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胸苷磷酸化酶及其调节剂干扰素．ｎ在肝癌使用氟尿嘧啶前体药化疗
中作用的研究
中文摘要
背景和目的
原发性肝癌已经成为严重危害人类生存的重要疾病之一。目前肝癌的治疗以手术为主的综合治疗，而化疗在综合治疗中仍有很大需求，尤其是出现肺、骨等脏器的转移，此时局部治疗难以起到良好效果、化疗将是很有需求的治疗手段。５一氟尿嘧啶（５－ＦＵ）虽已用于多种肿瘤，但全身应用对肝癌有效率仅约１５％，且有诸多副作用。卡培他滨（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ，商品名：希罗达Ｘｅｌｏｄａ）是一新型的氟尿嘧啶前体药，具有口服吸收迅速，在肿瘤内优先转化为５．ＦＵ的特点，较直接静脉应用５一ＦＵ相比，具有更强的肿瘤选择性和更少、更轻的副作用。已被美国ＦＤＡ批准用于紫杉醇耐药的乳腺癌临床治疗。我所周俭等研究表明，卡培他滨具有抑制高转移人肝癌裸鼠模型ＬＣＩ—Ｄ２０原位移植瘤的生长、转移及切除术后转移复发的作用。
卡培他滨本身无细胞毒作用，需在体内经过多步酶解反应才能生成有化疗作用的５一Ｆｕ。其中胸苷磷酸化酶（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅｐｈｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ，ＴＰ）是发挥作用的关键限速酶。ＴＰ能在肿瘤组织内催化５’．脱氧．５．氟尿苷（５＇－ｄＦＵｒｄ）、卡培他滨等５－ＦＵ的前体药转化为有细胞毒作用的５．Ｆｕ。ＴＰ在多种肿瘤组织中表达水平均高于周围正常组织，因此卡培他滨可以优先在肿瘤内部转化为５．ＦＵ。
我所周俭等研究还表明，门静脉癌栓、肝癌组织及癌旁肝组织中血小板衍化内皮细胞生长因子（ＰＤ．ＥＣＧＦ，与ＴＰ同源）ｍＲＮＡ表达率分别为７７．８％、６７．９％和３５．７％。另有报道，ＴＰ在肝癌中表达的阳性率为５１．９％，在Ｅｄｍｏｎｄｓｏｎ分级ＩＩＩ—Ｉｖ级或伴有门静脉癌栓的肝癌中ＴＰ表达水平较高。另一方面，在生理条件下，肝细胞中ＴＰ表达较高，肝癌组织与周围肝组织相比，ＴＰ表达水平差异不大，正常肝组织为１４３．５±７２．１ｕｇ５－ＦＵ／ｍｇｐｒｏｔｅｉｎ／ｈｒ，而肝癌组织为１５９．２±９１．７ｕｇ５－ＦＵ／ｍｇｐｒｏｔｅｉｎ／ｈｒ，远低于在子宫颈癌、乳腺癌，结、直肠癌等肿瘤组织与其相应正常组织之间的比值。为此，如何进一步提高肝癌组织中ＴＰ表达水平，以增加５－ＦＵ前体药敏感性具有重要意义。
提高肿瘤组织中ＴＰ表达水平的主要方法包括转染ＴＰｃＤＮＡ，以提高肿瘤细胞ＴＰ表达水平，但受转染效率、表达载体及给药途径等限制尚不能应用于临床。其它调节ＴＰ表达水平的方法还有联合应用其它化疗药和细胞因子。己有研究表明，联合应用丝裂霉素、泰索帝、紫杉醇、环磷酰胺等能提高肿瘤中ＴＰ表达水
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平和活性。多种细胞因子如ＩＬ．１Ⅱ、ＴＮＦ．ｑ、ＩＦＮ—ｙ、ｂＦＧＦ、ＰＤ．ＧＦ也能上调ＴＰ表达或活性，ＩＬ．１２能通过上调ＩＦＮ—Ｙ而起到间接上调ＴＰ表达的作用。
ＴＰ与ＰＤ．ＥＣＧＦ具有同源的氨基酸序列，体外能诱导内皮细胞移动，体内有促进血管生成的活性。ＴＰ促血管生成活性与其酶促活性密切相关。ＴＰ表达上调后，可能因其促进妞管生成能力增强而导致肿瘤转移潜能增加。已有报道，ＰＤ．ＥＣＧＦ／ＴＰ高水平表达与肿瘤转移及预后不良正相关。
如何解决这一对矛盾，即上调ＴＰ表达水平提高肝癌对氟尿嘧啶前体药的敏感性与ＴＰ表达上调后促进肝癌血管生成能力增加而致转移潜能增强之间的矛盾，是需要解决的问题。
