临床微生物检测的基因同源性分析 医院感染的流行病学研究是临床微生物学工作者的重要课题，在医院感染监测的研究中，一个很重要的问题就是如何确定感染途径和传播途径，以采取有效预防和控制措施，从而防止医院感染或者暴发流行，因此对微生物鉴定和菌株同源性分析提出了更高的要求。 目前，传统的细菌鉴定和同源性分析技术已不能很好地满足医院感染诊断和流行病学调查的需要，从型、亚型、株，甚至分子水平上去认识细菌变得愈来愈重要了。近年来分子生物学的理论和技术在细菌感染诊断中的渗透和广泛应用，使得细菌鉴定、耐药基因的检测、分子流行病学调查变得更加准确、简洁和快速。细菌DNA同源性分析技术如脉冲场凝胶电泳、聚合酶链反应、DNA探针杂交以及序列分析等方法是目前在分子水平上分析细菌的主要手段，它在鉴定细菌感染的爆发、确定院内交叉感染、感染病原菌之间的基因同源性等方面有着重要的作用，本文将对常用基因同源性分析方法的机理和过程做简要综述。 一、质粒分型(Plasmid profile assay)： 1、原理： 质粒是可移动的染色体外元件，可以自发丢失或者被宿主稳定地获得，因此流行病学上相关的分离菌株有可能表现出不同的质粒图谱。把质粒提取出来，进行常规的琼脂糖电泳分析，就可以知道分离菌株携带质粒的大小和数目。 2、实验过程：a.质粒抽提；b.0.8%琼脂糖电泳；c.EB染色、凝胶成像。 3、实验方法的评价： 优势： a.步骤比较简单，对实验仪器要求不高。 b.在评价那些从局限的时间和地点（如一个医院中的急性爆发）分离出来的菌株非常有效。 缺点： a.实验结果的重复性不好。 b.分辨力不高。 二、染色体DNA的限制性内切核酸酶分析 (Restriction Endonuclease Assay REA) 1、原理： 限制性内切核酸酶（REA）在特异的核酸识别序列切割DNA，DNA被消化后，所得到的限制性片段的数目和大小是由酶的识别位点和DNA的组成共同决定的。在传统的限制性内切核酸酶分析中，人们用含有相对多的限制性位点的内切核酸酶消化细菌的DNA，这样就会得到成百上千条长度在0.5-50Kb范围内的DNA 片段。恒定的电场琼脂糖电泳，可以根据分子质量的大小将这些DNA片段分开，然后通过EB染色并在紫外灯下观察其图谱。同一种的不同分离菌株的DNA序列的变异可造成限制性位点数目和分布的变化，所以可以导致其REA图谱出现差异。 2、实验流程：a.染色体DNA抽提；b.限制性内切酶消化DNA（主要是Hind III）； c.0.7%琼脂糖电泳； d.EB 染色、凝胶成像。
安徽农业大学 综述性论文 病毒基因序列的同源性比较的应用The Application of Homology Comparison of Viruses Gene 研究生：孙秀梅 学号：11720717 指导教师：潘玲副教授 专业名称：基础兽医学 所在学院：动物科技学院 2011年11月
病毒基因序列的同源性比较的应用 摘要现代分子生物学技术的不断进步和革新极大地提高了人们分析和比较基因序列的能力。这种趋势对病毒学的影响很深远，产生了一门叫做病毒分子生物学的学科，是用现代分子生物学的新理论、新技术和新方法对病毒基因组的结构和功能，基因组的复制、表达和调控，病毒与宿主的相互作用等进行研究的一门学科。病毒分子生物学对现代分子生物学的研究发展做出了重大贡献。它的研究成果揭示了病毒的感染、致病的分子本质，为病毒引起疾病的诊断、预防和治疗提供了重大的理论基础，促进了基因工程疫苗和抗病毒类药物的研制和发展。 DNA序列分析是分子生物学重要的基本技术。无论从病毒基因中筛选的特定基因或经PCR法扩增的基因，最终均需进行核酸序列分析，可藉以了解基因的精细结构，获得其限制性内切酶图谱，比较病毒基因的同源性，进而分析基因的序列对形态功能等各生物学方面的影响。 目前采用的测序技术和策略存在着许多难以逾越的瓶颈问题。以鸟枪法为主的随机测序方法为例，由于并行化程度大大提高，可以较快地对一个基因组完成测序，因此目前被大部分基因组测序中心所采用。随着时间的推移，DNA测序技术无疑将日臻完善，这一便捷精确的方法将成为人们解决生物学问题的重要手段。对本文就病毒基因序列的同源性比较这一方面的状况进行下综述。 关键词毒基因全基因序列同源性比较 我们今天所讲的基因同源性是指不同的DNA分子由于进化上的原因，其核苷酸序列具有相同来源而具有的某些共性，表现在相应的位点具有相同的或相似的核苷酸残基。基因序列分析是分子生物学重要的基本技术。无论从病毒基因中筛选的特定基因或经PCR法扩增的基因，最终均需进行核酸序列分析，可藉以了解基因的精细结构，获得其限制性内切酶图谱，比较病毒基因的同源性，进而分析基因的序列对形态功能等各生物学方面的影响。随着基因大规模自动测序的迅猛发展，序列数据爆炸性积累，以及生物信息学的产生与发展，对基因和蛋白序列资料中各种类型信息进行识别、储存、分析、模拟和分析等方面都得到了很大程度的提高，对于病毒基因序列的同源性比较及分析都有很大的帮助。 1.病毒基因组的研究进程 1.1.病毒的发展简史 关于病毒早在公元前1400年，古埃及象形文字就描述了一位司祭人员的病状是典型的脊髓灰质炎，即小儿麻痹症，这可能是对病毒学的最早记载[1，2]。病毒学也随着现代生物技术的发展而发展，从1953年开始，人们沿着“病毒结构蛋白—基因组核酸—非结构蛋白”的路线研究病毒的侵染、致病、复制、遗传、变异的生化及分子机理，从而对最简单的生物本质有所了解[3]。 不得不提的是，20世纪的下半叶是发现病毒的黄金时代，1957年，马动脉炎病毒和导致牛病毒性腹泻的病毒（一种瘟病毒）被发现；1963年，巴鲁克·塞缪尔·布隆伯格发现了乙型肝炎病
