质粒转染大肠杆菌
材料试剂：胰化蛋白胨，酵母提取物，琼脂，NaCl，NaOH（调pH），氨苄青霉素，卡那霉素，质粒提取试剂盒
仪器：高压灭菌锅，42℃恒温水浴锅，，恒温摇床（37℃,225rpm），无菌培养板，消毒1.5ml 离心管，消毒枪头，无菌操作台
实验步骤：
1.LB培养基的配制：
在950 ml去离子水中加入: 胰化蛋白胨10g 酵母提取物5g NaCl 10g 摇动容器直至溶质溶解.用5mol/LNaOH调pH至7.0.用去离子水定容至1L.在15psi高压下蒸汽灭菌20min.
固态培养基
LB固体培养基及倒板：
（1）.配制：100mlLB培养基加入1.5g琼脂粉
（2）.抗生素的加入：高压灭菌后，将融化的LB固体培养基置与55℃的水浴中，待培养基温度降到55℃时（手可触摸）加入氨苄抗生素（终浓度为50μg/ml），以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。
（3）.倒板：一般10ml倒1个板子。培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10-15分钟。
（4）.保存：用封口胶封边，并倒置放于4℃保存，一个月内使用。
2.从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上。
3.加入质粒DNA溶液（含量不超过50ng，体积不超过10μl），轻轻摇匀，冰上放置30
分钟后。
4.42℃水浴中热击45s/90s，热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。
5.向管中加入1ml LB液体培养基（不含Amp），混匀后37℃振荡培养1小时，使细菌恢
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复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因（Ampr ）。
6.将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Amp的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌
液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24小时。
同时做两个对照：
对照组1：以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。
对照组2：以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。
大肠杆菌的扩增
1.从LB平板上挑取新活化的单个菌落，接种于3-5ml LB液体培养基中，37℃下振荡
培养12小时左右，直至对数生长后期。将该菌悬液以1：100-1：50的比例接种于100ml LB液体培养基中，37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右。
2.取上述培养液置于冰中10min，之后转移到已灭菌的50ml离心管中再于冰上放置
5min
3.于4℃离心，2700rmp，10min，弃上清，收集细菌
4.质粒的提取
准备大肠杆菌质粒提取盒和扩增的带质粒大肠杆菌培养液
5.质粒鉴定（琼脂糖凝胶电泳）
质粒转染细胞株
材料
细胞株、质粒、培养基、链霉素/青霉素（双抗）、FCS（小牛血清）、PBS（磷酸盐缓冲溶液）、胰酶/EDTA消化液、转染试剂（Lipofectamine TM2000）
实验步骤
Ⅰ.准备细胞：
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实验目的 为了获得大量的质粒作为克隆载体，我们需要将购买来的质粒通过转化的方法导入细菌的细胞内。制备出感受态的细胞，我们就可以方便的将需克隆的质粒导入其中，使其繁殖，就能获得大量质粒。本次实验的目的就是增加质粒的数量。同时，我们能掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的基本原理和实验技术方法。 实验原理及过程 实验步骤 1挑取一个JM109单菌落于3ml LB(无抗生素)培养基中，37℃，180rpm培养过夜。 [让菌复苏，进入对数期的早中期。此时更容易制得感受态细胞。] 2取过夜培养物加入到40mL LB(无抗生素)培养基中，37℃250rpm大约小时。 [减少达到所需亮的均所需繁殖的世代数，以减少菌的变异。] 3取培养物置于40mL的灭菌离心管中，冰浴10min，4000rpm4℃离心 10min，弃上清。（将所有上清倒光，可以将离心管倒过来） [使细菌的生长停止，代谢减慢。因为这时已经没有培养基了，如果细菌仍有很高的代谢效率，则有大量细菌死亡。] 4菌体重悬于10mL100mmol/L冰冷CaCl2中，轻吹，4℃30min，4000rpm 离心5min弃上清。 [细菌处于0度，CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，外源DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸盐混合物黏附于细胞表面（羟基来源于细胞壁上的糖，磷酸来源于DNA），经短时间420C热激处理，促进细胞吸收DNA复合物。（一
定要轻吹，这时细胞壁打开，十分脆弱）]5菌体重悬于1mL 100mmol/L冰冷的CaCl2中，轻吹，用于转化。 [除去所有的LB以及细胞破损后释放出来的细胞内含物。防止细胞分裂，以致大量细胞死亡。（一定要轻吹，这时细胞壁打开，十分脆弱）] 6取感受态细胞100uL，加入2uLpET-21a质粒，冰浴30 min受体菌：感受态细胞100uL，加入2 uL无菌双蒸水阴性对照：LCaCl2溶液100uL，加入2 uL阴性对照 [第一个阴性对照是为了验证LB中的抗生素有活性；第二个阴性对照是为了验证CaCl2溶液和pET-21a质粒未被污染。] [冰浴是为了降低细胞代谢率，防止细胞大量死亡。] 7热激42度，90s 【在低温处理后，热激，可以使细胞壁热胀冷缩，再低温，使细胞壁上黏附的质粒进入细胞体内。】 8冰浴2 min 9加入800 uL无抗生素的LB，37℃复苏1h 【用LB复苏细胞，使细胞恢复活力，从而使细胞中的质粒表达抗抗生素的基因，只有这样才能使转化成功的细菌在有抗生 素的LB平板上生长。】 10取100ul细胞直接在含50ug/mLCarbenicillin(羧苄西林)的LB培养基上铺平板，将平皿放置37 oC温箱30min至液体被吸收。倒置平皿37 oC培养过夜，出现菌落。 【这些菌落为转化成功的菌落，而对照组应该没有菌落。在目的菌落的旁边有可能出现卫星菌落，这是因为亩的菌落的抗性基因似的菌落周围的抗生素失效，长出了转化为成功的菌落。用羧苄西林因其对酸稳定、不易被细菌降解，所以可以降低卫星菌落的数量。
