1目的：使冻干菌种活化。
2适用范围：细菌、酵母菌、霉菌保藏。
3方法：
3.1把冻干菌种管、双碟、镊子、营养肉汤培养基、营养琼脂斜面数支，移入接种室或净化工作台
3.2复溶液应室温平衡后吸取0.5-1ml，滴入疫苗瓶内，轻轻振荡，使冻干菌体溶解呈悬浮状。
3.3吸出菌液分别接种至营养琼脂斜面及普通肉汤内，并将吸管及菌种管投入消毒液内，将已接种
的营养肉汤及营养琼脂斜面置35~37℃培养24 h。
3.4取出培养物，仔细观察菌苔，转种3 代即可应用。
标准菌种管理规程 目的：规范药品微生物学检定用菌的管理，最大限度降低变异率，确 保菌种的溯源性与稳定性，从而确保微生物学检验结果的准确可靠。 职责： QC 主管负责菌种的申购、接受、保存、分发，微生物检验员 负责菌种的确认、传代、使用及销毁。 范围：本规程适用于检定用菌种的管理，包括菌种的申购、保存、传 代、使用及销毁等。 内容： 1术语 标准菌种是指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理 中心提供的冷冻干燥菌。 传代用菌种是指用标准菌种制备的采用特定保存方法长期固定保存 的菌种，用于传代及制备工作用菌种。 工作用菌种是指用标准菌种或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养 后，作为日常工作使用的菌种。 菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内，每萌发一次即 称为一代，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0 代。 2.标准： 2.1 检定菌的申购 QC主管每年根据检定菌种的使用情况（包括临时检验需要），提出购 买计划，交由质量管理部部长审批后，向中检所菌种保藏中心或省（市）药检所购买冻干菌种（标准菌种）；也可以直接向省（市）药检所购
买传代用菌种，购买时，需询问与确定菌种的代数，以便传代时控制 代数。 2.2 检定菌的接收 菌种到达实验室后，由QC主管接收菌种，检查其名称和数量，以及 每一支的完整性，同时将菌种的所有信息，填写在《检定菌接收记录》（附表 1）上，内容包括：名称、数量、编号（无编号者按检定菌种 的编号原则编号）、代数、来源、接收日期、接收人等，贴好标签并 储存于 2-8?C直到需要使用时。储存期最长不超过 5 年。 2.3 检定菌的保存 2.3.1 工作用菌种的保存 工作用菌种采用斜面低温保存法。将菌种接种在适宜的固体斜面培养 基上，待菌生长充分以后，转移至2～8℃冰箱中保存。此法仅用于 工作用菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况，经应灭活处理后销毁。保存时间根据菌种种类而不同， 细菌： 1 个月；酵母菌： 2 个月；霉菌及芽胞： 3 个月。 2.3.2 传代用菌种的保存 采用甘油冷冻管保藏法或液体石蜡保存法。 2.3.2.1．甘油冷冻管保存法 用无菌接种环轻轻刮取经冷冻复溶增菌后并接种至平板或琼脂斜面 的菌苔，并通过接种环与试管壁之间的轻轻摩擦而使细菌充分扩散到 预先装入试管中的无菌纯化水中，调整菌液浓度，使其等同于10 号比浊管，向已制备好的菌悬液中加入等体积的无菌甘油（浓度 20%），
菌种的复苏传代及保存标准程序 目的：建立菌种的复苏、传代及保存标准程序。 范围：适用于检定用菌种的复苏、传代及保存的操作。 职责：质管部生物测定人员对本规程的实施负责。 内容： 菌种的复苏与传代操作均应在生物检定室阳性对照间或专用超净工作台内进行。操作中使用过的滴管、吸管及菌种管等均需放入消毒液中浸泡，试验结束后经121℃30分钟高温灭菌处理。 1.菌种的复苏 1.1冻干菌种的复苏 检定用标准菌种，由中国药品生物制品检定所提供，为冷冻干燥菌种(0代)。使用前需将其复苏。 1.1.1准备： ①用具：灭菌1ml滴管、灭菌双碟、灭菌镊子、砂轮、酒精灯、接种环。 ②培养基：根据菌种的性质选择合适的液体培养基（营养肉汤培养基或改良马丁培养基）、营养琼脂（或改良马丁琼脂）斜面数支。 ③消毒液：75%酒精、碘酒、0.1%新洁尔灭或84消毒液等。 1.1.2操作： 1.1. 2.1将准备妥的冷冻菌种管、灭菌滴管、灭菌双碟及镊子、培养基移入工作台。 1.1. 2.2用砂轮将冻干菌种管颈部挫出刻痕，再75%酒精棉擦净菌种管外壁，放在灭菌双碟内待干。 1.1. 2.3点燃酒精灯，将菌种安瓿的封口一端在火焰上灼烧红热，用灭菌滴管吸取液体培养基少许，滴在灼热的菌种安瓿封口一端，使其骤冷而炸裂。 1.1. 2.4取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开后，把菌种安瓿放入灭菌双碟内。 1.1. 2.5另取一支灭菌滴管，在火焰旁吸取适用液体培养基少许，加至菌种管底部，将
冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，接种至液体培养基内。用接种环取菌液划线接种于琼脂斜面培养基上。 1.1. 2.6将已接种的液体培养基及琼脂斜面培养基置规定温度下（一般细菌在30~35℃，真菌在23~28℃）培养24h。 1.1. 2.7 取出培养物（第1代），仔细观察菌苔形态、有无杂菌，必要时涂片、革兰氏染色镜检，若呈典型菌落即可应用。如发现菌型不典型，可进行平板分离单菌落。 1.2 为保证工作用菌株的传代次数不超过5代，并减少购买冻干菌种的次数，可在对冻干菌种复苏的同时制备部分菌悬液（第1代）冷冻保存，并将此冻存菌液复苏后的第2代培养物冻存保藏。 1.2.1准备：①冻存保护液（40%无菌甘油）及灭菌冻存管。 ②细菌冻存液：由液体培养基与冻存保护液按1：1比例混匀制成。 1.2.2按1.1.2.1~1.1.2.4操作，将冻干菌复溶后，吸取菌悬液加入到细菌冻存液中，混匀。 1.2.3按1ml/管的量分装至灭菌冻存管中，密闭。标明菌名、编号及冻存日期等。置-20℃或-80℃条件下冷冻保存。 1.2.4制备第2代冻存菌悬液时，可用接种环直接刮取第1代冻存菌悬液复苏后转种至琼脂斜面或平板培养基上生长的纯菌落，再接种至细菌冻存液中，混匀后按1.2.3冻存。 1.3冻存菌悬液的复苏： 1.3.1准备： ①用具：灭菌1ml滴管、酒精灯、接种环。 ②培养基：根据菌种的特性选择适宜的液体培养基（如营养肉汤培养基10ml、硫乙醇酸盐流体培养基12ml或改良马丁培养基10ml等）、琼脂斜面或平板培养基。 ③消毒液：75%酒精、0.1%新洁尔灭或84消毒液等。 1.3.2操作： 1.3. 2.1从低温冰柜中取出菌种冻存管，室温下放置使其自然解冻。
