米曲霉固态发酵生产中性蛋白酶
1、实验目的及要求：
通过固态三角瓶培养曲霉，使学生掌握固态培养微生物原理和技术，并掌握蛋白酶活性的分析方法：
2、实验原理、过程和方法
2.1原理
固态培养微生物，是我国传统发酵工业的特色之一，具有悠久的历史。在黄酒、白酒、酱油、酱类等领域广泛应用。
固态培养方法：（Solid state cultivation）：主要有散曲法和块曲法。部分黄酒用曲，红曲及酱油米曲霉培养属散曲法；而黄酒用曲及白酒用曲一般采用块曲法。
固态制曲设备：实验室主要采用三角瓶或茄子瓶培养；种子扩大培养可将蒸熟的物料置于竹匾中，接种后在温度和湿度都有控制的培养室内进行培养；工业上目前主要是厚层通风池制曲，转式圆盘式固态培养装置正在试验推广之中；日本、台湾已大规模化，机械化。
固态培养微生物：主要用于霉菌的培养，但细菌和酵母菌也可采用此法。其主要优点是节能，无废水污染。单位体积的生产效率较高。我国广泛使用的厚层通风固态法培养法，空气一般不经过除菌处理，培养环境也无法做到严格无菌。故染菌问题未得到根本解决。
本实验所用的米曲霉的生长特性及菌落特征：
米曲霉（Aspergillus）属曲霉菌（Aspergillus）。菌落初为白色，黄色，继而变为黄褐色至淡绿褐色，反面无色。
2.2过程
米曲霉菌种的纯化（单菌落分离），制成斜面，将斜面菌种接入250ml三角瓶培养成种曲，再将种曲扩大培养（500ml）三角瓶。米曲霉培养物经水溶液萃取，制得粗酶制剂，取粗酶制剂进行蛋白酶活力的测定。
2.3方法
米曲霉的培养
本实验分为斜面种子培养及三角瓶培养两个阶段。三角瓶培养物在工厂常作为一级种子。
试管斜面培养基：豆饼浸出汁：100克豆饼粉，加水500ml，浸泡4小时，煮沸3-4小时，纱布自然过滤，取液，调整至5波美度。每100 ml 豆汁中加入可溶性淀粉2克，磷酸二氢钾0.1克，硫酸镁0.05克，硫酸铵0.05克，琼脂2克，自然pH。
或采用马铃薯培养基：马铃薯200g 葡萄糖20g 琼脂15-20g 加水至1000ml pH 自然。
三角瓶培养基制备：
米曲霉的培养其1：麸皮80g，面粉（或小麦粉）20g，水80ml；
2、豆粕粉10g，麸皮90g，水110ml；
装料厚度：1cm左右；
灭菌：120℃，30-60min；
接种及米曲霉的培养条件：
米曲霉固态培养主要控制条件：温度、湿度，装料量，基质水分含量。
固态培养前，原料的蒸熟及灭菌是同时进行的。实验室一般是在高压灭菌锅中进行；但在工厂，则原料的煮熟和灭菌与发酵分别在不同的设备中进行。这点与液态发酵是不同的。28-30℃，培养20小时后，菌丝应布满培养基，第一次摇瓶，使培养基松散，每隔8小时检查一次，并摇瓶。培养时间一般为48-70小时。
3、实验仪器、设备和材料
恒温培养箱或固态培养室，负压式超净工作台，显微镜，计数器，水浴锅，分光光度计，试管，茄子瓶，平板及500ml三角瓶等。
米曲霉菌种（酱油生产用米曲霉）
4、实验分析项目和方法
米曲霉孢子计数（显微镜观察）；通常每克曲（干基）孢子数可达100亿以上；
米曲霉蛋白酶活力的测定方法简介：
（1）称取充分研细的成曲5g，加入100ml水，40℃水浴间断搅拌1hr，过滤，滤液用适当的缓冲液稀释一定的倍数。
（2）样品的测定：取试管3支，编号，每管加入样品稀释液1ml，40℃水浴中预热2
分钟，再加入同样预热的酪蛋白1ml，精确保温10分钟，立即加入0.4mol/L的
三氯乙酸2ml，以终止反应，继续保温20分钟，使残余蛋白质沉淀后离心或过
滤。然后另取三支试管，编号，每管内加入滤液1ml，再加0.4mol/L的碳酸钠
5ml,已稀释的福林试剂1ml，摇匀，40℃保温发色20分钟，用分光光度计测定
OD值（波长660nm）。
（3）计算：
在40℃下，每分钟水解酪蛋白产生1ug酪氨酸，定义为一个酶活力单位。
样品蛋白酶活力单位（干基）=
A：由样品测定OD值，查标准曲线得相当的酪氨酸微克数；
4：4ml反应液取出1ml测定；
n:稀释倍数；
10:反应十分钟；
W：样品水份含量（%）
5、实验报告内容和数据处理
两种培养基米曲霉培养过程中蛋白酶活性变化规律。
6、实验结果和讨论
实验时间：1周
组织形式：每班分为6组，每组学生5人，做3×2个三角瓶。每12小时取样一个，分析测定蛋白酶活性。
比较两种培养基的米曲霉培养物的蛋白酶的活性的高低。
附录1：
固态转轴发酵设备的结构与工作原理
重要说明：
?在第一次操作本设备之前请仔细阅读本操作说明书；
?设备必须可靠接地；
?湿度仪最高使用温度不大于80℃，防水浸；
?发酵开始前准备工作（设定为发酵条件，进行DO电极斜率标定、pH电极零点标定）；
?发酵结束数据存盘；
?关闭总电源前，请将控制器返回主菜单，然后按Ctrl+F6关闭控制程序，然后关电
源。
?设备运行结束，勿忘关闭自来水阀、空气源、蒸汽发生器。
?开始控温前，必须先打开注水开关，直至排水口无气泡为止。
?最高工作压力不大于0.20Mp，进罐空气压力应不大于0.20Mp！最高消毒温度
126 ℃；
?公用工程要求：蒸汽：0.2~0.4Mpa; 水源：0.1~0.3Mpa
1 技术指标
1.1 概述
具有温度、转速、空气流量、湿度显示和控制功能。
1.2指标
1.2.1 温度：自动控制范围：冷却水温+5~50 ℃（±0.2 ℃)；显示范围：0~150 ℃
1.2.2 搅拌转速：变频调速范围0~30（±5)rpm，时间比例控制正反转
1.2.3 空气流量：显示控制范围0—50L/min
1.2.4 湿度控制：50~100%
1.2.5 罐体总体积50L，设计压力3.0kg/c㎡，最高工作压力1.5kg/c ㎡，设计工作温度131 ℃
1.2.6 灭菌方法：手动控制蒸汽消毒灭菌
1.2.7 主机功率：3KW（最大），单相220 V
1.28气源要求：2~4kg/c ㎡
1.2.9蒸汽要求： 2~4kg/c ㎡
2 管路说明
该流程图中空气管路阀门标号为“AXX”，蒸汽管路阀门标号为“SXX”，冷却水管路阀门标号为“WXX”，冷凝水管路阀门标号为“VXX”，电磁阀标号为“CXX”，物料管路阀门标号为“PXX”，冷冻水管路标号为“CWX”，其它气体管路标号为“NXX”。
2.1 空气及其净化
来自空压机的压缩空气经净化器（外接减压稳压器、除水、除尘、空气予过滤器）进入发酵罐空气总管，空气阀A01、空气流量计、阀A02、空气过滤器，阀A03到达加湿器内或
经电磁阀C02进入发酵罐底部分布器，尾气经阀VT1排出，本管路具有计量、净化作用。注：空气流量显示的流量是以过滤器前的压力下的流量，不是标准状态下的流量。如须测量控制湿度则开VT11关VT1。
2.2 蒸汽
2.2.1 蒸汽进夹套
蒸汽经阀S01进夹套（上进），经阀V01排出冷凝水。蒸汽对培养基预热。（固体物料传热效率低，可以取消本步操作）
2.2.2 蒸汽进反应器
蒸汽经阀A02、空气过滤器、阀A03、电磁阀C02进入罐内，由排气口空气阀VT1排出。蒸汽对过滤器及空气管线消毒
2.3 自来水
2.3.1 自来水进夹套
当电磁阀大开时，自来水经多功能阀、阀W01进入反应器夹套（下进），由夹套上口、电磁阀C01排出；当电磁阀关闭时，夹套水经W02进入电热器、循环泵、单相阀进入夹套（下口），通过夹套水的循环，将加热器的热能带入夹套，通过夹套的换热加热发酵液。特别提示：温度自动前必须对夹套注水。
2.3.2 自来水进排气冷凝器
自来水经阀W03进入排气冷凝器，对发酵尾气进行冷却尽可能减少培养基的水分蒸发2.4 冷冻水（选配）（消毒后降温应优先采用自来水）
冷冻水经切换阀T02（关T01）进入自来水管线、经切换阀T04（关T03）返回了冷冻水回路。
2.8 纯氧管线（选配）
纯氧管线：纯氧进入流量计、电磁阀C03、切断阀A21进入空气过滤器。纯氧流量调节：开C03、A21后调节流量计的调节手柄。
2.9空气流量检测与控制：
空气热质量流量计：与空气玻璃转子流量计并联安装且在热质量流量计前后安装切断阀。热质量流量计内通道必须保持干燥无尘，因此只有在发酵过程中才开质量流量计的前后切断阀A11、A12,发酵结束后应及时关闭A11、A12。
2.10 补氨水管线
氨水经电磁阀C04、切断阀A31、补料针进入发酵罐，电磁阀由控制器控制
