ、头孢力新等）是一种半合成的第一代口服头孢霉素类类抗生素药物，化学名（6R，7R）-3-甲基-7-[（R）-2-氨基-2-苯乙酰氨基]-8-氧代-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-甲酸，化学式C16H17N3O4S，在临床上广为使用。其含量测定在旧版的中国药典（ 1995年版）采用碘量法○1。但此法不仅操作步骤繁多，费工费时，干扰因素多；然后人们发明采用高效液相色谱法内标法测定的方法，但内标物保留时间过长，依然存在问题。最后人们又发现采用高效液相色谱法，用外标法测定其含量，方法操作简单方便、数据准确可靠，灵敏度较高，重复性好，最终获得了较为满意的结果○2。现在本文对这个方法进行确证，以确定该方法的有效性和准确性。 1.仪器与试药 分析天平（precisa instrument ltd switzer land xs 225a precisa ），高效液相色谱柱（diamonsic C18 250 * 46mm），检测器（UVD 170v），泵（P680 HPLC pump），头孢氨苄胶囊（广州白云山制药总厂批号：2110102） 2. 色谱条件 用十八烷基硅烷键和硅胶为填充剂：水-甲醇- 3.89% 醋酸钠溶液 - 4% 醋酸溶液（700：300：15：3）为流动相；检测波长为254nm；理论塔板数按头孢氨苄峰计算不低于1500。 3. 实验试剂制备 3.1 对照品储备液的制备：对照品储备液的制备：取头孢氨苄对照品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，为对照品储备液。 3.2 供试品溶液的制备：去装量差异项下的内容物，混合均匀，精密量取适量（约相当于头孢氨苄0.1g），置于 100ml 容量瓶里，加流动相适量，充分振摇使溶解，再加流动相稀释至
高效液相色谱法测定手册 一目的：制定高效液相色谱法，规范高效液相色谱法的测定操作。 二适用范围：适用于高效液相色谱法的测定。 三责任者：品控部。 四正文 1 简述 高效液相色谱法是一种现代液体色谱法，其基本方法是将具一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液，作为流动相，用泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图或进行数据处理，得到测定结果。由于应用了各种特性的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高，分析速度快的特点。 高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的药品的分析测定，特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分子物质的测定。有的药品需在色谱分离前或后经过衍生化反应方能进行分离或检测。常用的色谱柱填充剂有：硅胶，用于正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相或正相色谱，其中最常用的是十八烷基硅烷（又称ODS）键合硅胶，可用于反相色谱或离子对色谱；离子交换填料，用于离子交换色谱；具一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。 高效液相色谱仪基本由泵，进样器，色谱柱，检测器和色谱数据处理系统组成。检测器最常用的为可变波长紫外可见光检测器，其他检测器有如示差折光检测器和蒸发光散射检测器等。色谱信息的收集和处理常用积分仪或数据工作站进行。梯度洗脱，可用两台泵或单台泵加比例阀进行程控实现。 2 高效液相色谱仪的使用要求 2.1 按国家技术监督局国家计量检定规程汇编中“实验室液相色谱仪检定规程（JJG705—90）”的规定作定期检定，应符合规定。 2.2 仪器各部件应能正常工作，管路为无死体积连结，流路中无堵塞或漏液，在设定的检测器灵敏度条件下，色谱基线噪音和漂移应能满足分析要求。 2.3 具体仪器在使用前应详细参阅各操作说明书。
15-岛津LC-2030高效液相色谱仪使用、维修、保养操作规程