干扰素一ａ（ＩＦＮ—ｎ）是Ｉ型干扰素，具有抗病毒感染，促进细胞分化，调节细胞增殖和免疫等多种功能，近年又发现ＩＦＮ．ａ能上调肿瘤组织或细胞中ＴＰ表达或活性，而我所王鲁等发现，在大剂量时又具有抑制肿瘤新生血管形成的作用。临床研究表明，联合应用ＩＦＮ．ａ与氟尿嘧啶类药物及其它化疗药，可使部分不能切除的肝癌病人获得临床治愈的可能。因此本课题拟研究转染ＴＰｃＤＮＡ与应用干扰素．Ｑ两种途径调节肝癌细胞ＴＰ表达的可行性，以及ＴＰ表达改变后对细胞凋亡、诱导内皮细胞移动能力及药物敏感性的变化，以期寻找合适的ＩＦＮ．ａ剂量，达到既能上调ＴＰ表达提高肝癌对氟尿嘧啶前体药的敏感性，又能抑制ＴＰ表达上调后诱导血管生成增强的不良作用。
方法
ＴＰｃＤＮＡ原核表达载体ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ—ＴＰ酶切、胶回收，目的片段与ｐｃＤＮＡ３．１／ｚｅｏ（＋）质粒酶切产物进行连接反应，阳性反应克隆（ｐｃＤＮＡ３．１．ＴＰ）进行转化、扩增。利用ＲＴ－ＰＣＲ方法检测不同细胞ＴＰｍＲＮＡ表达水平。将ｐｃＤＮＡ３．１．ＴＰ转染肝癌细胞ＳＭＭＣ一７７２１，经ｚｅｏｃｉｎ筛选获得的阳性细胞克隆并检测其ＴＰｍＲＮＡ表达水平，免疫细胞化学方法检测ＴＰ蛋白质的表达，生长曲线法检测其增殖活性，流式细胞仪检测其凋亡，ＢｏｙｄｅｍＣｈａｍｂｅｒ小室法检测侵袭和诱导内皮细胞移动的潜能，ＭＴＴ法检测药物敏感性。ＩＦＮ—Ｑ处理ＳＭＭＣ．７７２１、Ｌ０２细胞，观察对ＴＰｍＲＮＡ表达水平及凋亡的影响，同时观察对ＳＭＭＣ一７７２１细胞诱导内皮细胞移动能力的影响：将３０只荷ＳＭＭＣ．７７２１裸鼠分为５组，给予不同剂量的ＩＦＮ—ｎ，利用酶联免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ）检测肿瘤组织中ＴＰ蛋白水平，利用抗ＣＤ３４免疫组化方法检测肿瘤组织中微血管密度（ＭＶＤ）。将３６只人肝癌高转移裸鼠模型ＬＣＩ—Ｄ２０，分别给予低剂量ＩＦＮ—ｎ、５－ＦＵ、卡培他滨及联合用药，观察对原位瘤体积、血常规和血生化的影响。再将３０只ＬＣＩ—Ｄ２０分别给予高剂量ＩＦＮ—ａ、卡培他滨及联合用药，观察对原位瘤体积、血常规和
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结果
一、转染ＴＰｅＤＮＡ后细胞ＴＰ表达水平和生物学行为的改变
与亲代ＳＭＭＣ一７７２１表达水平相比（０．４９±０．０２），转染ＴＰｅＤＮＡ后，ＴＰｍＲＮＡ表达水平明显增加（２．０９±０．１６）（Ｐ＜Ｏ．００１），而转染空载体ｐｃＤＮＡ３．１（Ｏ．４８±Ｏ．０６）变化不明显。转染ＴＰｅＤＮＡ后对细胞形态学和增殖能力无影响。ＳＭＭＣ一７７２１、７７２１一ｐＴＰ、７７２１?ｖｅｃ平均倍增时间分别为２．３、２．０和２．０天；凋亡细胞百分比分别为６，５０±３．８７％、３．７６±Ｏ．５０％和６．３６±１．９７％，差别无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。体外侵袭力差别不大，每高倍视野（２００×）细胞数分别为１０１－＋－３０、９２±３８和９３±１１，差别无显著性（Ｐ＞Ｏ．０５）。但７７２１－－ｐＴＰ诱导内皮细胞移动的能力明显增强，差别有高度统计学意义（Ｐ＜０．０００１）。每高倍视野（２００×）７７２１．ｐＴＰ、ＳＭＭＣ一７７２１和７７２ｌ－ｖｅｔ细胞诱导内皮细胞穿过微孔滤膜的数目分别为２７５±２９、１４３±２８和１２２±３５。７７２１一ｐＴＰ细胞对５＇－ｄＦＵｒｄ的敏感性增加，半数抑制剂量（ＩＣ５０）由亲代１２１．６８±１６．０３ｕＭ降至５６．８１±９．８５１１Ｍ，差别有统计学意义（Ｐ＜０．０１）。转染ＴＰｅＤＮＡ对ＳＭＭＣ一７７２１细胞对５．ＦＵ的敏感性影响不大。