全基因组关联分析(Genome-wide association study;GWAS)是应用基因组中 数以百万计的单核苷酸多态性(single nucleotide ploymorphism ，SNP)为分子 遗传标记，进行全基因组水平上的对照分析或相关性分析，通过比较发现影响复杂性状的基因变异的一种新策略。 随着基因组学研究以及基因芯片技术的发展，人们已通过GWAS方法发现并鉴定了大量与复杂性状相关联的遗传变异。近年来，这种方法在农业动物重要经济性状主效基因的筛查和鉴定中得到了应用。 全基因组关联方法首先在人类医学领域的研究中得到了极大的重视和应用，尤其是其在复杂疾病研究领域中的应用，使许多重要的复杂疾病的研究取得了突破性进展，因而，全基因组关联分析研究方法的设计原理得到重视。 人类的疾病分为单基因疾病和复杂性疾病。单基因疾病是指由于单个基因的突变导致的疾病，通过家系连锁分析的定位克隆方法，人们已发现了囊性纤维化、亨廷顿病等大量单基因疾病的致病基因，这些单基因的突变改变了相应的编码蛋白氨基酸序列或者产量，从而产生了符合孟德尔遗传方式的疾病表型。复杂性疾病是指由于遗传和环境因素的共同作用引起的疾病。目前已经鉴定出的与人类复杂性疾病相关联的SNP位点有439 个。全基因组关联分析技术的重大革新及其应用，极大地推动了基因组医学的发展。(2005年, Science 杂志首次报道了年龄相关性视网膜黄斑变性GWAS结果,在医学界和遗传学界引起了极大的轰动, 此后一系列GWAS陆续展开。2006 年, 波士顿大学医学院联合哈佛大学等多个研究机构报道了基于佛明翰心脏研究样本关于肥胖的GWAS结果(Herbert 等. 2006);2007 年, Saxena 等多个研究组联合报道了与2 型糖尿病( T2D ) 关联的多个位点, Samani 等则发表了冠心病GWAS结果( Samani 等. 2007); 2008 年, Barrett 等通过GWAS发现了30 个与克罗恩病( Crohns ' disrease) 相关的易感位点; 2009 年, W e is s 等通过GWAS发现了与具有高度遗传性的神经发育疾病——自闭症关联的染色体区域。我国学者则通过对12 000 多名汉族系统性红斑狼疮患者以及健康对照者的GWAS发现了5 个红斑狼疮易感基因, 并确定了4 个新的易感位点( Han 等. 2009) 。截至2009 年10 月, 已经陆续报道了关于人类身高、体重、 血压等主要性状, 以及视网膜黄斑、乳腺癌、前列腺癌、白血病、冠心病、肥胖症、糖尿病、精神分 裂症、风湿性关节炎等几十种威胁人类健康的常见疾病的GWAS结果, 累计发表了近万篇 论文, 确定了一系列疾病发病的致病基因、相关基因、易感区域和SNP变异。) 标记基因的选择： 1)Hap Map是展示人类常见遗传变异的一个图谱, 第1 阶段完成后提供了 4 个人类种族[ Yoruban ,Northern and Western European , and Asian ( Chinese and Japanese) ] 共269 个个体基因组, 超过100 万个SNP( 约1
1、进入网页：https://www.doczj.com/doc/de10432526.html,/BLAST/ 2、点击Search for short, nearly exact matches 3、在search栏中输入引物系列： 注：文献报道ABCG2的引物为5’-CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-3’; 5’-TGCCCATCACAACATCATCT-3’ （1）输入方法可先输入上游引物，进行blast程序，同样方法在进行下游引物的blast程序。 这种方法叫繁琐，而且在结果分析特异性时要看能与上游引物的匹配的系列，还要看与下游引物匹配的系列——之后看两者的交叉。
（2）简便的做法是同时输入上下游引物：有以下两种方法。输入上下游引物系列都从5’——3’。 A、输入上游引物空格输入下游引物 B、输入上游引物回车输入下游引物 4、在options for advanced blasting中： select from 栏通过菜单选择Homo sapiens Expect后面的数字改为10
5、在format中： select from 栏通过菜单选择Homo sapiens Expect后面的数字填上0 10
6、点击网页中最下面的“BLAST！” 7、出现新的网页，点击Format！
8、等待若干秒之后，出现results of BLAST的网页。该网页用三种形式来显示blast的结果。（1）图形格式： 图中①代表这些序列与上游引物匹配、并与下游引物互补的得分值都位于40～50分 图中②代表这些序列与上游引物匹配的得分值位于40～50分，而与下游引物不互补 图中③代表这些序列与下游引物互补的得分值小于40分，而与上游引物不匹配 通过点击相应的bar可以得到匹配情况的详细信息。