云南品斛堂生物科技有限公司 文件名称岛津LC-2030高效液相色谱仪使用、 维修、保养操作规程 页码2/10 文件类别工作标准颁发部门质量部文件编号SOP-03-015-00 制定审核批准 制定日期年月日审核日期年月日批准日期年月日分发部门质量部、生产部实施日期年月日文件状态修订口新订口原因：执行2010年版药品生产质量管理规 范 1目的：建立岛津LC-2030高效液相色谱仪使用、维修、保养操作规程，确保仪器的正确操作。 2范围：本规程适用于岛津LC-2030高效液相色谱仪使用、维修、保养。 3责任：化验室负责人，化验员。 4内容： 4.1概述 本系统由四元低压梯度系统输送泵、自动进样器、UV检测器、柱温箱、LabSolutions色谱数据工作站和电脑等组成。 4.2原理 储液器中的流动相被高压泵打入系统,样品溶液经进样器进入流动相,被流动相载入色谱柱固定相内,由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数,在两相中作相对运动时,经过反复多次的吸附-解吸的分配过程,各组分在移动速度上产生较大的差别,被分离成单个组分依次从柱内流出,通过检测器时,样品浓度被转换成电信号传送到记录仪,数据以图谱形式打印出来。 4.3技术参数 流量设定范围0.0001～10 mL/min 流速精度±1% 或±2μL/min 最大操作压力44MPa 进样数216个样品外形尺寸mm 410×500×605mm 波长重现性±0.1nm 温控精度±0.1℃波长范围190～700nm 噪声±2.5×10-6AU 漂移100×10-6AU/h 4.4设备安装位置
标准操作规程 1目的：建立高效液相色谱测定法操作规程，以使检验操作规化。 2适用围：适用于高效液相色谱测定法检验操作全过程。 3责任：QC人员对本SOP实施负责。 4容 高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入色谱柱，各组分在柱被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。 4.1.对仪器的一般要求和色谱条件 高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。色谱柱径一般为3.9~4.6mm，填充剂粒径为3~10μm。超高效液相色谱仪是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。 4.1.1.色谱柱 反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。 正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。常用的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。 手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。 色谱柱的径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分
离物质的性质来选择合适的色谱柱。 温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。 残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相pH值一般应在 2?8之间。残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH 值小于2或大于8 的流动相。 4.1.2.检测器 最常用的检测器为紫外-可见分光检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。 紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与被测物质的量有关，还与其结构有关；蒸发光散射检测器和示差折光检测器为通用检测器，对所有物质均有响应。结构相似的物质在蒸发光散射检测器的响应值几乎仅与被测物质的量有关。 紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器和示差折光检测器的响应值与被测物质的量在一定围呈线性关系，但蒸发光散射检测器的响应值与被测物质的量通常呈指数关系，一般需经对数转换。 不同的检测器，对流动相的要求不同。紫外-可见分光检测器所用流动相应符合紫外-可见分光光度法（通则0401）项下对溶剂的要求；采用低波长检测时，还应考虑有机溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测器和质谱检测器不得使用含不挥发性盐的流动相。 4.1.3.流动相 反相色谱系统的流动相常用甲醇-水系统和乙腈-水系统，用紫外末端波长检测时，宜选用乙腈-水系统。流动相中应尽可能不用缓冲盐，如需用时，应尽可能使用低浓度缓冲盐。用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱时，流动相中有机溶剂一般不低于5％，否则易导致柱效下降、色谱系统不稳定。 正相色谱系统的流动相常用两种或两种以上的有机溶剂，如二氯甲烷和正己烷等。 品种正文项下规定的条件除填充剂种类、流动相组分、检测器类型不得改变外，其余如色谱柱径与长度、填充剂粒径、流动相流速、流动相组分比例、柱温、进样量、检测器灵敏度等，均可适当改变，以达到系统适用性试验的要求。调整流动相组分比例时，当小比例组分的百分比例X小于等于33%时，允许改变围为0.7X?1.3X；当X大于33%时，允许改变围为X—10%?X+10% 。
优胜美特制药有限公司&浙江巨泰药业有限公司 --------药物研究所-------- 变更内容及定期审核 制定Agilent 1260型高效液相色谱仪操作维护规程，使操作维护规范化，保证检测结果准确可靠。
二、适用范围 本规程适用于Agilent 1260型高效液相色谱仪的操作维护。 三、职责 QC对本规程的实施负责，项目主管、研发总监对本规程实施进行监督。 四、程序内容 4.1仪器配置 本仪器由梯度泵，自动进样器，柱温箱，VWD检测器或DAD检测器和操作软件工作站组成。 4.2操作前的准备 色谱纯的试剂配制流动相，必要时照紫外分光光度法进行溶剂检查，应符合要求；水为新鲜制备的重蒸馏水。对规定pH值的流动相，应使用精密pH计进行调节，配制好的流动相应通过0.45μm以下的滤膜滤过，用前脱气，应配制足量的流动相。 4.2.2 供试溶液的配制供试品用规定溶剂配成供试溶液。定量测定时，对照品溶液和样品供试溶液均应分别配制2份。供试溶液在注入色谱仪前，一般应经0.45μm以下的滤膜滤过，必要时，在配制供试溶液前，样品需经提取净化，以免对色谱系统产生污染。 4.2.3 检查上次使用记录和仪器状态，检查色谱柱是否适用于本次试验，色谱柱进出口位置是否与流动相的流向一致，原保存溶剂与现用流动相能否互溶，流动相的pH值与该色谱柱是否相适应，仪器是否完好，仪器的各开关位置是否处于关断的位置。 4.3仪器的操作 4.3.1 接通电源，打开计算机及工作站其他各部件开关，约30秒后，各部件进入待机状态，指示灯为橘黄色，启动完成。 →梯度泵→柱温箱→检测器的状态，橘黄色为未就绪状态，绿色为空闲状态，粉色为进样状态，蓝色为运行状态，红色为出错状态。 显示所有数据：即打开运行样品时所有记录运行状态的数据图谱。 平铺数据：即将所有运行状态图谱平铺。 重叠数据：即将所有运行状态图谱重叠。 4.4色谱条件的设定及数据采集操作过程 一模块图标中的控制来开或关。把泵上的Purge阀逆时针松开，调流速为3.0ml/min,启动泵，系统开始排气泡，直到管线内（由容器瓶到泵出口）无气泡为止，切换通道继续Purge，直到所用流动相通道中无气泡为止，调流速为1.0ml/min，再把Purge 阀顺时针旋紧。 “与泵和进样器一致”使柱温箱温度一致，单击确定进入下一画面。 “最大压力限度”处输入柱子的最大耐高压，以保护柱子，单击确定进入下一画面。VWD检测器参数的设定