菌种传代与复苏 WEIHUA system office room 【WEIHUA 16H-WEIHUA WEIHUA8Q8-
菌种是从事微生物学及生命科学研究的基本材料，在医学领域中，诊断制品的制备，菌苗的生产、微生物致病性研究，药物的抑菌试验及药品微生物检验等都有一套完整的菌种、微生物具有生命活力，在传代过程中易发生变异甚至死亡，因此菌种传代与保藏是一项重要的基础工作。 菌种代号 国内药品微生物检验所用的菌种代号是CMCC(F)或CMCC(B)，CMCC--中国医学菌种保藏中心，、，B——代表细菌，F——代表真菌。 金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003大肠杆菌CMCC(B)44102 枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501 白色念珠菌CMCC(F)98001 黑曲霉CMCC(F)98003 传代和接种 菌种冻干粉复苏 把冻干菌种管、灭菌1ml滴管、双碟、镊子、营养肉汤培养基、营养琼脂斜面数支，移入接种室或净化台。 先用砂轮将冻干菌种安瓿瓶颈部挫出挫痕，再将冻干菌种管外壁用75%酒精擦洗消毒，稍干，用75%乙醇棉擦净，放在灭菌双碟内，待干。点燃酒精灯，将菌种管的封口一端在火焰上烧灼红热，用灭菌滴管吸取营养肉汤培养基，滴在灼热的菌种管封口一端，是骤冷而炸裂。 取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，放入灭菌双碟内，领取一只灭菌滴管，在火焰旁吸取营养肉汤少许，加至菌种管底部，将冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，分别接种至营养琼脂斜面及普通肉汤内，并将滴管及菌种管投入消毒液内，将已接种的营养肉汤及营养琼脂斜面进行培养。 菌种斜面传代操作
培养基应新鲜制备，如斜面已无冷凝水者，不宜再使用。标签上注明菌种名及菌种编号。至冰箱取出的菌种斜面，应在室温放置约30分钟，待温度平衡后再移入接种室或超净工作台。 点燃酒精灯，用左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰旁，右手拿接种棒后端，将接种环烧红30秒，随后将全部接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过3次。左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手无名指，小指及掌部夹住棉塞，拨开棉塞，将接种环深入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷却再移至菌苔上，刮去少量菌苔，随即取出接种环，并将菌种管口移至火焰旁。 堵上棉塞，左手将菌种管放下，取营养琼脂斜面一支，照上述操作打开棉塞，将接种环深入管内至琼脂斜面的底部，由底向上，将接种环轻贴斜面的表面曲折移动，使细菌划在斜面的表面上。 取出接种棒，在火焰旁将培养基管棉塞堵上，然后将接种过细菌的接种棒在火焰上烧灼灭菌。菌种的培养与保存 大肠杆菌35-37摄氏度培养48小时金黄色葡萄球菌30-35摄氏度培养48小时枯草芽孢杆菌30-35摄氏度培养48小时白色念珠菌23-28摄氏度培养7天黑曲霉23-28摄氏度培养7天 将培养物管自培养箱取出后放入冰箱（2-8摄氏度）保存，一般2个月转种一次。菌悬液的制备 取上述培养好的菌种斜面移入接种室或净化工作台，放置室温后，用接种环取菌苔少许接种至营养肉汤中（10ml/支，已灭菌），将已接种毕的细菌管置35-37摄氏度培养18-24小时，取出备用。一般于冰箱中保存可用两周。
4.1 菌种是从事微生物学及生命科学研究的基本材料，在医学领域中，诊断制品的制备，菌苗的生产、微生物致病性研究，药物的抑菌试验及药品微生物检验等都有一套完整的菌种、微生物具有生命活力，在传代过程中易发生变异甚至死亡，因此菌种传代与保藏是一项重要的基础工作。 4.2 菌种代号 国内药品微生物检验所用的菌种代号是CMCC(F)或CMCC(B)，CMCC--中国医学菌种保藏中心，、，B——代表细菌，F——代表真菌。 金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003大肠杆菌CMCC(B)44102 枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501 白色念珠菌CMCC(F)98001 黑曲霉CMCC(F)98003 4.3 传代和接种 4.3.1 菌种冻干粉复苏 4.3.1.1把冻干菌种管、灭菌1ml滴管、双碟、镊子、营养肉汤培养基、营养琼脂斜面数支，移入接种室或净化台。 4.3.1.2 先用砂轮将冻干菌种安瓿瓶颈部挫出挫痕，再将冻干菌种管外壁用75%酒精擦洗消毒，稍干，用75%乙醇棉擦净，放在灭菌双碟内，待干。点燃酒精灯，将菌种管的封口一端在火焰上烧灼红热，用灭菌滴管吸取营养肉汤培养基，滴在灼热的菌种管封口一端，是骤冷而炸裂。 4.3.1.3取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，放入灭菌双碟内，领取一只灭菌滴管，在火焰旁吸取营养肉汤少许，加至菌种管底部，将冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，分别接种至营养琼脂斜面及普通肉汤内，并将滴管及菌种管投入消毒液内，将已接种的营养肉汤及营养琼脂斜面进行培养。 4.3.2菌种斜面传代操作 4.3.2.1 培养基应新鲜制备，如斜面已无冷凝水者，不宜再使用。标签上注明菌种名及菌种编号。至冰箱取出的菌种斜面，应在室温放置约30分钟，待温度平衡后再移入接种室或超净工作台。 4.3.2.2点燃酒精灯，用左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰旁，右手拿接种棒后端，将接种环烧红30秒，随后将全部接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过3次。左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手无名指，小指及掌部夹住棉塞，拨开棉塞，将接种环深入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷却再移至菌苔上，刮去少量菌苔，随即取出接种环，并将菌种管口移至火焰旁。
