本科学生综合性实验报告
学号：姓名：
学院：生命科学学院专业、班级：班
实验课程名称：胡萝卜肉质根愈伤组织诱导、继代增殖、细胞
悬浮及体细胞胚胎发生培养实验
教师：
开课学期：至学年学期
填报时间：年月日
云南师范大学教务处编印
一．实验设计
实验序号实验一实验名称胡萝卜肉质根愈伤组织诱导、继代增殖、细胞悬
浮及体细胞胚胎发生培养实验
实验时间2013年3月-6月实验室325
实验内容：
实验1-1 MS培养基母液的配制与保存
实验1-2 MS固体培养基配制
实验1-3 胡萝卜肉质根愈伤组织诱导培养（初代培养）
实验1-4 胡萝卜愈伤组织培养
实验1-5 胡萝卜愈伤组织继代增殖培养
实验1-6 胡萝卜细胞悬浮培养
实验1-7 胡萝卜愈伤组织器官分化培养
一．实验目的
1-1：使学生能熟练准确配制MS培养基母液和组培室常用的化学试剂，巩固相关理论基础知识。
1-2：通过MS固体培养基的配制，掌握配制培养基的基本技能。
1-3：使同学能够熟练掌握外植体的表面消毒技术和无菌操作技术，并且基本掌握愈伤组织的诱导培养。
1-4：使同学熟练掌握愈伤组织培养的基本操作技术，进一步熟悉、规范无菌操作技术。
1-5：使同学熟练掌握愈伤组织继代增殖培养的基本操作技术，进一步熟悉、规范无菌操作技术。
1-6：使同学熟练掌握胡萝卜细胞悬浮培养的基本操作技术，进一步熟悉、规范无菌操作技术。
1-7：使同学了解胡萝卜愈伤组织器官分化培养的基本操作技术。
二、实验原理、实验流程
1.实验原理
植物细胞全能性是植物组织培养的细胞基础。生活的植物细胞只要有完整的膜系统和细胞核，它就会有一整套发育成一个完整植株的全部遗传信息，在适当条件下，这些信息可以表达，再生成一个完整植株。
1-1：培养基是植物离体培养组织和细胞赖以生存的营养基质。配制培养基时，为了减少试剂称取时的工作量和少量称取时出现的误差，以及避免多种营养成分混合导致沉淀产生或相互反应而失去培养效果，预先要将各种营养成分配制为一定倍数的培养基母液，待使用时稀释到要求的浓度。母液的浓度为培养基浓度的
10倍、20倍、50倍、100倍等或更高。
1-2：将事先配制好的培养基母液按一定比例稀释至浓度为培养基中规定的使用浓度，再加入琼脂、蔗糖、生长调节物质等，制备成符合要求的培养基。
1-3：将胡萝卜的贮藏根（根的变态）表面消毒后切割成小块接种于愈伤组织诱导培养基上，诱导外植体脱分化产生愈伤组织。
1-4：将胡萝卜肉质根诱导产生的愈伤组织，在无菌操作室中切取长势好的愈伤组织部分转接到胡萝卜愈伤组织培养基中，进行胡萝卜愈伤组织培养。
1-5：将胡萝卜愈伤组织转接到愈伤组织继代增殖培养基上培养，即可实现愈伤组织的增殖。
1-6：将增殖的大量胡萝卜愈伤组织转接到胡萝卜悬浮培养基中进行培养。
1-7：将增殖的大量胡萝卜愈伤组织转接到胡萝卜愈伤组织器官分化培养基中培养。
2.实验流程
（1）实验总体流程：
MS培养基母液的配制与保存
MS固体培养基配制
胡萝卜肉质根愈伤组织诱导培养（初代培养）
胡萝卜愈伤组织培养
胡萝卜愈伤组织继代增殖培养
胡萝卜细胞悬浮培养
胡萝卜愈伤组织器官分化培养
（2）MS培养基母液的配制与保存流程：
大量元素母液的配制
微量元素母液的配制
有机成分母液的配制
铁盐母液的配制
植物生长调节物质母液的配制
放入冰箱保存
（3）MS固体培养基配制流程：
培养基各种物质的混合
定容
调整PH：6
培养基分装
培养基封口
培养基灭菌
培养基保存备用
（4）胡萝卜肉质根愈伤组织诱导培养（初代培养) 流程：
外植体表面灭菌前的准备工作
实验材料的准备
器械及实验者的消毒灭菌、植物材料的表面灭菌和接种
(5)胡萝卜愈伤组织培养流程：
器械及实验者的消毒灭菌
剥离愈伤组织诱导培养所得的愈伤组织
胡萝卜愈伤组织接种
（6）胡萝卜愈伤组织继代增殖培养流程：
器械及实验者的消毒灭菌
胡萝卜愈伤组织培养所得愈伤组织
接种于胡萝卜愈伤组织继代增殖培养的培养基中
（7）胡萝卜细胞悬浮培养流程：
器械及实验者的消毒灭菌
胡萝卜愈伤组织继代增殖培养所得愈伤组织
接种于胡萝卜细胞悬浮培养的培养基中，在摇床中震荡
(8)胡萝卜愈伤组织器官分化培养流程：
器械及实验者的消毒灭菌
胡萝卜愈伤组织继代增殖培养所得愈伤组织
接种于胡萝卜愈伤组织器官分化培养的培养基中
三、实验设备及材料
1、实验材料
新鲜的胡萝卜贮藏根
2、实验设备
（1）主要用具与仪器：
烧杯、容量瓶、搪瓷杯、药勺、称量纸、玻棒、标签纸、pH试纸（pH5.4~7.0），冰箱、普通天平、分析天平、各种型号的试剂瓶（棕色和白色）、移液管、量筒、子、手术剪、解剖刀、已灭菌培养皿、酒精灯、超净工作台、恒温培养箱、摇床、电磁炉、果酱瓶、高压蒸汽灭菌锅、封口膜、棉线、酒精棉球、已灭菌滤纸、镊培养架等。
（2）主要药品和试剂：
盐酸吡哆素、烟酸、肌醇、2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)、NAA（α-萘乙酸）、硝酸铵、硝酸钾、氯化钙、硫酸镁、磷酸二氢钾、碘化钾、硫酸锰、硫酸锌、钼酸钠、硫酸铜、氯化钴、乙二胺四乙酸二钠、硫酸亚铁、甘氨酸、盐酸硫胺素、6-BA （6-苄基腺嘌呤）、KT、浓盐酸、氢氧化钠、浓硫酸、重铬酸钾、95%酒精、蒸馏水、琼脂、蔗糖、生长调节物质、蒸馏水、1mol·L-1HCl、1mol·L-1NaOH、无菌水、75％酒精、0.1%HgCl2。
四、实验方法步骤
1.MS培养基母液的配制
（1）大量元素母液的配制与保存
母液
种类成分
规定
用量
/mg?
L-1
浓
缩
倍
数
称取量
/mg
母液定容
体积/ml
配1L MS
培养基吸
取取量
/ml
大量元素KNO31900
20
38000
1000 50 NH4NO31650 33000
CaCl2?2H2O 440 8800
MgSO4?7H2O 370 7400
KH2PO4 170 3400
配制的步骤为：确定母液的浓度和体积→计算各种化合物用量→称量→分别溶解→混合→定容→装瓶→贴标签→放入冰箱保存。
CaCl2 ?2H2O最后加入。
（2）微量元素母液的配制
母
液
种类成分
规定
用量
/mg?