八．饮料中游离色氨酸的测定(高效液相色谱测定方法) 本方法适合饮料中游离色氨酸的测定 本方法检测限：饮料中游离色氨酸为30μg/100ml。 （一）方法提要 试样的游离色氨酸经处理后，在高效反相色谱C18柱上分离，紫外检测器或二极管阵列检测器检测，外标法定量游离色氨酸的含量。 （二）仪器 1. 高效液相色谱仪带紫外检测器或二极管阵列检测器。 2. 超声清洗仪（溶剂脱气用）。 3. 天平（精确到0.0001g）。 4. 微孔滤膜（HF 0.45 μm）。 （三）试剂 1. 1.0mol/L氢氧化钠溶液：称取4.0g氢氧化钠（分析纯），加适量去离子水并稀释到100ml。 2. 甲醇（色谱纯）。 3. 0.1%(m/V)磷酸溶液：1.0g磷酸（分析纯）加水至1000mL，溶解混匀，过微孔滤膜0.45μm，待用。 4. 色氨酸对照品，Fluka公司(纯度≥99.5%)。 5. 色氨酸标准溶液：精密称取色氨酸对照品约0.0300g，移入100ml容量瓶中，加入少许水，再加入50μL1.0mol/L氢氧化钠溶液，超声溶解并用水定容到100mL，成浓度为300μg/mL的标准储备液。取标准储备液5.0mL用去离子水定容到50mL，成为浓度为30μg/mL的标准溶液。 （四）测定步骤 1. 样品处理： ①汽水、可乐型饮料：取均匀试样置于小烧杯中，微温除去二氧化碳（或超声脱气10min），经0.45μm微孔滤膜过滤后供进样用。 ②果汁类：取均匀试样置于离心管中，5000rpm/min离心20min，上清液经0.45μm微孔滤膜过滤后供进样用。 2. 标准工作曲线制作。精密吸取色氨酸标准溶液1.0，5.0，10.0ml，分别置于100mL容量瓶中，用水定容到100mL，摇匀。分别取10μL标准工作系列溶液进样
液相色谱实用技术(一) HPLC定量原理及方法
液相色谱定量分析的基本原理 ?在定性的基础上定量,需有纯物质作为标准物 ?液相色谱定量是相对定量的方法: 即由已知量的纯被测物标样推算混合物中被测物的量?液相色谱法定量的依据是: ?被测组分的量与响应值(峰高或峰面积)成正比 ?由已知量的标样可求得定量校正因子 ?定量校正因子:是定量计算公式中的比例常数,其物理意义是单位响应值(峰面积)所代表的被测组分的量?测定未知组分的响应值,通过定量校正因子即可求得其含量
液相色谱定量分析的基本步骤?开发一个适合定量分析的色谱方法: 确认被检测组分峰,并达到分离度(R)大于1.5 确定被测组分色谱峰的一致性 确定方法的检测限及定量限;灵敏度及线性范围 ?用不同浓度的标准样品建立校正曲线 ?考查定量方法的准确度及精密度 ?用M32色谱管理系统实施样品采集,数据处理及报告结果
鉴别需定量的色谱峰(定性) ?定性鉴别每个要定量的色谱峰 ?通过比较保留值(通常是保留时间)的方法,找到各色谱峰所对应的组份 ?大多数情况下用与标样比较保留时间来定性 ?即所谓： ?保留时间相同，可能是同样的组份 ?保留时间不同，肯定不是同样的组份
用保留时间定性 ?用“标样”的保留值定出被测组份的位置 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.350.40 0.000.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.507.00 AU Minutes Uracil Ethylparaben Propylparaben
1 使用前 1.1 保持贮液瓶清洁，对专用贮液瓶应定期清洁；用试剂瓶作贮液瓶时，要经常更换。 1.2 定期（如半个月）在稀硝酸溶液中超声、清洁过滤器，保持过滤器畅通无阻。 1.3 使用HPLC试剂和新蒸二次蒸馏水作流动相，所使用的溶剂其截止波长一定要低于检测波长，对不是HPLC级的试剂要进行过滤（HPLC试剂出厂前已用0.02μm滤膜过滤）。对流动相一定要脱气。 1.4 每天开始使用仪器，注意放空排气，确保泵头、流动池以及其它流路系统中无气泡存在。 1.5 保持仪器使用环境20℃-30℃，湿度30%-70%。 2 使用中 2.1 珍惜保护色谱柱，避免柱头突然产生大的波动，扰动损伤柱床。如避免泵启动过速、升压过快、样品阀搬动过慢所造成的柱压力的波动。 2.2 采用保护（警戒）柱，延长柱寿命。如污染物堆积于保护柱柱头，造成柱压升高，柱效下降，峰型变差时，卸下用强溶剂反冲后再用或更换新保护柱。 2.3 避免超负荷进样，对250*4.6mm的柱子，绝对进样量应不超过100μg。