借用一下 标准菌验收、制备、保藏、传代、使用、销毁的管理 介绍了微生物实验中使用的标准菌的验收、制备、保藏、传代、使用、销毁的管理规程规定了质量管理部门实验用标准菌种的验收、制备、储管、使用、以及销毁等的相关规定。适用于微生物限度检查、无菌检查、抗生素微生物（效价）测定、评价防腐剂和抗菌剂的抑菌效果和确认灭菌效果、检验方法的验证、培养基的适用性检查，样品检验时的阳性对照等。依据: 中国药典2010年版二部及菌种使用说明书 1.标准菌的来源 标准菌株由中国药品生物制品检定所医学菌种保藏中心（China Medical culture collection ,CMCC）提供的冷冻干燥菌种（0代）或由上级药检部门已接种好的菌种斜面（3代）。黑曲霉的0代菌种为保存于含15%甘油的0.9%无菌氯化钠溶液中的孢子悬液冷存管。中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌种的标签CMCC （B）代表细菌（bacteria）,CMCC(F)代表真菌（fungi）每种菌具有固定的代号。 2.标准菌的验收 从菌种保藏中心购买的原始菌种管是玻璃安瓿装的冻干菌，接收同时应检查是否有随菌种附有的相关资料。接收菌种时应检查安瓿的数量和名称，和每一支安瓿的完整性。在相应的菌种接收记录上记上所有的关于菌种的信息，如名称、数量和接收日期等。在菌种安瓿及菌种管上粘贴标签，内容包括：菌种名称、菌种代号、代次、接收日期、接收人、贮存条件、有效期至。新购入的0代原始菌种储存于－20℃，有效期为三年。从上级药检部门购买的已接种好的菌种斜面（3代）应检查菌种管是否完好。储存于2～8 ℃，有效期为3个月。 3. 标准菌的复苏、复壮及标准储备菌株的制备 3.1物品及试剂：接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%酒精棉球 3.2培养基 改良马丁琼脂培养基:用于黑曲霉复苏、复壮. 液体硫乙醇酸盐培养基:用于生孢梭菌复苏、复壮. 营养肉汤培养基:用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮。 改良马丁培养基:用于白色念珠菌复苏、复壮. 3.3操作步骤： a.打开洁净工作台。 b.在安瓿的外表面用75%的酒精擦拭并让其自然风干。 c.用一小砂轮在安瓿的上部划一条线，用手轻轻将安瓿掰开（开启安瓿时必须小心，因为安瓿遇热时可能会破裂）。 d.以无菌方法用一无菌吸管从已准备好的上述液体培养基中移取0.5～0.8 ml到安瓿中。 e.轻轻地旋转安瓿以使冻干菌种和液体培养基充分混合并完全溶解。 f.用无菌吸管将安瓿内菌液全部转接到相应的液体培养基。 g.根据安瓿上所标明的不同菌种类型而将其培养于相应的温度（细菌培养温度30～35℃，培
菌种管理规程 目的 规范药品微生物学检定用菌种的管理，最大限度降低变异率，确保菌种 的溯源性与稳定性，从而确保微生物学检验结果的准确可靠。 范围 本规程适用于检定用菌种的管理，包括菌种的申购、验收、保存、传代、使用及销毁等。 责任 ●质量控制处主管：负责菌种的申购。 ●微生物检验人员：负责菌种的验收、保存、传代、使用及销毁等。 ●质量控制处经理：负责菌种申购计划的审核及日常督促检查。 ●质量管理负责人：菌种申购计划的审核。 ●制造中心总监：菌种申购计划的批准。 相关术语 ●标准菌种是指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理 中心提供的冷冻干燥菌。 ●传代用菌种是指用标准菌种制备的采用特定保存方法长期固定保存 的菌种，用于传代及制备工作用菌种。 ●工作用菌种是指用标准菌种或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养 后，作为日常工作使用的菌种。 ●菌种的代是指将其接种至新鲜培养基上或培养基内，每萌发一次即称 为一代，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代。 相关文件 无 程序 1菌种的申购 质量控制处主管根据菌种的使用情况（包括临时检验需要），提出申购计划，由质量控制处经理、质量管理部负责人审核，制造中心总监批准后，向中国药品生物制品检定所菌种保藏中心或省（市）药检所购买冻干菌种（标准菌种）；也可
以直接向省（市）药检所购买传代用菌种。购买时，需询问和确定菌种的代数，以便传代时控制代数。同时在运输过程中注意严格按照保存条件要求进行。 2菌种的验收 菌种到达实验室后，由质量控制处微生物检验人员验收，检查其名称和数量，以及每一支的完整性，同时将菌种的所有信息，填写在《菌种接收记录》上，内容包括：名称、数量、编号、代数、来源、接收日期、接收人等，新购入的0代原始菌种储存于－20℃，有效期为三年。从上级药检部门购买的已接种好的菌种斜面（3代）应检查菌种管是否完好。储存于2～8 ℃，有效期为3个月。新购进的菌种斜面应在一周内完成传代。 3 菌种的传代：菌种的传代因冻干菌（标准菌种）与传代用菌种而不完全相同。 3.1标准菌种的复苏、确认、传代 3.1.1 标准菌种的复苏步骤如下： 把冻干菌种管、灭菌毛细滴管（1ml）、双碟、镊子、营养肉汤培养基（或其它适宜培养基）数支，移入接种室或超净工作台。 将冻干菌种管外壁用碘酒擦洗消毒，稍干，用75%乙醇棉擦净，放在灭菌双碟内，待干。点燃酒精灯，将标准菌种管的封口一端在火焰上， 烧灼红热，用灭菌毛细滴管吸取营养肉汤培养基（或其它适宜的培养 基），滴在灼热的菌种管封口一端，使骤冷而炸裂。 取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，放入灭菌双碟内，另取1支灭菌毛细滴管，在火焰旁吸取营养肉汤培养基（或其它适宜的培 养基）少许，加至菌种管底部，将冻干菌块搅动促使溶解，随即吸出 管内菌液，接种至营养肉汤培养基（或其它适宜的培养基）内，并根 据不同菌种类型而将其培养于相宜的温度下24～72h（细菌需要 24～ 48h的培养物，酵母菌需要72h的培养物，形成孢子的微生物则宜保 藏孢子）。最后将毛细滴管及菌种管经高温灭菌（121℃，30分钟）。 黑曲霉的菌悬液先室温待菌悬液融化后用无菌吸管吸取管内液体1～2 滴滴在改良马丁琼脂斜面上，用吸管涂布均匀，置23～28℃培养5～7