L-1
浓
缩
倍
数
称取量
/mg
母液定容
体积/ml
配1L MS
培养基吸
取量/ml
微MnSO4?H2O
16.9
3380 ZnSO4? 7H2O
8.6 1720
量 元 素
H 3BO 3 6.2
200
1240
1000 5
KI
0.83 166
Na 2MoO 4 ? 2H 2O
0.25 50
CuSO 4 ? 5H 2O 0.025 5
CoCl 2 ? 6H 2O
0.025
5
配制步骤同大量元素（混合时不要求先后顺序）。
（3）有机成分母液的配制
配制的步骤为：确定母液的浓度和体积→计算各种化合物用量→称量→溶解→定容→装瓶→贴标签→放入冰箱保存。
(4)铁盐母液的配制
母 液 种 类
成分 规定用量 /mg ? mL -1 称取量/mg
母液定容
体积/ml
有 机 成 分
甘氨酸 2.0 200
100 VB 1 1.0 100
VB 6
1.0 100 烟酸 1.0 100 肌醇 10 1000
铁盐母液宜单独配制，其配制步骤为：
确定母液的浓度和体积→计算各种化合物用量→称量→分别溶解→混合→煮沸数分钟→调节pH 值至5.8 →定容→装瓶（棕色）→贴标签→放入冰箱保存。
（5）植物生长调节物质母液的配制
母液 种类 成 分 称取量 (mg ) 母液定容体积(ml )
母液浓度(mg/ml)
生长素 2,4-D 100 100
1.0 NAA
细胞分裂素 6-BA
KT
配制步骤与有机成分母液的配制步骤基本相同，但是2,4-D/NAA 用少量95％酒精溶解，再加水定容；6-BA/KT 应先溶于少量1 mol ·L -1的HCl 中，再加水定容。
2.MS 固体培养基配制 培养基配方：
MS 基本培养基＋6-BA 0.4mg/L ＋KT 0.2mg/L ＋NAA 0.2mg/L ＋ 2,4-D 1mg/L +琼脂0.7％＋蔗糖3％＋CH 100mg/L PH=5.8
大量元素:25 ml ； 微量元素：2.5 ml ； 铁盐：2.5 ml ； 肌醇：5ml ； VB 1：0.5mL VB6：0.25mL ； 盐酸：0.25mL ； 甘氨酸：0.5mL ； BA ：0.2ml
KT ：0.1mL ； NAA ：0.1mL ； 2,4-D ：0.5mL
母 液 种 类
成分
规定用量 /mg ? L -1 浓 缩 倍 数 称 取 量 /mg 母液定容体积/ml 配1L MS 培养基吸
取量/ml
铁 盐 Na 2EDTA ? 2H 2O
37.3
200
3730
500 5
FeSO 4 ? 7H 2O
27.8
2780
CH：50mg；蔗糖:15g；琼脂：3.5g。
每组配500mL,50mL三角瓶分装20瓶，25mL/瓶。
方法步骤：
（1）培养基各种物质的混合
A.琼脂的溶解 3.5g+350mLH2O
B.称取所需蔗糖量加入到琼脂溶液中溶解（15g）
C.按母液顺序和规定量依次量取母液并放入烧杯，并把混合母液加入到琼脂和糖的溶液内。
（2）定容：500mL
（3）调整PH：6
（4）培养基分装（20瓶，25mL/瓶）
（5）培养基封口
（6）培养基灭菌
（7）培养基保存备用
3.胡萝卜肉质根愈伤组织诱导培养（初代培养）
所用培养基为之前配制好的.MS固体培养基。
（1）、实验材料的准备
①、材料的修整、刷洗、冲洗。
②、用小刀刮去胡萝卜外表皮，横切取高约1cm的圆柱形胡萝卜块3块。（2）、准备工作
①、打开超净工作台和无菌操作室的紫外灯，照射40min左右，后关闭。
②、开启过滤室风机，使无菌风吹拂工作台面和四周的台壁。
③、用70%—75%的酒精擦拭工作台和双手。
④、用沾有70%—75%酒精的纱布擦拭盛培养基的培养器皿，放进工作台。
⑤、把解剖刀、剪刀、镊子等器械浸泡在95%的酒精中，再在火焰上消毒，放在器械架上。
⑥、在酒精灯火焰附近切割备用的接种材料。
⑦、打开瓶口，用火焰烧瓶口，转动瓶口使瓶口各部分都烧到。
⑧、取下接种器械，在火焰上消毒。
（3）、植物材料表面的灭菌与接种
①、工作人员消毒。
②、装材料的容器及玻璃棒用酒精进行表面消毒。
③、将待消毒材料浸入75%酒精中2秒钟。
④、移入消毒液0.1%HgCl2并计时。（10min）
⑤、倒入无菌水清洗4次后备用。
（4）、接种与培养
①、将经消毒的胡萝卜块去除外侧部分后，每一块再切成四小块，分别接种到5个盛培养基的三角瓶内。
②、培养瓶封口后置于恒温培养箱中全黑暗培养。温度控制在25℃左右。
③、接种结束后，清理和关闭超净工作台。
4.胡萝卜愈伤组织培养
胡萝卜愈伤组织培养基的配制与胡萝卜肉质根愈伤组织诱导培养基的配制方法相同。
在无菌操作条件下，用解剖刀剥离愈伤组织诱导培养所得的愈伤组织，接种于胡萝卜愈伤组织培养的培养基中，进行培养。
5.胡萝卜愈伤组织继代增殖培养：
首先要配制胡萝卜愈伤组织继代增殖培养基，其配置方法和培养基配方与MS固体培养基基本相同，只是胡萝卜愈伤组织继代增殖培养基中少了KT，且各种物质的含量与MS的相比有所不同。
（1）、准备工作
接种室的清洁和消毒；超净工作台的开机和消毒；剪刀、镊子、已灭菌培养皿和滤纸、待用培养基等的准备；实验材料的准备（选择装有无污染的胡萝卜愈伤组织培养所得愈伤组织三角瓶摆放于超净工作台）。
（2）愈伤组织继代培养
将无污染的胡萝卜愈伤组织培养所得愈伤组织转接到愈伤组织继代诱导培养基上（两瓶），封口后放置在25 ℃全黑暗条件进行愈伤组织的继代培养，以获得足够的愈伤组织，作为后续实验的实验材料。
6.胡萝卜细胞悬浮培养
培养基配方：MS基本培养基＋1mg/L 2,4-D ＋0.5mg/L 6-BA＋200mg/L水解酪蛋白＋3％蔗糖
（事先已配好）
配制方法与MS固体培养基相同。
将胡萝卜愈伤组织继代培养所得的两瓶无污染的愈伤组织，在超净工作台中，转接2/3到胡萝卜细胞悬浮培养的培养基中，在摇床中震荡，进行培养。
7.胡萝卜愈伤组织器官分化培养
配方：MS基本培养基＋0.1mg/L NAA ＋1mg/L 6-BA ＋0.7 ％琼脂＋3％蔗糖（配制方法同上）
将胡萝卜愈伤组织继代培养所得的两瓶无污染的愈伤组织，在超净工作台中，转接1/3到胡萝卜愈伤组织器官分化培养的培养基中进行培养。
五、注意事项
1、调节培养基时，理论上应调至5.8为宜，但因培养基经高温高压灭菌时，
蔗糖分解，PH值会有所下降，因此调至6.0可减小误差。
2.防火。实验中要经常用酒精消毒、用酒精灯烧镊子、刀具，注意安全。
3.无菌操作。材料经HgCl2消毒后，即认为是消毒干净，此后的操作中的
用具要求无菌。为防止染菌，注意：手要用酒精擦干净；镊子和刀经常在火焰上烧；锥形瓶、手不要放在盛材料的培养皿上方。
4.废液处理。酒精要回收，放原处；HgCl2有剧毒，小心不要溅出，废液使
用后应按要求放到指定位置。
5.实验材料大小应适中，不宜太大或太小。
6.实验中接种过程要在操净工作台进行，接种前，实验所用的所有器械及
手均需严格消毒灭菌。
7.切胡萝卜时，下面应垫上滤纸。
8.接种，动作要轻，力度适中。不要把接种的切块压入培养基里面，以致
破坏培养基。
9.接种时瓶口应倾斜45度，以免手、镊子上的赃物容易掉到三角瓶里。
10.操作期间应经常用70%—75%的酒精擦拭工作台和双手；接种器械应反复
在95%的酒精中浸泡和在火焰上消毒。
11.灭菌锅有很多种，实验室中常用手提式高压蒸汽灭菌锅，使用时要注意
以下几点：
（1）锅中应放足量的水，以免造成空烧或干烧；
（2）装锅时不要过度倾斜，可保持内部有一定的空间，利于蒸汽流动；
（3）增压前高压锅内的空气必须排净，否则易影响灭菌效果；
（4）灭菌过程中，应尽量保持压力恒定，严格遵守灭菌时间；
（5）排气降压时应缓慢进行；
（6）只有待高压锅内压力表指针恢复到零后，才能开启压力锅；
(7）高压锅工作时，应有专人看守。
12.培养基的保存应注意以下几点：
（1）灭菌后的培养基经冷却和凝固后即可使用检验灭菌效果。
检验是否无菌的方法：将培养基置于培养室中3天，若没有污染现象，说明灭菌可靠，可以使用。
（2）保存在低温条件下。常温下保存时要进行防尘和避光处理。
（3）保存时间不可过长。
六、参考文献
[1]. 李浚明，朱登云.植物组织培养（第3版）.中国农业大学出版社.2005,2.
