基因工程思考?答案
一、填空题
1．70
2．(1)分子水平上的操作；(2)细胞水平上的表达3．克隆基因的类型；受体的选择；载体的选择4．限制性酶切图谱
5．属名的第一个字母；种名的前两个字母；株名
6．(1)减少酶量；(2) 缩短反应时间；(3)增大反应体积
7．EcoK；EcoRl
8. GGCC;异源同工酶(同裂酶)
9．枯草杆菌蛋白酶；(1)5'-3'合成酶的活性；(2)3'-5'外切核酸酶
10. 碱性磷酸酶; 5'端的磷酸基团
11. Ca2+
13. DNA 聚合酶I ：5'一3'外切核酸酶; 5'一3'合成酶
14. S1 核酸酶切割; DNA 聚合酶补平
15. 核酸水解酶H; RNA
16. 质粒DNA ;病毒DNA ;质粒和病毒DNA 杂合体
17. 复制区：含有复制起点; 选择标记：主要是抗性基因; 克隆位点：便于外源DNA 的插入
18. 质粒消除(或治愈)
19, pMBI ; pSCIOI; pSF2124(R质粒)
20. 1000kb；300kb
21. 严紧
22. pBR322 和M13 ; pMBI ;转座子
23. 它在细菌中能够大量繁殖，这样有利于外源DNA 的扩增；对某些噬菌体(如噬菌)的遗传结构和功能研究得比较清楚，其大肠杆菌宿主系统的遗传也研究得比较详尽
24. 没有合适的限制性内切核酸酶识别位点；选择标记
25. 质粒；噬菌体；45
(1) 分子量大，(2)酶的多切点，(3)无选择标记
26.
27．复制区；IG 区
28. 75% ?105%
29. 螯合Mg2+离子，抑制核酸酶的活性
30. 中和DNA 分子的负电荷，增加DNA 分子间的凝聚力
31. (1)合成探针；(2)合成cDNA ; (3)用于PCR反应；(4)进行序列分析
32. T—载体
33. 第二链合成时形成的发夹环
34. 乙醇使DNA 分子脱水
35. (1)保持正确的可读框(2)能够使其转录的启动子(3)具有翻译的起始和终止信号
36. 接受外源DNA 的生理状态
37. (1)黏性末端连接；(2)平末端连接；(3)同聚物接尾连接；
(4)接头连接
法
38. 基因组DNA 克隆；基因组DNA 文库
39. cDNA克隆；cDNA文库
40. 聚合酶链式反应(PCR)
41.0 C；42 C
42. (1)遗传学方法；(2)物理筛选法；(3)核酸杂交法；(4)表达产物分析法
43. 插入外源片段的种类较多，大小又极为相似的重组体的筛选
44. 基因组DNA；cDNA
45. Klenow 酶填补的方法；T4DNA 聚合酶
46. (1)用M13 噬菌体载体合成单链DNA 探针；(2)从mRNA 反转录合成单链
cDNA探针；(3)用不对称PCR合成单链DNA探针
47. 外源基因是否进行了转录
48. 两种不同的细胞群体能够表达不同的基因，即在一个群体中能够表达一些基
因，而在另一个细胞群体中不能表达这些基因
49. Northern 印迹
50. Southern 印迹
51. 5' 3'合成酶；3' 5'外切核酸酶
52. (1)克隆的是完整的基因；(2)使用的是表达载体；(3)不含内含子
53. ⑴印迹的对象不同：Northern是RNA , Southern是DNA ; (2)电泳条件不
同，前者是变性条件，后者是非变性条件
54 . ( 1 )抗体能够被吸附到固体支持物上；(2)同一个抗原可以同几种抗体结合；(3)
抗体能够被标记
、选择题(单选或多选)
1. c ；
2. c；
3. b；
4. b
5.
b，
C，
d，e
； 6 . c ；7 .
b ；
8. d；9.
d；
10. B
；
11. a；12. a；13. d；14. b 15. d；16. c；
17.
a，
b；18.
a；
19. c
；
20. d；21. c；22. C；23.
b；24.