菌种传代与复苏
菌种传代与复苏 （实操） 一、菌种传代与复苏 1.1 菌种是从事微生物学及生命科学研究的基本材料，在医学领域中，诊断制品的制备，菌苗的生产、微生物致病性研究，药物的抑菌试验及药品微生物检验等都有一套完整的菌种、微生物具有生命活力，在传代过程中易发生变异甚至死亡，因此菌种传代与保藏是一项重要的基础工作。 1.2 菌种代号 国内药品微生物检验所用的菌种代号是CMCC(F)或CMCC(B)，CMCC--中国医学菌种保藏中心， B——代表细菌，F——代表真菌。 金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003大肠杆菌CMCC(B)44102 枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501 白色念珠菌CMCC(F)98001 黑曲霉CMCC(F)98003 1.3 传代和接种 1.3.1 菌种冻干粉复苏 1.3.1.1把冻干菌种管、灭菌1ml滴管、双碟、镊子、营养肉汤培养基、营养琼脂斜面数支，移入接种室或净化台。 1.3.1.2 先用砂轮将冻干菌种安瓿瓶颈部挫出挫痕，再将冻干菌种管外壁用75%酒精擦洗消毒，稍干，用75%乙醇棉擦净，放在灭菌双碟内，待干。点燃酒精灯，将菌种管的封口一端在火焰上烧灼红热，用灭菌滴管吸取营养肉汤培养基，滴在灼热的菌种管封口一端，是骤冷而炸裂。 1.3.1.3取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，放入灭菌双碟内，领取一只灭菌滴管，在火焰旁吸取营养肉汤少许，加至菌种管底部，将冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，分别接种至营养琼脂斜面及普通肉汤内，并将滴管及菌种管投入消毒液内，将已接种的营养肉汤及营养琼脂斜面进行培养。 1.3.2菌种斜面传代操作 1.3. 2.1 培养基应新鲜制备，如斜面已无冷凝水者，不宜再使用。标签上注明菌种名及菌种编号。至冰箱取出的菌种斜面，应在室温放置约30分钟，待温度平衡后再移入接种室或超净工作台。
16S rDNA方法鉴定细菌种属 一．目的 1. 掌握16S rDNA对细菌进行分类的原理及方法； 2. 掌握DNA提取、PCR原理及方法、DNA片段回收等实验操作。 二、原理 随着分子生物学的迅速发展，细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平，如(G+C)mol%、DNA杂交、rDNA指纹图、质粒图谱和16S rDNA序列分析等。 细菌中包括有三种核糖体RNA，分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA，rRNA基因由保守区和可变区组成。16S rRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16S rDNA。5S rRNA 虽易分析，但核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA含有的核苷酸数几乎是16S rRNA的两倍，分析较困难。而16S rRNA相对分子量适中，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16S rRNA作为序列分析对象对微生物进行测序分析。 在细菌的16SrDNA中有多个区段保守性，根据这些保守区可以设计出细菌通用物，可以扩增出所有细菌的16SrDNA片段，并且这些引物仅对细菌是特异性的，也就是说这些引物不会与非细菌的DNA互补，而细菌的16SrDNA可变区的差异可以用来区分不同的菌。因此，16SrDNA可以作为细菌群落结构分析最常用的系统进化标记分子。随着核酸测序技术的发展，越来越多的微生物的16SrDNA序列被测定并收入国际基因数据库中，这样用16SrDNA 作目的序列进行微生物群落结构分析更为快捷方便。 1、16S rRNA普遍存在于原核生物中。rRNA参与生物蛋白质的合成过程，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物进化的漫长历程中保持不变，可看作为生物演变的时间钟。 2、在16S rRNA分子中，既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究。 3、16S rRNA的相对分子量大小适中，约1 540 个核苷酸，便于序列分析。 4、可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16S rDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。 16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。是一种快速获得细菌种属信息的方法。 利用16S rDNA鉴定细菌的技术路线：