[2].王连清主编.植物组织培养.北京：中国农业出版社，2002.
[3].潘瑞炽主编. 植物组织培养（第三版）.广州：广东高等教育出版社，2003.
[4].曹孜义，刘国民主编. 实用植物组织培养技术教程.兰州：甘肃科学技
术出版社，2001.
二．实验报告
一、实验现象与结果
在本次综合实验中的培养基配制，在第一个实验中不太成功，但是在之后的培养基配制都是较成功的，基本达到了预期效果。
（一）胡萝卜肉质根愈伤组织诱导培养（初代培养）：
（1）实验现象
胡萝卜肉质根愈伤组织诱导培养时，在恒温箱全黑条件下培养一定时间后
就可看出诱导结果。在未被污染的培养瓶中，可以看到胡萝卜肉质根已经分化
出了愈伤组织，愈伤组织的形状为不规则的颗粒状结构。但是颜色还是和胡萝
卜肉质根的颜色接近。
（2）实验结果
在本次实验中总共做了5瓶，结果3瓶是培养得较好的，没有污染情况，而有2瓶不是很好，受到了轻微的污染。（如表1所示）
表1 胡萝卜肉质根愈伤组织诱导结果统计
总接种瓶数 5 总接种块数15
污染瓶数 3 污染块数 3
未污染瓶数 2 未污染块数12
未污染愈伤组织发生块数12 愈伤组织发生率100% 愈伤组织发生情况5个瓶中的胡萝卜，都产生了愈伤组织，只是有3瓶
中，分别每瓶中一块胡萝卜被污染了。
记录污染情况及原因分析本次实验污染的原因可能是在对胡萝卜肉质根进行
表面消毒时，没消毒干净，并且肉质根的凹陷处还残
留有泥土。
（二）胡萝卜愈伤组织培养
（1）实验现象
在培养的两瓶胡萝卜愈伤组织中，均被污染了。培养基的颜色变成了深褐色，被污染的愈伤组织的颜色也变成了淡黑色，如果是培养得好的愈伤组织，那么其颜色为乳白色，说明分离完全，形态为颗粒状和块状，不呈现胡萝卜的颜色。（2）实验结果
两瓶均被污染了。（如表2所示）
表2胡萝卜愈伤组织培养结果统计
总接种瓶数 2 总接种块数12
污染瓶数 1 污染块数 6
未污染瓶数 1 未污染块数 6
未污染愈伤组织发生块数 6 愈伤组织发生率50%
愈伤组织发生情况两个瓶中，分别装有切下来培养的愈伤组织，其中一
瓶中被污染，另外一瓶中完好
记录污染情况及原因分析可能是在超净工作台中操作时不规范，导致了污染。
（三）胡萝卜愈伤组织继代增殖培养
（1）实验现象
图1胡萝卜愈伤组织继代增殖培养结果
（2）实验结果
表3胡萝卜愈伤组织继代增殖培养结果
总接种瓶数 2 总接种块数30
污染瓶数0 污染块数0
未污染瓶数 2 未污染块数30
未污染愈伤组织发生块数30 愈伤组织发生率100%
愈伤组织发生情况两个瓶内的胡萝卜愈伤组织长势较好
记录污染情况及原因分析两瓶愈伤组织均未被污染，长势较好，愈伤组织
疏松透明
（四）胡萝卜细胞悬浮培养
（1）实验现象
图2胡萝卜细胞悬浮培养结果
（2）实验结果
结果可由上图所示，细胞长势较好，经过过滤之后，将滤液在显微镜下观
察，可看到单细胞。
（五）胡萝卜愈伤组织器官分化培养
现象：本实验还在进行当中，但是初步可以观察到的现象是：细胞在见光的情况下，进行叶绿体的组建，愈伤组织已经由乳白色渐变为淡绿色。（如图3所示）
图3胡萝卜愈伤组织器官分化培养初步现象
对实验现象、实验结果的分析及其结论：
1)胡萝卜愈伤组织诱导实验中，做了五瓶实验，结果污染了3瓶，主要原因可
能是对胡萝卜肉质根进行表面消毒时，没消毒干净，并且肉质根的凹陷处还残留有泥土。还可能是在超净工作台中工作时，操作不规范造成的。
2)另外，在胡萝卜愈伤组织培养这个实验中，实验材料来源于之前进行胡萝卜
愈伤组织诱导出的愈伤组织，有2瓶是好的，我用它们进行啦实验。
3)在同一小组中，即使是用同样的材料，每个人的实验结果都会不一样，这是
由于个人操作差异等原因造成的。
二、实验总结
1)由于试验第一次的培养基的配制失误，直接后果可能就是愈伤组织长得不理
想。
2)第二次配制培养基吸取第一次的教训，认真调试pH，第二次培养基的配制
成功对我们愈伤组织的继代的培养成功打下了良好基础。在做实验时，每个步骤都是关键。比如我在胡萝卜肉质根愈伤组织诱导，就是因为没有把胡萝卜肉质根消毒干净，所以导致被污染了的结果。
3)在做胡萝卜愈伤组织培养这个实验室，可能没有严格按照无菌的操作来进行
本次试验认为无菌操作没那么重要，就随便消了一下毒，结果导致愈伤组织全部污染了。
总之，本学期的植物组织培养实验让我明白啦许多东西，使我真正明白了理论中所说的愈伤组织到底是怎么一回事，自己亲自动手，将胡萝卜肉质根一步一步地培养成愈伤组织。
教师评语及评分：
签名：年月日
植物组织培养报告内部编号：（YUUT-TBBY-MMUT-URRUY-UOOY-DBUYI-0128）
大蒜茎尖的组织培养 谢婷婷江宋青万嫣文吕凌宇一、实验目的 掌握植物组织培养的相关理论知识及操作方法； 通过自行设计并完成实验，提高动手能力和思维能力； 利用植物细胞的全能性，使大蒜茎尖经过脱分化作用形成愈伤组织，再分化为有结构的组织和器官，最终增殖培育出大量品质优良的大蒜试管苗。二、实验原理 植物组织培养是利用植物细胞的全能性原理。植物组织培养是在无菌环境下，将离体的植物器官、组织以至单个细胞，在人工配置的培养基上培养，使其能够继续生长，甚至分化发育成一完整植株的过程。植物的组织在培养条件下，原来已经分化停止生长的细胞，又能重新分裂，形成没有组织结构的细胞团，即愈伤组织。这一过程称为“脱分化”。已经脱分化的愈伤组织，在一定条件下，又能重新分化形成输导系统以及根和芽等组织和器官，这一过程称“再分化”。 三、实验材料、试剂和器材 1 供试材料 以购于府前菜场的大蒜为实验材料，实验在丽水学院生态学院组培实验室进行。 2 仪器与设备 超净工作台、培养事、电子天平、烧杯、容量瓶、玻璃棒、量筒、移液
管。 3 试剂 70%酒精、95%酒精、0.1%升汞、蔗糖、琼脂条、6-BA（1.5 mg/L；2.0 mg/L）、2,4-D（2.0 mg/L）、NAA（1.0 mg/L；）、IBA（2.0 mg/L）、10倍的大量元素、100倍的微量元素、100倍的铁盐、100倍的有机物。 四、实验步骤 1.培养基的配制及灭菌 诱导培养基：MS+6-BA 2.0 mg/L+2,4-D 2.0 mg/L 出芽培养基：MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L 生根培养基：MS+IBA 2.0 mg/L （1）将MS母液（10倍的大量元素、100倍的微量元素、100倍的铁盐、100倍的有机物）按顺序排列、检查是否失效。 （2）在装有3/4蒸馏水的容器中加入0.7%琼脂和3%蔗糖，加热溶化。（3）依次吸取适量各种母液移到容器中。 （4）用蒸馏水定容到相应体积。 （5）调节pH值(用0.1M的NaOH或HCl调节)至5.8-6.0。 （6）向培养基中加入适量激素。 （7）将配制好的培养基进行分装（20-30ml/瓶）。 （8）用两层称量纸包扎瓶口，并用橡皮筋扎牢，然后在高压灭菌锅中121 ℃下灭菌 20 min 。取出三角烧瓶放在台子上，冷却后备用。接种操作所需的一切用具（烧杯、培养皿、灭菌水等），需同时灭菌。 （9）将灭菌后的培养基于常温下放置一星期，观察有无污染。
植物组织培养实验报告 一、实验目的 1．掌握无菌操作的植物组织培养方法； 2．通过配置ms培养基母液，掌握母液的配置和保存方法； 3．通过诱导豌豆根、茎、 叶形成愈伤组织学习愈伤组织的建立方法； 4．通过诱导豌豆茎、叶形成愈伤组织学习愈伤组织的建立方法； 5．了解植物细胞通 过分裂、增殖、分化、发育, 最终长成完整再生植株的过程, 加深对植物细胞的全能性的理 解。 二、实验原理（一）植物组织培养 植物组织培养是把植物的器官，组织以至单个细胞，应用无菌操作使其在人工条件下， 能够继续生长，甚至分化发育成一完整植株的过程。植物的组织在培养条件下，原来已经分 化停止生长的细胞，又能重新分裂，形成没有组织结构的细胞团，即愈伤组织。这一过程称 为“脱分化作用”，已经“脱分化”的愈伤组织，在一定条件下，又能重新分化形成输导系统 以及根和芽等组织和器官，这一过程称“再分化作用”。（二）植物细胞的全能性 植物细胞的全能性即是每个植物的本细胞或性细胞都具有该植物的全套遗传基因，在一 定培养条件下每个细胞都可发育成一个与母体一样的植株。（三）组织的分化与器官建 成 外植体诱导出愈伤组织后，经过继代培养，可以在愈伤组织内部形成一类分生组织即具 有分生能力的小细胞团，然后，再分化成不同的器官原基。有些情况下，外植体不经愈伤组 织而直接诱导出芽、根。 （四）培养基的组成 培养基中各成分的比例及浓度与细胞或组织的生长或分化所需要的最佳条件相近，似成 功地使用该培养基进行组织培养的主要条件。营养培养基一般由无机营养、碳源和能源、维 生素、植物激素（生长调节剂）和包括有机氮、酸和复杂物质的添加剂组成。 三、实验器材 高压灭菌锅、超净工作台、烘箱、培养室镊子、记号笔、橡皮筋、玻 璃器皿、三角烧瓶、烧杯、量筒、剪刀、棉塞、绳子、牛皮纸、酒精灯、喷雾器等。 四、实验材料 豌豆种子 五、实验药品 药品、70% 酒精、 0.1% 升汞、ms培养基、蒸馏水、naoh、 84消毒液、蔗糖、琼脂 等。 六、实验步骤 （一）培养基母液的配制 表1.ms培养基个成分的含量（单位：mg/l） 表2.ms培养基所需母液以及扩大倍数 名称大量元素微量元素 ca盐 mg盐 fe盐有机肌醇激素 扩大倍数 50 50 50 50 50 100 100 100 定容体积(ml) 500 500 500 500 500 200 200 50 吸取毫升数/l 20 20 20 20 20 10 10 5 （注：吸取毫升数为每升培养基所吸取的母液的体积） 表3.配制母液所需的药品及称取量