软琼脂克隆形成实验步 骤完整版 集团标准化办公室：[VV986T-J682P28-JP266L8-68PNN]
注意：软琼脂克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。软琼脂培养法常用检测肿瘤细胞和转化细胞系。接种细胞的密度每平方厘米不超过35个，正常细胞在悬浮状态下不能增殖，不适用于软琼脂克隆形成试验。 1、配制100ml的1.2%Argrose和0.7%Argrose，Argrose用DNA电泳用BIOWESTREGULARArgroseG10 （4℃），溶剂用双蒸水（DDW），高压灭菌后，维持在42℃中不会凝固；配制500ml的2×1640和 0.005%的结晶紫。 2、实验前，将水浴锅放入超净台内，紫外照射，设定温度42℃。提前融化血清和双抗。 3、如已制好上下胶，则在微波炉中溶解1.2%Argrose下胶和0.7%Argrose上胶，降温后放入42℃水浴锅 中保持。 4、根据实验需要的量配制20%FBS+2×1640+2×PS（5种细胞配40ml），每种细胞设3个复孔。 5、铺下胶：按1:1比例使1.2%Argrose下胶和20%FBS+2×1640+2×PS混合，6孔盘每孔迅速加入1.5ml 混合液，轻轻混匀，室温静置待下胶凝固（加混合液时不能产生气泡）。对于一个6孔盘，配5ml上述培养液+5ml1.2%Argrose下胶于50ml离心管中（离心管要一直置于水浴锅中）。 6、细胞计数：取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数， 用正常培养液调整细胞密度至40×104／ml以上，这样加的体积小于100ul，不会影响其他成分的稀释程度。每孔铺1万个细胞，准备4个孔的细胞数，即4×104。 7、铺上胶：按1:1比例混合0.7%Argrose上胶和20%FBS+2×1640+2×PS，每种细胞需先配2ml（20%FBS+2 ×1640+2×PS）+2ml0.7%Argrose上胶于离心管中混匀，放入42℃水浴锅中保持。再将细胞悬液加入上述混合液中，混匀后迅速加入6孔盘中，每孔1ml。待上层琼脂凝固后，置于5%CO ，37℃，培养2－3 2周。 8、间隔2天补加200ul10%FBS+1640+1×PS，以防过于干燥。 9、计数克隆：把平皿放置在倒置显微镜下（100×），在镜下随机选择10个视野，计数视野中大于50个 克隆数(﹥0.05mm的克隆)和所有克隆数，克隆形成率=大于50个克隆数\所有克隆数×100%。每孔加入1ml的0.005%结晶紫染色1h以上，镜下拍照。 10、数据处理：每个视野的面积是1mm2,6孔盘每孔的面积是9.6cm2,则一个孔中总的克隆数=平均克隆数× 960，如果要比较﹥0.05mm的克隆的绝对值，则可以利用“每孔﹥0.05mm的克隆数/每孔总细胞克隆数”，将分母取一组作为标准，做出此组与其他组的比值系数，再分别用此系数乘以各组﹥0.05mm的克隆的绝对值，就得到总细胞克隆数相同条件下的﹥0.05mm的克隆的绝对值，可进行比较。
1：DH5a菌株 DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。E.coliDH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。可用于蓝白斑筛 选鉴别重组菌株。 基因型：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA1 2：BL21(DE3) 菌株 BL21菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ噬菌体DE3区，该区整合于BL21 的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。 基因型：F-，ompT， hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3） 3：BL21(DE3) pLysS菌株 BL21(DE3) pLysS菌株含有质粒pLysS，因此具有氯霉素抗性。PLysS含有 表达T7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋 白的表达。该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。 基因型：F-，ompT hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3，pLysS ，Camr 4：JM109菌株 JM109菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α －互补，从而显示β－半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株 基因型：recA1，endA1，gyrA96，thi－1，hsdR17，supE44，relA1，Δ（lac －proAB）/F’[traD36，proAB+，lacIq，lacZΔM15] 5：TOP10菌株 TOP10菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。 基因型：F- ，mcrAΔ(mrr-hsd RMS-mcrBC)，φ80，lacZΔM15，△lacⅩ74，recA1 ，araΔ139Δ(ara-leu)7697， galU，galK ，rps， (Strr) endA1， nupG 6：HB101菌株 HB101菌株遗传性能稳定，使用方便，适用于各种基因重组实验 基因型：supE44，hsdS20（rB-mB－），recA13，ara－14，proA2，lacY1，galK2，rpsL20，xyl-5，mtl-1，leuB6，thi-1