菌种传代与复苏 （实操） 一、菌种传代与复苏 1.1 菌种是从事微生物学及生命科学研究的基本材料，在医学领域中，诊断制品的制备，菌苗的生产、微生物致病性研究，药物的抑菌试验及药品微生物检验等都有一套完整的菌种、微生物具有生命活力，在传代过程中易发生变异甚至死亡，因此菌种传代与保藏是一项重要的基础工作。 1.2 菌种代号 国内药品微生物检验所用的菌种代号是CMCC(F)或CMCC(B)，CMCC--中国医学菌种保藏中心， B——代表细菌，F——代表真菌。 金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003大肠杆菌CMCC(B)44102 枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501 白色念珠菌CMCC(F)98001 黑曲霉CMCC(F)98003 1.3 传代和接种 1.3.1 菌种冻干粉复苏 1.3.1.1把冻干菌种管、灭菌1ml滴管、双碟、镊子、营养肉汤培养基、营养琼脂斜面数支，移入接种室或净化台。 1.3.1.2 先用砂轮将冻干菌种安瓿瓶颈部挫出挫痕，再将冻干菌种管外壁用75%酒精擦洗消毒，稍干，用75%乙醇棉擦净，放在灭菌双碟内，待干。点燃酒精灯，将菌种管的封口一端在火焰上烧灼红热，用灭菌滴管吸取营养肉汤培养基，滴在灼热的菌种管封口一端，是骤冷而炸裂。 1.3.1.3取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，放入灭菌双碟内，领取一只灭菌滴管，在火焰旁吸取营养肉汤少许，加至菌种管底部，将冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，分别接种至营养琼脂斜面及普通肉汤内，并将滴管及菌种管投入消毒液内，将已接种的营养肉汤及营养琼脂斜面进行培养。 1.3.2菌种斜面传代操作 1.3. 2.1 培养基应新鲜制备，如斜面已无冷凝水者，不宜再使用。标签上注明菌种名及菌种编号。至冰箱取出的菌种斜面，应在室温放置约30分钟，待温度平衡后再移入接种室或超净工作台。
菌种是从事微生物学及生命科学研究的基本材料，在医学领域中，诊断制品的制备，菌苗的生产、微生物致病性研究，药物的抑菌试验及药品微生物检验等都有一套完整的菌种、微生物具有生命活力，在传代过程中易发生变异甚至死亡，因此菌种传代与保藏是一项重要的基础工作。 菌种代号 国内药品微生物检验所用的菌种代号是CMCC(F)或CMCC(B)，CMCC--中国医学菌种保藏中心，、，B——代表细菌，F——代表真菌。 金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003大肠杆菌CMCC(B)44102 枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501 白色念珠菌CMCC(F)98001 黑曲霉CMCC(F)98003 传代和接种 菌种冻干粉复苏 把冻干菌种管、灭菌1ml滴管、双碟、镊子、营养肉汤培养基、营养琼脂斜面数支，移入接种室或净化台。 先用砂轮将冻干菌种安瓿瓶颈部挫出挫痕，再将冻干菌种管外壁用75%酒精擦洗消毒，稍干，用75%乙醇棉擦净，放在灭菌双碟内，待干。点燃酒精灯，将菌种管的封口一端在火焰上烧灼红热，用灭菌滴管吸取营养肉汤培养基，滴在灼热的菌种管封口一端，是骤冷而炸裂。 取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，放入灭菌双碟内，领取一只灭菌滴管，在火焰旁吸取营养肉汤少许，加至菌种管底部，
将冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，分别接种至营养琼脂斜面及普通肉汤内，并将滴管及菌种管投入消毒液内，将已接种的营养肉汤及营养琼脂斜面进行培养。 菌种斜面传代操作 培养基应新鲜制备，如斜面已无冷凝水者，不宜再使用。标签上注明菌种名及菌种编号。至冰箱取出的菌种斜面，应在室温放置约30分钟，待温度平衡后再移入接种室或超净工作台。 点燃酒精灯，用左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰旁，右手拿接种棒后端，将接种环烧红30秒，随后将全部接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过3次。左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手无名指，小指及掌部夹住棉塞，拨开棉塞，将接种环深入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷却再移至菌苔上，刮去少量菌苔，随即取出接种环，并将菌种管口移至火焰旁。 堵上棉塞，左手将菌种管放下，取营养琼脂斜面一支，照上述操作打开棉塞，将接种环深入管内至琼脂斜面的底部，由底向上，将接种环轻贴斜面的表面曲折移动，使细菌划在斜面的表面上。 取出接种棒，在火焰旁将培养基管棉塞堵上，然后将接种过细菌的接种棒在火焰上烧灼灭菌。菌种的培养与保存 大肠杆菌35-37摄氏度培养48小时金黄色葡萄球菌30-35摄氏度培养48小时枯草芽孢杆菌30-35摄氏度培养48小时白色念珠菌23-28摄氏度培养7天黑曲霉23-28摄氏度培养7天将培养物管自培养箱取出后放入冰箱（2-8摄氏度）保存，一
菌种得复苏传代及保存标准程序 目得:建立菌种得复苏、传代及保存标准程序、 范围:适用于检定用菌种得复苏、传代及保存得操作、 职责:质管部生物测定人员对本规程得实施负责。 内容: 菌种得复苏与传代操作均应在生物检定室阳性对照间或专用超净工作台内进行、操作中使用过得滴管、吸管及菌种管等均需放入消毒液中浸泡,试验结束后经1２1℃３0分钟高温灭菌处理。 １.菌种得复苏 1.1冻干菌种得复苏 检定用标准菌种,由中国药品生物制品检定所提供,为冷冻干燥菌种(0代)。使用前需将其复苏。 1．１.１准备: ①用具:灭菌1ｍl滴管、灭菌双碟、灭菌镊子、砂轮、酒精灯、接种环。 ②培养基:根据菌种得性质选择合适得液体培养基(营养肉汤培养基或改良马丁培养基)、营养琼脂(或改良马丁琼脂)斜面数支。 ③消毒液:7５%酒精、碘酒、0.1％新洁尔灭或84消毒液等。 1.１。2操作: 1。1。２.１将准备妥得冷冻菌种管、灭菌滴管、灭菌双碟及镊子、培养基移入工作台、 1.1.2。2用砂轮将冻干菌种管颈部挫出刻痕,再７5％酒精棉擦净菌种管外壁,放在灭菌双碟内待干。 1.1。2。3点燃酒精灯,将菌种安瓿得封口一端在火焰上灼烧红热,用灭菌滴管吸取液体培养基少许,滴在灼热得菌种安瓿封口一端,使其骤冷而炸裂。 １．1.2.4取灭菌镊子,在火焰旁,将炸裂得管口打开后,把菌种安瓿放入灭菌双碟内。 1．1。2、5另取一支灭菌滴管,在火焰旁吸取适用液体培养基少许,加至菌种管底部,将 冻干菌搅动促使溶解,随即吸出管内菌液,接种至液体培养基内、用接种环取菌液