胡萝卜素愈伤组织培养开题报告 1011421130 徐亮 1、本论文课题国内外概况和文献综述： 应用细胞的全能性(totipotency)理论，即已经分化的细胞仍然具有发育成完整个体的潜能，可以将成熟胡萝卜直根的部分组织培养成完整胡萝卜植株。国内外研究者在探讨胡萝卜愈伤组织的成因时，发现影响胡萝卜愈伤组织的发生频率主要有基因型、外植体、培养基、激素等因素。 胡萝卜的基因型是影响其离体培养再生能力的重要因素。 对于不同品种的胡萝卜种子,大多数研究者认为利用其刚萌发的无菌苗的下胚轴诱导愈伤组织，出愈率较高 [1-3] 。 同一基因型的不同外植体其愈伤组织的发生能力有明显差异，这与不同外植体的分化程度和脱分化能力不同有关。近年来的研究表明，以胡萝卜下胚轴为外植体出愈率要高于子叶和贮藏根 [1,3,4] 。此外，杨宁等（1999）选取胡萝卜贮藏 根的皮层、木质部及韧皮部为外植体，发现从韧皮部诱导出的愈伤组织有较好的生长效果 [5] 。 在胡萝卜愈伤组织诱导和分化中，基本培养基成分对胚性愈伤组织的诱导率和质量均有显著影响，一般认为MS 培养基对体细胞胚的发生更为有利。但也有认为B5基础培养基略优于MS 基础培养基 [1] 。 不同的激素种类、浓度及其组合对愈伤组织的诱导率有显著影响。已有的研究结果表明，在培养基中加入2,4-D,6-BA,BA,KT 等，会影响胚性愈伤组织的发生。2,4-D 的浓度从0.1～10.0 mg/L 不等，6-BA 的浓度从0.2～4.5mg/L 不等，BA 的浓度从0.5～1.0mg/L 不等，KT 的浓度从0.2～2.0mg/L 不等 [2,3,6] 。此外还 有研究结果表明，2,4-D/KT 比值是影响愈伤组织形成的关键因素，随着比值的增大，愈伤组织诱导率有逐渐升高的趋势[7] 。
云南大学生命科学实验教学中心 实验报告 课程名称：细胞工程实验 院系：生命科学学院 年级专业：2013级生物技术（国家生命科学与技术姓名：杨梦梅选课号：2015107066 学号：20131070156座号：A2 开课日期：2015.09 学期：2015秋季学期 任课教师：吕琦、牛芸 云南大学生命科学实验教学中心制 胡萝卜愈伤组织的诱导、继代及细胞悬浮培养研究第一作者：杨梦梅同组实验者：赵姗 ( 云南大学生命科学学院,昆明650504) 摘要: 以胡萝卜肉质根为外植体诱导出愈伤组织, 并建立细胞悬浮系. 实验结果表 明: 胡萝卜肉质根是诱导愈伤组织和进行细胞悬浮培养的可行外植体; 诱导致密型 愈伤组织的最佳激素浓度配比是 0.5 mg/ L 2, 4- D+ 0.4 mg/ L KT;继代培 养 1代~ 2时,可得到高活性的悬浮细胞系；细胞悬浮培养细胞经过 14 天达到高 峰期（生长平台）。 关键词: 胡萝卜; 组织培养; 细胞悬浮培养; 致密型愈伤组织; The study about inducement, subculture and suspension cell lines of Carrots’ callus
Abstract: Carrots’ flesh roots can induce callus as explants, and then it establishes suspension cell lines. The experimental results show that: Carrots’flesh root s really can induce callus and then make suspension cell lines. In order to induce high density callus, the best hormone ratio is 0.5 mg/ L 2, 4- D+ 0.4 mg/ L KT. Subculturing the cell line for 1 to 2 times, we can obtain the suspension cell line with high activity. After 2 weeks, the cell line reaches to the peak of growth. Keywords: Carrot; tissue culture experiments; suspension cell; callus in high density 胡萝卜( Daucus carota L . ) , 属于十字花科植物, 是一种十分重要的蔬菜作物, 由于胡萝卜肉质根营养丰富，约含有88％的水、6％～8％糖、1％～2％植物纤维，0．7％～1．2％蛋白质、1％灰份及0～3％脂肪，及其适于生食、加工、烹调等多种用途, 在世界范围内广泛栽培。中国是农业大国, 胡萝卜作为蔬菜作物在人们生活中起着重要的作用。因此, 加快我国胡萝卜育种研究以成为迫切需要。近些年来, 随着生物技术与分子生物学技术的快速发展, 作为生物技术研究的理想材料, 许多国家对胡萝卜体细胞杂交技术、遗传转化与再生技术、分子标记与基因克隆技术进行了广泛深入的研究。我国科研工作者在胡萝卜的生物技术与分子生物学研究上也取得了一定进展, 特别是在组织培养、原生质体融合、遗传转化及再生等方面。但是在胡萝卜细胞培养方面并不是太多, 因此继续深入研究还是很有必要的。 本文对胡萝卜愈伤组织诱导的最佳培养基和细胞悬浮培养的条件进行探讨, 为其次生代谢产物α- 胡萝卜素、β- 胡萝卜素（维生素A前体）的生产以及将来的工厂化和分子生物学研究打下基础。 1 材料和方法 1. 1材料来源 胡萝卜肉质根自农贸市场购买. 1. 2 方法 1. 2. 1MS培养基的配制1000ml 1)用大烧杯取蒸馏水100-120ml 2)依次用移液管量取加入母液：100ml大量（10x）、100ml大量钙盐（10x）、10ml微量 I（100x）、1ml微量II（1000x）、10ml铁盐（100x）、10ml有机（100x）、100ml有机肌醇（10x）、以及适当含量植物激素。 3)称取30g蔗糖加入，搅拌直至全部溶解，作为1号溶液备用。 4)称取9g琼脂，用量筒量取500ml蒸馏水一起加入1000ml体积白瓷缸中，放在电炉上一 边加热一边搅拌，加热直至清澈无沉淀。将1号溶液加入，继续加热搅拌，至将要沸腾，离火。 5)用pH试纸调pH至5.8-6.0 。 6)在白瓷缸中定容至1000ml，搅拌均匀。 7)分装至350ml培养瓶中每瓶约40~50ml。121℃高压灭菌20min。
植物组织培养实验报告 学院：生命科学技术学院 班级：11生物技术(制品) 学号：2011192017 姓名：李鹏