在科研实验中，为了获得纯的重组质粒DNA，需要允许外源DNA分子进入的细胞。经过一些特殊方法（电击法、CaCl2法）等处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的细胞，即感受态细胞。 基本制备步骤 1.从37℃培养16-20 h的平板中挑取一个单菌落(直径2-3 mm)，转到一个含有100 ml LB或SOB培养基的1L烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养3 h。一般经验，1 OD600约含有大肠杆菌DH5α 109 个/mL。 2.将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50 ml聚丙烯管中，在冰上放置10 min，使培养物冷却至0℃。 3.于4℃用Sorvall GS3特头（或与之相当的转头）以4 100 r/min离心10 min，以回收细胞。 4.倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。 5.每50 ml初始培养液用30 ml预冷的0.1 mol/LCaCl2-MgCl2溶液(80 mmol/L MgCl2，20 mmol/L CaCl2)重悬每份细胞沉淀。 6.于4℃用Sorvall GS3转头（或与之相当的转头）以41 00 r/min离心10 min，以回收细胞。 7.倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。 8.每50 ml初始培养物用2 ml用冰预冷的0.1 mol/L CaCl2(或TFB)重悬每份细胞沉淀。 9.此时，可以用新鲜制备的感受态细胞直接做转化实验，也可以将细
胞冻存于- 70
℃。 洁净是最重要的~ 无菌都无所谓，在操作台上可正常操作。离心力要注意不要超过2500g,建议1500-2000g 5min。 涂板要注意，不要觉得不匀而多次反复。 轻轻在平板上带一下感觉板上大部分地方走过即可，特别在冰箱中保存过或在温箱中温浴2小时以上的板。涂完后建议空气晾干（20-30分钟）这样会减少卫星菌落出现。 预冷是必要的。 整个过程的低温也并非特别重要，只要注意就行了，我在去残液时经常在室温倒置1min，对感受态效率提高有帮助，第一次多加一点缓冲液，我经常加至20ml，效果不错。 关于感受态的制备方法~ 关于大肠杆菌的感受态制备及转化的方法很多，最复杂的莫过于电转化，而最简单的则是将LB平板上的菌落直接挑入装有缓冲液的EP管冰箱即开始转化。对于做克隆工作的人而言，高而稳定的感受态可减轻不少麻烦。
大肠杆菌电转化感受态细胞制备 第一天： 1. 将适合菌株(如XL1-Blue, DH5α)置于LB或其他营养丰富的培养基上，在37°C下过夜培养 2. 高温灭菌大的离心瓶(250-500ml)以备第二天摇瓶用 3. 准备几瓶灭菌水(总量约1.5升)，保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用 第二天： 4. 转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB(或其他营养丰富的培养基)的1-2升挡板∑恐? 5. 37°C下剧烈振荡培养2-6小时 6. 定时监控O.D.600值(培养1小时后每半小时测定一次) 7. 当O.D.600值达到0.5-1.0时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却至少15分钟(需要的话这种方式可以存放培养液数小时) 8. 细胞在4°C 5000g下离心15分钟，弃上清液(如需要，沉淀可在4°C的10%甘油中保存一两天) 9. 用灭菌的冰水重悬浮细胞。先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中(几毫升)，然后加水稀释至离心管的2/3体积。 10. 照上面步骤重复离心，小心弃去上清液 11. 照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞 12. 离心，弃上清液 13. 用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞 14. 照上面步骤离心，小心弃去上清液(沉淀可能会很松散) 15. 用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml 16. 将细胞按150μl等份装入微量离心管，于-80°C保存 转化方法: 1. 在冰上解冻电感受态细胞添加1-10μl DNA ，冰上培育约5分钟
2. 添加1-3μl DNA ，冰上培育约5分钟 3. 转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器(无泡)中 4. 加载P1000，准备好300μl LB 或 2xYT 5. 对电穿孔容器进行脉冲(200 欧姆, 25μFd, 2.5 千伏)(检查时间常数，应该在3以上) 6. 立即添加300μl 的LB或2xYT至电穿孔容器中 7. 37°C下培养细胞40分钟至1小时以复原 大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法 大肠杆菌电转化感受态细胞制备 第一天： 1. 将适合菌株(如XL1-Blue, DH5α)置于LB或其他营养丰富的培养基上，在37°C下过夜培养 2. 高温灭菌大的离心瓶(250-500ml)以备第二天摇瓶用 3. 准备几瓶灭菌水(总量约1.5升)，保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用 第二天： 4. 转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB(或其他营养丰富的培养基)的1-2升挡板∑恐? 5. 37°C下剧烈振荡培养2-6小时 6. 定时监控O.D.600值(培养1小时后每半小时测定一次) 7. 当O.D.600值达到0.5-1.0时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却至少15分钟(需要的话这种方式可以存放培养液数小时) 8. 细胞在4°C 5000g下离心15分钟，弃上清液(如需要，沉淀可在4°C的10%甘油中保存一两天) 9. 用灭菌的冰水重悬浮细胞。先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中(几毫升)，然后加水稀释至离心管的2/3体积。 10. 照上面步骤重复离心，小心弃去上清液