在灵敏度允许的前提下，应尽量将试样浓度降低，减少绝对进样量（进样体积可保持不变），这是保持HPLC 柱性能持久良好的重要举措之一。 2.4 经常用强溶剂冲洗柱子，将柱内强保留组分及时洗脱出。反相柱用异丙醇-二氯甲烷（1:1）冲洗，正相（硅胶柱）用纯甲醇或异丙醇冲洗，时间均不少于1h。 2.5 以硅胶为基质的柱子，如C-18、C-8等，要控制好流动相的pH值，一般不要低于2.5，不高于7.0。 2.6 尽量用流动相溶解样品，一是避免出现拖尾峰、怪峰，二是避免试样在系统中由于溶解度降低而析出。 2.7 对于阻塞或受伤严重的柱子，必要时，可卸下不锈钢滤板，超声洗去滤板阻塞物，对塌陷污染的柱床进行清除、填充、修补工作，此举可使柱效恢复到一定程度（80%），有继续使用的价值。 2.8 色谱仪检测器输出和积分仪（处理机）要匹配，要合理设置参数如斜率、半峰宽、阈值、AUFS值、衰减等。将适宜的进样量和合适的参数结合起来，使主峰峰高达到记录仪满量程的80%左右。 2.9 如仪器突发故障，应立即停机并报告，由专业人员排除故障后经校准方可重新使用。 3 使用后 3.1 做完实验，及时用适当溶剂冲洗柱子和进样阀，尤其是对过夜的柱子和进样阀，一定要
高效液相色谱仪维护保养操作规程
目的:建立高效液相色谱仪维护保养规程。 范围：高效液相色谱仪的维护保养。 责任：质量部、后勤保障部负责人。 内容： 1.泵的维护 1.1流动相的更换 1.1.1将新流动相置于储液瓶中。 1.1.2打开放空阀，启动泵使新的流动相从放空阀出口流出20ml.左右。 1.1.3关闭放空阀，然后将进样阀与色谱柱相连接端卸开，用小容器放置于进样阀的出口处。 1.1.4启动恒流泵，让流动相从进样阀出口流出10ml左右。 1.1.5重新连接色谱柱，设定适当流速，当流动相流出约30倍于色谱柱体积，而且检测器基线平恒后，流动相更换完毕。 1.2换非互溶性流动相（如甲醇系统更换为正己烷系统） 1.2.1准备50ml能与新旧流动相互溶的中介溶剂（如异丙醇）。 1.2.2用中介溶剂更换泵中的旧流动相，步骤同‘更换互溶流
动相’中的1－5过程（不要接色谱柱）。 1.2.3如果色谱柱中流动相也需要更换，用该溶剂冲洗色谱性。 1.2.4准备新流动相并置于储液瓶中。 1.2.5用新流动相更换中介溶剂步骤同‘更换互溶流动相’中的1－5过流动相更换完毕。 1.3换缓冲液流动相（如磷酸盐缓冲液更换为甲醇系统） 1.3.1取超纯水或去离子水500ml。 1.3.2用水更换色谱系统中缓冲液（不包括色谱柱），具体步骤与‘更换互 溶流动相’中的1－5过程相同。 1.3.3用水含量10%－60%范围的溶剂冲洗色谱柱中的盐。1.3.4用新流动相更换水或冲洗色谱柱溶剂，具体步骤与‘更换互溶流动相’中的1－5过程相同。 1.3.5【注意】由于一般缓冲液遇到甲醇、异丙醇等高含量有机溶剂混合液时容易将缓冲液中盐结晶出来，而结晶盐对密封圈、柱塞杆以及进样阀内部转子和定子都有很大的损坏，也容易阻塞输液管路，因此要特别仔细操作。 1.3.6用缓冲液作流动相或一段时间不使用泵，在关机前，首选用含量较高的超纯水或去离子水混合溶剂冲洗色谱柱和系统中的盐，然后用纯甲醇或乙腈冲洗。
高效液相色谱定量分析过程可分为样品的前处理、标准品的配制、进样、色谱分离、检测及数据处理等七个步骤。 一误差的主要来源 随着现在市场销售仪器自动化程度的提高，进样、色谱分离、检测及数据处理等实验环节对实验结果产生的误差越来越小，尤其在高效液相色谱定量分析中，实验结果的误差可能主要来源于样品的前处理及标准品的配制。 1、样品的前处理 样品的萃取率是样品前处理时存在的主要问题。当固-液萃取（含柱分离的前处理方法），液-液萃取时，存在萃取率不高且不稳定的问题。尤其在除去蛋白质时，存在变性蛋白质会吸附一些被测组分，导致萃取率降低的情况。通常，萃取率是通过在式样中添加被测成分在萃取的方法评价的。也就是说，被测成分的增加量和液相色谱中的峰面增大成比例关系，通过这种方法可以确定溶液中被测成分的变化趋势。 如果存在萃取率不稳定的问题，就有必要改变萃取的方法，要预先添加内标，然后萃取。这种情况采用的内标，必须与被测物质的化学结构类似，萃取的萃取率才可能相近。如果回收率不但接近100%而且较为稳定，可以证明这种前处理方法较为可靠。在分析中如果能充分考虑以上误差产生的各种原因，才有可能得到精确的分析结果。2、标准品的配制 本帖中讨论的问题带有普遍性，影响高效液相色谱分析结果准确性的