同源性分析标准操作规程 持有部门：检验科 制定部门：丰都县人民医院医院感染管理科执行时间： 2013年11月1日 一、同源性分析的应用 包括感染暴发的判断，感染病原菌的确定及感染源的寻找。 二、基本方法 1．细菌的表型特征分型技术(如血清型、耐药表型等)。 2．基因分型技术(如．PFGE、Rep—PCR、AFLP等)。 三、操作步骤 (一)表型分型(血清型、耐药表型) 1．标本孵育：从患者感染部位采集标本，并接种于相应培养基(培养瓶)中孵育。 2．分离菌种：分离病原菌(细菌或真菌)，并鉴定细菌(真菌)种类。 3．血清分型：如可能则对同种细菌进行血清分型，如军团菌等。 4．药敏试验：根据细菌(真菌)种类选择药敏卡(纸片)，进行药敏试验。 5．结果分析：分析血清型和药敏谱，如结果相同或药敏相差不大则提示有同源性。 (二)基因分型(PFGE) 1．菌栓制备：将细菌悬液与2％低熔点琼脂糖凝胶混合，制备菌栓。 2．细菌消化：分别用含溶菌酶和(或)蛋白酶K的裂解液对菌栓进行消化。 3．洗涤菌栓：可用无菌水反复清洗或PMSF中和多余的蛋白酶K。 4．酶切：按照各种不同限制性内切酶的说明进行酶切。 5．制胶：用PF(讵电泳凝胶模具制备：PF(逼级琼脂糖凝胶。 6．电泳：根据不同细菌酶切片段的大小选择适当的脉冲参数，进行电泳。 7．凝胶成像：胶块染色后在凝胶成像仪下成像。 8．结果分析：根据Tenover等制定的标准对凝胶图像进行分析，判断菌株之间的同源性。 四、注意事项 1．不同的分型方法，在分型能力、重复性、分辨能力、操作和成本等方面都不尽相同，可根据情况进行选择。 2．表型分型方法的分辨能力普遍比基因分型方法低，但简便、快速，适用于对感染暴发的初筛。
全基因组关联分析(GWAS)解决方案 ※ 概述 全基因组关联研究（Genome-wide association study，GWAS）是用来检测全基因组范围的遗传变异与 可观测的性状之间的遗传关联的一种策略。2005年，Science杂志报道了第一篇GWAS研究——年龄相关性黄 斑变性，之后陆续出现了有关冠心病、肥胖、2型糖尿病、甘油三酯、精神分裂症等的研究报道。截至2010年 底，单是在人类上就有1212篇GWAS文章被发表，涉及210个性状。GWAS主要基于共变法的思想，该方法是 人类进行科学思维和实践的最重要工具之一；统计学研究也表明，GWAS很长时期内都将处于蓬勃发展期（如 下图所示）。 基因型数据和表型数据的获得，随着诸多新技术的发展变得日益海量、廉价、快捷、准确和全面：如 Affymetrix和Illumina公司的SNP基因分型芯片已经可以达到2M的标记密度；便携式电子器械将产生海量的表型 数据；新一代测序技术的迅猛发展，将催生更高通量、更多类别的基因型，以及不同类别的高通量表型。基于 此，我们推出GWAS的完整解决方案，协助您一起探索生物奥秘。 ※ 实验技术流程 ※ 基于芯片的GWAS Affymetrix公司针对人类全基因组SNP检测推出多个版本检测芯片，2007年5月份，Affymetrix公司发布了 人全基因组SNP 6.0芯片，包含90多万个用于单核苷酸多态性（SNP）检测探针和更多数量的用于拷贝数变化（CNV）检测的非多态性探针。因此这种芯片可检测超过180万个位点基因组序列变异，即可用于全基因组 SNP分析，又可用于CNV分析，真正实现了一种芯片两种用途，方便研究者挖掘基因组序列变异信息。 Illumina激光共聚焦微珠芯片平台为全世界的科研用户提供了最为先进的SNP（单核苷酸多态性）研究平 台。Illumina的SNP芯片有两类，一类是基于infinium技术的全基因组SNP检测芯片（Infinium? Whole Genome Genotyping），适用于全基因组SNP分型研究及基因拷贝数变化研究，一张芯片检测几十万标签SNP位点，提 供大规模疾病基因扫描(Hap660,1M)。另一类是基于GoldenGate?特定SNP位点检测芯片，根据研究需要挑选SNP位点制作成芯片(48-1536位点)，是复杂疾病基因定位的最佳工具。 罗氏NimbleGen根据人类基因组序列信息设计的2.1M超高密度CGH芯片，可以在1.1Kb分辨率下完成全基 因组检测，可有效检测人基因组中低至约5kb大小的拷贝数变异。
相似性度量在基因表达聚类分析中的应用研究 摘要：聚类分析是基因表达数据分析研究的主要技术之一，其算法的基本出发点在于根据对象间相似度将对象划分为不同的类，选择适当的相似性度量准则是获得有效聚类结果的关键。采用预处理过的基因数据集在不同相似性度量准则下进行的不同聚类算法的 聚类分析，并得到聚类结果评价。其中算法本身的缺陷及距离相似性度量的局限性都是影响结果评价的因素，为了获得更有效的聚类结果，改进相关聚类算法并提出了一种比例相似性度量准则。 关键词：dna微阵列；聚类分析；相似性度量；基因表达 dna 微阵列(dna microarray) 技术的日益成熟导致了基因表达数据不断扩大,尤其在近十几年内更以指数形式增长。如何分析和处理大量的基因表达数据，从中提取有用的生物学或医学信息，已成为后基因组时代研究的瓶颈［12］。由于基因芯片产生巨量的表达谱数据，数据挖掘技术已经被广泛的应用到基因表达谱的许多方面，并取得成功。聚类分析是基因表达数据分析研究的主要技术之一［23］，并且作为一种有效的数据分析工具, 已广泛地应用于图像处理、信息检索、数据挖掘等领域。 目前，作为研究基因表达数据的主要技术之一的聚类分析算法有很多种，如分层聚类(hierarchical clustering)，k (k_means clustering)，自组织映射(self organizing maps，soms)，主成分分析(principal component analysis，pca)等等。但由于