注意：软琼脂克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。软琼脂培养法常用检测肿瘤细胞和转化细胞系。接种细胞的密度每平方厘米不超过35个，正常细胞在悬浮状态下不能增殖，不适用于软琼脂克隆形成试验。 1、配制100ml的1.2% Argrose和0.7%Argrose，Argrose用DNA电泳用BIOWEST REGULAR Argrose G10（4℃），溶剂用双蒸水（DDW），高压灭菌后，维持在42℃中不会凝固；配制500ml的2×1640和0.005%的结晶紫。 2、实验前，将水浴锅放入超净台内，紫外照射，设定温度42℃。提前融化血清和双抗。 3、如已制好上下胶，则在微波炉中溶解1.2%Argrose下胶和0.7% Argrose上胶，降温后 放入42℃水浴锅中保持。 4、根据实验需要的量配制20%FBS+2×1640+2×PS（5种细胞配40ml），每种细胞设3 个复孔。 5、铺下胶：按1:1比例使1.2%Argrose下胶和20%FBS+2×1640+2×PS混合，6孔盘每 孔迅速加入1.5ml混合液，轻轻混匀，室温静置待下胶凝固（加混合液时不能产生气泡）。对于一个6孔盘，配5ml上述培养液+5ml 1.2%Argrose下胶于50ml离心管中（离心管要一直置于水浴锅中）。 6、细胞计数：取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞， 作活细胞计数，用正常培养液调整细胞密度至40×104／ml以上，这样加的体积小于100ul，不会影响其他成分的稀释程度。每孔铺1万个细胞，准备4个孔的细胞数，即4×104。 7、铺上胶：按1:1比例混合0.7% Argrose上胶和20%FBS+2×1640+2×PS，每种细胞需 先配2ml（20%FBS+2×1640+2×PS）+2ml0.7% Argrose上胶于离心管中混匀，放入42℃水浴锅中保持。再将细胞悬液加入上述混合液中，混匀后迅速加入6孔盘中，每孔1ml。待上层琼脂凝固后，置于5%CO2，37℃，培养2－3 周。 8、间隔2天补加200ul 10%FBS+1640+1×PS，以防过于干燥。 9、计数克隆：把平皿放置在倒置显微镜下（100×），在镜下随机选择10个视野，计数 视野中大于50个克隆数(﹥0.05mm的克隆)和所有克隆数，克隆形成率=大于50个克隆数\所有克隆数×100%。每孔加入1ml的0.005%结晶紫染色1h以上，镜下拍照。
常用大肠杆菌感受态JM109，DH5a，BL21的区别 1：DH5a菌株 DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。E.coli DH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。 基因型：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA1 2：BL21(DE3) 菌株 该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ 噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。 基因型：F-，ompT， hsdS（rBB-mB－），gal， dcm（DE3） 3：BL21(DE3) pLysS菌株 该菌株含有质粒pLysS，因此具有氯霉素抗性。PLysS含有表达T7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表达。该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。 基因型：F-，ompT hsdS（rBB-mB－），gal， dcm（DE3，pLysS ，Camr 4：JM109菌株 该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α－互补，从而显示β－半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株 基因型：recA1，endA1，gyrA96，thi－1，hsdR17，supE44，relA1，Δ（lac－proAB）/F’[traD36，proAB+，lacIq，lacZΔM15] 5：TOP10菌株 该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。基因型：F- ，mcrAΔ(mrr-hsd RMS-mcrBC)，φ80 ，lacZΔM15，△lacⅩ74，recA1 ，araΔ139Δ(ara-leu)7697， galU ，galK ，rps， (Strr) endA1， nupG 6：HB101菌株 该菌株遗传性能稳定，使用方便，适用于各种基因重组实验 基因型：supE44，hsdS20（rB-mB－），recA13，ara－14，proA2，lacY1，galK2，rpsL20，xyl-5，mtl-1，leuB6，thi-1 7：M110或 SCS110 大多数大肠杆菌菌株中含有Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶，前者可以在GATC序列中腺嘌呤N-6位上引入甲基，后者在CCA/TGC序列的第一个胞嘧啶 C-5位置上引入甲基。常用的菌株都会产生dam,dcm，从而受到甲基化的影
大肠杆菌感受态细胞的制备 标签： tr..,Ca..,co.. 分类：细胞技术> 感受态细胞 来源： 实验管理实验概要 大肠杆菌感受态细胞的CaCl2 法制备及质粒转化 实验原理 处于对数生长期的细菌经 CaCl2 处理后接受外源 DNA 的能力显著增加。细菌处于容易吸收外源DNA 的状态叫感受态。 在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体 中，一般缺乏此种转移所必需的 mob 基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转 以移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态，摄取外源 DNA 。 