因素较多，仅在标准溶液的配置过程中，可以分为标准物质的称量，溶液的配制和溶液的储存三个环节。 作为标准溶液使用的标准物质其纯度要求很高，应避免使用纯度不符合要求的试剂，作为标准溶液使用的标准物质具有不可替代性，现在市场有销售的HPLC专用的溶剂及各种标准试剂可供实验选择；其次选择与样品浓度要求相适应的天平，应该尽可能使用高精度的天平，这样才能把由于天平使用带来的称量操作误差降至最低。 二消除误差的方法 要提高分析结果的准确度，必须考虑在分析过程中可能产生的各种误差，采取有效措施，将这些误差减到最小。 1、选择合适的分析方法各种分析方法的准确度是不同的。化学分析法对高含量组分的测定能获得准确和较满意的结果，相对误差一般在千分之几。而对低含量组分的测定，化学分析法就达不到这个要求。仪器分析法虽然误差较大，但是由于灵敏度高，可以测出低含量组分。在选择分析方法时，一定要根据组分含量及对准确度的要求，在可能条件下选最佳分析方法。 2、增加平行测定的次数如前所述增加测定次数可以减少随机误差。在一般分析工作中，测定次数为2—4次。如果没有意外误差发生，基本上可以得到比较准确的分析结果。 3、消除测定中的系统误差消除测定中系统误差可采取以下措施：其一是做空白实验，即在不加试样的情况下，按试样分析规程在同样操作条件下进行的分析。所得结果的数值称为空白值。然后从试样结果
高效液相色谱质谱仪日常维护计划 目的：指导化验员正确的维护和保养高效液相色谱质谱仪，提高仪器使用寿命，使仪器稳定的工作得到稳定可靠的数据。 液相色谱仪部分： 一：流动相的制备要求： 高效液相级色谱醇，二次蒸馏水，缓冲盐一定要过滤；流动相 脱气至关重要（可采用抽滤，超声波脱气等方法 二：高压恒流泵的维护和保养 1．高压恒流泵为整个色谱系统提供稳定均衡的流动相流速，保证系统的稳定运行和系统的重现性。高压输液泵由步进电机和柱塞等组成，高压力长时间的运行回逐渐磨损泵的内部结构。在升高流速的时候应梯度势升高，最好每次升高0.2ml/min当压力稳定时再升高，如此反复直到升高到所需流速。 2．特殊情况下可拆下滤头抽取以判断其中是否堵塞；亦可用注射器吸取流动相通过吸滤头打出以判断其是否堵塞。若有堵塞情况可用异丙醇超声波清洗；清洗不成功则需要更换 3．在仪器使用完了以后，要及时清晰管路冲洗泵，保证泵的良好运转环境，保证泵的正常使用寿命。 三：色谱柱的维护和保养 1．所使用的流动相均应为HPLC级或相当于该级别的，在配置过程中所有非HPLC级的试剂或溶液均经0.45um薄膜过滤。而且流动相使用前都经过超声仪超声脱气后才使用。 2．所使用的水必须是经过蒸馏纯化后再经过0.45um水膜过滤后使用，所有试液均新用新配。并且在进样的样品都必须经过0.45um
薄膜针筒过滤后进样。 3．所使用到的最大流速为1.0ml/min，所以流速提升过程应是梯度提升，不存在流速的突升突降。 4．在仪器检测完了后，均使用水：甲醇=90：10清洗了管路和色谱柱1小时以上，使用水：甲醇=90：10保存管路和色谱柱40分钟以上。 四：工作站的维护 出现死机可重启计算机；不正常运行时，首先可更换电脑测试其硬件故障；或在本机上重新插拔接口、重新安装软件。 五：常见故障及日常维护 下表中列出了液相色谱常见的一些问题，右侧中则列出了的日常维护的方法可以减少问题出现的频率。 溶剂瓶
高效液相色谱法含量测定 1检验方法 高效液相色谱法 2检验原理 高效液相色谱法系采用高压输液泵，将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对样品进行测定的色谱方法。注入样品，由流动相带入柱内，各组分在柱内被分离，并依此进入检测器，由数据处理系统记录和处理色谱信号。 3检验试剂 甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、纯水（高纯水）、磷酸等。 4供试品溶液制备 取要测试的供试品适量，参照《药典》及《制剂规范》，用规定的溶剂适宜的提取精制方法，配制成一定浓度的供试品溶液。