划线接种于琼脂斜面培养基上。 1.1。2。6将已接种得液体培养基及琼脂斜面培养基置规定温度下(一般细菌在3０~35℃,真菌在23~28℃)培养24ｈ。 １。1.2。7 取出培养物(第1代),仔细观察菌苔形态、有无杂菌,必要时涂片、革兰氏染色镜检,若呈典型菌落即可应用。如发现菌型不典型,可进行平板分离单菌落。 １、２为保证工作用菌株得传代次数不超过5代,并减少购买冻干菌种得次数,可在对冻干菌种复苏得同时制备部分菌悬液(第1代)冷冻保存,并将此冻存菌液复苏后得第２代培养物冻存保藏。 1.２.1准备:①冻存保护液(４0%无菌甘油)及灭菌冻存管、 ②细菌冻存液:由液体培养基与冻存保护液按1:１比例混匀制成。 1.２．２按1.１、２。1～1、1.２。４操作,将冻干菌复溶后,吸取菌悬液加入到细菌冻存液中,混匀。 １。２.3按1mｌ/管得量分装至灭菌冻存管中,密闭。标明菌名、编号及冻存日期等。置-２0℃或－80℃条件下冷冻保存。 １.2.４制备第２代冻存菌悬液时,可用接种环直接刮取第１代冻存菌悬液复苏后转种至琼脂斜面或平板培养基上生长得纯菌落,再接种至细菌冻存液中,混匀后按1.２。3冻存。 1。3冻存菌悬液得复苏: 1.3．1准备: ①用具:灭菌1ml滴管、酒精灯、接种环。 ②培养基:根据菌种得特性选择适宜得液体培养基(如营养肉汤培养基10mｌ、硫乙醇酸盐流体培养基１2ml或改良马丁培养基1０ml等)、琼脂斜面或平板培养基。 ③消毒液:75％酒精、０、1%新洁尔灭或84消毒液等、 1。3。2操作: 1。3。２。１从低温冰柜中取出菌种冻存管,室温下放置使其自然解冻。1．３。２、2将解冻后菌种管及灭菌滴管、液体培养基等移入工作台、 1.3．2、3用75％酒精棉球擦拭菌种冻存管外壁,稍干。 1.3. 2.4点燃酒精灯,在火焰旁打开菌种冻存管盖,用一支灭菌滴管吸取解冻得菌悬
几种菌种的保存及复苏方法（含扩增方法） 定期移植法，亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于4～6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。 操作步骤如下： 1 培养基制备 1.1 器皿准备 培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等，经洗涤、干燥、包装、灭菌后使用。 1.2 溶解培养基配料 先在烧杯中放适量水，按培养基配方称取各项材料，依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解，最后加足水量，搅拌均匀。 1.3 调pH值 配料溶解后将培养基冷却至室温，根据要求加稀酸（0.1mol/L盐酸）或稀碱(10%氢氧化钠)调pH值。加酸或碱液时要缓慢、少量、多次搅拌，防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。 1.4 加凝固剂 配制固体培养基时需加凝固剂，如琼脂、明胶等。将凝固剂加入液体培养基中，加热并不断搅拌至融解，再补足所蒸发水分。 1.5 过滤分装 在二层纱布中间夹入脱脂棉，将配好的培养基趁热过滤并分装。斜面培养基分装量约为试管高度的四分之一(4～5mL)，穿刺培养基分装量以试管高度的二分之一为宜。分装过程中勿使培养基沾污管口，以免弄湿棉塞造成污染。 1.6 包扎标记 将试管加棉塞，外面包扎一层牛皮纸或铝箔并注明培养基名称及配制日期。 1.7 灭菌 根据要求将培养基灭菌，通常蒸汽灭菌为121℃，15～20min。 1.8 斜面摆放 灭菌后及时摆放斜面，斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。 1.9 无菌检查 将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验，通常30℃培养1～3天。无菌检查合格后将其保存于4℃下备用。 2 接种 2.1 斜面接种 2.1.1 点接 把菌种点接在斜面中部偏下方处。适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌（如毛霉、根霉等）。 2.1.2 中央划线 从斜面中央自下而上划一直线。适用于细菌和酵母菌等。 2.1.3 稀波状蜿蜒划线法 从斜面底部自下而上划“之”字形线。适用于易扩散的细菌，也适用于部分真菌。 2.1.4 密波状蜿蜒划线法 从斜面底部自下而上划密“之”字形线。能充分利用斜面获得大量菌体细胞，适用于细菌和酵母菌等。 2.1.5 挖块接种法 挖取菌丝体连同少量培养基，转接到新鲜斜面上。适用灵芝等担子菌类真菌。 2.2 穿刺接种
目的：建立菌种的复苏、传代及保存标准程序。 范围：适用于检定用菌种的复苏、传代及保存的操作。 职责：质管部生物测定人员对本规程的实施负责。 内容： 菌种的复苏与传代操作均应在生物检定室阳性对照间或专用超净工作台内进行。操作中使用过的滴管、吸管及菌种管等均需放入消毒液中浸泡，试验结束后经121℃30分钟高温灭菌处理。 1.菌种的复苏 冻干菌种的复苏 检定用标准菌种，由中国药品生物制品检定所提供，为冷冻干燥菌种(0代)。使用前需将其复苏。 1.1.1准备： ①用具：灭菌1ml滴管、灭菌双碟、灭菌镊子、砂轮、酒精灯、接种环。 ②培养基：根据菌种的性质选择合适的液体培养基（营养肉汤培养基或改良马丁培养基）、营养琼脂（或改良马丁琼脂）斜面数支。 ③消毒液：75%酒精、碘酒、%新洁尔灭或84消毒液等。 1.1.2操作： 1.1. 2.1将准备妥的冷冻菌种管、灭菌滴管、灭菌双碟及镊子、培养基移入工作台。 1.1. 2.2用砂轮将冻干菌种管颈部挫出刻痕，再75%酒精棉擦净菌种管外壁，放在灭菌双碟内待干。 1.1. 2.3点燃酒精灯，将菌种安瓿的封口一端在火焰上灼烧红热，用灭菌滴管吸取液体培养基少许，滴在灼热的菌种安瓿封口一端，使其骤冷而炸裂。 1.1. 2.4取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开后，把菌种安瓿放入灭菌双碟内。 1.1. 2.5另取一支灭菌滴管，在火焰旁吸取适用液体培养基少许，加至菌种管底部，将
冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，接种至液体培养基内。用接种环取菌液划线接种于琼脂斜面培养基上。 1.1. 2.6将已接种的液体培养基及琼脂斜面培养基置规定温度下（一般细菌在30~35℃，真菌在23~28℃）培养24h。 1.1. 2.7 取出培养物（第1代），仔细观察菌苔形态、有无杂菌，必要时涂片、革兰氏染色镜检，若呈典型菌落即可应用。如发现菌型不典型，可进行平板分离单菌落。 为保证工作用菌株的传代次数不超过5代，并减少购买冻干菌种的次数，可在对冻干菌种复苏的同时制备部分菌悬液（第1代）冷冻保存，并将此冻存菌液复苏后的第2代培养物冻存保藏。 1.2.1准备：①冻存保护液（40%无菌甘油）及灭菌冻存管。 ②细菌冻存液：由液体培养基与冻存保护液按1：1比例混匀制成。 1.2.2按操作，将冻干菌复溶后，吸取菌悬液加入到细菌冻存液中，混匀。 1.2.3按1ml/管的量分装至灭菌冻存管中，密闭。标明菌名、编号及冻存日期等。置-20℃或-80℃条件下冷冻保存。 1.2.4制备第2代冻存菌悬液时，可用接种环直接刮取第1代冻存菌悬液复苏后转种至琼脂斜面或平板培养基上生长的纯菌落，再接种至细菌冻存液中，混匀后按冻存。 冻存菌悬液的复苏： 1.3.1准备： ①用具：灭菌1ml滴管、酒精灯、接种环。 ②培养基：根据菌种的特性选择适宜的液体培养基（如营养肉汤培养基10ml、硫乙醇酸盐流体培养基12ml或改良马丁培养基10ml等）、琼脂斜面或平板培养基。 ③消毒液：75%酒精、%新洁尔灭或84消毒液等。 1.3.2操作： 1.3. 2.1从低温冰柜中取出菌种冻存管，室温下放置使其自然解冻。 1.3. 2.2将解冻后菌种管及灭菌滴管、液体培养基等移入工作台。
四、试验用菌种的培养传代方法 ●程序： 冻干菌复苏————接种（斜面）（菌种传代） （营养肉汤） 制备菌悬液对照菌液 ●检定用标准菌种，由中国药品生物检定所提供，为冷冻干燥菌种。 ●菌种的复苏与保存在专用无菌室或超净工作台内进行。 1 菌种的复苏 ?把冻干菌种管、灭菌1ml 滴管、双碟、镊子、营养肉汤培养基、营养琼脂斜面数支，移入接种室或净化工作台。 ?先用砂轮将冻干菌种安瓶颈部挫出刻痕,再将冻干菌种管外壁用碘酒擦洗消毒、稍干，用75% 乙醇棉擦净，放在灭菌双碟内，待干。点燃酒精灯，将菌种管的封口一端在火焰上，烧灼红热，用灭菌滴管吸取营养肉汤培养基，滴在灼热的菌种管封口一端，使骤冷而炸裂。 ? 取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，放入灭菌双碟内，另取1支灭菌滴管，在火焰旁吸取营养肉汤少许，加至菌种管底部，将冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，分别接种至营养琼脂斜面及普通肉汤内，并将滴管及菌种管投入消毒液内，将已接种的营养肉汤及营养琼脂斜面置35~37℃培养22~24 h。 ? 取出培养物，仔细观察菌苔形态、有无杂菌、涂片、革兰氏染色镜检，呈典型菌落后，转种3 代即可应用。如发现菌型不典型，可进行平板分离单菌落。 2 菌种的传代与保存 方法（1）：菌斜面菌斜面（保存） ? 培养基应新鲜制备，如斜面已无冷凝水者，不宜再使用。标签上著名菌名及接种日期。至冰箱取出的菌种斜面，应在室温放置约30分钟，待温度平衡后再移入接种室或超净工作台。 ? 点燃酒精灯，用左手握住菌种斜面，将管口靠进火焰旁，右手拿接种棒后端，将接种环烧红30秒，随后将全部接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过3次。左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手用无名指、小指及掌部夹住棉塞，拨开棉塞，将接种环伸人管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷却再移至菌苔上，刮去少量菌苔，随即取出接种棒，并将菌种管口移至火焰旁。 ? 堵上棉塞，左手将菌种管放下，取营养琼脂斜面1支，照上述操作打开棉塞，将接种环伸入管内至琼脂斜面的低部，由底向上，将接种环轻贴斜面的表面曲折移动，使细菌划在斜面的表面上。? 取出接种棒，在火焰旁将培养基管棉塞堵上，然后将接种过细菌的接种棒在火焰上烧灼灭菌。? 将已接种毕的细菌管置35~37℃培养22~24小时，霉菌管一般置20~25℃霉菌培养箱内培养7日。取出后放人冰箱保存，一般3个月转种一次。 方法2：菌斜面营养肉汤分离平板菌斜面 如果菌落形态不典型可纯化，按下列方法传代（分离菌落）： 用接种环取上述菌管（斜面）菌苔少许接种置营养肉汤中(5ml/支,已灭菌), 置35~37℃培养18~24小时后，再用接种环取培养好的营养肉汤菌悬液（浓菌液），接种于分离平板，置35~37℃培养18~24小时，用接种针选典型菌落划线于营养琼脂斜面，置35~37℃培养18~24小时。一般同时接种几支管，其中一支用于以后菌种传代或接种到半固体琼脂培养基中，其它用做工作菌种。 常用分离平板： 大肠埃希菌——EMB琼脂平板 铜绿假单胞菌——溴化十六烷三甲铵琼脂培养基 金黄色葡萄球菌——甘露醇氯化钠琼脂培养基 沙门菌——SS琼脂平板
依据: 中国药典2010年版二部及菌种使用说明书 1.标准菌的来源 标准菌株由中国药品生物制品检定所医学菌种保藏中心(China Medical culture collection , CMCC)提供的冷冻干燥菌种(0代)或由上级药检部门已接种好的菌种斜面(3代)。黑曲霉的0代菌种为保存于含15%甘油的0.9%无菌氯化钠溶液中的孢子悬液冷存管。中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌种的标签CMCC(B)代表细菌(bacteria),CMCC(F)代表真菌(fungi)每种菌具有固定的代号。 2.标准菌的验收 从菌种保藏中心购买的原始菌种管是玻璃安瓿装的冻干菌,接收同时应检查是否有随菌种附有的相关资料。接收菌种时应检查安瓿的数量和名称,和每一支安瓿的完整性。在相应的菌种接收记录上记上所有的关于菌种的信息,如名称、数量和接收日期等。在菌种安瓿及菌种管上粘贴标签,内容包括:菌种名称、菌种代号、代次、接收日期、接收人、贮存条件、有效期至。新购入的0代原始菌种储存于-20℃,有效期为三年。从上级药检部门购买的已接种好的菌种斜面(3代)应检查菌种管是否完好。储存于2~8 ℃,有效期为3个月。 3. 标准菌的复苏、复壮及标准储备菌株的制备 3.1物品及试剂:接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%酒精棉球 3.2培养基 改良马丁琼脂培养基:用于黑曲霉复苏、复壮. 液体硫乙醇酸盐培养基:用于生孢梭菌复苏、复壮.
营养肉汤培养基:用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮。 改良马丁培养基:用于白色念珠菌复苏、复壮. 3.3操作步骤: a.打开洁净工作台。 b.在安瓿的外表面用75%的酒精擦拭并让其自然风干。 c.用一小砂轮在安瓿的上部划一条线,用手轻轻将安瓿掰开(开启安瓿时必须 小心,因为安瓿遇热时可能会破裂)。 d.以无菌方法用一无菌吸管从已准备好的上述液体培养基中移取0.5~0.8 ml 到安瓿中。 e.轻轻地旋转安瓿以使冻干菌种和液体培养基充分混合并完全溶解。 f.用无菌吸管将安瓿内菌液全部转接到相应的液体培养基。 g.根据安瓿上所标明的不同菌种类型而将其培养于相应的温度(细菌培养温度30~35℃,培养18~24小时;真菌培养温度23~28℃,培养3~5天。观察是否浑浊,浑 浊说明菌种复苏生长;若不浑浊,细菌应延长培养时间至7天,真菌应延长培养时间至14天,若仍未浑浊,灭菌处理。 h.黑曲霉的菌悬液先室温待菌悬液融化后用无菌吸管吸取管内液体1~2滴滴 在改良马丁琼 脂斜面上,用吸管涂布均匀,置23~28℃培养5~7天,斜面正面为黑褐色厚绒状,色泽均一,不应有杂色,斜面侧面无色,接近菌层培养基略带黄色。确认后用含有 0.05%(ml/ml)的吐温-80的0.9%无菌氯化钠溶液洗脱到无菌试管中。
菌种的复苏及传代 4.1 菌种是从事微生物学及生命科学研究的基本材料，在医学领域中，诊断制品的制备，菌苗的生产、微生物致病性研究，药物的抑菌试验及药品微生物检验等都有一套完整的菌种、微生物具有生命活力，在传代过程中易发生变异甚至死亡，因此菌种传代与保藏是一项重要的基础工作。 4.2 菌种代号 国内药品微生物检验所用的菌种代号是CMCC(F)或CMCC(B) CMCC--中国医学菌种保藏中心B——代表细菌，F——代表真菌。 金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003 大肠杆菌CMCC(B)44102 枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501 白色念珠菌CMCC(F)98001 黑曲霉CMCC(F)98003 4.3 传代和接种 4.3.1 菌种冻干粉复苏 4.3.1.1把冻干菌种管、灭菌1ml滴管、双碟、镊子、营养肉汤培养基、营养琼脂斜面数支，移入接种室或净化台。 4.3.1.2 先用砂轮将冻干菌种安瓿瓶颈部挫出挫痕，再将冻干菌种管外壁用75%酒精擦洗消毒，稍干，用75%乙醇棉擦净，放在灭菌双碟内，待干。点燃酒精灯，将菌种管的封口一端在火焰上烧灼红热，用灭菌滴管吸取营养肉汤培养基，滴在灼热的菌种管封口一端，是骤冷而炸裂。 4.3.1.3取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，放入灭菌双碟内，领取一只灭菌滴管，在火焰旁吸取营养肉汤少许，加至菌种管底部，将冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，分别接种至营养琼脂斜面及普通肉汤内，并将滴管及菌种管投入消毒液内，将已接种的营养肉汤及营养琼脂斜面进行培养。 4.3.2菌种斜面传代操作 4.3.2.1 培养基应新鲜制备，如斜面已无冷凝水者，不宜再使用。标签上注明菌种名及菌种编号。至冰箱取出的菌种斜面，应在室温放置约30分钟，待温度平衡后再移入接种室或超净工作台。 4.3.2.2点燃酒精灯，用左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰旁，右手拿接种棒后端，将接种环烧红30秒，随后将全部接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过3次。左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手无名指，小指及掌部夹住棉塞，拨开棉塞，将接种环深入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷却再移至菌苔上，刮去少量菌苔，随即取出接种环，并将菌种管口移至火焰旁。 4.3.2.3堵上棉塞，左手将菌种管放下，取营养琼脂斜面一支，照上述操作打开棉塞，将接种环深入管内至琼脂斜面的底部，由底向上，将接种环轻贴斜面的表面曲折移动，使细菌划在斜面的表面上。 4.3.2.4取出接种棒，在火焰旁将培养基管棉塞堵上，然后将接种过细菌的接种棒在火焰上烧灼灭菌。 4.4菌种的培养与保存 4.4.1 大肠杆菌35-37摄氏度培养48小时 金黄色葡萄球菌30-35摄氏度培养48小时 枯草芽孢杆菌30-35摄氏度培养48小时