3 实罐灭菌操作
3.1 准备
3.1.1盖紧罐盖上各种盖帽，旋紧罐盖上压紧螺栓。
3.2培养基预热
3.2.1准备工作
预先启动蒸汽发生器及空气压缩机
将控制器中的温度控制设定为手动
开排气阀VT1，关闭其它阀门
湿度仪不耐高温和不可水浸，消毒后必须关闭排气旁通阀VT11。
3.2.2开排气阀VT1，开夹套冷凝水阀V01排夹套水，关闭其它阀门。
3.2.3启动反应器搅拌马达。调转速20~30Rpm
3.2.4 蒸汽进夹套（固体物料可以取消本操作）缓缓开夹套蒸汽阀S01蒸汽夹套（注意：此时有轻微爆炸声属正常，如声音过响，则开阀的速度应减慢）。待排水总口排出蒸汽时调节冷凝水阀V01，控制蒸汽排出量以有少量蒸气冒出即可。并控制夹套内压力不超过0.2Mpa。当培养基预热至98 ℃时，进入实罐灭菌操作。在培养基温度在80~90 ℃时可以适当的减慢升温速度，在本温度的区域内可以杀死大部分的微生物。
3.3实罐灭菌
3.3.1蒸汽进过滤器：微开过滤器上排冷凝水阀V02，开过滤器前蒸汽阀S02，微加湿器底阀排冷凝水阀V03，缓缓开切断阀A03，蒸汽经过滤器进入反应器，同时在控制器F5“空气”子画面中设定控制方式为“手动”并按F3输入“-100”后按“ENTER”，电磁阀C02在消毒过程中始终是开着的，以保正空气管线消毒彻底。当冷凝水阀V02、V03出口冷凝水很少时，调节冷凝水阀V02、V03以有少量蒸汽排出为宜。当排气口有蒸汽排出或罐温达到100 ℃两分钟后，关闭排气阀VT1。调节切断阀A03和蒸汽阀S02，维持过滤器前蒸汽压力为0.12~0.16Mpa，同时必须保证切断阀有一定开度，不得关死。
3.3.2 当达到预定温度或罐压，开排气阀VT1至有少量蒸气排出，关紧或微开夹套蒸汽阀S01，根据罐压或温度的变化趋势，及时调节蒸汽阀S02、S03。阀门调节宜微调应避免大幅度开关。当反应罐罐压或罐温维持在预定的范围内开始计时。
3.3.3 （略）
3.3.4 保温阶段应旋松接种口盖至有少量蒸气冒出
3.3.5 移种管线消毒（适用于多级发酵）
在保温过程中开移种管线阀P03及受种阀前排水阀V04，保温结束前关闭V03。
3.4灭菌完成及降温（先开后关，后开先关）
3.4.1 保温结束首先旋紧接种口盖。
3.4.2关紧冷凝水阀V03，关紧过滤器前蒸汽阀，全开空气阀A01、A02，用空气吹过滤器，当过滤器冷凝水阀V02排尽冷凝水后就可以关闭。
3.4.3 关夹套蒸汽阀S01、冷凝水阀V01，开夹套进水阀W01和循环管线切断阀W02。在控制器中将温度控制方式设定为“自动”并对温度进行设定，发酵罐进行自动降温。按下搅拌开关，设定搅拌转速并“自动”控制。
3.4.5 在降温过程中，始终监视罐压，严禁压力掉零。当温度达到工艺要求时，调节搅拌转速、空气流量、罐压、标定溶氧电极斜率及校正pH电极的零点。
注意：1.如另配冷冻水系统消毒后降温请选用自来水降温（控制箱左侧板N2开关拨向“W”）
2. 消毒过程中不得开湿度仪前切断阀VT11。湿度仪最好使用温度为80 ℃
4 发酵操作
4.1准备
4.2接种
4.2.1 摇瓶倒种：调节进气量至0.2VVM，开排气阀VT1至罐压接近零（不得大于0.02Mpa），予先旋松接种口，在接种口处放好火焰圈并点燃（在火焰圈中放置少量的棉花可以助燃提高火焰的高度），打开接种口，倒入种子，然后旋紧接种盖，立即调高罐压。
4.2.3 发酵初始化：在控制器的发酵罐状态画面输入“发酵批号”，再按“就绪”或“开始”并“确认”，发酵数据才能自动保存。设定发酵过程参数及适宜的控制模式
4.3 湿度控制
4.3.1 关阀A03，将经灭菌消毒的补水瓶及输液管放置底座上，用硅胶管将补水瓶上的呼吸过滤器与空气精过滤器阀V02连通。
4.3.2 旋下加湿器补料口上闷头，用酒精棉球对补料口内橡胶塞外表面消毒，然后将针头插入并穿透密封盖，并用补料针上的螺母锁紧。
4.3.3 开输液管上的弹簧夹，缓缓开阀V02 将无菌水压入加湿器内。关阀V02 ，拔出针头，盖紧补料口上闷头。
4.3.4 湿度控制：在控制器空气子画面上设定：F1：空气50~100（（说明：这里的“空气”实际上是“湿度”，单位L/min应为%），F2：控制方式为“自动”。开阀A03。当湿度低于设定值时电磁阀自动关闭，空气进入加湿器。当湿度高于设定值时，电磁阀自动打开，大量空气经过电磁阀直接进入发酵罐。
4.3.5开排气阀VT11，关VT01
4.4取样
4.4.1取样器：开罐盖N9口上闷头，将取样管垂直于管盖插入罐内（建议取样时关闭搅拌），抽出取样管，盖紧上闷头。
4.5发酵开始前设定发酵参数（详见第五章)
4.6 放料放料是通过开罐盖放料
4.7 发酵结束
发酵结束必须在控制器在控制器的发酵罐状态画面按“正在发酵”并“确认”，如果需要发酵数据归档请按“可以归档”并确认。发酵数据将自动整理并保存。发酵结束后应关紧VT11
4.8 搅拌正反转设定：在时间比例控制器拨动数字盘设定正转时间、反转时间，拨动数字盘上端的时间单位;M-分钟。S-秒。设定完成后开时间比例控制器右侧的控制开关（向右开，向左关），任何一次设定后必须重新开关“控制开关”
附录2：
蛋白酶活力的测定方法
1 原理
根据福林试剂(磷钼酸与磷钨酸混合物)，在碱性情况下极不稳定，可被酞类化合物还原而呈蓝色反应(钼蓝和钨蓝的混合物)，由于蛋白质分子中含有酚基的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸及苯丙氦酸等)，它使蛋白质或其水解产物也呈这个反应，于是就可利用这个原理来测定蛋白酶活力的强弱，即以酪蛋白为作用底物，在一定pH与温度下，同酶液反应，经一定时间后，加入三氯醋酸，以终止酶反应，并使残余的酪蛋白质沉淀，同水解产物分开，经过滤后取滤液(即含蛋白水解产物的三氯醋酸液)。用碳酸钠碱化，再加入福林试剂使之发色，用分光光度计或光电比色计测定。蓝色反应的强弱，同三氯醋酸中蛋白水解产物的多少成正比而水解产物的量又是同酶活力成正比例关系。因此，根据蓝色反应的强弱就可推测蛋白酶的活力。
2 试剂
2.1 福林试剂
于2000ml磨口回流装置内加入钨酸钠(Na2WO4〃2H2O)100g，钨酸钠(NaMoO4〃2H2O)25g，水700ml，85%磷酸50m1，浓盐酸1000ml，文火回流10h．加入硫酸锂(Li2SO4)150g，蒸溜水50m1，混匀取去冷凝器，加入几滴液体溴，再煮沸l5min，以驱逐残溴及除去颜色，溶液应呈黄色而非绿色。若溶液仍有绿色，需再滴加溴液。再煮沸除去之。冷却后，定溶至1000ml。细菌漏斗4~5号过滤，置于棕色瓶中保存。此溶液使用时加2倍蒸馏水稀释，即成稀释的福林试剂。
2.2 0.4mol/L三氯醋酸(TCA)溶液
称取三氯醋酸65.4g，定容至1000ml。
2.3 0.4mol/L碳酸钠溶液
称取无水碳酸钠(Na2CO3)42.4g，定容至1000m1。
2.4 0.05mol/L pH2.5 乳酸-乳酸钠缓冲液
A液：称取10.6g80-90%乳酸加蒸馏水定容至1000ml。
B液：称取16克70%乳酸钠加蒸馏水定容至1000ml。
取A液16ml与B液1ml稀释1倍即成0.05mol/L pH2.5 乳酸-乳酸钠缓冲液。
2.5 2%酪蛋白溶液
称取干酪素2g加入0.1mol/L氢氧化钠20ml在水浴中加热使溶解(必要时用小火加热煮沸)，然后用pH2.5乳酸-乳酸钠缓冲液定容至1000mI即成。配制后应及时使用或放入冰箱内保存。否则极易繁殖细菌，引起变质。
配制酪蛋白溶液定容时，若泡沫过多，则可加1~2滴酒精消泡。3350酸性蛋白酶酪蛋白溶液的配制，应加弄乳酸2~3滴湿润。
2.6 100μg/m1酪氨酸溶液
精确称取在l05℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1g，逐步加入0.1mol/L盐酸(HCl)使溶解，加蒸溜水定容至100m1，其浓度为1000μg/m1。再吸取此液10ml以蒸馏水定容至100ml即配成100μg/m1酪氨酸镕液．此溶液配成后也应及时使用或放入冰箱内保存，以免繁殖细菌而变质。
3 操作步骤
3.1 标准曲线的绘制
（1）按表配制各种不同浓度的酪氨酸溶液