不同聚类算法，甚至同一聚类算法使用不同参数，一般都会产生不同的聚类结果。因此，在对数据处理过的基因表达矩阵聚类分析时，选择合适的聚类相似性准则至关重要，同时也是获得合理、精确的聚类结果的关键。 1dna微阵列 dna微阵列（dna microarray）,也叫基因芯片。它将几十个到上百万个不等的称之为探针的核苷酸序列固定在微小的（约1 cm2）玻璃或硅片等固体基片或膜上，该固定有探针的基片就称之为dna 微阵列。 1.1基因表达数据的获得和表示 在不同的实验环境条件或是不同的时间点，通过对基因芯片的扫描，可以得到不同的实验数据，所以这些数据是基因在一定实验条件下或一段时间内的表达情况。经过对这些数据表达进行预处理和标准化后，产生得到的微阵列数据也就是基因表达数据。 微阵列基因表达数据主要为数值型，并以矩阵的方式存储，“行”为各个基因在不同环境条件下或不同时间点的表达情况，“列”是同一环境或时间下一个样本所有基因的表达谱。每一个元素代表第i个基因在第j个样本中的表达水平。 1.2基因数据的研究现状 与已经发展了几十年的结构基因组学相比,基因表达谱的生物信息学仅处于起步阶段。现阶段基因芯片所遇到的挑战并不在于表达
4、生物信息学分析 通过核苷酸序列数据库和基因序列同源性在线分析途径初步对Rv2029c基因进行分类整理。由于结核分枝杆菌耐利福平野生株与核苷酸序列数据库KEGG GENES中的结核分枝杆菌标准株H37Rv的匹配率为100%，以下对基因的分析按照结核分枝杆菌标准株H37Rv的数据库信息进行，即完全匹配的1020bp长度序列（本次提取基因中包含上下游引物等序列，较长，1346bp）。 4.1基本信息 表1 基因基本信息 4.2基因组信息 表2 基因组信息
5、PLN02341（PfkB型碳水化合物激酶家族蛋白），位点208-294 6、PTZ0029（核糖激酶），位点205-301 药物靶点1、同源基因没有药物靶点 2、非同源但序列相似基因没有药物靶点 图3 蛋白结构域 4.3蛋白表达 4.3.1 二级结构分析 预测结果显示，PfkB蛋白的二级结构中β转角占46.61%，α螺旋占33.63%，β折叠占19.76%。转角结构和螺旋结构构成了结核分枝杆菌PfkB蛋白二级结构的骨架。
图4 蛋白二级结构 4.3.2 跨膜区分析 Tuberculist跨膜蛋白预测结果表明：蛋白长度339aa，预测跨膜蛋白数0。 图5 蛋白跨膜区分析 4.3.3 信号肽预测 Predict Protein分析表明PfkB蛋白氨基酸残基没有信号肽，由此推断此蛋白不包含信号肽，不是分泌型蛋白质。
图6 蛋白信号肽预测 4.3.4 疏水性分析 分析结果显示，蛋白最大疏水指数为2.411，最小疏水指数为-2.372。
图7 蛋白疏水性分析 4.3.5 DNA同源性分析 表3 基因同源性分析 菌株序列覆盖 率 E值一致性 Mycobacterium tuberculosis strain Beijing-like, complete genome 100% 0.0 100% Mycobacterium bovis subsp. bovis AF2122/97 complete genome 100% 0.0 100% Mycobacterium tuberculosis 18b genome 100% 0.0 100% Mycobacterium tuberculosis H37RvSiena, complete genome 100% 0.0 100% Mycobacterium tuberculosis str. Kurono DNA, complete genome 100% 0.0 100% Mycobacterium tuberculosis 49-02 complete 100% 0.0 100%
浙江农业学报ＡｃｔａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｅＺｈｅｊｉａｎｇｅｎｓｉｓ?２０１９?３１(１):９８－１０３ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｚｊｎｙｘｂ.ｃｎ陈炫?张天烨?羊健?等.小麦ＴａｅＥＦ１β基因的克隆二同源性及表达分析[Ｊ].浙江农业学报?２０１９?３１(１):９８－１０３. ＤＯＩ:１０ ３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１００４￣１５２４ ２０１９ ０１ １３ 收稿日期:２０１８￣０３￣２５ 基金项目:国家自然科学基金(３１５０１６０)?国家农业产业体系(ＣＡＲＳ￣３￣１)?国家小麦转基因专项(２０１６ＺＸ０８００２００１) 作者简介:陈炫(１９９２ )?女?陕西咸阳人?硕士研究生?主要从事植物病理学研究?Ｅ￣ｍａｉｌ:ｖｉｖｉａｎｃｃｘ＠１６３.ｃｏｍ?通信作者?陈剑平?Ｅ￣ｍａｉｌ:ｊｐｃｈｅｎ２００１＠１２６.ｃｏｍ小麦ＴａｅＥＦ１β基因的克隆二同源性及表达分析 陈一炫１?张天烨１?羊一健２?张恒木２?陈剑平２?? (１.浙江农林大学林业与生物技术学院?浙江杭州３１１３００?２.浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所?浙江杭州３１００２１) 摘一要:真核翻译延伸因子(ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｅｌｏｎｇａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ?ｅＥＦｓ)是一种重要的多功能调控蛋白?ｅＥＦ１β是ｅＥＦ１的组成部分?在蛋白质生物合成过程中发挥着重要的作用?本文通过ＲＴ￣ＰＣＲ扩增克隆小麦(ＴｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍＬ.)的ｅＥＦ１β基因?并命名为ＴａｅＥＦ１β?氨基酸同源性分析发现?ＴａｅＥＦ１β具有高度保守性?且其保守结构域位于１３７~２２６ａａ处?ｑＲＴ￣ＰＣＲ结果表明?中国小麦花叶病毒(Ｃｈｉｎｅｓｅｗｈｅａｔｍｏｓａｉｃｖｉ￣ｒｕｓ?ＣＷＭＶ)侵染小麦植株后?可以诱导ＴａｅＥＦ１β基因转录水平的上调表达?另外?本文也进一步分析了ＴａｅＥＦ１β基因在小麦根二茎二叶的表达水平和ＣＷＭＶ侵染不同时间点的表达情况? 关键词:真核翻译延伸因子?中国小麦花叶病毒?同源性分析 中图分类号:Ｓ４３５ １２文献标志码:Ａ文章编号:１００４￣１５２４(２０１９)０１￣００９８￣０６Ｇｅｎｅｃｌｏｎｉｎｇ?ｈｏｍｏｌｏｇｙａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆＴａｅＥＦ１βｉｎＴｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍＬ.ＣＨＥＮＸｕａｎ１?ＺＨＡＮＧＴｉａｎｙｅ１?ＹＡＮＧＪｉａｎ２?ＺＨＡＮＧＨｅｎｇｍｕ２?ＣＨＥＮＪｉａｎｐｉｎｇ２?? (１.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ?ＺｈｅｊｉａｎｇＡ＆ＦＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ?Ｈａｎｇｚｈｏｕ３１１３００?Ｃｈｉｎａ?２.ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＶｉｒｏｌｏ￣ｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ?ＺｈｅｊｉａｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ?Ｈａｎｇｚｈｏｕ３１００２１?Ｃｈｉｎａ) Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｅｌｏｎｇａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ(ｅＥＦｓ)ｉｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｐｒｏｔｅｉｎ.ｅＥＦ１βｗａｓｓｕｂ￣ｕｎｉｔｏｆｔｈｅｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｅｌｏｎｇａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ￣１(ｅＥＦｓ￣１)ｃｏｍｐｌｅｘａｎｄｐｌａｙｅｄａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｐｒｏｔｅｉｎｂｉｏ￣ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ.ＴｈｅｅＥＦ１βｇｅｎｅｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｃｌｏｎｉｎｇｗｉｔｈＲＴ￣ＰＣＲｆｒｏｍｗｈｅａｔａｎｄｎａｍｅｄａｓＴａｅＥＦ１β.ＴｈｅａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＴａｅＥＦ１βｗｅｒｅｈｉｇｈｌｙｃｏｎｓｅｒｖｅｄａｎｄｔｈｅｃｏｎｓｅｒｖｅｄｄｏｍａｉｎｗａｓｌｏｃａｔｅｄｉｎ１３７￣２２６ａａ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｑＲＴ￣ＰＣＲｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＴａｅＥＦ１βｗｅｒｅｕｐ￣ｒｅｇｕｌａｔｅｄｉｎｔｈｅＣＷＭＶ￣ｉｎｆｅｃｔｅｄｐｌａｎｔｓ.Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ?ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＴａｅＥＦ１βｉｎｔｈｅｓｔｅｍｓ?ｌｅａｖｅｓａｎｄｒｏｏｔｓｏｆｗｈｅａｔａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｔａｇｅｓｏｆＣＷＭＶｉｎｆｅｃｔｉｏｎｗａｓａｌｓｏｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｑＲＴ￣ＰＣＲ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｅｌｏｎｇａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ?Ｃｈｉｎｅｓｅｗｈｅａｔｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ?ｈｏｍｏｌｏｇｙａｎａｌｙｓｉｓ 一一真核翻译延伸因子(ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｅ￣ｌｏｎｇａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ?ｅＥＦｓ)最早作为一个对噬菌体Ｑβ 的依赖于ＲＮＡ的ＲＮＡ聚合酶(ＲＮＡ￣ｄｅｐｅｎｄｅｎｔＲＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ?ＲｄＲｐ)活性具有重要作用的辅助因子被发现并鉴定[１]?在真核细胞中包括３类延伸因子?分别为ｅＥＦ１α(ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｅｌｏｎｇａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ１α)二ｅＥＦ１β和ｅＥＦ２[２]?ＥＦ１β在真核生物中的结构比在细菌中更复杂?该蛋白由ＥＦ１β￣ａｌｐｈａ二ＥＦ１β￣ｇａｍｍａ和ＥＦ１β￣ｂｅｔａ三个亚基组成?在蛋白质的合成过程中?ｅＥＦ１β主要作为
全基因组关联分析（Genome-wide association study,GWAS) 是一种对全基因组范围内的常见遗传变异: 单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism , SNP) 进行总体关联分析的方法, 即在全基因组范围内选择遗传变异进行基因分型, 比较病例和对照间每个变异频率的异差, 计算变异与疾病的关联强度, 选出最相关的变异进行验证并最终确认与疾病相关。 单核苷酸多态性（英语：Single Nucleotide Polymorphism，简称SNP，读作/snip/）指的是由单个核苷酸—A,T,C或G的改变而引起的DNA序列的改变，造成包括人类在内的物种之间染色体基因组的多样性。 在后GWAS时代，利用已有的GWAS数据在多个人群间进行meta分析已经成为一种常用的分析手 段，这不仅可以进一步扩大样本量，更重要的是提高了统计效能。GWAS meta分 析已经成功应该用在多种复杂疾病的遗传学研究，发现一批新的易感基因。 全基因组关联水平（P_meta < 5.0×10-8）罕见等位基因（MAF < 5％）， 基因型填补（imputation）：依据已分型位点的基因型对数据缺失位点或未分型位点进行基因型预测的方法。可用于精细定位（fine-mapping），填补已确认的关联位点附近的位点，以便评价相邻SNP位点的关联证据。加快复杂性疾病易感基因的定位。 连锁与连锁不平衡（linkage disequilibrium,LD）: 连锁：如果同一条染色体上2个位点的位置比较近，则这2个位点上的等位基因倾向于一起传递给下一代。 连锁不平衡：又称等位基因关联，是指同一条染色体上，两个等位基因间的非随机相关。即当位于同一条染色体上的两个等位基因同时存在的概率大于人群中因随机分布而同时出现的概率时，就称这两个位点处于LD状态。所谓的连锁不平衡是一种遗传标记的非随机性组合。比如，一个基因有两个位点，一个位点有两种基因型，那么子代应该有2的2次方，即4种基因型。但是发现子代的基因型往往会少于4种，这就是连锁不平衡现象。这是由于两个位点距离较近引起的两个位点上的等位基因经常同时出现在同一染色体上。
基因表达及其分析技术 生命现象的奥秘隐藏在基因组中，对基因组的解码一直是现代生命科学的主流。基因组学研究可以说是当今生命科学领域炙手可热的方向。从DNA 测序到SNP、拷贝数变异(copy number variation , CNV)等DNA多态性分析，到DNA 甲基化修饰等表观遗传学研究，生命过程的遗传基础不断被解读。 基因组研究的重要性自然不言而喻。应该说，DNA 测序技术在基因组研究 中功不可没，从San ger测序技术到目前盛行的新一代测序技术(Next Gen eration Seque ncing NGS)到即将走到前台的单分子测序技术，测序技术是基因组解读最重要的主流技术。而基因组测序、基因组多态性分析、DNA 甲基化修饰等表观遗传分析等在基因组研究中是最前沿的课题。但是基因组研究终究类似“基因算命”，再清晰的序列信息也无法真正说明一个基因的功能，基因功能的最后鉴定还得依赖转录组学和蛋白组学，而转录作为基因发挥功能的第一步，对基因功能解读就变得至关重要。声称特定基因、特定SNP、特定CNV、特定DNA修饰等与某种表型有关，最终需要转基因、基因敲除、突变、 RNAi 、中和抗体等技术验证，并必不可少要结合基因转录、翻译和蛋白修饰等数据。 基因实现功能的第一步就是转录为mRNA或非编码RNA，转录组学主要研究基因转录为RNA 的过程。在转录研究中，下面几点是必须考虑的： 1，基因是否转录(基因是否表达)及基因表达水平高低(基因是低丰度表达还是中、高丰度表达)。特定基因有时候在一个细胞中只有一个拷贝的表达，而表达量会随细胞类型不同或发育、生长阶段不同或生理、病理状态不同而改变。因此任何基