植物组织培养实验报告 实验一植物组织培养母液的配制 一、实验目的 1.了解植物组织培养基本培养基的组分及其作用。 2.学习掌握植物组织培养MS培养基的配制方法。 二、实验原理 培养基是植物组织培养中离体组织赖以生存和发育的条件。大多数培养基的成分是有无机盐、有机化合物（碳源、维生素、肌醇、氨基酸等）、生长调节物质、水分和其他附加物等五大类物质组成。 无机盐类由大量元素和微量元素组成。大量元素中，氮类化合物主要以硝酸类和铵类化合物的形式存在，但在培养基中多用硝酸类，也可以将硝酸类和铵类混合使用；磷和硫常用磷酸盐和硫酸盐来提供；钾是培养基中主要的阳离子；钙、钠、镁的需要量较少。微量元素包括碘、锰、铜、锌、钴、铁。培养基中的铁离子，大多数以螯合物的形式存在，即硫酸亚铁与乙二胺四乙酸二钠的混合。 有机化合物包括碳源、维生素、肌醇、氨基酸等。培养中的植物组织和细胞的光合作用较弱，因此，需要在培养基中附加一些碳水化合物物来提供营养需要。培养基中的碳水化合物通常为蔗糖。蔗糖除了作为培养基的碳源和能源外，对维持培养基的渗透压也起着重要的作用。在培养基中加入维生素有助于细胞的分裂和增长。一般包括VB1、B6、烟酸、生物素、叶酸、泛酸钙、VC。肌醇在糖类的相互转化、维生素和激素的利用等方面具有重要的催进作用。 常用的植物生长调节物质包括以下三类：①生长素类：吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、二氯苯氧乙酸（2,4-D）②细胞分裂素：玉米素（ZT）6-苄基嘌呤（6-BA）和激动素（KT）。③赤霉素：组织培养中使用的赤霉素只有一种，即赤霉酸（GA3）。 培养基中的其他附加物包括人工合成和天然的有机物附加物。其中最为常见的为酵母提取物。琼脂作为培养基的支持物，也是最常用的邮寄附加物，他可以是培养基呈固体状态，以利于组织和细胞的培养。 植物组织培养是否成功，在很大的程度上取决于培养基的选择之上。目前普遍使用的是MS培养基。MS固体培养基可用于诱导愈伤组织，或用于胚胎、茎段、茎尖及花药的培养等。MS培养基的硝酸盐、钾和铵的含量略高于其他的培养基，也是它被普遍使用的原因之一。 三、实验材料、试剂、配方和仪器设备 1．试剂 NH 4NO 3 ,KNO 3 ,KH 2 PO 4 ,CaCl 2 ·2H 2 O ,MgSO 4 ·7H 2 O,FeSO 4 ·7H 2 O Na 2-EDTA,MnSO 4 ·4H 2 O,ZnSO 4 ·7H 2 O,H 3 BO 3 ,KI,Na 2 MoO 4 ·2H 2 O CuSO 4 ·5H 2 O,CoCl 2 ·6H 2 O,肌醇，甘氨酸，盐酸硫胺素，盐酸吡哆醇，烟酸， 蒸馏水。 2.仪器设备 电子天平，烧杯（50ml、100ml、500ml）量筒（1000ml、100ml、25ml），容量瓶(1000ml、500ml、100ml)，移液管（10ml，5ml，1ml）试剂瓶，玻璃棒数支，药匙，称量纸等。
姓名班级学号实验日期 科目植物生理学实验实验名称Effects of Hormones on Morphogenesis in Plant Tissue Culture 合作者指导教师成绩 Effects of Hormones on Morphogenesis in Plant Tissue Culture Introduction The technology of plant tissue culture is based on the principle of totipotency which means the capacity to generate a whole plant from any cells or an explant.During the plant tissue culture,the hormones affect largely on morphogenesis,such as Auxin and Cytokinin.And the content and ratio of these hormones can make different results.NAA is the routine reagent of auxine and6-BA is the reagent of cytokinin.For the tissue culture,we prepare the Murashige and Skoog’s medium(MS medium).The MS medium contains hormones,macronutrients and micronutrients(detailed ingredients are in Table 2-1).The pH in the medium will be adjusted with1M NaOH.We should prepare10MS media with hormones. During the whole operation of tissue culture,six potential source of contamination are air,water, growth media,equipment,explant and people.We use the laminar flow hood to remove most of microbes from air flow.The water and the media have been autoclaved.The tools should be kept sterile in the70%alcohol and flamed by alcohol burner.And we sterilize the explants with Ca(ClO)2and70% ethanol and sterile water. We use the NAA to induce the callus to generate root. Materials Fresh young leaves of tobacco(Nicotiana tabacum) MS medium:NH4NO3,KNO3,CaCl2,MgSO4,KH2PO4,MnSO4?H2O,ZnSO4?7H2O,KI,Na2MoO4?2H2O,CuSO4?5H2O,CoCl2?6H2O,Na2EDTA,FeSO4?7H2O,Nicotinic acid,Pyridoxine HCl(VB6), Thiamine HCl(VB1).Glycine,Mesoinositol. Agar,HgCl2,NAA,6-BA.2%Ca(ClO)2,sterile distilled water,70%ethanol,Beaker,Balance,10 Bottles,pH test strips,Laminar flow hood,Tween-80,Scissor,Forceps,Scalpels,Alcohol lamp. Method Part1:Prepare10bottles of culture. 1.Wash10bottles and dry them for a group. 2.Our group’s task:Weigh50mg6-BA and mix with sterile distilled water to be50mL1mg/ml solution in a bottle and mark the stock solution name,the date,and our group number. 3.Other groups prepare the MS medium culture,agar,NAA and sugar.In Table2-1,MS=100ml A+ 1ml B+10ml C+5ml D+10ml E.Every3group prepare1L medium=MS+1mg/ml6-BA+ 0.2mg/L NAA+3%sugar+0.7%agar.Boil the solution with induction cooker to mix thoroughly. 4.Adjust the pH of medium to 5.8with1M NaOH or HCl. 5.Repackage the1L medium to the bottles of3groups.10bottles of each group,30ml for each bottle. 6.Sterilize the culture bottles by autoclaving at115℃for30min.Store them at room temperature. Part2:Operation of plant tissue culture. 1.The space in the laminar flow hood has been sterilized by UV light for15min.We place all items in well order to start working. 2.Rinse4young leaves as explants in tap water for10-30min.The next operations are all aseptic.