转化（ Transformation）是将外源DNA 分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种 手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体 （R-,M- ），它可以容忍外源DNA 分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些 特殊方法（如电击法， CaCl2 ，RbCl(KCl) 等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生 了暂时性的改变，成为能允许外源DNA 分子进入的感受态细胞（ Compenent cells ）。进入受体细胞的 DNA 分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。 将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（Transformant ，即带有异 源 DNA 分子的受体细胞）。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2 和 RbCl(KCl) 法，RbCl(KCl) 法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2 法简便易行，且其转化效率完全可 以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油于-70 ℃保存（半年），因此CaCl2 法使用更广泛。 主要试剂 (1)0.1mol/L CaCl2溶液 (2)LB 液体培养基
大肠杆菌感受态细胞的制备实验具体步骤及详细说明 带有外源DNA 的重组质粒，在体外构建后，导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得纯的重组质粒DNA，该过程称之为转化过程。受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl 等化学试剂）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许外源DNA 的载体分子通过。 带有外源DNA 的重组质粒，在体外构建后，导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得纯的重组质粒DNA，该过程称之为转化过程。受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl 等化学试剂）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许外源DNA 的载体分子通过。 具体步骤 1、从37℃培养16-20 h的平板中挑取一个单菌落(直径2-3 mm)，转到一个含有100 ml LB或SOB培养基的1L烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养3 h。一般经验，1 OD600约含有大肠杆菌DH5α 109个/mL。 2、将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50 ml聚丙烯管中，在冰上放置10 min，使培养物冷却至0℃。 3、于4℃用Sorvall GS3特头（或与之相当的转头）以4 100 r/min离心10 min，以回收细胞。 4、倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。
5、每50 ml初始培养液用30 ml预冷的0.1 mol/LCaCl2-MgCl2溶液(80 mmol/L MgCl2，20 mmol/L CaCl2)重悬每份细胞沉淀。 6、于4℃用Sorvall GS3转头（或与之相当的转头）以41 00 r/min离心10 min，以回收细胞。 7、倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。 8、每50 ml初始培养物用2 ml用冰预冷的0.1 mol/L CaCl2(或TFB)重悬每份细胞沉淀。 9、此时，可以用新鲜制备的感受态细胞直接做转化实验，也可以将细胞冻存于- 70℃。 注意事项 1. 为达到高效转化，活细胞数务必少于108个细胞/mL，对于大多散大脑杆菌来说，这相当于OD值为0.4左右。为保证细菌培养物的生长密度不致过高，可每隔15-20 min测定OD600值来监测，用监测的时间及OD值列一个图表，以便预测培养物的OD600值到0.4的时间，当OD600值达到0.35时，收获细菌培养物。 2. 在菌株与菌株之间，OD值与每毫升中活细胞散间的关系变化很大，因此有必要通过漶量特定脑杆菌的生长培养物在生长周期的不同时相的OD600值，并
细胞xx形成实验 当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。 每个克隆含有50以上的细胞，大小在之间。集落形成率表示细胞的独立生存能力。各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测。 细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大： 一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。 实验方法： 平板集落形成实验、软xx集落形成实验 (a)平板集落形成实验：本法适用于贴壁生长的细胞和正常培养的细胞(b)软琼脂集落形成实验：本法适用于非锚着依赖性生长的细胞，如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。 平板xx形成实验基本步骤： 1、取对数生长期的各组细胞，分别用%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。 2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。 置37℃ 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。