利用系统进化分析软件对序列进行同源性分析 1.0目的 1.1为了保持国际上各个耐药性实验室的高检验水准，进行分子进化分 析是有很重要作用的。它不仅可以保证流行病学目的顺利实现，而 且有利于发现检测阶段可能产生的潜在的交叉污染。 1.2利用此软件进行分析所得的信息对于进行艾滋病毒在人群中传播 的流行病学研究具有十分重要的意义。 1.3通过对实验室之前分析的数据与当前数据进行比较，可以发现在此 前实验过程中由于标本处理不当所导致的潜在的实验室污染。 1.4对于确保得到高质量的实验结果并及时发现可能出现在实验室里 的问题具有重要意义。 2.0仪器设备 2.1计算机一台。 2.2Windows 95以上的操作系统。 2.3BioEdit 以及MEGA 4 分析软件。 2.3.1均为免费软件，可以从互联网上下载，在计算机上进行安装。 3.0操作过程 3.1局限及要求 3.1.1经过序列编辑软件拼接处理后的txt文件或fasta文件均可， 例如ChromasPro软件。 3.1.2可以在MEGA上分析的分子序列或距离矩阵数据。 3.1.3Mega 4软件只能将长度相等的序列转换为MEGA输出文 件，因此，任何多序列文件必须通过BioEdit软件进行对齐 修剪，然后才能进入通过Mega软件转换成*.meg格式进行 分析。 3.1.4该数据集的大小受限于计算机上可用的物理（RAM）和虚 拟内存。 3.1.5分析的序列必须包括两个或两个以上长度相同的序列，所有 序列分析之前必须用MEGA软件对齐。 3.1.6核苷酸和氨基酸序列应该用英文字母连续书写，不区分大小 写。一些特殊的特殊符号，例如表示对齐缺口，碱基缺失等 的符号也可以包含在序列中。 3.1.7空格和制表符经常用于数据文件中，因此会被MEGA忽略。 ASCII字符，如（.）（- ）（？），一般都作为特殊符号
万方数据
万方数据
７０８ 图ｌＭＤＲ基本步骤示意图 划分为不同的分类，也就是图中的单元格。单元格中左侧直方图表示病例，右侧直方图表示对照。 第４步：在ｎ维的每个多因子分类（单元格）中，计算病例数和对照数的比值，若病例数与对照数之比达到或超过某个阈值（例如≥１），则标为高危，反之则为低危。这样就把ｎ维的结构降低到一维两水平。 第５步：多因子分类的集合中包含了ＭＤＲ模型中各因子的组合。在所有的两因子组合中，选择错分最小的那个ＭＤＲ模型，该两位点模型在所有模型中将具有最小的预测误差。 第６步：通过十重交叉验证评估模型的预测误差，一以及单元格分配时的相对误差。也就是说，模型拟合９／１０的数据（训练样本），其预测误差将通过剩下１／１０的数据（检验样本）来衡量。选择预测误差最小的模型作为最终的模型，取ｌＯ次检验的预测误差平均值，作为模型相对预测误差的无偏估计。由于数据分组的方式对交叉验证的结果影响较大，因此，十重交叉验证过程将重复进行１０次，对ｎ个因子可能的集合将重复进行１０×１０次的交叉验证。 通过十重交叉验证，在一定程度上可以避免因数据转换的偶然性，使Ｉ类错误增大而产生假阳性结果的影响。预测误差是衡量ＭＤＲ模型在独立检验的亚组中预测危险状态的指标，通过十重交叉验证的亚组中每一个的预测误差的平均值来计算。根据交叉验证的预测误差的平均值，选择最佳的Ｔｌ因子模型，并根据不同的因子数重复以上过程。最终筛选出最有可能存在交互作用的基因。 ＭＤＲ的优势在于不需要考虑疾病的遗传模型，它利用计算机运算速度快的优势，对多个基因进行随机组合，按照上述方法找出存在交互作用的基因位点。但当主效应存在时，用ＭＤＲ方法很难得到最终模型，且同样受遗传异质性的影响；它只是一种数据挖掘方法，不是严格意义上的统计方法，还无法判断它的Ｉ类错误和检验功效。 ＭＤＲ分析软件包可在ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｐｉｓｔａｓｉｓ．ｏｒｇ／ｍｄｒ．ｈｔｍｌ免费下载。 ４基于复合ＬＤ的交互作用分析法 吴学森等Ⅲ’提出基于复合ＬＤ的交互作用的分析法。该方法以病例一对照试验设计为基础，基于ＬＤ计算方法，构建完全有别于以上方法的一种新型基因间交互作用的统计分析方法：（１）用两个位点（基因）单倍型的外显率（只。）与等位基因的边际外显率的乘积（Ｐａ?Ｐ。）的偏差（６．口＝ＰＡ。一只?Ｐ８），分别定义病例组和对照组两个位点交互作用的度量．进而综合两组交互作用度量构造检验交互作用的统计量；（２）对于基因一环境交互作用模型的构建，则将环境（分类型变量）变量视为“虚拟位点”（例如Ｅ＝ｌ表示环境暴露。Ｅ＝０表示即非暴露），则同样依据上述方法构建其模型。４．１基因型数据的联合概率分布及其表达对于基因之间、基因与环境之间的交互作用统计量的构建，无论是二阶或高阶情形，均至少涉及两个变量。在本研究中，均以病例一对照试验设计为基础，个体的基因数据一律用其基因型表示。无论是病例组还是对照组，均设两个位点的等位基因分别为Ａ，ａ；Ｂ，ｂ，则它们的联合基因型分布可表述为表３的形式： 则．配子的ＬＤ系数为：６．。＝％一ＰＡＰ。；非配子的ＬＤ系数为：乳口＝九日一只－匕，其中，Ｐ．ｅ＝尸竺＋ＰＡＢ舳＋碟＋Ｐ竺；ＪＤ∥。＝Ｐ竺＋Ｐ竺＋Ｐ：：＋形：。但是，当计算病例组或对照组的６．。时，需要知道双杂合子的概率Ｐ苫、Ｐ：：。然而。当它们的相未知时，则无法确定其值，只能进行单倍型推断。由于单倍型推断总是存在误差，这给后面构造的检验交互作 用的统计量带来很多不确 万方数据