中国生物工程杂志!"#$%&'$()*+#%(,(-. /011 21 11 103 112 收稿日期 /01041/4/0!!修回日期 /0114054/6 国家转基因生物新品种培育科技重大专项资助项目 /00678050029016' /0057805002900: /005780500;9001 /00678050109012' 通讯作者 电子信箱 < $%-<$)<=>,$?*@+(A 植物类胡萝卜素生物合成及功能 霍!培!季!静 !王!罡!关春峰 天津大学农业与生物工程学院!天津!20003/ 摘要!详述了植物类胡萝卜素生物合成途径 并从突破类胡萝卜素合成途径中上游瓶颈限制 类胡萝卜素代谢各分支途径的改造 提高植物细胞对类胡萝卜素物质积累能力三个方面探讨了类胡萝卜素生物合成酶基因在植物基因工程中的研究现状 最后对植物类胡萝卜素代谢的研究前景进行了展望 关键词!类胡萝卜素!生物合成!基因工程 中图分类号!B 51 !!类胡萝卜素是一类天然色素的总称 普遍存在于动物 高等植物 真菌 藻类和细菌中 不同的类胡萝卜素具有不同的生物学功能 在植物中 类胡萝卜素主要存在于植物叶绿体以及许多花和果实的有色体中 其在植物光合作用中发挥两个重要功能 即参与光吸收和防止前体细胞发生光氧化 1 同时 类胡萝卜素也是植物对外界刺激响应的信号分子前体物质 因此 在植物中类胡萝卜素具有促进光形态发生 参与非光化学抑制反应 脂质过氧 化反应及吸引传粉昆虫等作用 /42 近期研究还发现 类胡萝卜素可以参与传统植物激素 如脱落酸 和新型植物激素 如独角金内酯 的生物合成 ;4: 在动物细胞中 类胡萝卜素物质也起着尤为重要的作用 但其自身不能合成类胡萝卜素 只能从日常饮食中摄取 C 类胡萝卜素物质具有抗氧化活性 可以保护人类远离一系列的慢性病 是健康饮食中必须的 重要成分 3 其中 4胡萝卜素广泛的存在于各种橘黄 色水果及深绿色和黄色蔬菜中 如花椰菜 菠菜 甘蓝 胡萝卜 南瓜 番薯和西葫芦等 是人体合成维生素D 的重要前体物质 而维生素D 在人体正常生长和组织修复过程中起着重要作用 对维持人体视觉系统和免 疫系统的正常生理功能尤为重要 5 番茄红素是一种红色素 存在于许多水果和蔬菜中 如番石榴 西瓜 葡萄柚和番茄 可以作为单线态氧的有效猝灭剂 能消除羟自由基 在细胞中和脂类结合而有效抑制脂质的氧化 是非常好的食用抗氧化剂 对降低恶性肿瘤和冠心病发病率起着重要作用 6 叶黄质和玉米黄质存在于绿色 某些黄色和橙色的水果和蔬菜中 如玉米 油桃 橘子 木瓜和南瓜等 是人体视网膜黄斑的主要构成成分 10 可以预防老年人群中由黄斑病变所引起的失明 11 正是由于类胡萝卜素与人类健康的关系密切 以及其他方面的应用价值 有关类胡萝卜素生物合成途径及其相关基因的遗传操作调控得到了广泛的研究 本文主要对类胡萝卜素生物合成途径及类胡萝卜素生物合成酶基因在植物基因工程方面应用的国内外最新研究进展进行了综述 !"类胡萝卜素生物合成途径 类胡萝卜素是含;0个碳的类异戊烯聚合物 即四萜化合物 是含有5个异戊二烯单位的四萜化合物 由两个二萜缩合而成 植物中的萜类化合物有两条合成途径 即甲羟戊酸途径 A *?&,(%&)* E F D 和/4"4甲基4G 4赤藻糖醇4;4磷酸 /4"4A *)#.,4G 4*H .)#H $)(,4;4I#(J I#&)* E K L 途径 7#&%等 1/ 综述了植物帖类化合物的生物合成途径并以图表形式清晰的给出了类胡萝卜素生物合成的前体物质异戊烯二磷酸 $J (I*%)*%.
植物组织培养实验报告 摘要：以大豆子叶为外植体，在MS培养基上附加不同浓度、不同种类的植物激素，以研究不同激素组合和不同浓度对大豆子叶愈伤诱导率的影响，并练习无菌操作。实验结果显示第2组即MS+6-BA（2.0mg/L)+NAA(1.0mg/L)和第 3 组即MS+KT（0.5mg/L)+2,4-D(1.0mg/L) 培养基中愈伤组织诱导率较高，为较佳的愈伤组织诱导组合。 关键词：大豆；植物组织培养；无菌操作；愈伤组织 1.材料与方法 1.1实验材料：大豆子叶 1.2实验试剂与仪器 （1）试剂：75%酒精、MS干粉、蔗糖、琼脂、植物生长调节剂（NAA、2，4-D、KT、6-BA）、无菌水、升汞、NaOH溶液 （2）仪器：超菌净工作台、圆纸片、培养皿、封口膜、称量纸、千分之一天平、不锈钢杯子、移液枪、试管、高压灭菌锅、注射器、酒精灯、镊子、手术刀、搁置架、烧杯、电炉。 1.3实验方法 1.3.1培养基的配制与灭菌 1.3.1.1 配制培养基的准备阶段 （1）准备80个培养试管及封口膜，2个小培养皿、1个大培养皿，用洗衣粉、自来水洗净，再用蒸馏水把每个培养试管、润洗一下。带晾干后将试管编号1-80；（2）在称量纸上用百分之一天平分别称取1.5g 琼脂4份，7.5g 蔗糖4份，在烧杯里用千分之一天平上称取1.185g MS干粉4份（烧杯不要清洗）；
（3）剪小圆纸片40，均分在两个小培养皿小能从中自由取出为宜；剪大圆纸片10，均分在两个大培养皿中。然后分别用报纸包好。 （4）把接种工具手术刀、镊子、剪刀等用报纸包好。 1.3.1.2 配制培养基 （1）在装有MS干粉的烧杯中按下表加入植物生长调节剂 实验所用的所有激素浓度均为0.5mg/mL 激素的加样量(ml) 编号培养基配置 6-BA NAA KT 2,4-D 1 MS+6-BA（1.0mg/L)+NAA(0.5mg/L) 0.5 0.25 2 MS+6-BA（2.0mg/L)+NAA(1.0mg/L) 1.0 0.5 3 MS+KT（0.5mg/L)+2,4-D(1.0mg/L) 0.25 0.5 4 MS+KT（1.0mg/L)+2,4-D(2.0mg/L) 0. 5 1.0 （2）用量筒量取250ml（稍多）蒸馏水，取一个不锈钢杯子加入150ml蒸馏水和称量好的琼脂，在电炉子加热沸腾2min，再加入混合好的MS培养基1号和蔗糖，混合沸腾2min，用剩余的蒸馏水定容至250ml； （3）当温度降到60℃左右时，将溶液pH 调至5.8，一般加4滴NaOH溶液即可；（4）取编号1-20的培养试管，用大量注射器以每瓶12.5ml 左右培养基分装在培养试管中，用封口膜封口，4支一捆捆扎好。 （5）用相同的方法配置2-4号培养基，并分装、捆扎。 1.3.1.3高压湿热灭菌 （1）将包好的接种工具，包好的培养皿，以及分装好的试管一起放到高温灭菌