3、经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。 4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜（低倍镜）计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。 克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100% 平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。 平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。 软xx培养xx形成试验基本步骤： (1)取对数生长期细胞，用%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用含20%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度至1×106细胞/L。然后根据实验要求作梯度倍数稀释。 (2)用蒸馏水分别制备出%和%两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40℃中不会凝固。 (3)按1:1比例使%的琼脂糖和2×DMEM培养基(含有2×抗生素和20%的小牛血清)混合后，取3mL混合液注入直径6cm平皿中(10cm平皿加7～10mL)，冷却凝固，可作底层琼脂置CO2温箱中备用。 (4)按1:1比例让%的琼脂糖和2×DMEM培养基在无菌试管中相混以后，再向管中加入的细胞悬液，充分混匀，注入铺有%琼脂糖底层平皿中，逐形成双琼脂层。 待上层琼脂凝固后，置入37℃ 5%CO2温箱中培养10～14天。
感受态细胞制备及各种 感受态的特点 Company Document number：WUUT-WUUY-WBBGB-BWYTT-1982GT
感受态细胞制备制备感受态常用的方法是电击法和CaCl2制备法，以下介绍CaCl2制备法： 1、可以从-80℃冰柜中，取出一支冻存菌株，于事先照过紫外的超净台中，用无菌的接种环轻轻蘸取菌种后，在无抗平板（由于Rocetta含有氯霉素抗性，需要涂布在氯霉素抗性的平板，后面的都是如此）上划线，并将菌种迅速放回-80℃保存，在划线板上做好相应标记，于37℃培养过夜。 2、从37℃培养过夜的新鲜平板上挑取一个单克隆，接种于2mlEP管中，37℃， 220rpm震荡培养约6个小时至对数生长中后期；将该菌悬液以1:100的比例接种于 50ml LB液体培养基（2瓶）中,37℃振荡培养小时至OD600=。 注意：接种比例不得大于1:10。 3、在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、预冷的离心管（50ml）中，在冰上放置 5~10min； 注意：划板、接种为了防止意外发生最好多划一块平板和多接一根试管，划板、接种、转接均要严格按照无菌操作。 4、4℃ 5000g离心5分钟。用预冷的去离子水洗涤沉淀，4℃ 5000g离心5分钟；Note：此步主要是为了洗去培养基中的盐等 5、沉淀加入2ml预冷的L CaCl2-15%甘油混合溶液，轻吹散，冰浴5分钟，4℃5000g 离心5分钟； 6、沉淀加入2ml预冷的L CaCl2-15%甘油混合溶液，轻吹散，即成为感受态细胞悬液。分装成50~100μl的小份，贮存于-70℃可保存半年。 含15%甘油的L CaCl2制备方法: 称取 CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌。
CaCl2感受态细胞的制备实验步骤 ?1、从新活化的E.coli DH5α平板上挑取一单菌落，接种于3～5ml LB液 体培养中，37℃振荡培养至对数生长期(12h左右)； ? 2、将该菌悬液以1:100～1:50转接于100ml LB液体培养基中，37℃振 荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔20～30min测一次OD600，至OD600为0.3～0.5时停止培养，并转装到1.5 mL离心管中； ? 3、培养物于冰上放置20min； ? 4、 0～4℃，4000g离心10min，弃去上清液，加入1 mL冰冷的 0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞, 冰浴20分钟； ?5、0～4℃， 4000g离心10min，倒净上清培养液，再用1.0 mL冰冷的 0.1mo1／L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴20min； ? 6、 0～4℃， 4000g离心10min，弃去上清液，加入100 μL冰冷的 0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，即制成了感 受态细胞悬液； ? 7、制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，如果在4℃放置 12～24h，其转化效率可以增高4～6倍；也可加入占总体积15％左右 高压灭菌过的甘油，混匀后分装于1.5ml离心管中，置于-70℃条件下， 可保存半年至一年。
CaCl2感受态细胞的制备实验步骤 1．前夜接种受体菌（DH5α或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中 37℃摇床培养过夜（约16小时）； 2 ．取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振 荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）； 3 ．将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上 操作； 4 ．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟； 5 ．4℃下3000 g冷冻离心5分钟； 6 ．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动 打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟； 7 ． 4℃下3000 g冷冻离心5分钟； 8 ．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动 打匀，使细胞重新悬浮； 9 ．细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15% - 20%甘油）后超 低温冷冻贮存备用（－70℃）。 注意事项 1．细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使 用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制。