C；
25. d；26.
a，C，
d；27.
b；
28. c
；
29. b；30. a；31 . c；32.
a,c,d,e，
33.
a
，b，c；34.
b；
35. c；36.
c；
37. d
；
38. b；39. c；40. a；41 .
c；42. a，
b，
c；43. b；44. b；45.
d；
46.
a
；
47. a；48. c；49. c；50.
b；51 .
c；
52. c；53. b；54.
a,c,d；
55. a
；
56. b；57. a，b；58. c；
59. a ；60.
d
；61 . b；
62.
c；
三、简答题
1 . 答：
San ger DNA测序法是建立在两个基本原理之上：
(1) 核酸是依赖于模板在聚合酶的作用下由5'端向3'端聚合(DNA 聚合酶参与了细菌修复DNA 合成过程)；
(2) 可延伸的引物必须能提供游离的3'羟基末端，双脱氧核苷酸由于缺少游离的3'羟基末端，因此会终止聚合反应的进行。如果分别用 4 种双脱氧核苷酸终止反应，则会获得 4 组长度不同的DNA 片段。通过比较所有DNA 片段的长度可以得知核苷酸的序列。
2. 答：
盐离子浓度不对，温度不对，甘油浓度过高。
3. 答：
回文序列是：5'-CATATG-3，
4. 答：
GATATC；AAATTT ，因为它们是回文序列。
5. 答：
注意星活性，先低盐，后高盐；先低温酶，后高温酶；并且可以直接在换酶前将第一种酶失活，再加第二种酶，否则，易产生星活性。或使用通用缓冲液。
6．答：
由于反转录酶缺少在E．coli DNA 聚合酶中起校正作用的3'-5'外切核酸酶活
性，所以聚合反应往往会出错，在高浓度的dNTP和Mg2+下，每500个碱基中可能有一个错配。
7．答：
所谓测序酶即是修饰了的T7 DNA 聚合酶，是采用缺失的方法，从外切核酸酶结构域中除去28 个氨基酸，这样使T7 DNA 聚合酶完全失去了3'-5'的外切核酸酶活性，只有5'---3'聚合酶的活性，而且聚合能力提高了3?9 倍, 测序时常用此酶。
8．答：
S1核酸酶作图是一种对RNA转录产物的末端和剪接位点进行作图的方法。
9. 答：
YAC 带有天然染色体所有的功能元件，包括一个着丝粒，一个DNA 复制起点，两个端粒。YAC能够容纳长达几百kb的外源DNA，这是质粒和黏粒办不到的。
大片段的插入更有可能包含完整的基因，在染色体步移中每次允许更大的步移距离，同时能够减少完整基因组文库所需的克隆数目。
10．答：
( 1 )独立复制；(2)有选择标记；(3)有独特的酶切位点；(4)能转化但不
扩散。
11 ．答：
含有细菌质粒和克隆的真核生物DNA 片段的杂种质粒，有两个复制起点和既能在细菌又能在真核细胞中进行选择的选择标记，所以，很容易从一宿主转到另一个宿主(来回穿梭)。
12. 答：
(1)削减分子量(除去非必需区和整合区)；(2)削减酶切位点；(3)添加选择标
记；(4)引入终止突变
13．答：
(1) DNA 半保留复制的原理，在体外进行DNA 的变性、复性和引物延伸。
(2) 至少要预先知道足够合成一对引物的靶DNA 序列。
14．答：
基因组克隆包含所有不在cDNA 中出现的内含子。
15．答：
化学合成一些长为10bp含有EcoRI识别位点的短的DNA片段，然后与待克隆片段两端连接起来，如果用EcoRI 切割这种连接片段，就会产生EcoRI 的单链末端。这种片段就可以插入到任何EcoRI 的限制性内切酶位点中。
16 ．答：
(1) COS位点可以自身环化；⑵可以利用COS位点包装噬菌体颗粒；
(3) 可以感染寄主细胞；(4)利用质粒复制子复制，不整合、不裂解。
17 ．答：
(1) 着丝粒；(2)端粒；(3)ARS 序列。
18 ．答：
(1) 含有来自其他生物DNA 的酵母人工染色体，叫YAC；
(2) 主要特性是可以克隆较大的外源片段。
19 ．答：
PCR用双引物，体内复制用单引物。
20．答：