类胡萝卜素的测定方法（高效液相色谱法） 本方法适用于各类食品中以羟基类胡萝卜素为主的多种类胡萝卜素的测定。 本方法最低检出量为：α-胡萝卜素为5ng/mL，β-胡萝卜素为 4.3ng/mL，γ-胡萝卜素为3.5ng/mL，番茄红素为2.7ng/mL，斑蝥黄素为1.0ng/mL。 1. 方法提要 样品以丙酮-石油醚（1+1体积比）混合溶剂反复萃取使类胡萝卜素与其他成分分离，在450nm 波长条件下进行HPLC分析检测，通过外标法计算各种类胡萝卜素的含量。 2. 仪器 （1）高效液相色谱仪。 （2）冷凝回流皂化装置。 （3）旋转蒸发仪。 （4）离心机（5000r/min）。 3. 试剂 本方法所使用试剂除特殊注明外，均为分析纯；所用水为重蒸馏水。 （1）丙酮-石油醚（1+1体积比）混合溶剂：取相同体积的丙酮、石油醚混匀。 （2）50% KOH甲醇-水溶液：称取250g氢氧化钾，用50mL适量水溶解后，用甲醇定容至500mL容量瓶，备用。 （3）无水硫酸钠（Na-2SO4）。 （4）二丁基羟基甲苯（BHT）。 （5）无水乙醇（C2H5OH）。 （6）流动相使用液：按乙腈+二氯甲烷+甲醇（85+10+5）比例准确量取各溶剂，并充分混匀，经.45μm微孔膜过滤后使用。 （7）类胡萝卜素标样：α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、番茄红素、斑蝥黄素。（8）标准溶液：准确称取α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、番茄红素、斑蝥黄素一定量，先分别用少量的乙酸乙酯溶解，再用甲醇配制成60~80ng/L的标准储备液（于-30℃冻箱保存），使用时再配成3.5~16.5mg/L的标准使用液。 4. 测定步骤 （1）样品处理： a. 皂化提取法（如牛奶等脂肪含量较高的样品）：取250L鲜牛奶于2℃、5000r/min冷冻离心30min，取上层油脂于250mL皂化瓶中，加入50mL乙醇、40mL 50% KOH甲醇溶液、0.1g BHT，65~75℃回流皂化30min，用石油醚反复提取皂化液，多次水洗至中性后用无水硫酸钠脱水，定容至25mL容量瓶中，备用。 b. 直接提取法（如番茄等脂肪含量较低的样品）：适量新鲜成熟番茄匀浆后称取5~10mg于小烧杯中，加入0.1g BHT，用丙酮-石油醚（1+1体积比）混合溶剂提取3次，合并、收集
学号姓名 学院 专业、班级 实验课程名称红豆杉愈伤组织的诱导培养 1. 实验设备及材料 （1）主要实验用具和仪器 冰箱，普通天平，分析天平，各种型号的试剂瓶（棕色和白色）、电炉，三角瓶，移液管，量筒，烧杯，容量瓶，玻璃棒，医用口杯，精密pH试纸（pH5.4~7.0），药勺，称量纸，标签纸，封口膜，橡皮筋，电炉，高压蒸汽灭菌锅、100ml三角瓶、500ml 搪瓷杯、25ml量筒、10ml和5ml吸管、解剖刀、已灭菌培养皿、酒精棉球、小块纱布、已灭菌培养皿和滤纸、枪状镊子、眼科手术剪、手术刀、酒精灯、100ml三角瓶、500或1000ml搪瓷杯、50ml量筒等。 （2）药品和试剂 硝酸铵、硝酸钾、氯化钙、硫酸镁、磷酸二氢钾、碘化钾、硫酸锰、硫酸锌、钼酸钠、硫酸铜、氯化钴、乙二胺四乙酸二钠、硫酸亚铁、甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆素、烟酸、肌醇、2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)、NAA（α-萘乙酸）、6-BA （6-苄基腺嘌呤）、浓盐酸、氢氧化钠、95%酒精、蒸馏水等。MS培养基母液、琼脂、蔗糖、生长调节物质、蒸馏水、1mol·L-1HCl、1mol·L-1NaOH、愈伤组织继代培养基、75％酒精。（3）实验材料 红豆杉种子 处于脱分化进程中的外植体 2．实验方法步骤及注意事项 I、MS培养基母液和常用试剂的配制 （1）培养基的成分 目前，不论液体培养还是固体培养，大多数植物组织培养中所用的培养基都是由无机营养物、碳源、维生素、生长调节物质和有机附加物等几大类物质组成。 （2）培养基的配制方法 配制培养基的最简单的方法是用市售培养基干粉溶解在蒸馏水里，加上蔗糖、琼脂和其他必要的补加物，再加入蒸馏水使之达到最终的容积。最后调节pH值，高压灭菌，于是制成所需要的培养基。 如果没有培养基干粉，则可采用以下两种方法来配制： 一个是按照配方规定的数量分别称量出各种成分，分别使它们溶解于水，然后再将它们混合在一起。 另一个是先配制一系列的浓缩贮备液(母液)，贮存在2～4℃冰箱内，待配培养基时取出，按比例稀释配用。此法较为常用。 （3）MS培养基母液的配制 母液的配制有两种方法：
类胡萝卜素的作用与功效 【类胡萝卜素】 不溶于水而溶于有机溶剂。叶绿体中的类胡萝卜素含有两种色素，即胡萝卜素和叶黄素，前者呈橙黄色，后者呈黄色。功能为吸收和传递光能，保护叶绿素。 辅助色素：在植物和光合细菌，像类胡萝卜素叶黄素和藻胆素中，吸收可见光的色素，这类色素是对叶绿素捕获光能的补充。 非皂化脂质。是广泛地分布于动植物中的黄、橙、红或紫色的一组色素。构成发色原因的共轭二重键具有长链聚烯烃结构。通常是几种混在一起生成。具有C40的萜结构的较多，不含氮。已知天然类胡萝卜素约有300种，其中不含氧的碳化氢类有胡萝卜素、菌脂素等；含氧的非常多，有醇、酮、醚、醛、环氧化物、羰酸和酯等。它们之中大量存在的有岩藻黄质、叶黄素（、堇菜黄质、新黄质等，均属于胡萝卜醇。类胡萝卜素多数不溶于水，溶于脂溶剂，不稳定，易氧化。其生物合成过程如下： 乙酰，异甲基焦磷酸→牻牛儿基焦磷酸，无色类胡萝卜素等。 β-胡萝卜素、α-胡萝卜素等在动物体内变为视黄醇（维生素A）和视黄醛（维生素A醛），与视觉有关。在光合作用时，类胡萝卜素所吸收的光能传递给叶绿素，用于推动光化学过程。对细菌，则与其向光性有关．类胡萝卜素是O2的一种重要的激活状态的有效灭活剂，可防止生物的光灭活和光破坏。细菌的类胡萝卜素，有菌酯色素、β-
胡萝卜素、γ-胡萝卜素和玉米黄素等，此外特别值得重视的是从具有光合成的红色硫黄细菌和红色无硫黄细菌中所取得的螺菌黄素、球形（红极毛杆菌）酮，以及绿色硫黄细菌中含有的绿菌烯等。 类胡萝卜素是高度不饱和化合物（多烯），含有一系列共轭双键和甲基支链。色素的颜色随着共轭双键的数目而变动。共轭双键的数目越多，颜色移向红色越远。 有些类胡萝卜素在工业上利用作为食物和脂肪的着色剂，如β－胡萝卜素、番茄红素、玉米黄质、叶黄素、辣椒红、藏花素、藏花酸、胭脂树橙、红酵母红素等。 类胡萝卜素的生物合成也是按照类萜的合成模式，两个单位“头对头”缩合成为衍生物即类胡萝卜素──八氢番茄红素。高等植物、藻类和真菌都能将八氢番茄红素逐步脱氢，按次序生成六氢番茄红素,δ-胡萝卜素，链孢红素，最后产生番茄红素。类胡萝卜素分子两端的环化过程尚未完全阐明，但已有证据说明链孢红素或番茄红素是环化类胡萝卜素的前体。含氧的类胡萝卜素──叶黄素是通过直接引入分子氧而合成的。 维生素 A是无色的脂溶性类异戊二烯醇。在动物体内,β-胡萝卜素加两分子的水，断裂成为两分子的视黄醇(即维生素A,A存在于动物肝脏，血液和眼球的视网膜中;A只发现于淡水鱼中)。在暗中全反式视黄醛转变成为11顺视黄醛才能与视蛋白结合形成视紫红质，后者与暗视觉有关，故缺维生素A导致夜盲症。 希望对你能有所帮助，祝你天天快乐！
验名称 胡萝卜的愈伤组织诱导培养 实验时间 4月至6月 小组合作： 是○√ 否○ 一、实验预习 1、实验目的： 1.1通过本次实验，能够熟练准确配制培养基，并能根据实验目的设计适合的培养基配方。 1.2熟练掌握外植体的表面消毒技术和无菌操作技术，同时能设计和配制胡萝卜伤组织增殖培养基。 1.3熟练掌握愈伤组织继代培养的基本操作技术，进一步熟悉、规范无菌操作技术；设计和配制胡萝卜细胞悬浮培养的培养基。 2、实验准备： 2.1 MS 母液培养基的配置 主要实验用具和仪器： 电子天平、烧杯、容量瓶、细口瓶、药勺、玻璃棒、电炉。 药品： NH 4NO 3、KNO 3、CaCl 2·2H 2O 、 MgSO 4·7H 2O 、KH 2PO 4、KI 、H 3BO 3、MnSO 4·4H 2O 、 ZnSO 4·7H 2O 、Na 2MoO 4·2H 2O 、 CuSO 4·5H 2O 、CoCl 2·6H 2O 、FeSO 4·7H 2O 、 Na 2-EDTA ·2H 2O 、肌醇、烟酸、盐酸吡哆醇(维生素B6)、盐酸硫胺素 (维生素B1)、甘氨酸。 2.2胡萝卜愈伤组织诱导培养培养基的配置 主要实验用具和仪器： 冰箱、普通天平、三角瓶、移液管、量筒、烧杯、容量瓶、玻璃棒、医用口杯、精密pH 试纸（pH5.4~7.0）、药勺、称量纸、标签纸、封口膜、橡皮筋、电炉、高压蒸汽灭菌锅等。 药品和试剂： MS 培养基母液、琼脂、蔗糖、生长调节物质、蒸馏水、1mol ·L-1HCl 、1mol ·L-1NaOH 2.3胡萝卜愈伤组织诱导 主要实验用具和仪器： 100ml 三角瓶、500ml 搪瓷杯、25ml 量筒、10ml 和5ml 吸管、pH 试纸（5.4~7.0）、封口膜、扎口用棉线、药勺、称量纸、酒精棉球、小块纱布、已灭菌滤纸、枪状镊子、手术剪、解剖刀、已灭菌培养皿、酒精灯等。