二、干扰素一ｄ对ＳＭＭＣ－７７２１细胞ＴＰｍＲＮＡ表达、细胞凋亡、诱导内皮细胞
移动能力和化疗敏感性的影响
ＳＭＭＣ一７７２１细胞用ＩＦＮ—ｏ处理后，ＴＰｍＲＮＡ表达水平逐渐升高，具有剂量－时间依赖性。ＴＰｍＲＮＡ表达水平随ＩＦＮ．ａ浓度的增加而升高。应用浓度１０，０００Ｕ／ｍｌＩＦＮ后，细胞ＴＰｍＲＮＡ８小时升高明显，至１２小时达到峰值，此后维持较高水平至７２小时。ＩＦＮ—ａ处理与未用ＩＦＮ．ａ相比，凋亡细胞百分比无明显区别。ＩＦＮ—ｄ浓度１０，０００Ｕ／ｍｌ能显著抑制内皮细胞的移动（Ｐ＜Ｏ．００１）：而不同浓度ＩＦＮ－ｎ处理的ＳＭＭＣ一７７２１细胞，在低浓度ＩＦＮ．Ｑ时，诱导内皮细胞移动能力增强，１０、１００和１０００Ｕ／ｍｌ处理的ＳＭＭＣ．７７２１诱导内皮细胞穿过微孔滤膜的数目分别为每４００×视野１４４＿＿＿２５、１２５±１６和１３８±１８个，而对照组仅为９３±９个，有统计学意义（Ｐ＜０．００１）。而在１０，０００Ｕ／ｍｌ，穿过微孔滤膜的内皮细胞数与对照组无区别。用ＩＦＮ．ｎ能明显提高ＳＭＭＣ．７７２１对５＇－ｄＦＵｒｄ的敏感性。ＩＣ５０随着ＩＦＮ浓度的增加而下降，ＩＦＮ．Ｑ浓度为１０，０００Ｕ／ｍＩ时，细胞对５＇－ｄＦＵｒｄ的敏感性增加２倍，与未用ＩＦＮ．Ｑ及小剂量ＩＦＮ—ａ相比，差别有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。而ＩＦＮ—ａ对５一ＦＵ的敏感性影响不大，各组差别无统计学意义。结合ＩＦＮ－ｏ对ＳＭＭＣ．７７２１ＴＰｍＲＮＡ表达水平的影响，发现细胞对５’一ｄＦｕｒｄ敏感性的增加与ＩＦＮ．ｏ上调ＴＰｍＲＮＡ表达正相关，相关系数为０．６（Ｐｅａｒｓｏｎ检验
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三、干扰素．ｎ对荷ＳＭＭＣ．７７２ｌ细胞裸鼠皮下瘤生长及ＴＰ、ＭＶＤ的影响
ＩＦＮ．ａ抑制裸鼠皮下瘤生长具有剂量依赖性。随着ＩＦＮ—Ｑ剂量的增加肿瘤组织ＴＰ表达水平增加，ＩＦＮ—ｄ剂量为９．０×１０６Ｕ／ｋｇ／ｄａｙ、１．５×１０７Ｕ／ｋｇ／ｄａｙ时，肿瘤组织中ＴＰ蛋白表达水平分别是对照组的１．９和２．４倍，差别有统计学意义（Ｐ＜０．０１）。而在［ＦＮ－ｎ作用下，肿瘤组织中ＭＶＤ出现先增加后下降的变化，ＩＦＮ．Ⅱ剂量为９．Ｏ×１０６Ｕ／ｋｇ／ｄａｙ时，ＭＶＤ数目最多，达到６．Ｏ±１．８／４００×视野，而对照组仅为３．０±０．８／４００×视野，差别有统计学意义（Ｐ＜Ｏ．００１）。而当ＩＦＮ．Ｑ剂量达到１．５×１０７Ｕ瓜ｇ／０ａｙ时，ＭＶＤ数目却明显下降，与ＴＦＮ．ａ剂量９．０×１０６Ｕ／ｋｇ／ｄａｙ相比，差别有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。
四、干扰素．ａ联合氟尿嘧啶前体药对ＬＣＩ－Ｄ２０原位移植瘤生长和ＴＰ表达影响
单独５－ＦＵ的抑瘤率仅１３％，卡培他滨或低剂量ＩＦＮ．Ⅱ的抑瘤率为６０％。联合应用ＩＦＮ与５－ＦＵ，虽然肿瘤较单独应用５－ＦＵ有所缩小，但析因设计方差分析表明，二者之间无交互作用（Ｐ＝Ｏ．３６３）。联合应用低剂量ＩＦＮ．ｎ与卡培他滨，抑瘤率达９２．５％，析因设计方差分析表明，二者之间存在交互作用ｆＰ＝０．０２７）。其肿瘤较单独应用任何一种药物都小，因此二者之间应为协同作用。单用高剂量ＩＦＮ．Ｑ抑瘤率达７５％以上。联合应用高剂量ＩＦＮ．ｏ与卡培他滨肿瘤更小，较对照组、单独应用卡培他滨或高剂量ＩＦＮ—ａ组相比，差别有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。