供试品溶液注入色谱柱前要经适宜的0.45nm的滤膜滤过。5对照品溶液制备 根据供试品所要测定的成分取相应的对照品，用适宜的溶剂配制成相应浓度的对照品溶液。6流动相配制 用高纯度的试剂配制流动相，水应为新鲜配制的高纯水。配制好的流动相通过适宜的0.45nm 的滤膜滤过，用前脱气。 7操作 7.1打开自动进样器、检测器、泵、柱温箱，进入工作站。 7.2自动进样器排气 自动进样器排气用50%甲醇（用前脱气），点击自动进样器界面上的purge键，自动排气25分钟。 7.3泵排气 分析界面中，设置方法参数，下载方法参数。用流动相冲洗吸滤头，再把吸滤头浸入流动相中，逆时针旋转排气阀90-180度，点击purge键，排气3-4分钟，顺时针旋转排气阀90-180度，激活仪器。 7.4进样操作 7.4.1.将对照品溶液和供试品溶液分别置于样品瓶中，盖上带有垫片的瓶盖，顺时针旋紧，7.4.2将样品瓶按顺序放置于样品瓶架上。 7.4.3设置方法参数，选择波长、柱温、流速、结束时间等，下载并保存方法文件，待色谱系统充分稳定，基线平直。 7.4.4设置批处理分析表。分析界面主项目中，点击批处理分析，依次设置样品瓶号、样品瓶架号、样品名、方法文件、数据文件、进样体积，保存批处理分析表，点击批处理分析开始，开始数据采集。 7.4.5不同浓度的对照品溶液和同一浓度的供试品溶液应分别进样不少于5针。 7.5色谱数据的收集处理 7.5.1 建立标准曲线 7.5.1.1再解析界面中，选择要处理的对照品数据的其中一个数据，点击向导，出现化合物表向导，选择最小面积，点击下一步，选择有效峰，点击下一步，输入浓度单位，最大级别数，点击下一步，输入化合物名，依次输入几个对照品溶液浓度，点击完成。保存方法文件。7.5.1.2在方法中，打开上述所保存的方法文件，出现校准曲线视图，将相应浓度的对照品色谱数据拖至数据文件相应的级别中，形成标准曲线图，查看R数值不大于0.9999，表明线性关系良好，方法文件另存为标准曲线。
140 7 高效液相色谱技术（HPLC ） 高效液相色谱（HPLC ：High Performance Liquid Chromatography ）是化学、生物化 学与分子生物学、医药学、农业、环保、商检、药检、法检等学科领域与专业最为重要的 分离分析技术，是分析化学家、生物化学家等用以解决他们面临的各种实际分离分析课题 必不可缺少的工具。国际市场调查表明，高效液相色谱仪在分析仪器销售市场中占有最大 的份额，增长速度最快。 高效液相色谱的优点是：检测的分辨率和灵敏度高，分析速度快，重复性好，定量精 度高，应用范围广。适用于分析高沸点、大分子、强极性、热稳定性差的化合物。其缺点 是：价格昂贵，要用各种填料柱，容量小，分析生物大分子和无机离子困难，流动相消耗 大且有毒性的居多。目前的发展趋势是向生物化学和药物分析及制备型倾斜。 7.1 基本原理 固定相 流动相 A B C C B A 固定相 —— 柱内填料，流动相 —— 洗脱剂。 HPLC 是利用样品中的溶质在固定相和流动相之间分配系数的不同，进行连续的无数 次的交换和分配而达到分离的过程。 通常，按溶质（样品）在两相分离过程的物理化学性质可以作如下的分类： 分配色谱：—— 分配系数 亲和色谱：—— 亲和力 吸附色谱：—— 吸附力 离子交换色谱：—— 离子交换能力 凝胶色谱（体积排阻色谱）：—— 分子大小而引起的体积排阻 分配色谱又可分为：
正相色谱：固定相为极性，流动相为非极性。 反相色谱：固定相为非极性，流动相为极性。用的最多，约占60～70％。 固定相（柱填料）： 固定相又分为两类，一类是使用最多的微粒硅胶，另一类是使用较少的高分子微球。后者的优点是强度大、化学惰性，使用pH范围大，pH=1～14，缺点是柱效较小，常用于离子交换色谱和凝胶色谱。 最常使用的全孔微粒硅胶（3～10μm）是化学键合相硅胶，这种固定相要占所有柱填料的80％。它是通过化学反应把某种适当的化学官能团（例如各种有机硅烷），键合到硅胶表面上，取代了羟基（－OH）而成。它是近代高效液相色谱技术中最重要的柱填料类型。 使用微粒硅胶要特别注意它的使用pH范围是2～7.5，若过碱（＞pH7.5），硅胶会粉碎或溶解；若过酸（＜pH2），键合相的化学键会断裂。 