植物组织培养实验报告 一实验目的 让植物组织经过脱分化作用，形成愈伤组织，经过再分化作用，愈伤组织又能重新分化为有结构的组织和器官，最终形成完整的植株。 二实验原理 植物组织培养是把植物的器官，组织以至单个细胞，应用无菌操作使其在人工条件下，能够继续生长，甚至分化发育成一完整植株的过程。植物的组织在培养条件下，原来已经分化停止生长的细胞，又能重新分裂，形成没有组织结构的细胞团，即愈伤组织。这一过程称为“脱分化作用”，已经“脱分化”的愈伤组织，在一定条件下，又能重新分化形成输导系统以及根和芽等组织和器官，这一过程称“再分化作用”。植物激素在此过程中起着重要的作用，吲哚乙酸（IAA ）和 6 –苄基氨基腺嘌呤（6 – BA ）的比例，决定了根和芽的分化。 三实验器材 （一）试剂 乙醇、IAA 或 2 ，4 – D 、HgCl 2 （或次氯酸钠）、6- 苄基氨基腺嘌呤（6-BA ） MS 培养基 （二）仪器设备 培养室，高压灭菌锅，水浴锅，解剖刀，三角烧瓶（100mL ），烧杯，量筒，培养皿，超净工作台，分析天平，长镊子，剪刀，橡皮筋等 三实验步骤 1. 配制培养基 （1 ）愈伤组织诱导培养基：MS 培养基（蔗糖含量为10 g/L ，2,4 – D 含量为 2 mg/L ，琼脂10 g/L ）。 （2 ）试验培养基：在MS 培养基中按表33 – 1 加入IAA 和6–BA 。 吲哚乙酸先用少量0.1 mol/L NaOH 溶解，6- 苄基氨基腺嘌呤先用少量0.1 mol/L HCl 溶解，然后用蒸馏水稀释，再加入培养基中。 2. 培养基灭菌 将配好的培养基加入琼脂加热溶解，调至pH 5.8 ，趁热分装于100 mL 三角烧瓶中，每瓶约20 mL 。待培养基冷却凝固后，用两层称量纸包扎瓶口，并用橡皮筋扎牢，然后在高压灭菌锅中121 ℃（ 1 kg/cm 2 ）下灭菌20 min 。取出三角烧瓶放在台子上，
胡萝卜组织培养教学设计 小组成员：何家会、宋亚伟、冯海艳、尹化、黄洁、牛伟坤 一、教学目标 1、知识目标： 说明植物组织培养的基本原理，学习植物组织培养的基本技术，进行胡萝卜的组织培养。 2、能力目标： 掌握培养基制备、外植体消毒、接种、培养、移栽以及栽培等基本操作技术。 3、情感目标： 关注植物组织培养技术在实践生活中的运用，养成严谨的科学素养。 二、实验目的 1、掌握植物组织培养过程中的愈伤组织诱导和生根培养技术。 2、掌握植物组织培养过程中使用的无菌技术。 三、实验原理 植物组织培养： 指通过无菌操作分离植物体的一部分（外植体explant），接种到培养基上，在人工控制的条件下（包括营养、激素、温度、光照、湿度）进行培养，使其产生完整植株的过程。 植物细胞全能性：任何具有完整细胞核的植物细胞，都拥有形成一个完整植株所必须的全部遗传信息和发育成完整植株的能力。 ?外植体：从植物体上分离下来的用于离体培养的那部分材料。 ?愈伤组织：原指植物在受伤之后于伤口表面形成的一团薄壁细胞，在组培中则指在离体培养过程中形成的具有分生能力的一团不规则薄壁 细胞，多在植物体切面上产生。 ?脱分化：已分化好的组织细胞在人工诱导条件下，恢复分生能力，回复到分生组织状态的过程。或者说是由高度分化的植物组织或器官产生 愈伤组织的过程。
?再分化：脱分化后具有分生能力的细胞再经过与原来相同的分化过程，重新形成各类组织和器官的过程。或者说是由愈伤组织再生出小植株的过程。 ?植物体的任何一个细胞都具有全能性。分化了的植物根、茎、叶等组织器官在一定的条件下进行离体培养，给于一定的营养和激素，可以脱分化为愈伤组织。愈伤组织在不同的营养和激素的作用下，又可以再生出完整的小植株。植物的脱分化和再分化培养，证明分化了的植物细胞仍具有形成完整植株所需要的全套基因。 四、实验材料与方法 实验材料 ?胡萝卜（新鲜幼嫩） ?MS培养基+2mg/L 2,4-D+0.5mg/L 6-BA ?70%酒精2.5%NaCLO无菌水超净工作台、光照培养架、高压蒸汽灭菌锅、恒温振荡器、打孔器、小刀、培养皿、解剖刀、镊子、植物组培试剂盒。 实验方法 ?培养基的配制。 ?小麦籽粒用无菌水浸泡10小时。 ?取材、消毒和接种。 五、实验过程 胡萝卜愈伤组织的诱导 1、外植体消毒 用清水洗干净胡萝卜直根，用小刀给其削去表皮，并切成小段放入烧杯中。先用70%酒精对胡萝卜直根消毒5min，用无菌吸水纸吸干，再用10%的次氯酸钠溶液消毒10min（或用0.1%的升汞消毒10min,接着用无菌水漂洗一遍，再用无菌水浸泡30min），放入无菌水中漂洗2~3次，用无菌吸水纸吸干待用。 2、外植体接种 把消毒好的胡萝卜直根放入无菌培养皿中，用消毒好的小刀沿截面将其横切成厚度1mm左右的小圆片，然后将小圆片的韧皮部和木质部切去，留下形成层，
L/O/G/O
维生素A与类胡萝卜素 维生素 与类胡萝卜素
主要内容
1 维生素A及其衍生物 维生素 及其衍生物
2 3
类胡萝卜素及其功能 视黄醇及类胡萝卜素与抗氧化
维生素A与类胡萝卜素
2
1
维生素A及其衍生物 维生素 及其衍生物
A. 维生素 （retinol）及其衍生物的种类 维生素A（ ）及其衍生物的种类
a. 种类
a) 全反视黄醇是最基本形式 b) 多以棕榈酸酯形式存在 c) 视黄酸是维生素 的代谢产物，具有很高的活性和 视黄酸是维生素A的代谢产物， 的代谢产物 功能 d) 自然界中最重要的异构体是 顺-视黄醛 自然界中最重要的异构体是11-顺 视黄醛
维生素A与类胡萝卜素
3
维生素A与类胡萝卜素
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b. 性质
a) 在氧的作用下视黄醇及其同系物极不稳定 b) 无氧时
– 视黄醛对碱比较稳定 – 酸性条件下，脱氢或重组双键 酸性条件下，
c) 强光下发生键异构化，形成聚合体 强光下发生键异构化，
维生素A与类胡萝卜素
5
1
维生素A及其衍生物 维生素 及其衍生物
B. 维生素 的代谢 维生素A的代谢
a. 维生素 （原）的吸收 维生素A（
a) 维生素 维生素A
– 在小肠内与其他脂类一起经胆汁和胰脂酶作用水解为视 黄醇和脂肪酸 – 视黄醇在小肠以主动吸收方式吸收，生理剂量下吸收率 视黄醇在小肠以主动吸收方式吸收， 为70%-90% – 视黄醇在小肠粘膜细胞内重新酯化后，与视黄醇结合蛋 视黄醇在小肠粘膜细胞内重新酯化后， 白（RBP）结合 ）
维生素A与类胡萝卜素
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