DH5α菌株OD600为0.5时细胞密度是5×107/ml）； 2 ．所有操作均应在无菌条件和冰上进行； 3 ．经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的 推移而增加，24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的 活菌数随时间延长而减少造成的）； 4 ．化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子 （如Mn 2+或Co 2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）； 5 ．所使用的器皿必须干净。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能 大大降低细菌的转化效率； 6 ．质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的DNA； 7 ．一定范围内，转化效率与外源DNA的浓度呈正比；
细胞集落形成实验方法介绍 非整倍体无限细胞系和癌细胞株中，仍然存在不同细胞亚群，它们的功能和生长特点有些差异，其中有些亚群细胞对培养环境有较大的适应性和具有较强的独立生存能力，细胞集落率高。纯化细胞群来自一个共同的祖细胞，细胞遗传性状、生物学特性相似，利于实验研究。原代培养细胞和二倍体有限细胞系，细胞集落率很低。细胞集落化培养之前，应先测定细胞集落形成率，以了解细胞在极低密度条件下的生长能力。 集落抑制率=（1-（实验组集落形成率/对照组集落形成率））×100% （一）原理 细胞集落形成率单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，称为集落或克隆。每个克隆含有50个以上的细胞，大小在0.3-1.0mm 之间。集落形成率表示细胞独立生存能力。常用方法有平板集落形成试验、软琼脂集落形成试验。 （二）实验用品 1.材料：Hela细胞。 2.器材：（直径60mm ）培养皿、细胞记数板、烧杯、吸管、离心机、离心管、废液瓶、倒置显微镜、二氧化碳培养箱、超净工作台、水浴锅。 3.试剂：Giemsa染液、0.25%胰蛋白酶消化液、血清细胞培养液、安尔碘、琼脂。 （三）方法 1.平板克隆形成试验 本法适用于贴壁生长的细胞，包括培养的正常细胞和肿瘤细胞。 (1)对指数生长期细胞，采用常规消化传代方法，制成细胞悬液。 (2)细胞悬液反复吹打，使细胞充分分散，单个细胞百分率应在95%以上。细胞记数，并用培养基调节细胞浓度，待用。 (3)根据细胞增殖能力，将细胞悬液倍比稀释。一般按照每皿含50、100、200个细胞的浓度分别接种5ml细胞悬液到培养皿（直径60mm ）中，以十字方向轻轻晃动培养皿，使细胞分散均匀。 (4)培养皿置37℃、5%CO2中培养2~3周，中间根据培养液pH变化适时更换新鲜培养液。 (5)当培养皿中出现肉眼可见克隆时，终止培养，弃去培养液，PBS液小心浸洗2次，空气干燥。甲醇固定15分钟，弃甲醇后空气干燥。用Giemsa染液染色10分钟，流水缓慢洗去染液，空气干燥。 2.软琼脂集落形成试验
全国免费电话：400-818-1148 TOP10 感受态细胞 Cat. No. JH0102-3 保存：-80℃ 组分说明 产品简介 本产品是大肠杆菌 TOP10 菌株经特殊工艺处理得到的感受态细胞，可用于 DNA 的热击转化。TOP10 是一种常用于质粒克隆的菌株，其 φ80lacZΔM15 基因产物可与载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α互补，可用于蓝白斑筛选。使用 pUC19质粒检测，转化效率可达 108，适用于高效的质粒 DNA 克隆并能保证高拷贝质粒的稳定复制。 注意事项 1.转化所有步骤均在无菌条件下操作。 2.感受态细胞应在-80℃下保存，不可多次冻融和放置时间过长，以免降低感受态细胞的转化效率。 3.包装中有0.1 ng/μl 的pUC19DNA ，供对照试验使用。 操作步骤 1.取感受态细胞置于冰浴中。一次转化感受态细胞的建议用量为50-100 μl ，可以根据实际情况分装使用。 以下实验以100 μl 感受态细胞为例。 2.待感受态细胞融化后，向感受态细胞悬液中加入目的DNA （根据实际情况加入适量的DNA ，通常100 μl 感受态细胞能够被1 ng 超螺旋质粒DNA 所饱和），用移液器轻轻吹打混匀，冰浴30分钟。 3.42℃热击90秒，迅速将离心管转移到冰浴中，冰上静置2-3分钟。 4.向每个离心管中加入900 μl 无菌的SOC 或LB 培养基（不含抗生素），混匀后置于37℃摇床，150 rpm 振荡培养45分钟使菌体复苏。 5.取100 μl 已转化的感受态细胞，加到含相应抗生素的SOC 或LB 固体琼脂培养基上，用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开，直至干燥，倒置平板，37℃培养12-16小时。 注意：1） 涂布用量可根据具体实验调整。若转化的DNA 总量较多，可取少量转化产物涂布平板；若转化的DNA 总量较少，可取200-300 μl 转化产物涂布平板。若预计的克隆数较少，可通过离心（4,000 rpm ，2分钟）后吸除部分培养液，悬浮菌体后将其涂布于平板中。 2） 新制备的固体培养基不易涂干，可将平板正置于37℃直至液体被吸收后再倒置培养。 3） 涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的转化菌落数过少，可以将剩下的菌液再涂布新培养基进行培养。 Cat. No. JH0102-3 Kit Size 10×100 μl TOP10 感受态细胞 10×100 μl Control DNA pUC19，0.1 ng/μl 10 μl
感受态细胞的制备 一、实验原理 受体细胞通过一些特殊方法（如电击法，CaCl2，MnCl2，MgCl2等化学试剂法)的处理后，使细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的状态，成为感受态细胞。 本方案介绍的方法为TSS法和KCM转化法。 二、材料及准备工作 一）材料准备