(2)测定步骤
另取6支试管按上表编号分别吸取不同浓度的酪氨酸1ml，各加入0.4mo1/L碳酸钠5m1，再加入已稀释的福林试剂1m1。摇匀置于水浴锅中，40℃保温发色20min，在于波长660nm处测定吸光度。一般测3次，取平均值．
以吸光度为纵座标。酪氨酸的浓度为横座标，绘制成标准曲线。
3.2 酶液的制备
准确称取蛋白酶固态发酵的湿曲2g，用10~20ml蒸馏水，30℃浸提半小时，用滤纸过滤。将滤液稀释一定倍数(使其测定光密度在0.2~0.4范围内为宜)。
3.3 测定
取四支试管，分别加入1ml稀释酶液，其中一支为空白管，三支为平行试验管。置入40℃水浴中预热3~5min，在三支平行试验管中分别加入1ml2%酪蛋白溶液，准确计时保温10min。立即加入2ml 0.4M三氯乙酸溶液，l5min后用滤纸过滤。分别吸取1ml清液，加5ml0.4M碳酸钠溶液，最后加入1ml福林-酚试剂，摇匀，于40℃水浴中显色20min。
空白管中先加入2ml0.4M三氯乙酸溶液，再加lml2%酪蛋白溶液，15min后用滤纸过滤。以下操作与平
行试验管相同。
见空白管为对照，在680纳米波长下测光密度，取其平均值。
4 计算
蛋白酶活力单位定义：在40℃，pH2.5下，每分钟水解酪蛋白释放1微克酪氨酸的酶量定义为1个蛋白酶单位。 W N D O K 1104?????=蛋白酶活力
式中 K ：标准曲线中O 〃D 值为1所相当的酪氨酸的微克数；OD ：平行试验管的平均光密度；4：试管中反应液总体积(毫升)；10：反应10分钟；N ：稀释倍数；W ：曲的称取量(克)
5 说明
（1）对于同一台分光光度计与同一批福林-酚试剂，其工作曲线K 值可以沿用，当另配福林-酚试剂时，工作曲线应重作。
（2）当用不同产品的酪蛋白对同一蛋白酶测定时，其结果会有差异，故蛋白酶活力表示时应注明所用酪蛋白的生产厂。
毕 业 论 文 课题名称 米曲霉的制备 姓 名 学 号 所在系 制药与生物工程系 专业年级P09生物制药 指导教师 职 称 讲师 指导教师 职 称 二O 一二年六月八日
摘要 微生物在酱油生产制曲工艺和发酵过程中起着至关重要的作用，在高盐稀态发酵工艺过程中，培养良好的米曲霉菌种不仅可以提高酱油中总氮、氨基酸态氮含量和酱油风味,而且还可以提高原料利用率。因此米曲霉种曲培养是生产优质酱油的有效保证。本论文主要介绍米曲霉在不同阶段的扩大培养方法，包括试管菌种、锥形瓶菌种、种曲罐菌种、种曲等方面的培养方法及注意事项。米曲霉培养温度为28～32℃,培养时间为72h,米曲霉生长最旺盛作用,此时,曲料的曲酶孢子数大于8×109个/g,蛋白酶活力可达1000mg/100g以上。 关键词米曲霉；温度；时间；试管菌种；三角瓶菌种；扩大培养
目录 引言 (1) 1 菌种的种类 (1) 1.1 米曲霉 (1) 1.2 黑曲霉 (1) 2 菌种的选择条件 (1) 2.1 不产生黄曲霉毒素及其他真菌毒素 (1) 2.2 酶系全、酶活力高 (2) 2.3 对环境适应能力强，生长繁殖快 (2) 2.4 酿制的酱油风味好 (2) 3试管实验 (2) 3.1 灭菌 (2) 3.2 培养基的制备 (2) 3.3 培养基的鉴别 (2) 3.4 接种培养 (3) 3.5 菌种的留选 (3) 4 锥形瓶培养 (3) 4.1 原料配比 (3) 4.2 接种培养 (3) 5种曲制备 (3) 5.1 种曲原料要求 (3) 5.2 做料前检查事项 (4) 5.3 做料 (4) 5.4 蒸料 (4) 5.5 抽真空 (4) 5.6 降温 (4) 5.7 接种 (5) 5.8 自动培养 (5)
酶的特性综述 酶通常是指由活细胞产生的、具有催化活性的生物大分子，大多数酶是蛋白质，少数是RNA，另有一些需要辅助因子的辅助。酶的特性主要体现在这几个方面： 一、高效性 1、酶的高效性是和非酶的催化剂比较而言。主要是指催化能力，蛋白质（环境适宜）的催 化能力是普通化学催化物质的10^5—10^8倍。生物分子之间的反应首先要进行分子碰撞接触，如果在没有酶作用的情况下，分子主要靠自然的热运动来随机进行接触，这样的几率比较小，而在酶的作用下，由于酶和作用底物有特异性结合位点，相当于把反应需要的分子给拉到一起去了，所以这样的效率要高很多。 2、酶的高效性实验探究 材料： 新鲜猪肝研磨液（含有H2O2酶)、3%的FeCl3溶液（催化过氧化氢分解的化学催化剂）、清水、试管5支、试管架、酒精炉、线香、打火机、量筒 步骤： 1、在5支试管中分别加入5mLH2O2溶液，依次编号置于试管架上。 2、在1号试管中加入一定量的清水；2号试管中加入与清水等量的新鲜猪肝研磨液；3号试管中加入等量的3%的FeCl3溶液；4号试管中加入经过高温煮过的等量的新鲜猪肝研磨液；5号试管中加入高温煮过的FeCl3溶液。 3、用点燃但无火焰的线香插入试管检验。 现象： 氧气量效果 1号：—无催化作用 2号：﹢﹢高效催化 3号：﹢低效催化 4号：—无催化作用 5号：﹢低效催化 结论：过氧化氢酶比FeCl3催化剂高效。酶具有高效性。
二、专一性 酶对所作用的底物有严格的选择性。一种酶仅能作用于一种物质，或一类分子结构相似的物质，促其进行一定的化学反应，产生一定的反应产物，这种选择性作用称为酶的专一性。 酶的专一性是指酶对底物及其催化反应的严格选择性。通常酶只能催化一种化学反应或一类相似的反应，不同的酶具有不同程度的专一性，酶的专一性可分为三种类型：绝对专一性、相对专一性、立体专一性；也可分为：结构专一性和立体异构专一性。 如过氧化碳氢酶只能催化过氧化氢分解，不能催化其他化学反应。细胞代谢能够有条不乱的进行，与酶的专一性是分不开的。 探究酶的专一性的实验 序 号 项目 试管 1 2 1 注入可溶性淀粉2mL / 2 注入蔗糖溶液/ 2mL 3 注入新鲜淀粉酶溶液2mL 振荡 4 60℃温水保温 5 min 5 加斐林试剂1mL 振荡 6 将试管下部放入60℃热水 中 2 min 7 观察实验结果有砖红色沉淀无砖红色沉淀结 论 淀粉酶只能催化淀粉水解，不能催化蔗糖水解 三、多样性 酶的种类很多，大约有5000多种，其中可以通过食用补充的酵素达2000多种；形态上主要有三种：专业级酵素为酵素胶囊，其次为酵素粉，而液体酵素含量低、效价低、易腐败而安全性较差一些，食用风险较高。 四、温和性
米曲霉培养及蛋白酶的分析 ?实验目的及要求：通过固态三角瓶培养米曲霉，掌握固态培养微生物原理和技术，并掌握蛋白酶活性的分析方法。 ?实验原理： 固态培养方法（ solid state cultivation ）：主要有散曲法和块曲法。部分黄酒用曲，红酒及酱油米曲霉培养属散曲法，而黄酒用曲及白酒用曲一般采用块曲法。 固态制曲设备：实验室主要采用三角瓶或茄子瓶培养；种子扩大培养可将蒸热的物料置于竹匾中，接种后在温度和湿度都有控制的培养室进行培养；工业上目前主要是厚层通风池制曲；转式圆盘式固态培养装置正在试验推广之中。 固态培养微生物，主要用于霉菌的培养，但细菌和酵母也可采用此法。其主要优点是节能，无废水污染。单位体积的生产效率教高。 米曲霉（ Aspergillus oryzae ）属于曲霉菌（ Aspergillus ）。菌落初为白色，黄色，既而变为黄褐色至淡绿褐色，反面无色。 ?实验过程： ?米曲霉菌种的纯化，制成斜面，将斜面菌种接入 250ml 三角瓶培养成种曲，再将种曲扩大培养（ 500ml ）三角瓶。培养物经过水溶液萃取，制得粗酶制剂，取粗酶制剂进行蛋白酶活性测定。 ?米曲霉培养：本实验分为斜面培养和三角瓶培养两个阶段。三角瓶培养物在工厂中作为一级种子。试管斜面培养基：豆饼浸出汁： 100 克豆饼，加水 500ml ，浸泡 4 小时，煮沸 3-4 小时，纱布自然过滤，取液，调整至 5 波美度。没 100ml 豆汁加入可溶性淀粉 2 克，磷酸二氢钾 0.1 克，硫酸镁 0.05 克，硫酸铵 0.05 克，琼脂 2 克，自然 pH 。 或采用马铃薯培养基：马铃薯 200 克，葡萄糖 20 克，琼脂 15-20 克，加水至 1000ml ，自然 pH 。 三角瓶培养基制备： 米曲霉的培养基： 1 ：麸皮 40 克，面粉（或小麦） 10 克，水 40ml 。 2 ：豆粕粉 40 克，麸皮 36 克，水 44ml 。 装料厚度： 1cm 左右； 灭菌：120 ℃，30min； 接种及米曲霉的培养条件：米曲霉固态培养主要控制条件：温度，湿度，装料量，基质水分含量。固态培养前，原料的蒸熟及灭菌是同时进行的，实验室一般是在高压灭菌锅中进行；但在工厂中则是原料的煮熟和灭菌与发酵分别在不同的设备中进行。这点与液态发酵是不同的。 28-30℃，培养20小时后，菌丝应布满培养基，第一次摇瓶，使培养基松散；每隔8小时检查一次，并摇瓶。培养时间一般为72小时。 3. 实验仪器、设备很材料 恒温培养箱或者固态培养室，负压式超净工作台，显微镜，水浴锅，分光光度计，试管，茄子瓶，平板和 500ml 三角瓶等。 4. 实验分析项目和方法 米曲霉蛋白酶活力的测定方法 （ 1 ）称取充分研细的成曲 5g ，加入 100ml 蒸馏水，40 ℃水浴不间断搅拌20分钟，使其充分溶解。然后用干纱布过滤。吸取滤液1ml，用适当的缓冲液（0.02mol/LpH7.5磷酸缓冲液）稀释一定的倍数（如10、20、或者30倍）。 （ 2）绘制标准曲线 A、取试管7支，编号，按照下表加入试剂。单位：ml