应注意的问题有：启动子、密码子、剪接、分泌。
21 ．答：
为了扩增突变体的thyA 基因，先设计一对引物，其中一个引物的序列与thyA 基因的5'端相同，另一个引物同该基因的3'端互补。在引物的5'端加上合适U类限制性内切核酸酶的识别序列，以便于后来的克隆。将染色体DNA 同引物混合后，进行PCR扩增。然后进行琼脂糖凝胶电泳，纯化扩增片段，可以直接测序或克隆到合适的载体再测序。
22．答：如果你的杂交探针是双链的，可能因为在加人杂交混合物之前忘记将探针变性而得到空白的放射自显影结果。
23．答：
(1) DNaseI 造成切口；
(2) DNA 聚合酶III 的5' 3'外切核酸酶进行切割；
⑶DNA聚合酶川的5' 3'合成酶进行修补；
(4) 在修补过程中，随着切口(nick)的移动，将放射性的底物掺人到双链DNA中。24．答：
原因是：Hind川的切点在A基因内。
25．答：
Western印迹是将蛋白质经电泳分离后从凝胶中转移到固相支持物上，然后用特异性的抗体进行检测。它与Southern的不同在于探针的性质不同，在Western 印迹中使用的探针是抗体(蛋白质)。
26．答：
基因型是lac-.原因是在该密码子中插入了两个碱基，造成了移码突变，所以Lac 的基因是缺陷的。
27.答：这是因为细菌没有内含子剪接系统，并且不能识别真核生物的启动子之故。
四、问答题：
1. 答：
限制性内切核酸酶采用三字母的命名原则，即属名+种名+株名的各一个首字母，再加上序号。
基本原则：3-4个字母组成，
方式是：属名+种名+株名+序号；
首字母：取属名的第一个字母，且斜体大写；
第二字母：取种名的第一个字母，斜体小写；
第三字母：(1)取种名的第二个字母，斜体小写；(2)若种名有词头，且已命名过限制酶，则取词头后的第一字母代替。
第四字母：若有株名，株名则作为第四字母，是否大小写，根据原来的情况而定，但用正体。
顺序号：若在同一菌株中分离了几种限制酶，则按先后顺序冠以I、U、川、…
等，用正体。
2. 答：
U类限制酶虽然识别和切割的序列都具有特异性，但是这种特异性受特定条件的限制，即在一定环境条件下表现出来的特异性。条件的改变，限制酶的特异性就会松动，识别的序列和切割都有一些改变，改变后的活性通常称第二活性，而将这种因条件的改变会出现第二活性的酶的右上角加一个星号表示，因此第二活性又称为星活性。概括起来，诱发星活性的因素有如下几种：(1)高甘油含量(>5%, v/v); (2)限制性内切核酸酶用量过高(>100U / ugDNA); (3)低离子强度(<25 mmol/L);⑷高pH(8. 0以上)；(5)含有有机溶剂，如DMSO，乙醇等；(6)有非Mg2+的二价阳离子存在(如Mn2+ , Cu2+, C02+, Zn2+等)。
3．答：
影响DNA 连接酶催化连接反应的因素有很多，但温度对连接反应的影响较大。
黏性末端链通常以12°C 一15° C 最好，这种温度有利于末端退火和连接酶的活性稳定。温度高了难以进行末端退火，低于上述温度会降低连接酶的活性。平末端连接以室温为宜，因为平末端连接不存在DNA 的退火问题，但是温度高于30E，连接酶特别不够稳定。平末端连接时连接酶的浓度要比黏性末端连接时高10-100 倍。DNA 中有残存的tRNA 不会抑制DNA 连接酶的活性，但是，如果NaCI的浓度高于150mmol/L,则对连接反应有强的抑制作
用。
另外反应体系中有NH4+离子的存在，对E. coli DNA连接酶具有激活作用。
E. coli DNA连接酶需要NAD+作辅助因子，而T4 DNA连接酶需要ATP。
4. 答：
Klenow酶是1974年Klenow用枯草杆菌蛋白酶水解DNA聚合酶I，得到两个片段，其中大片段的分子量为75kDa，它具有5'-3'聚合酶和3'-5'外切核酸酶的活性，小片段具有5'-3'外切核酸酶活性。由于大片段失去了DNA 聚合酶I中会降解5'引物的5'-3'外切核酸酶的活性，所以在基因工程中更有用。