二)试剂配制 1、液体LB培养基（200ml，高压灭菌，4℃保存备用） 蛋白胨 2.0g 酵母提取物 1.0g 氯化钠（NaCl） 2.0g 2、固体LB培养基（2×100ml，高压灭菌） 蛋白胨2×1.0g 酵母提取物2×0.5g 氯化钠（NaCl）2×1.0g 琼脂粉2×1.5g 温度降低到45℃后（不烫手），取其中一瓶加入氨苄至终浓度100μg/ml（100mlLB加100μl 100mg/ml的氨苄）后铺平皿，另一瓶直接铺平皿。4℃保存备用。 3、TSS液（100ml）（有效期2周） 聚乙二醇（PEG8000）10g 终浓度10% DMSO 5ml 终浓度5%
MgCl2(1mol/L）5ml 终浓度50mmol/L LB 85ml 终浓度85% 去离子水补足100ml，0.22μm过滤器过滤后，4℃保存备用 注：聚乙二醇分子量可以为3000-8000 4、5×KCM液（10ml）（可-20℃长期保存备用） KCl（2mol/L） 2.5ml CaCl2(1mol/L) 1.5ml MgCl2(1mol/L) 2.5ml 水补足到10ml, 0.22μm过滤器过滤后，4℃保存备用（不要高压消毒） 5、氨苄青霉素（amp）（100mg/ml） 取0.5g氨苄青霉素，溶解于5ml去离子水中，0.5ml分装，-20℃ 保存备用 三）仪器设备 1、低温大容量离心机 2、恒温水浴锅 3、超净台 4、高压锅 5、37℃孵育箱 6、恒温摇床 7、制冰机 8、分光光度计
感受态细胞的制备步骤和原理 实验目的 为了获得大量的质粒作为克隆载体，我们需要将购买来的质粒通过转化的方法导入细菌的细胞内。制备出感受态的细胞，我们就可以方便的将需克隆的质粒导入其中，使其繁殖，就能获得大量质粒。本次实验的目的就是增加质粒的数量。同时，我们能掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的基本原理和实验技术方法。 实验原理及过程 实验步骤 1挑取一个JM109单菌落于3ml LB(无抗生素)培养基中，37℃，180rpm培养过夜。 [让菌复苏，进入对数期的早中期。此时更容易制得感受态细胞。] 2取0.4mL过夜培养物加入到40mL LB(无抗生素)培养基中，37℃250rpm大约2.5小时。 [减少达到所需亮的均所需繁殖的世代数，以减少菌的变 GAGGAGAGGAFFFFAFAF
异。] 3取培养物置于40mL的灭菌离心管中，冰浴10min，4000rpm 4℃离心10min，弃上清。（将所有上清倒光，可以将离心管倒过来） [使细菌的生长停止，代谢减慢。因为这时已经没有培养基了，如果细菌仍有很高的代谢效率，则有大量细菌死亡。] 4菌体重悬于10mL 100mmol/L冰冷CaCl2中，轻吹，4℃30min，4000rpm离心5min弃上清。 [ 细菌处于0度，CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，外源DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸盐混合物黏附于细胞表面（羟基来源于细胞壁上的糖，磷酸来源于DNA），经短时间420C热激处理，促进细胞吸收DNA复合物。（一定要轻吹，这时细胞壁打开，十分脆弱）] 5菌体重悬于1mL 100mmol/L冰冷的CaCl2中，轻吹，用于转化。 [除去所有的LB以及细胞破损后释放出来的细胞内含物。防止细胞分裂，以致大量细胞死亡。（一定要轻吹，这时细 胞壁打开，十分脆弱）] GAGGAGAGGAFFFFAFAF
感受态细胞的制备步骤和原理 实验目的为了获得大量的质粒作为克隆载体，我们需要将购买来的质粒通过转化的方法导入细菌的细 胞内。制备出感受态的细胞，我们就可以方便的将需克隆的质粒导入其中，使其繁殖，就能 获得大量质粒。本次实验的目的就是增加质粒的数量。同时，我们能掌握大肠杆菌感受态细 胞的制备及转化的基本原理和实验技术方法。实验原理及过程实验步骤 1挑取一个JM109单菌落于3ml LB（无抗生素）培养基中，37C, 180rpm培养过夜。［让菌复苏， 进入对数期的早中期。此时更容易制得感受态细胞。］ 2取0.4mL过夜培养物加入到40mL LB（无抗生素）培养基中，37C 250rpm大约2.5小时。 ［减少达到所需亮的均所需繁殖的世代数，以减少菌的变异。］ 3取培养物置于40m L的灭菌离心管中，冰浴10min , 4000rpm 4C离心10min，弃上清。（将所 有上清倒光，可以将离心管倒过来） ［使细菌的生长停止，代谢减慢。因为这时已经没有培养基了，如果细菌仍有很高的代谢效率，则有大量细菌死亡。］ 4菌体重悬于10mL 100mmol/L 冰冷CaCl2中，轻吹，4 C 30min , 4000rpm离心5min弃上 ［细菌处于0度，CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，外源DNA形成抗DNA酶的羟基 -钙磷 酸盐混合物黏附于细胞表面（羟基来源于细胞壁上的糖，磷酸来源于DNA ）,经短时 间420C热激处理，促进细胞吸收DNA复合物。（一定要轻吹，这时细胞壁打开，十分脆弱）］ 5 菌体重悬于1mL 100mmol/L冰冷的CaCl2中，轻吹，用于转化。 ［除去所有的LB以及细胞破损后释放出来的细胞内含物。防止细胞分裂，以致大量细胞死亡。 （一定要轻吹，这时细胞壁打开，十分脆弱）］ 6取感受态细胞100uL,加入2uLpET-21a质粒，冰浴30 min受体菌：感受态细胞100uL, 加入2 uL 无菌双蒸水阴性对照：0.1mol/LCaCl2溶液100uL,加入2 uL阴性对照 ［第一个阴性对照是为了验证LB中的抗生素有活性；第二个阴性对照是为了验证CaCl2溶 液和pET-21a质粒未被污染。］［冰浴是为了降低细胞代谢率，防止细胞大量死亡。］ 7热激42度，90s 【在低温处理后，热激，可以使细胞壁热胀冷缩，再低温，使细胞壁上黏附的质粒进入细胞体内。】8冰浴2 min 9加入800 uL无抗生素的LB, 37 C复苏1h 【用LB复苏细胞，使细胞恢复活力，从而使细胞中的质粒表达抗抗生素的基因，只有这样才能使 转化成功的细菌在有抗生素的LB平板上生长。】 10取100ul细胞直接在含50ug/mL Carbenicillin（短节西林）的LB培养基上铺平板，将平皿放置 37 oC温箱30min至液体被吸收。倒置平皿37 oC培养过夜，出现菌落。 【这些菌落为转化成功的菌落，而对照组应该没有菌落。在目的菌落的旁边有可能出现卫星菌落，这是因为亩的菌落的抗性基因似的菌落周围的抗生素失效，长出了转化为成功的菌 落。用短节西林因其对酸稳定、不易被细菌降解，所以可以降低卫星菌落的数量。 因为抗生素高温易失活，所以应等到LB600C时（热而不烫），加入抗生素。】