析因设计方差分析表明，二者之间也具有交互作用（Ｐ＝０．００３）。联合应用使肿瘤进一步缩小，表明二者是协同作用。ＬＣＩ—Ｄ２０模型中，原位移植瘤组织ＴＰ基础值为１９．６４４－２．８８ｎｇ／ｍｇ蛋白组织。卡培他滨对肿瘤组织ＴＰ表达影响不明显。而应用ＩＦＮ—ａ能上调ＴＰ表达，达到基础值的１．５倍左右，与对照组相比差别有显著统计学意义（ｐ＜Ｏ０１）。二者联合ＴＰ水平也较对照组上调，达到３０３４±１０．５７ｎｇ／ｍｇ蛋白质，差别也有显著统计学意义（ｐ＜０．０１）；与单独应用ＩＦＮ．Ⅱ相比，差别不明显（ｐ＞Ｏ．０５）。
五、联合应用干扰素．ａ与氟尿嘧啶前体药的毒副作用
联合应用ＩＦＮ—ａ与５－ＦＵ、卡培他滨，裸鼠体重及白细胞均无明显影响。联合应用低剂量ＩＦＮ一Ⅱ与５－ＦＵ的副作用主要表现为血清白蛋白下降，尿素氮、肌酐升高，尤以联合用药明显，而对转氨酶影响不大。联合应用高剂量ＩＦＮ．ａ与卡培他滨主要的副作用为肾脏毒性，表现为血清尿素氮升高，但高剂量ＩＦＮ．ｎ与卡培他滨单独也会引起血清尿素氮水平升高。
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结论
１，转染ＴＰｅＤＮＡ§％通过上调ＴＰｍＲＮＡ黔液达提离群癌缁艟ＳＭＭＣ一７７２１对５＇－ｄＦＵｒｄ的敏感性。但转染ＴＰｅＤＮＡ却导致细胞凋亡减少，诱导内皮细胞移动麓力罐强。
２．ＩＦＮ—ｄ能上调ＳＭＭＣ一７７２１细胞ＴＰｍＲＮＡ的表达，存襁一定程度的剂掇一时淹菝熬瞧。一定浓度黪ＩＦＮ．＆髓提高缎蘧对５＇－ｄＦＵｒｄ鳃敏感缝，对５－ＦＵ的敏感性影响不大。
３。一定浓凄熬ｌＦＮ。ｇ（１０，０００Ｕ／ｍ１）处理黪ＳＭＭＣ．７７２１爨藏，ＴＰｍＲＮＡ豹表达增加，但凋亡细胞未减少，诱导内皮细胞移动能力未增强。
４。ＩＦＮ一８刻量为ｌ。５×１０７Ｕ／ｋｇ／ａａｙ§％上调蘩ＳＭＭＣ＊７７２１襟菠皮下痰组织串露的表达，而不增加ＭＶＤ。
５。体内联合应月ＩＦＮ。ａ与卡培链滨兵毒捺怒撺铡ＬＣＩ．Ｄ２０缀位瘙生长熬终建，而联合应用ＩＦＮ。ｎ与５－ＦＵ仅具有相加作用。就体重变化而言，联合用药无明显毒性反应。主要副｛乍用为鹭毒性。
关键词：胸瞢磷酸化酶血小板衍化内皮细胞生长因子干扰素一ａ５－氟尿嚼啶５’一脱氯．５．氟尿萤卡墙他滨嚣千细胞癔微血篱密度
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ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＳｔｕｄｉｅｓｏｎＥｆｆｅｃｔｏｆＴｈｙｍｉｄｉｎｅＰｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅａｎｄｉｔｓＭｏｄｕｌａｔｏｒＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ＱｉｎＣｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙｏｆＨｅｐａｔｏｃｅＵｕｌａｒＣａｒｃｉｎｏｍａｕｓｉｎｇＰｒ－ｄｒｕｇｏｆ５－Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ
Ａｂｓｔｒａｃｔ
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ｃｅｌｌｓ．ＴｈｅｈｉｇｈｌｅｖｅｌｏｆＴＰｗａｓｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙｒｅｌａｔｅｄｔｏｔｕｍｏｒｍｅｔａｓｔａｓｉｓａｎｄｐｏｏｒ