第六节酸性蛋白酶生产工艺 07040642 47 李继江 1 蛋白酶、蛋白类酶、酸性蛋白酶 1.1 蛋白酶的定义 蛋白酶是催化肽键水解的一类酶，它可迅速水解蛋白质为胨、肽类，广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。同时大多数微生物蛋白酶都是胞外酶。 1.2 微生物蛋白酶分类 微生物蛋白酶按其作用的最适pH可分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶三类。 碱性蛋白酶为透明褐色液体，能与水混溶，最适温度50~60℃，最适pH8.5。 中性蛋白酶为金属酶，褐色颗粒或液体，易溶于水，最适温度45~55℃，最适pH5.5~7.5。 酸性蛋白酶为近乎白色至浅黄色无定型粉末或液体，易溶于水，最适温度45℃，最适pH2.5。 1.3 蛋白类酶 蛋白类酶主要是指由蛋白质组成的酶（P酶）；而主要由核糖核酸组成的酶称为核酸类酶（R酶）。 蛋白类酶分为氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、合成酶（或称连接酶）。 1.4 酶的生产方法 酶的生产方法主要有：提取分离法、生物合成法、化学合成法。 酶的微生物合成法主要有：液体深层发酵、固体培养发酵、固定化细胞培养、固定化原生质发酵。 酸性蛋白酶用微生物发酵法生产，采用液体深层发酵。 液体深层发酵是指液体培养基在发酵罐中灭菌冷却后，接入产酶细胞，一定条件下发酵，适用于微生物细胞、动植物细胞的培养。具有机械化程度高、技术管理严格、酶产率高、质量稳定，产品回收率高的特点，是目前酶发酵的主要方式。 1.5 酸性蛋白酶制剂的性能 1.5.1 酸性蛋白酶的作用机理 酶是一种蛋白质，它是活细胞产生的生物催化剂，生物体的新陈代谢活动都离不开酶的作用。酶的种类很多，酸性蛋白酶是水解酶类的一种，能够在微酸环境下（pH2．5～4．0）
酸性蛋白酶与碱性蛋白酶生产工艺的不同之处？ 酸性蛋白酶是一种在酸性环境下（pH 2.5-4.0）催化蛋白酶水解的酶制剂，适用于酸性介质中水解动植物蛋白质。可用于毛皮软化，酒精发酵，啤酒、果酒澄清，动植物蛋白质水解营养液，羊毛染色，废胶片回收，饲料添加剂等等。本品在酸性条件下有利于皮纤维松散，且软化液可连续使用，是当前理想的毛皮软化酶制剂；在酒精发酵中，添加酸性蛋白酶，能有效水解原料中的蛋白质，破坏原料颗粒粒间细胞壁的结构，有利于糖化酶的作用，使原料中可利用碳源增加，从而可提高原料出酒率；另一方面，蛋白质的水解提高了醪液中α-氨基态氮的含量，促进酵母菌的生长与繁殖，提高发酵速度，从而缩短发酵周期和提高发酵设备的生产能力。 碱性蛋白酶碱性蛋白酶是在碱性条件下水解蛋白质肽键的酶类,是一类非常重要的工业用酶,最早发现于猪胰脏。碱性蛋白酶广泛存在于动、植物及微生物中。微生物蛋白酶均为胞外酶,不仅具有动植物蛋白酶所具有的全部特性,还有下游技术处理相对简单、价格低廉、来源广、菌体易于培养、产量高、高产菌株选育简单、快速、易于实现工业化生产等诸多优点。1945年瑞士M等在地衣芽孢杆菌中发现了微生物碱性蛋白酶。 碱性蛋白酶是由细菌原生质体诱变选育出的地衣芽孢杆菌 2709，经深层发酵、提取及精制而成的一种蛋白水解酶，其主要酶成分为地衣芽孢杆菌蛋白酶，是一种丝氨酸型的内切蛋白酶，它能水解蛋白质分子肽链生成多肽或氨基酸，具有较强的分解蛋白质的能力，广泛应用
于食品、医疗、酿造、洗涤、丝绸、制革等行业。 1、碱性蛋白酶是一种无毒、无副作用的蛋白质，属于丝氨酸型内切蛋白酶，应用在食品行业可水解蛋白质分子肽链生成多肽或氨基酸，形成具有独特风味的蛋白质水解液。 2、碱性蛋白酶成功应用于洗涤剂用酶工业，可添加在普通洗衣粉、浓缩洗衣粉和液体洗涤剂当中，既可用于家庭洗衣，也可用于工业洗衣，可以有效的去除血渍、蛋类、乳制品、或肉汁、菜汁等蛋白类的污渍，另外也可作为医用试剂酶清洗生化仪器等。 3、在生物技术领域，碱性蛋白酶可作为工具酶用于核酸纯化过程中的蛋白质（包括核酸酶类）去除，而对DNA无降解作用，避免对DNA 完整性的破坏。 酸性蛋白酶如何灭活第一种方法几乎所有酶都适用，就是加热。第二种，既然是酸性酶，加入强碱应该也是可以的。 酸性蛋白酶产生菌的筛选方法？酸性蛋白酶是一种能在酸性环境下水解蛋白质的酶类，其最适作用pH值为2.5-5.0。由于酸性蛋白酶具有较好的耐酸性，因此被广泛地应用于食品、医药、轻工、皮革工艺以及饲料加工工业中。目前用于工业化生产的酸性蛋白酶大多为霉菌酸性蛋白酶，此类酶的最适作用pH值为3.0左右，当pH值升高时，酸性蛋白酶的酶活会明显降低，且此类酶不耐热，当温度达到50℃以上时很不稳定，从而限制了酸性蛋白酶的应用范围。因此，本研究以开发耐温偏酸性蛋白酶为目标，进行了以下几方面的研究：(1)偏酸性蛋白酶产生菌的分离筛选。 (2)偏酸性蛋白酶粗酶酶学性
1.菌种特点： 米曲霉( 属于真菌菌落生长快，10d直径达5~6cm，质地疏松，初白色、黄色，后变为褐色至淡绿褐色。背面无色。分生孢子头放射状，一直径150~300μm，也有少数为疏松柱状。分生孢子梗2mm左右。近顶囊处直径可达12~25μm，壁薄，粗糙。顶囊近球形或烧瓶形，通常40~50μm。上覆小梗，小梗一般为单层，12~15μm，偶尔有双层，也有单、双层小梗同时存在于一个顶囊上。分生孢子幼时洋梨形或卵圆形，长大后多变为球形或近球形，一般μm，粗糙或近于光滑。（半知菌亚门丝孢钢丝孢目从梗孢科曲霉属真菌中的一个常见种）。菌落生长较快，质地疏松。初呈白色、黄色，后转黄褐色至淡绿褐色，背面无色，分布甚广，主要在粮食、发酵食品、腐败有机物和土壤等处。是我国传统酿造食品酱和酱油的生产菌种。也可生产淀粉酶、蛋白酶、果胶酶和曲酸等。会引起粮食等工农业产品霉变。米曲霉(Aspergillus oryzae)具有丰富的蛋白酶系,能产生酸性、中性和碱性蛋白酶,其稳定性高,能耐受较高的温度,广泛地应用于食品、医药及饲料等工业中。米曲霉也是美国食品与药物管理局和美国饲料公司协会1989年公布的40余种安全微生物菌种之一。 米曲霉 米曲霉是一类产的，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、、、等。在淀粉酶的作用下，将原料中的直链、支链降解为糊精及各种低分子糖类，如、等；在蛋白酶的作用下，将不易消化的大分子蛋白质降解为、及各种，而且可以使辅料中、等难吸收的物质，提高营养价值、保健功效和消化率，广泛应用于、、生产曲酸、等发酵工业，并已被安全地应用了1000多年。米曲霉是理想的生产不能表达的真核生物活性蛋白的。米曲霉所包含的信息可以用来寻找最适合米曲霉发酵的条件，这将有助于提高食品酿造业的生产效率和产品质量。米曲霉基因组的破译，也为研究由曲霉属真菌引起的曲霉病