键合相使用硅胶作基质的优点是：①硅胶的强度大；②微粒硅胶的了孔结构和表面积易人为控制。③化学稳定性好。 硅胶( SiO2?n H2O) ：OH OH —Si—O—Si— 重要的键合相是：硅烷化键合相，它是硅胶与有机硅烷反应的产物。 最常用的键合相键型是： —Si—O—Si—C R1R1 —Si—OH + X—Si—R —Si—O—Si—R + HX R2R2 硅胶有机硅烷键合相 X ━Cl，CH3O，C2H5O等。 R ━烷：C8H17（即C8填料），C10H21，C18H37等。 R1、R2 ━X、CH3等。 最常用的“万能柱”填料为“C18”，简称“ODS”柱，即十八烷基硅烷键合硅胶填料（Octadecylsilyl，简称ODS）。这种填料在反相色谱中发挥着极为重要的作用，它可完成高效液相色谱70～80％的分析任务。由于C18(ODS)是长链烷基键合相，有较高的碳含量和更好的疏水性，对各种类型的生物大分子有更强的适应能力，因此在生物化学分析工作中应用的最为广泛，近年来，为适应氨基酸、小肽等生物分子的分析任务，又发展了 141
生效日期20140101 负责姓名职位签名/日期 起草何瑞清QC 审核梁天静QC主管 批准张小伶质量部经理 分发部门： 部门份数部门份数QC室1 1 目的 建立高效液相色谱法检验程序 2 范围 本程序适用于高效液相色谱法检验标准操作 3 职责 3.1QC人员：严格按本程序操作 3.2QC主管：严格按本程序检查 4 内容 4.1 定义及概述 4.1.1 高效液相色谱法是一种现代液体色谱法，其基本方法是将具一 定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液作为流动相，用高压 输液泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流 动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪 或数据处理装置记录色谱图或进行数据处理，得到测定结果。 由于应用各种性质的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有 分离性能高，分析速度快的特点。 4.1.2 高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的 药品的分析测定，特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分
子物质的测定。有的药品需要在色谱分离前或后经过衍生化反 应，方能进行分离或检测。常用的色谱柱填充剂有：硅胶用于 正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相 或正相色谱，其中最常用的是十八烷基硅烷（又称ODS）键合 硅胶，可用于反相色谱或离子对色谱离子交换填料，用于离子 交换色谱，是有一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。 4.1.3 仪器的组成和一般要求： 4.1.3.1 仪器的组成：高压输液泵、色谱柱、检测器、积分仪、打印机。 4.1.3.2 对仪器的一般要求： ——所用的仪器为高效液相色谱仪。色谱柱 的填充剂和流动相的组分按各品种项下的规 定。常用的色谱柱填充剂有硅胶和化学健合硅 胶，后者以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用， 辛基硅烷键合硅胶次之，氰基或氨基键合硅胶 也有使用。离子交换填充剂用于离子交换色 谱；凝胶或玻璃微球等填充剂用于分子排阻色 谱等。除另有规定外，柱温为室温，检测器为 紫外吸收检测器。 ——在用紫外吸收检测器时，所用流动相应符 合紫外分光光度法项下对溶剂的要求。（紫外 分光光度法项下对溶剂的要求：用1cm石英吸 收池盛溶剂，以空气为空白（即空白光路中不 置任何物质），测定其吸收度。溶剂和吸收池 所吸收度，在220～240nm范围内不得超过 0.40，在241～250nm范围内不得超过0.20，在 251～300nm范围内不得超过0.10，在300nm以 上时不得超过0.05。）