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８
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前言
原发性肝癌已经成为严重危害人类生存的重要疾病之一。Ｐｉｓａｎｉ等报道，就全球而言，肝癌的发病率在各种癌症中位列第八位，而病死率却排在第四位¨Ｊ；我国肝癌病死率占全部恶性肿瘤病死率的第二位，占全部恶性肿瘤死亡人数的１８．８％【２】。为此，在２１世纪，积极开展肝癌的防治研究仍有其紧迫性。最近的几十年肝癌的研究取得了可喜的进展，然而整个人群的肝癌５年生存率，无论东方还是西方，仍都只有５％左右。
目前，肝癌的治疗仍以手术为首选，但手术切除的突出问题是切除率低，就诊的病人中适合手术切除的不足２５％口】，且术后复发率高，根治性切除术后５年复发率达６１．５％１４Ｊ。对于不能切除的肝癌，经肝动脉化疗栓塞（ＴＡＣＥ）己成为首选疗法。一项随机对照临床试验研究表明，不能手术切除的亚洲肝癌病人中，ＴＡＣＥ可以明显改善肝癌病人的生存期【５】。但单纯ＴＡＣＥ阻止肿瘤细胞播散入血的作用有限的，在ＴＡＣＥ治疗前后外周血ＡＦＰｍＲＮＡ的阳性率并无显著改变【６】，而在ＴＡＣＥ治疗的基础上序贯局部或全身的化疗或免疫治疗可取得比单一治疗方式更好的疗效，能显著降低肝外转移率，对改善肝癌患者的预后有积极意义”｛。
最新研究结果表明，单一治疗模式已不适合于肝癌的治疗，以提高肝癌总体疗效为目的的规范化综合治疗成为临床研究的首要问题。综合治疗是相对于单一治疗方法而言，以多种疗法的合理综合与序贯应用为特点。主要包括３个方面的内容：（１）可切除性肝癌的术前、术后综合治疗，以预防术后复发：（２）对无法根治性切除的肝癌做姑息性切除，术后进一步抗癌治疗，以延长患者带瘤生存时间；（３）对不能切除患者的综合治疗，可使部分患者的肿瘤缩小后获得二期切除或延长患者生存期惮Ｊ。
在目前肝癌的综合治疗中，全身化疗的作用逐渐引起重视。然而在肝癌的治疗历史中，全身化疗的作用多数时候被忽视了。的确，对一些中晚期不能手术切除的病人，单纯的全身化疗并不能带来好处，它既不能使肿瘤缩小，又对病人的生存率无影响，相反，因大多数病人全身情况差，不能耐受全身化疗的副作用，全身化疗会加速病情恶化。但是，临床上发现一些根治术获较长期生存的病人，在余肝无复发，功能良好的情况下，出现了肺、骨等脏器的转移，给治疗上带来了很大困难，严重影响了病人的治疗，此时局部治疗很难起到良好的效果、全身化疗将是很有前途的治疗手段ｐＪ。
５一氟尿嘧促（５一ＦＵ）作为许多恶性肿瘤特别是消化道肿瘤（包括肝癌）的主要化疗药物已有４０多年历史。全身应用５．ＦＵ对肝癌的疗效各家报道不一，一般有效率仅约１５％左右［１０】，且５－ＦＵ治疗常伴有呕吐、脱发、白细胞计数降低等副作用，病人常因不能耐受副反应而放弃治疗。现已有多种方法来减轻５一Ｆｕ的副
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作用，其中之一是应用无毒性作用的５．Ｆｕ前体药物。卡培他滨（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ，商品名：希罗达Ｘｅｌｏｄａ）是一个新型的氟尿嘧啶前体药，具有口服后迅速吸收，在肿瘤内部优先转化为５－ＦＵ的特点，较直接静脉应用５一ＦＵ相比，具有更强的肿瘤选择性和更少、更轻的副作用。已被美国ＦＤＡ批准用于紫杉醇抵抗的乳腺癌的临床治疗【Ｉ“。我所周俭等研究表明，卡培他滨具有抑制高转移人肝癌裸鼠模型ＬＣＩ．Ｄ２０肝内原位移植瘤的生长、转移及切除术后转移复发的作用［１２，１３１。卡培他滨本身无细胞毒作用，需在体内经过多步酶解反应才能生成具有化疗作用的５一ＦＵ。