黑曲霉详细说明 产品英文名称：Aspergillu s niger CAS编 号： 6826- 42-2 别名： 山东黑曲霉孢子粉|培养物载体销售|发酵菌种厂家|高孢 子数菌种供应商|饲料发酵菌种报价 分子式：c11h1204 EINECS 编号： 6826- 42-2 有效物质 含量： 75 % 品牌：康丰源产品规 格： 500克 执行标 准： QS9001：2008 黑曲霉孢子粉 一、黑曲霉在发酵饲料方面的应用： 《2014年饲料添加剂目录》有关于黑曲霉可以直接添加使用的决定。 1、黑曲霉能够提高发酵后饲料的营养水平和消化吸收率。本品所含的微生物能分解饲料中的大分子糖类为单糖和寡糖,并生成多种有机酸、维生素、生物酶、未知生长因子，大大提高了发酵饲料的营养水平和消化吸收率； 2、使饲料脱毒。通过微生物自身的生命活动，使饲料内所含的有毒有害物质被降解而脱除，从而大大提高了饲料的安全性； 3、提高动物的抗病力。本品所含的微生物直接参与动物肠道的屏障作用，补充动物肠道有益微生物的数量，通过生物竞争机制阻止病原微生物的定植和生长繁殖.恢复和维护动物肠道的微生态平衡，从而提高动物的免疫力和抗病能力； 4、提高饲料的适口性，显著增加食欲。在饲料中添加本产品可以提高饲料利用率、提高动物的生产性能，降低生产成本，改善养殖环境。 黑曲霉在发酵剂方面还能发酵能量饲料、蛋白饲料、粗饲料等所有种类饲料。发酵的饲料既适用于猪、牛、羊等家畜动物，又适用于鸡、鸭、鹅等家禽动物，而且适用于鱼虾水产、黄粉虫昆虫等各种动物。发酵饲料能使饲料解毒脱毒，大大提高饲料的安全性，而且在发酵的过程中会产生淡淡的香味，从而增加了动物的适口性；发酵过程中还能生成多种有机酸、维生素、生物酶、氨基酸及其他多种未知生长因子，大大提高了发酵饲料的营养水平和消化利用率；提高动物的抵抗力，降低饲料成本。 二、黑曲霉孢子粉使用说明： 《2014年饲料添加剂目录》有关于黑曲霉可以直接添加使用的决定。 产品优势：1.孢子含量高，便于产品的存放 2.产品有效菌对环境的适应性强 3.孢子的发酵再生能力高 产品用途：1.用于生物肥料秸秆腐熟剂等发酵时添加； 2.用于复合微生物肥料接种剂； 3.用于禽畜的粪便、有机垃圾发酵剂； 4.用于动物饲料发酵时添加； 产品配方：麦片、豆皮、微量元素、纯种米曲霉/黑曲霉菌株等。 使用量：万分之三到万分之五，即每吨加300克——500克 （根据实际菌孢子量和生产工艺的要求添加）。
1.菌种特点： 米曲霉( Asp.oryzae) 属于真菌菌落生长快，10d直径达5~6cm，质地疏松，初白色、黄色，后变为褐色至淡绿褐色。背面无色。分生孢子头放射状，一直径150~300μm，也有少数为疏松柱状。分生孢子梗2mm左右。近顶囊处直径可达12~25μm，壁薄，粗糙。顶囊近球形或烧瓶形，通常40~50μm。上覆小梗，小梗一般为单层，12~15μm，偶尔有双层，也有单、双层小梗同时存在于一个顶囊上。分生孢子幼时洋梨形或卵圆形，长大后多变为球形或近球形，一般4.5μm，粗糙或近于光滑。（半知菌亚门丝孢钢丝孢目从梗孢科曲霉属真菌中的一个常见种）。菌落生长较快，质地疏松。初呈白色、黄色，后转黄褐色至淡绿褐色，背面无色，分布甚广，主要在粮食、发酵食品、腐败有机物和土壤等处。是我国传统酿造食品酱和酱油的生产菌种。也可生产淀粉酶、蛋白酶、果胶酶和曲酸等。会引起粮食等工农业产品霉变。米曲霉(Aspergillus oryzae)具有丰富的蛋白酶系,能产生酸性、中性和碱性蛋白酶,其稳定性高,能耐受较高的温度,广泛地应用于食品、医药及饲料等工业中。米曲霉也是美国食品与药物管理局和美国饲料公司协会1989年公布的40余种安全微生物菌种之一。米曲霉 米曲霉 米曲霉是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等。在淀粉酶的作用下，将原料中的直链、支链淀粉降解为糊精及各种低分子糖类，如麦芽糖、葡萄糖等；在蛋白酶的作用下，将不易消化的大分子蛋白质降解为蛋白胨、多肽及各种氨基酸，而且可以使辅料中粗纤维、植酸等难吸收的物质降解，提高营养价值、保健功效和消化率，广泛应用于食品、饲料、生产曲酸、酿酒等发酵工业，并已被安全地应用了1000多年。米曲霉是理想的生产大肠杆菌不能表达的真核生物活性蛋白的载体。米曲霉基因组所包含的信息可以用来寻找最适合米曲霉发酵
酸性蛋白酶的研究进展 姓名：石宏志班级学号：090432215 中文摘要：提起酶不了解的人都会觉得很神奇，为什么人类、动物、植物体内都会有酶，酶究竟是什么东西。此文就对酸性蛋白酶从菌种培养、工艺流程、在生产生活中的应用、产过程中的注意事项及最后酶的提纯做了简单的陈述。酸性蛋白酶，酶的一种，它的研究进展从这里我们就可以窥一斑而见全身了。 Abstract:Mentions enzyme don't understand people would think very magical, why do humans, animals, plants body will have enzymes, enzyme what exactly. The article from strains of acid protease training, processes and the application in production and life, and production process the matters needing attention and finally enzyme makes simple the purification of statement. Acid protease, one of the enzymes, the research progress of it from here we can peep one spot and see whole body. 中文关键字：酸性蛋白酶，扩培，发酵，盐析，结晶 Key words：Acid protease, enlarge cultivates, fermentation, salting-out, crystallization 前言 21世纪科技领头羊可以说是非生物工程莫数，从DNA双螺旋结构的推出，到多利克隆羊的出世；从原来对污染海洋的石油用燃烧方法，到现在的微生物处理；从原始的青草喂牲畜，到现在的蛋白饲料等等，这诸多变化之中无一脱离了生物催化剂——酶。高效、绿色环保、投入小收获大众多优秀辞藻被冠在酶身上。 蛋白酶做为一种重要的工业酶制剂，作为一种较早被人们了解的酶类现在正在人类的生活中发挥巨大的作用，特别是酸性蛋白酶以其作用的广泛性、高效率越来越多的受到了人们的关注。 酸性蛋白酶(acidic protease)是指在酸性(pH 2~5)环境下催化蛋白质肽键水解的一类酶的总称，广泛存在于动物、植物和微生物中。其在食品、酿造、饲料、毛皮与皮革、胶原纤维和医药等工业领域中的应用很广。近年来，酸性蛋白酶作为高效率酒精发酵的优选促进剂和新型饲料添加剂的应用得到人们的重视。下面就对酸性蛋白酶的生产做简单的介绍。 1．酸性蛋白酶的概述 酸性蛋白酶(acidic protease)在1954年首先由吉田在黑曲酶中发现。该酶广泛存在于霉菌、和担子菌中，细菌中极少发现，其最适pH3~4，相对分子质量30000~40000，等电点（pH3~5）。酸性蛋白酶主要是一种羧基蛋白酶，大多数在