功能基因的克隆及其生物信息学分析 摘要：随着多种生物全基因组序列的获得，基因组研究正从结构基因组学（structural genomics）转向功能基因组学(functional genomics)的整体研究。功能基因组学利用结构基因组学研究获得的大量数据与信息评价基因功能(包括生化功能、细胞功能、发育功能、适应功能等)，其主要手段结合了高通量的大规模的实验方法、统计和计算机分析技术[1]，它代表了基因分析的新阶段，已成为21世纪国际生命科学研究的前沿。功能基因组学是利用基因组测序获得的信息和产物，发展和应用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使生物学研究从对单一基因或蛋白的研究转向多个基因或蛋白同时进行系统的研究，是在基因组静态的组成序列基础上转入对基因组动态的生物学功能学研究[2]。如何研究功能基因，也成为我们面临的一个课题，本文就克隆和生物信息学分析在研究功能基因方面的应用做一个简要的阐述。 关键词：功能基因、克隆、生物信息学分析。 1.功能基因的克隆 1.1 图位克隆方法 图位克隆又称定位克隆，它是根据目标基因在染色体上确切位置，寻找与其紧密连锁的分子标记，筛选BCA克隆，通过染色体步移法逐步逼近目的基因区域，根据测序结果或用BAC、YAC克隆筛选cDNA表达文库寻找候选基因，得到候选基因后再确定目标基因。优点是无需掌握基因产物的任何信息，从突变体开始，逐步找到基因，最后证实该基因就是造成突变的原因。通过图位克隆许多控制质量性状的单基因得以克隆，最近也有报道某些控制数量性状的主效基因（控制蕃茄果实大小的基因克隆[3]、控制水稻成熟后稻谷脱落基因克隆[4]以及小麦VRN2 基因克隆[5]等）也通过图位克隆法获得。
临床微生物检测的基因 同源性分析 Revised as of 23 November 2020
临床微生物检测的基因同源性分析 医院感染的流行病学研究是临床微生物学工作者的重要课题，在医院感染监测的研究中，一个很重要的问题就是如何确定感染途径和传播途径，以采取有效预防和控制措施，从而防止医院感染或者暴发流行，因此对微生物鉴定和菌株同源性分析提出了更高的要求。 目前，传统的细菌鉴定和同源性分析技术已不能很好地满足医院感染诊断和流行病学调查的需要，从型、亚型、株，甚至分子水平上去认识细菌变得愈来愈重要了。近年来分子生物学的理论和技术在细菌感染诊断中的渗透和广泛应用，使得细菌鉴定、耐药基因的检测、分子流行病学调查变得更加准确、简洁和快速。细菌DNA同源性分析技术如脉冲场凝胶电泳、聚合酶链反应、DNA 探针杂交以及序列分析等方法是目前在分子水平上分析细菌的主要手段，它在鉴定细菌感染的爆发、确定院内交叉感染、感染病原菌之间的基因同源性等方面有着重要的作用，本文将对常用基因同源性分析方法的机理和过程做简要综述。 一、质粒分型(Plasmidprofileassay)： 1、原理： 质粒是可移动的染色体外元件，可以自发丢失或者被宿主稳定地获得，因此流行病学上相关的分离菌株有可能表现出不同的质粒图谱。把质粒提取出来，进行常规的琼脂糖电泳分析，就可以知道分离菌株携带质粒的大小和数目。
3、实验方法的评价： 优势： a.步骤比较简单，对实验仪器要求不高。 b.在评价那些从局限的时间和地点（如一个医院中的急性爆发）分离出来的菌株非常有效。 缺点： a.实验结果的重复性不好。 b.分辨力不高。 二、染色体DNA的限制性内切核酸酶分析(RestrictionEndonucleaseAssayREA) 1、原理： 限制性内切核酸酶（REA）在特异的核酸识别序列切割DNA，DNA被消化后，所得到的限制性片段的数目和大小是由酶的识别位点和DNA的组成共同决定的。在传统的限制性内切核酸酶分析中，人们用含有相对多的限制性位点的内切核酸酶消化细菌的DNA，这样就会得到成百上千条长度在范围内的DNA片段。恒定的电场琼脂糖电泳，可以根据分子质量的大小将这些DNA片段分开，然后通过EB染色并在紫外灯下观察其图谱。同一种的不同分离菌株
全基因组关联分析（Genome-wide Association Study）是利用高通量基因分型技术，分析数以万计的单核苷酸多态性（SNPs）以及这些SNPs与临床表型和可测性状的相关性。简单地理解全基因组关联分析，GW AS就是标记辅助选择在全基因组范围上的应用，在全基因组层面上开展大样本的、多中心的、重复验证的技术，并对相关基因与复杂性状进行关联研究，从而全面地揭示出不同复杂性状的遗传机制和基础。GW AS是一项开创性的研究方法，因为它可以在以前很难达到的分辨率水平上对成千上万无关样本的全基因组进行研究，且不受与疾病有关的先验性假设的限制，GWAS在全基因组范围、零假设性较候选基因研究都迈出了重要的一步，而且随着高通量测序成本的降低，GW AS在人类疾病以及畜禽经济性状的研究上都表现出巨大的优势。 GW AS的优势除了可以一次性检测到数以万计的SNPs信息，从而提高试验效率以及检验功效以外，其还有其他两个显著的优势，主要表现在：（1）对未知信息的基因进行定位探索。传统的QTL定位仅仅限于对已知的候选基因进行分析探索，而GW AS是对全基因组的范围内的所有位点进行关联分析，因此其拥有更广泛的关联信息，相比候选基因分析GW AS 更有可能找到与性状真正关联的候选基因，因此不再受到预先假设的候选基因的限制。（2）对于GWAS在研究不同的复杂性状之前，不需要像以往的研究一样“盲目地”预设一些假定条件，而是通过在病理和对照组中，有目的地比较全基因组范围内所有SNPs的等位基因频率或者通过家系进行传递不平衡检验（TDT，Transmission disequilibrium test），从而找出与复杂性状显著相关的序列变异。到目前为止，利用全基因组关联分析研究已经挖掘出众多与各种复杂性状相关联的基因和染色体区域，在这些被新鉴定出的位点和区域中，只有小部分结果位于以前对这些性状研究的区域之中或者附近，绝大多数位于以前从未被研究过的区域，GW AS的研究结果表明以前没有被纳入研究的未知区域有可能对于复杂性状也是十分