其中胸苷磷酸化酶（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅｐｈｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ，ＴＰ）是发挥作用的关键限速酶１１４１。研究表明，在多种肿瘤组织中ＴＰ表达水平升高［１５，１６，１７，１８］，因此卡培他滨可以优先在肿瘤内部转化为５－ＦＵ。但由于肿瘤的异质性，不同肿瘤之间，同一肿瘤内部不同个体之间，ＴＰ表达水平差别都很明显，如何提高ＴＰ低表达或无表达的肿瘤对氟尿嘧啶前体药的敏感性，是进一步提高其疗效的关键。
提高肿瘤组织中ＴＰ的主要手段包括转染ＴＰｃＤＮＡ［１９１，联合应用上调ＴＰ表达的细胞因子或化疗药∞２１】，从而增强肿瘤对５一Ｆｕ前体药物的敏感性。但ＴＰ表达水平升高后，具有潜在的促进肿瘤新生血管形成的作用，因为研究已经发现，体外具有诱导内皮细胞移动，体内具有促进肿瘤血管生成的血小板衍化内皮细胞生长因子（ＰＤ．ＥＣＧＦ）是通过其具有ＴＰ的酶促活性实现的１２２１。而在一些肿瘤中，ＰＤ．ＥｃＧＦ，ｒＰ的高水平表达与肿瘤的转移及不良预后正相关。
干扰素一ｎ（ＩＦＮ．ａ）是Ｉ型干扰素，具有抗病毒感染，促进细胞分化，调节细胞增殖反应和免疫调节等多种功能，我所王鲁等发现ＩＦＮ，ｎ具有抑制肿瘤新生血管形成的作用口３１。还有报道表明，白介素．１ａ、肿瘤坏死因子一Ｑ、干扰素Ｙ、ｎ等多种细胞因子能上调ＴＰ表达。临床研究表明，联合应用干扰素与５．氟尿嘧啶及其它化疗药，使部分不能切除的肝癌病人获得临床治愈的可能【２４Ｊ。
本课题拟研究转染ＴＰｃＤＮＡ与应用干扰素．ａ两种途径调节肝癌细胞ＴＰ表达的可行性，以及ＴＰ表达改变后对细胞形态学、凋亡水平、诱导内皮细胞移动能力及药物敏感性的变化，以期寻找合适的ＩＦＮ—Ｑ剂量，达到既能上调ＴＰ表达提高肝癌对氟尿嘧啶前体药的敏感性，又能有效抑制ＴＰ表达上调后诱导血管生成能力增强的不良作用。为使该课题应用于临床，又设计了在人肝癌高转移裸鼠模型ＬＣＩ—Ｄ２０中进行联合应用ＩＦＮ．ａ与氟尿嘧啶类药物的干预实验，观察联合用药的效果及毒副作用，以期为将来应用于临床提供参考。
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第一部分
转染瘸营磷羧健酶ｅＤＮＡ撵寒器瘦黯氟晷嘧睫兹俸骜敏感瞧豹磅究
主要仪器设备：
ｌ，低温超逮褒心戡Ｍｉｃｒｏｍ￡ＬｘＲｆＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
２．ＵＶ，Ｖｉｓｉｂｌｅｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ，Ｕｌｔｒｏｓｐｅ３０００ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ
３．ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ２４００ＰＥＲＫＩＮＥＬＭＥＲ
４．ＤＹ—Ａ电泳仪、Ｈ６－－ｌ微型电泳槽
凝胶灌制平台、凝胶样品梳上海西巴擞生物科技开发公司５．Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ－５４１５ＣＥｐｐｅｎｄｏｒｆ
６。ＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒＶＤＳＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ
７．ＤＫＺ系歹ｌ电热恒温振荡水槽上海益恒实验仪器有限公司８．Ｗａｔｅｒ－ＪａｃｋｅｔｅｄＩｎｃｕｂａｔｏｒＦｏｒｍａＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
９．嘏转纯仪ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ．谢ＢＩＯ．ＲＡＩＤ
１０．Ｃ０２培养箱ＥＳＰＥＣＢＮＡ－－３２１Ｄ溅，ＵＳＡｌ１．流式细胞佼ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ，ＢｅｋｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ
主要试裁及配割：
ＲＰＭＩ１６４０培养液：溶解１．２９／ＬＮａＨＣ０３、５．７９／ＬＨＥＰＥＳ、０．１ｌ∥Ｌ丙酮酸、
０，３９ｌＬＬ一谷氮聚黩，澜ｐＨ鏊趸７．２，０，２２ｐ．ｍ滤器撼滤，努装，４＂Ｃ缣存。
高糖ＤＭＥＭ培养液：ＤＭＥＭ为ＧＩＢＣＯＢＲＬ产品，用三蒸水配制。加入３．７∥ｌ碳酸鬣钠，按照２０蛞浓度加入人ＡＢ型盘渍ｆ上海市中心盘懿），调ｐＨ至７．２，
０２２９ｍ滤器过滤，分装，４℃保存。
骧蛋彝酶：用ｐＨ７，４不含ｃ矿＋、Ｍ９２＋戆Ｄ．Ｈａｎｋ’ｓ液配或ｅ，２５％的胰酶，撼滤除
菌后，分装，．２０℃储存。
Ｄ－Ｈａｎｋ’ｓ液的配刳：每舞含有ＮａＣｌ８．ＯＯｇ，ＫＣｔ０．４０９，Ｎａ２ＨＰ０４?７Ｈ２０Ｏ．１２９，ＫＨ２Ｐ０４Ｏ０６９，ＮａＨＣ０３Ｏ．３５９。
０。０２％ＥＤＴＡ：用ｐＨ７。４不舍Ｃａ２＋、Ｍｇ”的Ｄ－Ｈａｎｋ’ｓ液配制媛Ｏ。０２％的工作渡，
１０磅１５ｍｉｎ高压蒸汽灭菌，分装、４＂Ｃ储存。
０．１ｍｏｌ／ＬＰＢＳ（ｐＨ７．３）缓冲液；Ｎａ２ＨＰ０４‘１２Ｈ２０２７．５８１４９，ＮａＨ２Ｐ０４＂２Ｈ２０３．５８９１５９，ＮａＣｌ８．５９，加三蒸馏水至１０００ｍｌ，溶解，高压消毒后室游保存。
Ｇｉｅｍｓａ染液：准确拣取Ｏ．５０９Ｇｉｅｍｓａ色素（上海试剂三厂，批号２００００３２４），
放入陶瓷研钵中，加入分析纯甘油３０ｍｉ研蘑，然后加入３０ｍ１分析纯甲醇，５６℃水浴２小时后，室瀑密闭保存。
旗纯丙碇（ＰＩ）染液：ＰＩ１５ｒａｇ，榴橡黻铺Ｏ。Ｉｇ，ＮＰ一４０Ｏ．３ｍｌ，加蒸馏水至１００ｍｌ，
地董盛酸业堕丛丛型互型土丛塞：！垄』！王堡焦旦亟屋耍噻煎住荭毡痘尘韭旦塑婴壅筮＝部垃４＂Ｃ避光保存。
苏木素染液：称取苏木索粉ｏ．５９和铵矾２４９溶解于７０ｍｌ蒸馏水中，然后取Ｎａｌ０３１９，水５９，再加入甘油３０ｍｌ和冰醋酸２ｍｌ，混合均匀，滤纸过滤，备用。
伊红染液：称取Ｏ．５９水溶性伊红染料，溶于１００ｍｌ蒸馏水中。
ＭＴＴ溶液：称取２５０ｍｇＭＴＴ（批号０１０３０２），加５０ｍｌＰＢＳ（０．０１ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ７．４）在电磁力搅拌机上搅拌３０ｍｉｎ，用微孔滤器除菌，分装，４＂Ｃ保存。
４％台盼蓝母液：称取４９台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至１００ｍｌ，用滤纸过滤，４Ｖ保存。使用时，用ＰＢＳ稀释至Ｏ．４％。
ＲＮＡ提取：
ＴｒｉｚｏｌＲｅａｇｅｎｔ购自ＳＮＢＣ；氯仿，异丙醇购自中国医药上海化学试剂公司；
磷酸缓冲盐溶液（ＰＢｓ）：８９氯化钠，Ｏ．２９氯化钾，ｔ．４４９磷酸氢二钠，Ｏ．２４９磷酸二氢钾溶于８００ｍｌ去离子水中，调ｐＨ为７．４，定容至１０００ｍｌ。
ＤＥＰＣ（焦碳酸二乙酯）处理水：在１０００ｍｌ去离子水中加入２ｍｌＤＥＰＣ，剧烈振荡，室温过夜后，高压灭菌。
７５％乙醇：３００ｍｌ无水乙醇＋１００ｍｌＤＥＰＣ处理水，振荡混匀