饲料研究FEED RESEARCH NO .6,2011 5 脂肪酶特性与应用 陈倩婷广州博仕奥集团 饲料资源不足一直是我国养殖业面临的一个大问题，在耕地和水资源严重紧缺的情况下，粮食产量很难提高。我国动物生产中饲料转化率低，猪、鸡和奶牛等的饲料转化率均比国际先进水平低0.3 %~0.6 %，使饲料资源不足的问题更加严峻。饲料用酶制剂的开发和应用极大的缓解了饲料资源的不足，酶制剂在饲料工业中的有效应用使得饲料工业和养殖业安全、高效、环保和可持续发展成为可能。 目前研究较多的饲用酶制剂有蛋白酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶、纤维素酶及植酸酶等。脂肪酶也是一种重要的酶制剂，它能够水解脂肪（三脂酰甘油或三酰甘油）为一酰甘油、二酰甘油和游离脂肪酸，最终产物是甘油和脂肪酸。 产物脂肪酸为动物体生长和繁殖提供能量，部分中链脂肪酸能抑制肠道有害微生物，改善肠道菌落环境，从而促进消化，起到类似抗生素的作用，脂肪酶在常温常压下反应，反应条件温和，转化率高，具有优良的立体选择性，不易产生副产物，避免因化学催化法而带来的有害物质，不会造成环境污染，因此，在食品、皮革、医药、饲料和洗涤剂等许多工业领域中均有广泛的应用。 1 脂肪酶的特性 1.1 脂肪酶的来源 脂肪酶按其来源主要分为3类：1）动物源性脂肪酶，如：猪和牛等胰脂肪酶提取物；2）植物源脂肪酶，如：蓖麻籽和油菜等；3）微生物源性脂肪酶。由于微生物种类多、繁殖快且易发生遗传变异，具有比动植物更广的作用pH、作用温度范围及底物专一性，且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，所以，微生物脂肪酶是主要的研究对象。产微生物脂肪酶菌种的研究主要集中在真 菌包括，根霉、黑曲霉、镰孢霉、红曲霉、黄曲霉、毛霉、犁头霉、须霉、白地霉、核盘菌、青霉和木霉；其次是细菌，如：假单胞菌、枯草芽抱杆菌、大肠杆菌工程菌、无色杆菌、小球菌、发光杆菌、黏质赛氏杆菌、无色杆菌、非极端细菌和洋葱伯克霍尔德菌等；另外还有解酯假丝酵母和放线菌。1.2 特性1.2.1 催化特性 脂肪酶不同活性的发挥依赖于反应体系的特点，在油水界面促进酯水解，而在有机相中可以酶促合成和酯交换。其催化特性在于：在油水界面上其催化活力最大，溶于水的酶作用于不溶于水的底物，对均匀分散的或水溶性底物不作用，反应在2个彼此分离的完全不同的相的界面上进行。Macrae 等研究表明：在油水界面上油脂量决定脂肪酶活性，增加乳化剂量，可提高油水界面饱和度，从而提高脂肪酶活性，增加油水界面面积，可承载更多脂肪酶分子，也可增加催化反应速率。而在水体系中，大多数脂肪酶活性很低或没有活性。 由于脂肪酶在非均相体系中表现出的高催化活性，且在酶催化反应中不需要辅酶，所以可利用非水相中的脂肪酶催化完成各种有机合成及油脂改性反应，如：酯化、酸解、醇解、转酯、羟基化、甲基化、环氧化、氨解、酰基化、开环反应和聚合等反应。 1.2.2 底物特异性 不同来源脂肪酶对底物不同碳链长度和饱和度脂肪酸表现出不同反应性，圆弧青霉和金黄色葡萄球菌脂肪酶水解短链(低于C 8)脂肪酸所形成的三脂酰甘油，黑曲霉和根霉对中等长链(C 8~C 12)脂肪酸形成的三脂酰甘油有强烈特异性，猪葡萄球菌脂肪酶偏爱磷脂为底物，也可以水解脂肪酸链长短不一的各种油脂。解脂无色杆菌对饱和脂肪酸表现出 收稿日期：2011 - 05 - 09
2014级生物工程专业实验(II) 黑曲霉液态发酵生产酸性蛋白酶 一、实验目的 掌握液态耗氧发酵的一般工艺，熟悉机械搅拌发酵罐及相关设备的原理和使用。 二、实验材料 2.1菌株 黑曲霉Aspergillus niger SZ-357，由发酵与酶工程研究室分离。 2.2 实验试剂 糊精、酵母膏、氯化铵、磷酸二氢钾、CaCl2、酪蛋白、酪氨酸、20%三氯乙酸，3,5-二硝基水杨酸(DNS)。 2.3实验设备 DHP-9082电热恒温培养箱；2112型恒温摇床；GL-20G-II高速冷冻离心机；BIOTECH-5BG发酵罐，静音无油空气压缩机、BILON-T-501低温冷却液循环系统；722S型分光光度仪；SW-CJ-2FD型净化工作台；HZS-H 超级恒温水浴锅；Sartorius分析天平。 三、角蛋白酶液态发酵实验 3.1工艺流程 3.2培养基及培养条件 3.2.1种子培养基及培养条件 （1）液体种子培养基及培养条件：糊精1%，酵母膏4%，氯化铵3%，KH2PO4 0.03%，CaCl2 0.5%，pH7.0，121o C灭菌15 min。将斜面菌种接种于含有100 mL 种子培养液的500 mL三角摇瓶中，在34o C，180r/min的恒温摇床中振荡培养24 h。
(2)麸皮固体种子培养基及培养条件：将斜面菌种接种于含水90%的麸皮固体培养基中，34o C，静置培养72 h，取出麸皮种子40 o C烘干备用。 3.2.2发酵培养基及培养方法 发酵培养基：糊精1%，酵母膏4%，氯化铵3%，KH2PO40.03%，CaCl2 0.5%，pH7.0。培养基121o C灭菌20 min，将种子液按5%（麸皮种子按3‰）的接种量接种于发酵罐中，在34o C，500 r/min的条件下发酵72 h。 3.3 检测方法 3.3.1菌体浓度的测定 干重法。 3.3.2还原糖的测定 采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定发酵液中还原糖含量。 (1) 标准曲线的绘制：配制1.0 mg/mL葡萄糖标准溶液，取9支洁净的25 mL比色管编号，按表1加入试剂。向9支比色管中加入0.5 mL DNS，摇匀，于沸水浴中加热5 min，取出置于自来水中冷却，加入4 mL蒸馏水，以管“1”为空白在540 nm波长处测定OD值。以浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线。 (2)发酵液中还原糖含量的测定：取0.5 mL 待测样于比色管中，再加入0.5 mL DNS；在沸水浴中加热5 min，然后冷却；最后加入4 mL蒸馏水，540 nm下测定OD值。结合标准曲线计算发酵液中还原糖含量。 表1 葡萄糖标准曲线的制作 管号葡萄糖溶液/mL 蒸馏水/mL 最终浓度/(mg/mL) 1 0 0.5 0 2 0.05 0.45 0.1 3 0.1 0. 4 0.2 4 0.1 5 0.35 0.3 5 0.2 0.3 0.4 6 0.25 0.25 0.5 7 0.3 0.2 0.6 8 0.35 0.15 0.7 9 0.4 0.1 0.8 3.3.3酸性蛋白酶活力的测定 Folin-酚法。
微生物发酵蛋白饲料 项目概述 （一）微生物发酵蛋白产品： 发酵蛋白饲料是以微生物、复合酶为生物饲料发酵剂菌种，将饲料原料转化为微生物菌体蛋白、生物活性小肽类氨基酸、微生物活性益生菌和复合酶制剂为一体的生物发酵蛋白饲料。 （二）微生物发酵蛋白产品生产背景： 生物技术特别是微生物发酵技术来开发新型蛋白饲料资源，具有广泛的应用前景。利用微生物生产的饲料蛋白、酶制剂、氨基酸、维生素、抗生素和益生菌等相关产品，可以弥补常规饲料中容易缺乏的氨基酸等物质，而且能使其他粗饲料原料营养成分迅速转化，达到增强消化吸收利用效果。 饲料和粮食生产一直是我国国民经济的薄弱环节。由于受人口增长、耕地减少和肉食品消费增加的影响，我国粮食供需平衡十分脆弱。我国人均占有粮食一直在400k以下其中粮食总产量的40%左右用于饲料生产。在耕地和水资源长期紧缺的情况下，我国粮食产量已很难提高。饲料资源短缺的问题长期制约着我国农牧业的发展，尤其是蛋白质饲料的严重不足已经成为全球性问题。发展高效饲料工业，提高粮食向畜牧产品的转化效率和饲料利用率、开发新型蛋白饲料是满足人民对肉、禽、鱼、蛋越来越大的需求量的最佳途径。 （三）微生物发酵的分类： 微生物发酵根据获得产品的不同可分为微生物酶发酵、微生物菌体发酵、微生物代谢产物发酵、微生物的转化发酵、生物工程细胞的发酵。根据微生物
的种类不同可分为厌氧发酵和好氧发酵，厌氧发酵在发酵时不需要供给空气，如利用乳酸杆菌进行的丙酮、丁醇发酵等；好氧发酵需要在发酵过程中不断的通入一定量的空气，如利用黑曲霉进的柠檬酸发酵，利用棒状杆菌进行的谷氨酸发酵利用黄单胞菌进行的多糖发酵等。根据培养基的同可分为固体发酵和液体发酵，根据设备不同可分为敞口发酵、密闭发酵、浅盘发酵和深层发酵。 （四）微生物发酵的优越性 4.1发酵脱毒 多数情况下微生物的代谢产物可以降低饲料毒素含量，甘露聚糖可以有效地降解黄曲霉B 1 等。有研究表明，曲霉属，串珠霉属等 5个菌株能效的降低发酵棉籽粕中游离棉酚的含量。 4.2改变蛋白质的品质 微生物可以分解品质较差的植物性或动物性蛋白质，合成品质较好的微生物蛋白质，例如活性肽、寡肽等。微生物能把15%以上的糖、半纤维粗纤维3%及以上的粗脂肪转化为30%以上的粗蛋白、赖氨酸和蛋氨酸，有利于畜禽的消化吸收。 4.3 产生促生长因子 不同的菌种发酵饲料后所产生的促生长因子量不同，这些促生长因子主要有有机酸族维B素和未知生长因子等。 4.4降低粗纤维 一般发酵水平可使发酵基料的粗纤维含量降低12%～16%，增加适口性和消化率等研究。Carlson报道，发酵后饲料中的植酸磷或无机磷酸盐被降解或析出，变成了易被动物吸收的游离磷。
毛霉是腐乳发酵生产的主要菌种，在腐乳生产工艺中其主要作用是分泌蛋白酶水解豆腐胚内的大豆蛋白。腐乳成品中的蛋白质主要是以多肽的形式存在的，具有相当高的水解程度，并且已经从中分离出多种具有生理活性的多肽[1-2]。而对众多腐乳产品的感官分析也表明，腐乳产品通常不具有一般蛋白水解物所特有的苦味。综合以上 结果来看，毛霉蛋白酶在解决大豆蛋白水解率低、水解物的苦味等难题方面具有很大的潜力。毛霉虽然在发酵工业中的应用有着悠久的历史，但是对这类菌种胞外蛋白酶系的研究却并未完全开展。仅有极少数学者对该菌种的发酵产酶特性及粗酶的催化、水解特性进行过探讨[3-5]。然而，毛霉由于长期受到高蛋白环境条件的驯化， Catalytic and kinetic properties of one protease from Mucor PAN Jin-quan (Life Science and Technology School,Zhanjiang Normal University,Zhanjiang 524048)Abstract:One protease was purified from extracellular of Actinomucor elegans AS3.2778and its catalytic and kinetic properties were also investigated.The results show that the purified protease was one alkaline serine protease,which has relatively higher activity at pH8.5～9.5and 60℃,and is stable at pH6.0~9.0at ＜45℃.At 40℃,the kinetics of casein hydrolysis by the protease fit the Mchaelis-Mentonequation:V=22.8S S+8.857,and the energy of activation (Ea)of this hydrolysis reaction below 45℃is 44.09kJ.The protease was unstable at 50℃,and the kinetics of deactivation fit the model:a=exp(－0.218t). Key words:Actinomucor elegans;protease;catalytic properties;kinetics 潘进权 (湛江师范学院生命科学与技术学院，湛江524048) 摘要：从雅致放射毛霉胞外分离纯化出一蛋白酶组分，以酪蛋白为底物对其催化特性及动力学 进行了分析。结果表明：该蛋白酶组分是一种碱性丝氨酸蛋白酶；在pH8.5～9.5、60℃具有最大催化活性，在pH6～9和低于45℃具有很好的稳定性；在40℃该蛋白酶水解酪蛋白的反应符合米氏方程：V=22.8S S+8.857；在4～45℃的范围内，该蛋白酶水解酪蛋白反应的活化能Ea 为44.09 kJ ；该蛋白酶在50℃不稳定，其热失活规律符合一级指数衰减动力学模型：a=exp(－0.218t)。关键词：雅致放射毛霉；蛋白酶；催化特性；动力学 中图分类号：TS 201.2 文献标志码：A 文章编号：1005-9989(2010)11-0036-05 毛霉蛋白酶的催化特性及 动力学研究 收稿日期：2010-03-13 基金项目：广东省自然科学基金项目(9452404801001943)。 作者简介：潘进权(1978—)，男，博士，讲师，主要从事酶与发酵工程相关领域的研究工作。 ·36 ·
米曲霉在食品中的应用 摘要：介绍了米曲霉的生物学特性，并综述了它在调味品、饲料、生产曲酸、消除乳糖不耐症、酿酒等方面的应用，提出了其发 展前景。 关键词：米曲霉；工业：应用；展望 1米曲霉的生物学特征 米曲霉CAs ) 是一种好气性真菌，属于半知菌亚门、曲霉属，菌丝一般呈黄绿色，后为黄褐色，分生孢子梗生长在厚壁的足细胞上，分生孢子头呈放射形，项囊球形或瓶形，小梗一般为单层，分生孢子球形平滑，少数有刺，培养适温为37度。米曲霉的菌丝由多细胞组成，是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤 维素酶、植酸酶等。在淀粉酶的作用下，将原料中的直链、支链淀粉降解为糊精及各种低分子糖类，如麦芽糖、葡萄糖等；在蛋白酶的作用下，将不易消化的大分子蛋白质降解为蛋白胨、多肽及各种氨基酸， 而且可以使辅料中粗纤维、植酸等难吸收的物质降解，提高营养价值、保健功效和消化率，广泛应用于食品、饲料、生产曲酸、酿酒等发酵业。 2米曲霉在工业上的应用 2．1用于发酵生产 豆豉、豆酱豆豉是我国古老的大豆发酵制品之一，营养丰富，药食兼用，对我国人民的饮食文化和医疗保健发 挥着重大作用。在传统豆豉酿造工艺中，米曲霉酿造豆豉在我国应用最早、最广。《食经》等历史文献记载作豉法大都是米曲霉豆豉。当时先人们能够巧妙地控制米曲霉的最适温度，不超过37℃，“温如人腋下”，直到“后着黄衣，色均足”。由于没有显微镜，看不到微生物的个体形态，但能通过微生物的群体形态“黄农”来控制微生物的生长繁殖。成曲以米曲霉为主，兼有其它霉菌、酵母和细菌等稳定的群 体。随着科学发展，在前人基础上相继出现改良的多菌制曲和无盐固态发酵工艺，己达到相当高的水平，在生产实践中产生了良好的效果。 随着人们对食品的营养结构及保健性要求的提高，虽然酱具特有的色、香、味，然而已满足不了人民生活水平不断提高的需求。最近，日本研制了保健酱一荞麦豆酱，其除了含有17种氨基酸外，还含有 其它酱品没有的芦丁(2．4rag／lOOg)，在保持原有豆酱生理机能的同时，又增加了荞麦的保健性，是一种多功能的保健调味品。鞠洪荣等[3]研究表明，在传统工艺和日本工艺的基础上进行改进，即按一定比例如入米曲霉酿造的荞麦豆酱，酱香较浓，与传统豆酱相比具有独特的醇香味，且提高了营养价值和保健效果，有潜在的市场前景。 2．2与黑曲霉、绿色木霉复合发酵 用于酱油生产酱油酿造主要靠米曲霉的作用。在米曲霉生过程中能分泌多种酶系，其中最重要的是蛋白酶、淀粉酶和酯酶等。天然发酵酱油是利用蛋白酶的水解作用，将豆类中的蛋白质降解成多肽、氨基酸等可溶性含氮物，且口味好，营养丰富，是营养性风味调料的发展方向[4]。而淀粉酶的作用是将制曲后原料中的淀粉或经糖化后糖浆中残留的淀粉进一步彻底糖化降解，糖化后生成的单糖类如葡萄糖、果糖、多缩戊糖等，对酱油的色、香、味、体有重要影响。因此，米曲霉所产淀粉酶的性质与酱油质量好坏密切相关。吕嘉枥等[5]对分离纯化的米曲霉(今野菌株)所产．淀粉酶进行了研究，探索出了该菌株产淀粉酶的培养温度和最佳培养时间。米曲霉酶系活性的高低将直接影响到原料的利用率及产品的产率，影响酱油中可溶性含氮物的含量，从而也会影响酱油的品质；而米曲霉产孢子能力的强弱则会影
酸性蛋白酶 酸性蛋白酶cas|酸性蛋白酶价格|酸性蛋白酶厂家|酸性蛋白酶详细介绍 酸性蛋白酶选来选去，还是隆科特好！ 酸性蛋白酶是采用黑曲霉3.4310菌株，经液体深层发酵培养，再用其独特的生产工提取，精制而成的产品。 本产品是一种在酸性环境下（PH2.5-4.0）催化蛋白质酶解的酶制剂，适用于酸性介质中水解动、植物蛋白质。例如毛发软化，啤酒果酒澄清，动、植物蛋白质水解营养液，羊毛染色，废胶片回收；还可以进一步加工成医用级蛋白酶作为消炎和助消化剂，或试剂用蛋白酶；亦可以作为饲料添加剂等。 1、产品基本性质 项目指标 外观黄褐色粉末 酶活力u/g(ml) 20000-100000 pH适应范围 2.0-5.0 最适pH值为2.5-3.5 温度适应范围30-50℃，最适温度40℃，超过50℃失活严重 金属离子对酶活力的 被钙、镁离子激活，被铜、汞、铅离子所抑制影响 产品标准GB/T 23527-2009 1.1产品性状：浅棕色粉状制剂。 1.2作用方法：作用键内酶主要生成物质肽类和少量氨基酸。 1.3热稳定性：PH在 2.0-4.0条件以下比较稳定，超过50℃酶活不稳定，60℃以上很快失活。 1.4PH稳定性：PH 2.5-4.0之间稳定，低于2.5或高于4.0很快失活。 1.5最适作用温度：对0.5%酪蛋白在PH3.0左右，最适用温度范围30-50℃，最适用温度为40℃。 1.6酶的最适作用PH：在40℃条件下最适作用PH范围 2.5-4.0，最适作用PH 3.0。 1.7各种金属离子对酶活的影响：被Mn、Ca、Mg离子激活，被Cu、Hg、Al离子所抑制。酶活力：5万-20万单位/克 2、应用工艺（根据试验情况进行调整） 1、白酒工业： 本品用以淀粉为原料的生产酒精及白酒行业，提高出酒率0.25%个酒分，提高发酵速度。 2、食品工业： 食品上用以淀粉改良，提高食品风味、改良品质，因能提高氨基酸含量 3、啤酒生产： 能有效阻断双乙酰生成，缩短啤酒成熟期。