逆转录反应：５ｘＦｉｒｓｔ－ＳｔｒａｎｄＢｕｆｆｅｒ（２５０ｍＭＴｒｉＳ－Ｈｃｌ（ｐＨ８ｆ３），３７５ｍＭＫＣｌ，１５ｍＭＭｇＣｌ２）、ＤＴＴｌＯＯｍＭ、Ｍ?ＭＬＶＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ２００ｕ／ｌａｌ均购自
ＧｉｂｃｏＢｒｌ；Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）ｌ５Ｏ．１ｉｎｇ／Ｄ１、由赛百盛合成；ｄＮＴＰｓ１０．０ｍＭ、ＲＮａｓｉｎ４０“ｕｌ均购自Ｐｒｏｍｅｇａ。
多聚酶链反应：１０×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ［１００ｍＭＴｒｉｓ．ＨＣＩ（ｐＨ９．０），１００ｍＭＫＣｌ，２０ｍＭＭｇＳ０４，８０ｍＭ（ＮＨ４）２Ｓ０４，Ｏ．５％ＮＰ一４０）、ＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ５ｕ］ｇｌ购自ＢＢＳＴ；ＴＰＰｒｉｍｅｒ、１３－ａｃｔｉｎＰｒｉｍｅｒ、ＺｅｏｃｉｎＰｒｉｍｅｒ均由申友公司合成。
琼脂糖凝胶电泳
ＴＢＥ电泳缓冲液：１０８９Ｔｒｉｓ碱＋５５９硼酸＋４０ｍｌＯ．５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ８．０），加去离子水至１Ｌ，所得的溶液为１０×贮存液。用时再用去离子水稀释１０倍或２０倍，即得１ｘＴＢＥ或０．５×ＴＢＥ。
１％、１．７％琼脂糖凝胶：在一三角烧瓶中分别加入ｌｇ，１．７９Ａｇａｒｏｓｅ，ｌＯＯｍｌＯ．５ｘＴＢＥ，在Ｍｉｃｒｏｗａｖｅ中转２分钟后，加入１０ｍｇ／ｍｌ溴化乙锭５９ｌ，室温下保存，备用。Ａｇａｒｏｓｅ购自ＳＩＧＭＡ公司。
墅萱蠛篷些醢缝蕴翌堇趔王魃茎：！褒驻擅焦旦然屡堡壁藏链蒸毡痘童疰旦数受筑签＝趣坌８．克隆培养，鉴定
梳６个毙隆培养后，进行质粒小抽，利粥Ｎｏｔ】，Ｘｈｏｌ双酶切及Ａｐａｌ单酶切，鉴定。双酶切反应体系及反应条件同前。Ａｐａｌ单酶切反应体系：１０×ｂｕｆｆｅｒＹ５１ａｌ，Ａｐａ｛ｌｇｌ，ｐｃＤＮＡ３．１／ｚｅｏ（＋）－ＴＰｌｇｇ，粕双蒸永至５０９ｌ。葳应条｛串：３７℃，９０分钟，６５℃，１５分钟。
覆毅扩增，中搔，缝亿：方法、步骤嚣蔚。
结果
全长ＴＰｅＤＮＡ插入在原梭表达载体ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ的多克隆位点的ＥｃｏＲｌ内。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ—ＴＰ质数经Ｎｏｔｌ积Ｘｈｏｌ酶切瑟生成大，｛、不等黪秀条片段，片段长度分别约３．０ｋｂ和１．６ｋｂ，其中较短的片段中含有目的基因ＴＰｃＤＮＡ。而ｐｃＤ凇３．１／ｚｅｏ（＋）经双酶切鼷褒电泳强上仅凳一条豢，为５。０ｋｂ左豢。由予在ｐｃＤＮＡ３．ｉ／ｚｅｏ（＋）质粒的多克隆位点内及ＴＰｅＤＮＡ的赫因中各有一个Ａｐａｌ的限制性酶切位点，所以将筛选出麴阳性竞隆进行ＴＮｏＺｌ秘Ｘｈｏｌ约双懿切及Ａｐａｌ的单酶切（如图ｌａ），其中长片段为５．０ｋｂ的ｐｃＤＮＡ３．１，短片段为１．６ｋｂ的目的片段，内含全长ＴＰｅＤＮＡ。图ｌｂ显示为鑫质粒的酶切位点的示意匿，念长ＴＰｅＤＮＡ位于ＥｃｏＲｌ俄点之间。
ｌ２３４５６７８９１０
５。０ｋｂ
３．０ｋｂ
｛．６ｋｂ
＋一１．６ｋｂ
潍ｌａ，ｌ，１０Ｍａｒｋｅｒ；２，４硝ｌｕｅｓｃｒｉｐｔ－ＴＰ；３，５
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ—ＴＰ双酶切；６ｐｃＤＮＡ３．１；７
ｐｃＤＮＡ３．１双酶切：８ｐｃＤＮＡ３。ｌ—ＴＰ烈酶切：９
ｐｃＤＮＡ３．１－ＴＰ单酶切