WOIRD格式 1.菌种特点： 米曲霉(Asp.oryzae)属于真菌菌落生长快，10d直径达5~6cm，质地疏松，初白色、黄色， 后变为褐色至淡绿褐色。背面无色。分生孢子头放射状，一直径150~300μm，也有少数为 疏松柱状。分生孢子梗2mm左右。近顶囊处直径可达12~25μm，壁薄，粗糙。顶囊近球 形或烧瓶形，通常40~50μm。上覆小梗，小梗一般为单层，12~15μm，偶尔有双层，也 有单、双层小梗同时存在于一个顶囊上。分生孢子幼时洋梨形或卵圆形，长大后多变为球形 或近球形，一般4.5μm，粗糙或近于光滑。（半知菌亚门丝孢钢丝孢目从梗孢科曲霉属真 菌中的一个常见种）。菌落生长较快，质地疏松。初呈白色、黄色，后转黄褐色至淡绿褐色， 背面无色，分布甚广，主要在粮食、发酵食品、腐败有机物和土壤等处。是我国传统酿造食 品酱和酱油的生产菌种。也可生产淀粉酶、蛋白酶、果胶酶和曲酸等。会引起粮食等工农业 产品霉变。米曲霉(Aspergillusoryzae)具有丰富的蛋白酶系,能产生酸性、中性和碱性蛋白酶, 其稳定性高,能耐受较高的温度,广泛地应用于食品、医药及饲料等工业中。米曲霉也是美国食品与药物管理局和美国饲料公司协会1989年公布的40余种安全微生物菌种之一。 米曲霉 米曲霉是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、 植酸酶等。在淀粉酶的作用下，将原料中的直链、支链淀粉降解为糊精及各种低分子 糖类，如麦芽糖、葡萄糖等；在蛋白酶的作用下，将不易消化的大分子蛋白质降解为 蛋白胨、多肽及各种氨基酸，而且可以使辅料中粗纤维、植酸等难吸收的物质降解， 提高营养价值、保健功效和消化率，广泛应用于食品、饲料、生产曲酸、酿酒等发酵 工业，并已被安全地应用了1000多年。米曲霉是理想的生产大肠杆菌不能表达的真 核生物活性蛋白的载体。米曲霉基因组所包含的信息可以用来寻找最适合米曲霉发酵 专业资料整理
２００６Ｎｏ．３ＳｅｒｉａｌＮｏ．１５６ ＣｈｉｎａＢｒｅｗｉｎｇ ＦｏｒｕｍａｎｄＳｕｍｍａｒｙ ＊米曲霉的应用研究进展 赵龙飞，徐亚军（商丘师范学院生物系，河南商丘４７６０００） 摘要：介绍了米曲霉的生物学特性，并综述了它在调味品、饲料、生产曲酸、消除乳糖不耐症、酿酒等方面的应用，提出了其发展前景。 关 键 词：米曲霉；工业；应用；展望 中图分类号：ＴＳ２０１．３ 文献标识码：Ａ 文章编号：０２５４－５０７１（２００６）０３－０００８－０３ ＊ １米曲霉的生物学特征 米曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）是一种好气性真菌，属于半知菌亚门、曲霉属，菌丝一般呈黄绿色，后为黄褐色，分生孢子梗生长在厚壁的足细胞上，分生孢子头呈放射形，顶囊球形或瓶形，小梗一般为单层，分生孢子球形平滑，少数有刺，培养适温为３７℃。米曲霉的菌丝由多细胞组成，是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等［１］。在淀粉酶的作用下，将原料中的直链、支链淀粉降解为糊精及各种低分子糖类，如麦芽糖、葡萄糖等；在蛋白酶的作用下，将不易消化的大分子蛋白质降解为蛋白胨、多肽及各种氨基酸，而且可以使辅料中粗纤维、植酸等难吸收的物质降解，提高营养价值、保健功效和消化率，广泛应用于食品、饲料、生产曲酸、酿酒等发酵工业。２米曲霉在工业上的应用 ２．１用于发酵生产豆豉、豆酱 豆豉是我国古老的大豆发酵制品之一，营养丰富，药食兼用，对我国人民的饮食文化和医疗保健发挥着重大作用。在传统豆豉酿造工艺中，米曲霉酿造 豆豉在我国应用最早、最广［２］。《食经》等历史文献记载作豉法大都是米曲霉豆豉。当时先人们能够巧妙地控制米曲霉的最适温度，不超过３７℃，“温如人腋下”，直到“后着黄衣，色均足……”。由于没有显微镜，看不到微生物的个体形态，但能通过微生物的群体形态“黄衣”来控制微生物的生长繁殖。成曲以米曲霉为主，兼有其它霉菌、酵母和细菌等稳定的群体。随着科学发展，在前人基础上相继出现改良的多菌制曲和无盐固态发酵工艺，已达到相当高的水平，在生产实践中产生了良好的效果。 随着人们对食品的营养结构及保健性要求的提高，虽然豆酱具特有的色、香、味，然而已满足不了人民生活水平不断提高的需求。最近，日本研制了保健酱—荞麦豆酱，其除了含有１７种氨基酸外，还含有其它酱品没有的芦丁（２．４ｍｇ／１００ｇ），在保持原有豆酱生理机能的同时，又增加了荞麦的保健性，是一种多功能的保健调味品。鞠洪荣等［３］研究表明，在传统工艺和日本工艺的基础上进行改进，即按一定比例加入米曲霉酿造的荞麦豆酱，酱香较浓，与传统豆酱相比具有独特的醇香味，且提高了营养价值和保健效 收稿日期：２００５－０１－２６ 作者简介：赵龙飞（１９７８－），男，河南杞县人，教师；徐亚军，通讯作者，主要从事生物学和茶学方面的教学和研 究工作。Ｅｍａｉｌ：ｈｎｚｈａｏｌｏｎｇｆｅｉ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ ＲｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒｅｓｓｏｎｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ ＺＨＡＯＬｏｎｇ－ｆｅｉ，ＸＵＹａ－ｊｕｎ＊ （ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＢｉｏｌｏｇｙ，ＳｈａｎｇｑｉｕＮｏｒｍａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｓｈａｎｇｑｉｕ４７６０００，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅｗａｓｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄｉｎｔｈｉｓａｒｔｉｃｌｅ．ＴｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＡ．ｏｒｙｚａｅｉｎｆｉｘｉｎｇｓ，ｆｅｅｄ，ｋｏｊｉａｃｉｄｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｌａｃｔｏｓｅｉｎｔｏｌｅｒａｎｃｅｓｙｍｐｔｏｍ，ｂｒｅｗｉｎｇ，ａｎｄｍａｎｙｍｏｒｅｗｅｒｅｓｕｍｍａｒｉｚｅｄａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｉｔｓｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ．Ｉｔｓｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｐｒｏｓｐｅｃｔｗａｓａｌｓｏｐｒｏｐｏｓｅｄａｃｃｏｒｄｉｎｇｌｙ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ；ｉｎｄｕｓｔｒｙ；ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ；ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｐｒｏｓｐｅｃｔ ８??