第十二章激素及激素代谢产物的测定
体液中激素及其代谢产物的浓度甚微，如血液中的浓度往往在每100ml只有数微克水平，24h尿液中的浓度也只有数微克至数毫克水平，因此要求具有极其灵敏而特异的方法才能进行测定。比色法灵敏度不够高，但由于操作简便，不需特殊设备，仍作为常规测定方法，如尿中17-酮类固醇、17-羟皮质类固醇的测定。荧光法的灵敏度较比色法高约100倍，尿儿茶酚胺的测定可采用此方法。放射免疫法因具有灵敏度高、特异性强等优点，几乎全部激素均可用这种方法进行测定。但由于放免法受放射性物质的限制，短半衰期的限制，125I标记物灵敏度的最低值限制等限制了这项技术的发展。于是酶免疫测定法、化学发光免疫测定法、时间分辨荧光免疫测定法等得到了长足的发展，且已越来越多地应用于激素及其代谢产物的测定。
实验71 ELISA法测定人绒毛膜促性腺激素
人胎盘绒毛滋养叶细胞合成与分泌的人绒毛膜促性腺激素((human chorionic gonadotropin,hCG)是一种由α和β亚基构成的糖蛋白(分子量36 000)。其α亚基的肽链组成与结构和来自脑垂体前叶的糖蛋白激素促黄体生成素(LH)、促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)相类似。而绒毛膜促性腺激素β亚基(β-hCG)则具有特异性，系hCG的生物活性所在。故测定β-hCG交叉反应小，特异性高，能准确地反映hCG的水平。
【原理】二点酶免疫分析法的原理是先将抗β-hCG亚基单克隆抗体(McAb)包被固相载体(如聚苯乙烯反应板微孔)，再加入检样与酶标记的抗β-hCG亚基McAb，如检样中有hCG 存在，则可形成夹心式结合物，加入底物后出现呈色反应。因采用对hCG特异的抗-β亚基McAb包被，故特异性较高。
【试剂】酶免疫法测hCG试剂盒。最主要的试剂包括：
1．包被固相载体用的β-hCG亚基McAb。
2．辣根过氧化物酶(HRP)标记的β-hCG亚基的McAb。
3．在HRP反应体系中作底物(供氢体)的四甲基联苯胺(TMB，目测呈蓝色)或邻苯二胺(OPD，呈现黄色)。
【操作步骤】二点酶免疫法
1．标本
(1) 尿液：以1 500～2 000r/min离心10min。清晨尿hCG水平最高，接近于血清水平，
通常收集晨尿送检。
(2) 血清：不加抗凝剂，尽快分离血清进行检测。
2．在已包被抗β-hCG亚基McAb的聚乙烯反应板微孔中加最适浓度(说明书指定)酶标记抗β-hCG亚基McAb 0.1ml，立即加尿或血清0.1ml。
3．轻轻抖动反应板，或于混匀器上混匀30s，再置37℃20min。
4．甩去孔内反应物，以蒸馏水冲洗6次，晾干。
5．加底物溶液0.1ml，室温放置5min，观察。蓝色(底物为TMB-H2O2时)或黄色(底物为OPD-H2O2时)为阳性，无色为阴性。如需定量，可同时做一标准系列浓度，结果以lgC对吸光度作图，待测样本浓度可从曲线中查出。
【参考范围】正常人hCG＜1.0μg/L。
【临床意义】
1．可用于早孕诊断。正常育龄妇女hCG升高提示早孕。
2．作为绒毛膜上皮细胞癌、葡萄胎的早期诊断指标。
3．可用于对绒毛膜上皮细胞癌、葡萄胎手术后化疗效果观察，是有效随访监测的手段。
【评价】早期采用的生物学方法由于所选择的试验测试对象的个体差异及对试验条件的反应性不同，使得定性测试结果差异较大。
随后出现凝集抑制试验，在试验中引入凝集抑制试验及免疫学的技术，使得灵敏度、准确度、精密度有了一定的提高，检测时间进一步缩短(最快速检测3～5min完成定性)。通过对抗体的纯化标记技术的改进，引入了同位素标记及酶标记技术，极大地提高了检测灵敏度、准确度、精密度，使hCG测定从定性转化为定量，极大地满足临床的需要。
现今较常用对血清、尿液等的定量分析方法为竞争性结合的放射免疫法及固相双抗体夹心酶联免疫吸附试验，化学发光免疫分析也已应用于临床。
(刘忠民)
实验72 酶标免疫荧光法测定血清皮质醇
皮质醇(Cortisol)又称氢化可的松、化合物F、糖皮质类固醇。
血液中皮质醇浓度直接反映肾上腺糖皮质激素分泌情况，而尿中游离皮质醇(Urine free cortisol，UFC)由血液中游离皮质醇经肾小球滤过而来，因此其量与血浆中真正具生物活性(包括调节自身分泌)的游离皮质醇浓度成正比。血浆(清)皮质醇或24h UFC测定现被推荐为是否存在肾上腺皮质功能紊乱的临床生化检查首选项目。
目前皮质醇测定方法有荧光光度法、免疫化学法、HPLC、GC、GC-MS等。其中，荧光法因受多种内源性皮质激素及其前体物如皮质酮、11-去氧皮质醇(甲吡酮抑制试验时可能大量出现)等干扰，特异性较差，测定结果较其他方法偏高。HPLC、GC、GC-MS法虽然特异性、灵敏度均高，但难以在临床常规工作中使用。免疫化学法除特异性及灵敏度均可满足要求外，其操作简便、快速、且有商品试剂盒供选用，为目前最常使用的方法。
【原理】以皮质醇-C21-半琥珀酸在低温下进行辣根过氧化物酶(HRP)标记，得到高活力的酶标记物。抗体包被于微孔滴定板上，采用竞争抑制原理进行反应，后用对羟基苯丙酸(HPPA)作为荧光试剂，测定血中皮质醇，代替放射免疫中的同位素标记，从而建立酶标免疫荧光测定法(F-EIA)。
【试剂】
1．辣根过氧化物酶(HRP)。
2．对羟基苯丙酸(HPPA)。
3．皮质醇抗体。
4．皮质醇-C21-半琥珀酸。
5．包被缓冲液0.05mol/L NaHCO3-Na2CO3(pH9.6)。
6．测定缓冲液0.12mol/L PBS(pH7.0～7.2)。
7．洗涤缓冲液(PBST，pH7.0～7.2)，每1 000ml PBS中加0.5ml Tween-20。
8．荧光试剂①Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.0)；②0.5% HPPA和0.05% H2O2，临用前以1:1(V/V)新鲜配制。
9．终止液2mol/L NaOH。
【测定】
1．抗原的酶标记采用混合酸酐法。取皮质醇-C21-半琥珀酸3.1mg，二氧六环0.2ml，三正丁胺10μl，氯钾酸异丁酯4μl，在4℃反应30min，滴加入HRP 7.1mg/ml中，整个溶液保持在pH8～8.5，水浴反应4h，测定缓冲液透析48h，用Sephadex G50柱层析(50cm×1.5cm)，洗脱液为0.05mol/L PBS(pH7～7.2)，用部分收集仪收集每管1ml，共30管，用分光光度计405nm波长测吸光度，取高值管加0.2%牛血清白蛋白(BSA)PBS稀释4倍，保存4℃备用。
2．微孔板的抗体包被首先将酶标板洗净，除第一列ABCD四孔外，每孔加皮质醇抗体(1：15 000)200μl，4℃过夜，次日弃去板中液体，并用冲洗液洗涤三次，甩干。包被板可保存1周。
3．将血清用测定缓冲液对倍稀释，置60℃10min，以破坏血清中皮质类固醇结合球蛋白(CBG)，取经处理后血清100μl置于抗体包被的微孔内，然后加酶标记抗原100μl (1：1
200)4℃过夜，次日弃去板中液体，用洗涤液冲洗3次并甩干，以下步骤同标准孔。
4．校正曲线 设8个标准孔分别含皮质醇0，0.625，1.25，2.5，5.0，10，20，40ng ，加于被抗体包被的微孔中，均作复孔，按待测样品相同方法进行免疫反应，2对PBS 孔中均未被抗体包被，其中一对孔为总酶结合物读数孔，另一对为非特异性吸附孔(NSB)。
5．荧光显示 各孔加0.05mol/L Tris-HCl 缓冲液(pH8.0)100μl ，再加0.5%HPPA 和0.05%H 2O 2 1：1(v/v)底物100μl ，37℃ 2h ，加2mol/L NaOH 50μl 终止反应。用SFF-200型酶免荧光仪测定荧光强度，激发波长为320nm ，发射波长为405nm 。
【计算】 以不同标准浓度的结合率(B%)绘出校正曲线。
%100/0%?--=
非特异吸附孔读数
读数标准曲线非特异吸附孔读数
待测样品读数结合率L g B μ
样品结合率B%在校正曲线上查得ng 数×2×(104/103)即得血清皮质醇ng 值。 【参考范围】 晨8时为79±23μg/L 。
【临床意义】
1．皮质醇增多症 血浆和尿皮质醇含量明显增高，血浆昼夜节律变化消失。
2．异位产生ACTH 的肿瘤 如燕麦型肺癌，胰、甲状腺、甲状旁腺、卵巢、睾丸、大肠、胆囊、乳腺以及纵隔瘤等癌肿组织具有分泌ACTH 样物质的功能，促使肾上腺皮质合成皮质醇，血浆中皮质醇含量显著升高。
3．垂体前叶功能亢进症 由于垂体前叶促激素的大量分泌，靶腺增生，血浆和尿皮质醇可升高。
4．肾上腺皮质功能低下 如阿狄森病、席汉综合征，血浆和尿皮质醇含量减少。 5．长期使用类固醇激素可通过负反馈抑制ACTH 分泌，使肾上腺皮质处于抑制或萎缩状态，则血浆和尿液皮质醇含量减少。
6．单纯性肥胖 血浆和尿液皮质醇含量略高或在正常范围。
7．先天性肾上腺皮质增生症 因体内缺乏某种酶如C 20—22断裂酶3β-脱氢酶，17α-羟化酶11β-羟化酶等使皮质醇合成障碍，而皮质醇产生减少。
【注意事项】
1．血浆(清)皮质醇测定，是检测包括蛋白结合和游离两部分的总皮质醇浓度，并不能排除CBG 、白蛋白浓度改变等各种影响皮质醇蛋白结合率因素对游离皮质醇浓度的影响，因此其浓度不一定和游离皮质醇浓度平行。正常人皮质醇的分泌存在昼夜节律，可由此导致单次取样测定因取样时间在分泌峰或谷浓度，产生假阳性或假阴性结果。皮质醇增多症者，该昼夜节律多消失，可为诊断依据之一。故现在均主张分别在早晨8点及午夜12点分别取血测定，
代表峰浓度、谷浓度。并且为避免因住院、静脉穿刺等产生应激性皮质醇分泌因素的影响，采血宜在住院至少3d后，并以保留式静脉取血套管进行。
2．24h UFC测定不受昼夜节律影响，并可靠地反映游离皮质醇水平。特别是当皮质醇增多症时，血皮质醇浓度超过CBG结合容量，游离皮质醇浓度将不成比例地升高，UFC亦将出现较血浆总皮质醇、尿17-OHCS和17-ks更明显的改变。故在诊断皮质醇增多症上，24h UFC 测定更为敏感可靠。但本测定除同样受上述影响血浆皮质醇测定的因素影响外，还受肾功能影响。若同时测定尿肌酐排泄量，以24h UFC/24h尿肌酐表示，可在一定程度上排除肾功能对24h UFC测定的影响。
【评价】
1．校正曲线范围为0～40ng，灵敏度为0.5ng，平均回收率95.1%±3.7%，批内变系数为6.2%，批间变异系数为12.4%。与Serono酶标法比较，相关性良好，较传统的放射免疫法简单方便，快速，没有同位素污染。
2．使用C21-半琥珀酸皮质醇，以辣根过氧化物酶直接标记在碳21位上，这与半抗原在21位接牛血清白蛋白再制备抗体有良好的结合反应，该酶标物既保持了酶的活性又具有与皮质醇抗体结合的免疫活性，并与血中游离皮质醇抗原相竞争。本法抗体的合理稀释度为 1.5×104～2.0×104，酶结合物的合理稀释度为1.2×103～1.5×103。
3．在酶反应中使用HPPA—H2O2底物，经HRP作用后产物在320nm光的激发下能发射405nm波长的荧光，该荧光物质能稳定24h，荧光基质HPPA和酶标比色所应用的对甲基苯酚相比，前者HPPA可提高灵敏度，又没有对甲基苯酚的致癌作用。
(刘忠民)
实验73 时间分辨免疫法测定血浆雌二醇
【原理】雌二醇(estrodiol E2)是由18个碳原子所组成的一种女性甾体类激素。用时间分辨荧光免疫法(Time resolved fluorescence immunoassay，TRFIA)测定的模式可以采用第二抗体固相法。即样品中的E2和Eu3+铕标记的E2衍生物共同竞争性地和限量抗体结合。样品中的E2浓度升高，抗体和Eu3+标记E2结合量降低。反之，样品中的E2浓度降低，抗体和Eu3+标记E2结合的量增加。第二抗体作为一种特异性的分离剂。测定固相上Eu3+标记物的量，便可算出样品中E2的浓度。
【试剂】
1．固相第二抗体制备取高滴度羊抗鼠IgG抗血清，用盐析法和离子交换柱层析法提取
IgG。将抗鼠第二抗体IgG用包被缓冲液配制成20μg/ml。向经活化的微量滴定条每孔加200μl，4℃过夜，洗涤2次，每孔加1%戊二醛液200μl，放室温1h后洗涤2次，再次加第二抗体IgG液200μl进行第二次包被。每孔加10g/L BSA液封闭4h，洗涤后放4℃保存。
2．E2-6-BSA Eu3+标记取E2-6-BSA(Sigma 产品，也可自行合成)1mg溶于0.15mol/L NaCl 液500μl中，加入Eu3+-[对-异硫氰酸苯基]-DTTA (Pharmacia Wallac产品)25μg，即刻用0.1mol/L NaOH液调pH至pH9.0，4℃反应过夜。将反应液加至1cm×30cm SephadexG-50柱中分离，50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.75)洗脱。在紫外280nm检测下收集蛋白峰洗脱液。加适量保护蛋白和防腐剂后，分装，置－20℃保存。
3．Tris-HCl缓冲液50mmol/L Tris-HCl(pH7.75)，含NaCl 18.5g/L，BSA 2.5g/L，三氯醋酸10g/L，NaN3 0.5g/L，EDTA-Na2 8mg/L，Tween-40 0.2g/L。
4．15μmol/L标准E2贮存液称取准确E2量，用无水乙醇适量溶解并定容，4℃可长期保存。
5．标准E2应用液取去甾体激素血清，加入15μmol/L标准E2贮存液，使浓度为0.1，0.5，2.5，5，10，15μmol/L。分装每瓶250μl，冷冻干燥，4℃保存。临用前用250μl蒸馏水溶解。
6．抗E2单克隆抗体按预先经125I RIA法所测得的滴度，用Tris-HCl缓冲液稀释，临用前配制。
7．增强液。
【操作步骤】
1．将固相抗鼠IgG微量滴定条用洗涤液洗2次，按表12-1加入样品和试剂。
表12-1 血清E2测定加液程序(单位μl)
NSB管S0管S1～6管样品管
去激素血清25 25 －－
标准E2液－－25 －
待测血清－－－25
Eu3+-E2液50 50 50 50
抗血清－100 100 100
缓冲液100 －－－2．在室温下振荡反应4h，洗涤10次后加增强液200μl，振荡15min，放置15min，测
量荧光强度，从所编程序直接打印出血清中E2浓度。
【参考范围】
男性：0～1.6(X=0.08) (nmol/L)
女性：
滤泡期0.1～0.61(X=0.2) (nmol/L)
排卵期0.57～1.62(X=0.95) (nmol/L)
黄体期0.2～0.73(X=0.43) (nmol/L)
女性绝经后0～0.16(X=0.04) (nmol/L)
孕妇(7-9个月) 20～130(nmol/L)
【临床意义】
1．雌二醇测定是检查下丘脑-垂体-性腺轴的功能指标之一，主要用于青春期前内分泌疾病的鉴别诊断和闭经或月经异常时卵巢功能评价的指标。
2．血清雌二醇测定也可作为男性睾丸或肝脏肿瘤等疾病的诊断指标之一。
【注意事项】
1．本法直接取血清测定简便易行，适合大量样品检测。但反应液中三氯醋酸钠作为E2和蛋白结合的阻断剂，浓度要适宜，否则将影响结果的准确性。
2．血清样品也可经二氯甲烷提取，有机相蒸干后溶于缓冲液中，然后按本法测定，排除了蛋白的干扰，缓冲液中不必加三氯醋酸蛋白变性剂，方法准确性较高。
【评价】
1．取4份不同浓度E2血清(0.06～6.65nmol/L)检测本法精密度。批内CV3.3%～11.7%(n=12)，批间CV3.8%～9.1%(n=6)。
2．以零标准孔CPS－2SD 计算灵敏度，本法最小检出值为0.05nmol/L。校正曲线量程0.1～15nmol/L。
实验74 尿17-酮类固醇测定
【原理】17-酮类固醇(17-ketosteroids，17-ks)是肾上腺皮质激素及雄性激素的代谢产物，它们都是环戊烷多氢菲的衍生物，在第17位碳原子上都有一酮基。这类化合物主要为雄酮、表雄酮、去氢表雄酮和原胆烷醇酮等，大部分结合成为水溶性的葡萄糖醛酸酯或硫酸酯。它们必须经过酸水解成游离的类固醇后，再用有机溶剂提取，经过洗涤除去酸类与酚类物质，利用17-酮类固醇分子结构中酮-亚甲基(—CO—CH2—)能在碱性溶液中与间二硝基苯作用生
成紫红色化合物(Zimmermann反应)，在520nm波长处有一吸收峰，可与标准同时操作进行比色测定。
【试剂】
1．浓盐酸(AR)。
2．乙醚(AR)。
3．去醛乙醇无水乙醇1 000ml，加入4g盐酸间苯二胺，充分混匀后，暗处静置一周，每天振摇2次，到期进行蒸馏，弃去开始馏出与最后剩余部分各50ml，收集中间部分所得乙醇，置棕色瓶中保存。
4．0.12mol/L间二硝基苯乙醇溶液称取纯化的间二硝基苯2g，溶于去醛无水乙醇内，定容至100ml。冰箱避光保存。
间二硝基苯必须重结晶提纯，处理方法如下：取间二硝基苯20g，加95%乙醇150ml，加温至40℃，使其溶解。加2mol/L NaOH溶液100ml，静置5min。在室温下徐徐加蒸馏水2 500ml，边加边摇，静置即可出现针状白色结晶，用布氏漏斗收集沉淀，并用蒸馏水洗涤后吸干，沉淀用无水乙醇80~120ml再结晶2次，纯化的结晶洁白无色，熔点90.5~91℃。
5．雄酮标准溶液(100μg/ml) 将雄酮(GR)置于干燥器中至少48h，精确称取雄酮10mg，置于100ml容量瓶中，用去醛乙醇溶解并定容。此液不能久存，必须分装于洁净的中号试管中，每管0.2ml(含20μg)，置37℃温箱中烘干，置暗处保存，每次测定时取出一管使用。
6．5mol/L KOH 溶液。
7．70%去醛乙醇溶液取去醛乙醇70ml，加蒸馏水至100ml。
8．2mol/L NaOH溶液。
【操作步骤】
1．标本收集收集24h尿液于洁净的容器中，预加浓盐酸5ml防腐，并记录尿液总量。
2．水解取24h混合尿液5ml，置试管中，加浓盐酸1.5ml，在沸水中煮沸20min，取出，置冷水中冷却。
3．提取将上述水解液倒入30ml分液漏斗中，加乙醚约10ml，振摇2min，静置分层以后，弃下层尿液，加5ml 2mol/L NaOH于分液漏斗中，振摇1min，以除去酸性酚类干扰物质，静置分层后，弃去下层NaOH液，再加蒸馏水5ml洗涤二次，弃去下层水液，于40~45℃水浴中蒸干。此管即为测定管。
4．标准管取上述分装于15mm×150mm试管中烘干的标准管一支作标准管。
5．显色取测定、标准、空白3支试管，按表12-2操作。
表12-2 尿17-酮类固醇测定步骤
加入物(ml) 空白管标准管测定管
去醛乙醇0.2 0.2 0.2
0.12mol/L间二硝基苯乙醇溶液0.2 0.2 0.2
5mol/L KOH溶液0.3 0.3 0.3
混匀, 置37℃水浴20min，避光
70%去醛乙醇溶液 5.0 5.0 5.0
各管混匀，1 000r/min离心5min，上层液移入比色杯中，在波长520nm处，以空白管调零，读取各管的吸光度。
【计算】
尿17-ks(mg/24h)=
()
5
24
02
ml
h尿量
标准管吸光度
测定管吸光度
?
?
?
按雄酮分子量288.41计算，17KS(μmol/24h)= mg/24h×3.47
【参考范围】
成年男性: 28.5~61.8μmol/24h(8.2~17.8mg/24h)；
成年女性：20.8~52.1μmol/24h (6.0~15.0 mg/24h)。
【临床意义】
尿17-ks排泄量与性别年龄有关：男性高于女性；同性中，儿童、老年人偏低，中壮年期较高。
1．尿17-ks增高见于肾上腺皮质功能亢进、垂体肿瘤和睾丸间质细胞肿瘤等。雄激素、ACTH等药物的应用也会导致尿17-ks含量增高。
2．尿17-ks减低见于肾上腺功能减退、性功能减退及某些慢性病如结核、肝病等。
【注意事项】
1．由于对光敏感显色不稳定，宜放暗处，因此加完试剂后需在10~20min内完成比色。
2．乙醚提取时如出现乳化现象而分不清时，可加氯化钠少许，振摇后即分清。
3．本实验所用乙醚、去醛乙醇，应远离火源，保证安全。
4．乙醚蒸干后，管内不应有水滴，否则影响显色。
5．病人在留尿前，禁用安神、普鲁卡因酰胺、冬眠灵和类固醇激素等，以减少干扰。
6．如室温过低，比色液可出现混浊，应在比色前加饱和NaCl溶液0.1ml, 使浊度消失后再进行比色。
【评价】尿17-ks测定在国际上还没有统一的参考方法，在国内推荐的测定方法即Zimmermann反应。本方法检测范围，从2~20mg/L之间基本呈直线关系。显色如果超过40min，吸光度逐渐下降，影响测定的准确性。该方法回收率为87.6%~89.2%，批内变异系数为9.75%，因此本方法不如直接测定单个酮类固醇，但目前国内有不少实验室还采用Zimmermann反应测尿-17ks。
实验75 尿17-羟皮质类固醇测定
【原理】尿17-羟皮质类固醇(17-hydroxycorticosteroid，17-OHCS)为肾上腺皮质所分泌的激素及其代谢产物，主要有皮质醇、四氢皮质醇、皮质素、四氢皮质素等，均为环戊烷多氢菲的衍生物，在第17位碳原子上有一个羟基，第20位碳原子上有一个酮基。在酸性条件下，促使17-羟类固醇水溶性下降，用10:1氯仿-正丁醇混合液将尿中结合型和游离型17-羟类固醇自尿中提取后，在尿提取物中加入盐酸苯肼和硫酸，使17-羟类固醇与盐酸苯肼作用，生成黄色苯肼衍生物(Porter-Silber反应)，此结果减去硫酸与其他非尿17-羟类固醇显色物所产生的空白颜色，与标准液同样处理比色，求其含量。
【试剂】
1．氯仿(AR) 若空白管颜色过高，氯仿应精制，方法如下：用分析纯浓硫酸洗至硫酸无色，再用蒸馏水洗至中性。
2．正丁醇取正丁醇1 000ml，加10mol/L硫酸调节pH到1，加盐酸苯肼100mg，混匀室温放置过夜。在砂浴上重蒸馏，弃去头尾各100ml，收集中段沸点117℃的正丁醇。
3．无水硫酸铵(AR)。
4．盐酸苯肼硫酸溶液取纯化的盐酸苯肼65mg，加10mol/L硫酸100ml，加氯化钠2g，置冰箱可用1个月。
盐酸苯肼精制方法如下：取分析纯盐酸苯肼10g，用无水乙醇400ml隔水加热溶解，室温冷却置冰箱内1~2h即有结晶析出，布氏漏斗过滤，重复结晶2~3次，直至无水乙醇无色，得到白色结晶，37℃烘干，保存于棕色瓶中。
5．硫酸溶液10mol/L 取浓硫酸(AR)280ml缓缓加入到蒸馏水220ml中。
6．皮质醇标准液(100μg/ml) 精确称取皮质醇(氢化可的松)10mg，用无水乙醇约10ml 溶解后，转移入100ml容量瓶中，加氯仿-正丁醇定容。
7．氯仿－正丁醇混合液比例为10:1。
【操作步骤】
1．标本收集 收集24h 尿液于洁净的容器中，预加浓盐酸5ml 防腐，并记录尿液总量。 2．提取 取尿液3ml 于带塞烧瓶中，加10mol/L 硫酸2滴，使尿液pH 调至1，加硫酸铵3g ，摇匀，再加氯仿－正丁醇混合液21ml ，加塞后用力振摇3min ，静置待分层后，用滴管吸取上层尿液，留下层氯仿-正丁醇提取液备用。
3．标准管 将皮质醇标准液(100μg/ml)分装于15ml 带塞试管中，每管加0.2ml ，置室温中干燥后，用塞塞好，放暗处备用。
4．显色 取15ml 带塞试管6支，其中C 管和D 管为含皮质醇的标准管，按表12-3操作。
表12-3 尿17-OHCS 的测定步骤
加入物(ml)
比色空白管
(A)
试剂空白管
(B) 标准空白管
(C) 标准管(D) 测定空白管(E) 测定管(F) 氯仿－正丁醇提取液 — — — — 7.0 7.0 氯仿－正丁醇混合液 7.0 7.0 7.0 7.0 — — 盐酸苯肼硫酸溶液 — 4.0 — 4.0 — 4.0 10mol/L 硫酸
4.0
—
4.0
—
4.0
—
各管剧烈振摇5min ，静止20min ，分层后分别吸取上层硫酸层加入另一批试管中，将各管标记清楚，置60℃水浴25min ，取出后用410nm 波长比色，以A 管调零，读取各管吸光度。
【计算】
17-OHCS (mg/24h) =
总尿量h C
B D E
B F 24020???----
按皮质醇分子量362.47计算，尿17-OHCS(μmol/24h)= mg/24h ×2.76
【参考范围】
成年男性：27.88±6.6μmol/24h(10.1±2.40mg/24h)； 成年女性：23.74±4.47μmol/24h(8.6±1.62mg/24h)。 【临床意义】
尿中17-OHCS 含量可以反映肾上腺皮质分泌皮质醇的情况，有助于某些内分泌疾病的诊断。
1．尿中17-OHCS 减少 艾迪生病，肾上腺皮质功能减退，垂体前叶功能低下。 2．尿中17-OHCS 增高 肾上腺皮质增生，肾上腺皮质功能亢进，肾上腺皮质肿瘤，库欣综合征。肥胖患者略高，严重刺激和创伤如灼伤，大手术也会导致17-OHCS 增高。
【注意事项】
1．皮质素和皮质醇的显色强度不同，尿中排出以皮质醇为主，故以皮质醇(氢化可的松)
为标准。
2．所有试剂必须纯化，以消除杂质的影响。精制过程中应加强防火措施。
3．盐酸苯肼精制品，以氯仿－正丁醇作试剂空白检测，吸光度不应超过0.02。
4．显色反应在30min内完成比色。
5．为防止植物色素的干扰，试验前应停服中草药或有色素药物，并停止饮茶1周以上。
【评价】尿17-OHCS测定的推荐方法为Porter-Silber比色法。本方法检测范围(2.5~30mg/L)线性良好。显色时间超过40min，吸光度随时间延长明显下降。该方法回收率为86.2%~87%，批内CV为8.9%。因费时，且特异性不高，试剂处理要求高，故已逐渐被免疫学法所取代。
实验76 柱层析荧光法测定尿液儿茶酚胺
【原理】将尿样品pH调至6.5并经弱阳型离子交换树脂的层析柱，儿茶酚胺被交换到树脂上。用硼酸洗脱后，去甲肾上腺素和肾上腺素在锌离子中被高铁氢化物氧化成肾上腺素红。在碱性介质中肾上腺素红重新排列成肾上腺素黄。加入抗坏血酸是为了破坏多余的氧化剂并防止肾上腺素黄进一步氧化。肾上腺素黄的荧光在405nm处激发，在495nm处测定。与尿基质制备的标准同时测定即可计算出儿茶酚胺的含量。
【试剂】
1．2.7mmol/L乙二胺四乙酸二钠称取1g EDTA-Na2，用蒸馏水溶解，加水定容至1L。室温下可稳定1年。
2．5mol/L NaOH 称取20g NaOH，用蒸馏水溶解，冷却后加水定容至100ml。室温下可稳定1年；吸取5ml 5mol/L NaOH，用蒸馏水稀释至50ml，即为0.5mol/L NaOH。室温下可稳定1年。
3．0.1mol/L HCL 吸取0.85ml浓HCl(AR)，加蒸馏水稀释至100ml。室温下可稳定1年4．0.65mol/L硼酸称取40g硼酸，用蒸馏水溶解，加水定容至1L。结晶体比粉末更容易溶解。室温下可稳定1年。
5．1.0 mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5) 在大约75ml温水中溶解6.38g Na2HPO4和7.52g KH2PO4，冷却, 用0.5mol/L的NaOH调节pH到6.5±0.2，用水定容至100ml。在4℃下可稳定1个月。如出现结晶，应弃之。
6．3.7 mmol/L硫酸锌称取25mg ZnSO4·7H2O，用少量蒸馏水溶解，加水定容至10ml。在4℃下稳定1周。
7．7.6 mmol/L高铁氰化钾称取25mg K3Fe(CN)6，用少量蒸馏水溶解，加水定容至10ml。在4℃下稳定1周。如果在冰箱里出现结晶，可在室温放置到结晶溶解。如果溶液从淡黄色转成绿色，应弃之。
8．0.11 mmol/L抗坏血酸溶液溶解100mg抗坏血酸于5ml的蒸馏水中，用前制备。
9．碱性抗坏血酸溶液(含4.0mol/L NaOH和21mmol/L 抗坏血酸钠) 取18ml 5mol/L NaOH与4ml的0.11 mmol/L抗坏血酸混合, 临用前制备。
10．100mg/L标准去甲肾上腺素贮存液在最后容量为500ml的0.1mol/L HCl中溶解60.8mg的去甲肾上腺素盐酸盐。在4℃下稳定至少6个月。1mg/L标准应用液，应当天制备。吸取1ml的标准贮存液，用0.1mol/L HCl稀释至100ml。
制备校正曲线，按表12-4 剂量混合1mg/L的标准应用液和正常尿。
11．标准品标准品已有商品供应，或者可以用具有被分析标本特点的尿样制备。在100ml 尿液(已被酸化到pH低于3)中加入1ml 5g/L偏亚硫酸氢钠和1ml 2.7mmol/L EDTA-Na2。如果有颗粒出现，用粗滤纸真空过滤。加入去甲肾上腺素标准用于异常范围内的对照，混合。整份分装于闪烁瓶内，冰冻储存，可稳定6个月。
12．层析柱使用填充有弱酸型离子交换树脂的柱子(用Bio-Rex70树脂填料制备)。但散装的Bio-Rex70的网孔大小并不像原装的层析柱那样严格控制，通过柱子的流量特性也很难达到原装柱子的质量水平。
【操作步骤】
1．通过适当的控制钮或滤光片将荧光测定仪设在450nm激发波长和495nm测定波长。
2．在50ml的烧杯内放入5ml的尿(过分浑浊的尿必须先过滤或离心)。每一个标准放在一个单独的50ml的烧杯内。
3．每一个烧杯加入15ml 2.7mmol/L EDTA-Na2，并混匀。
4．用0.5mol/L的NaOH调节每一烧瓶内容物的pH至6.5±0.2，用pH计检测。
5．准备树脂层析柱，每一个样品和每一个标准各1支。摇匀或旋转柱子使树脂重新悬浮起来，然后让柱子直立使树脂下沉，打开盖子并去掉柱下端封口，让柱子控干。
6．将每一个样品和标准倒入一个单独的柱子，使之完全控干并弃去洗脱液。用20ml的
蒸馏水洗涤柱子并弃去洗涤液。
7．将每一个柱子放入一个干净的，标记好的15mm×150mm的试管内，每一管加入10.0ml 0.65mol/L的硼酸，收集洗脱液于试管内并混合，注意：此时如放在冰箱，样品至少可稳定96h。
8．从每一管分别取出2个3.5ml到2个15mm×100mm的试管，一个标上“空白”，一个标上“测定”。每个试管加入1.0ml的磷酸盐缓冲液并且混合。
9．准备碱性抗坏血酸溶液，加入1ml到每个标有“空白”的试管，仔细混匀。
10．在每一个空白管加入0.2ml的硫酸锌溶液和0.2ml的K3Fe(CN)6溶液, 仔细混匀；注意：通过快速混匀使反应立即停止，不然空白管的值将升高。当K3Fe(CN)6的黄色消失时反应终止。溶液必须清澈。下两个步骤(11和12)必须严格按时间顺序不间断地进行，每间隔15s 加入1次，可以2min做一批8个样品。
11．在步骤8标有“测定”的试管中每间隔15s加入0.2ml的硫酸锌溶液和0.2ml的K3Fe(CN)6，在加入第二份溶液后，仔细混匀。
12．在加入硫酸锌溶液和K3Fe(CN)6溶液到第一管后2min，加入1.0ml的碱性抗坏血酸试剂到第一管，混匀，然后每隔15s，按顺序加入1.0ml的碱性抗坏血酸试剂到其他的试管。
13．20min内，在荧光测定仪上读出所有试管的读数。
【计算】
用测定管读数减去相应的空白管读数计算出未知管和标准管的真正的荧光读数。RF100=F100-F0，RF200=F200-F0，RF300=F300-F0，RF100，RF200和RF300是100、200和300μg/L 标准管的相对荧光读数；F100、F200和F300是这些标准管的荧光读数；F0是0μg/L标准管的荧光读数。找出RF100，RF200和RF300对浓度的坐标点，划出校正曲线。用校正曲线和未知样品的真正荧光读数找出它们的浓度(每升尿的μg数)，每24h尿儿茶酚胺含量为μg/L×24h 尿量(L)。
【参考范围】25～125μg/24h
【临床意义】
1．嗜铬细胞瘤病人儿茶酚胺可升高2～5倍，个别可达10～20倍，但也有个别人在正常范围或正常值。虽然嗜铬细胞瘤相对少见(高血压病人的1/200)，但是检测这些指标对肿瘤病人是很重要的。
2．甲亢时儿茶酚胺的排泄可能稍高于正高，这可能与甲亢时甲状腺激素增多，影响体内儿茶酚胺的生物转化，使体内游离儿茶酚胺增多有关。
3．充血性心衰时由于心排血量降低，主动脉及颈动脉压降低，右心房及上下腔静脉压增
高，反射性引起交感神经兴奋，也可使儿茶酚胺升高。
4．各种原因所致的低血糖症，儿茶酚胺也可升高。
5．严重的应激情况，如恐慌、剧烈疼痛、创伤手术、出血、缺氧、窒息等均可引起儿茶酚胺升高。
6．儿茶酚胺降低常见于肾功能不全和甲状腺功能减退症。
7．糖尿病：儿茶酚胺低于正常，尤其是病情控制不良，血糖较高，降低更明显。
【注意事项】
1．尿液在pH1.5～2.0时水解，所测出的儿茶酚胺只包含有结合儿茶酚胺的酚型硫酸盐部分，而与葡萄糖醛酸结合的儿茶酚胺在这个条件下不能被水解。
2．干扰荧光反应的食物和药物，有香蕉、香草素、四环素、氯丙嗪、水杨酸及核黄素等，空白读数增高提示可能有干扰物质。在偶尔情况下，用荧光分光光度测定法检查激发和荧光的光谱可能有助于发现假性读数增高。
3．儿茶酚胺在pH8.0～8.5易破坏，故吸附过程必须限定在15min内完成。
4．在pH6.5时测出的是肾上腺素与去甲肾上腺素之总量，在pH3.5时测出的只是肾上腺素之量。
5．实验器皿须用双蒸水清洗，注意防止非特异性荧光物质的污染。
【评价】目前尚未建立参考方法，最广泛采用的即三羟基吲哚荧光测定法。本方法检测范围，从0～300μg/L呈直线，该方法CV为10%～15%，低于HPLC方法。荧光法很敏感(0.25～0.35μg)，但要求大量的提纯步骤来保证它的特异性和精确结果，双玻璃器皿的清洁要求高，以确保背景荧光减少到最低水平。
实验77 尿香草扁桃酸测定
【原理】香草扁桃酸(3-甲氧基-4-羟基扁桃酸，vanilmandelic acid，VMA)是肾上腺素与去甲肾上腺素的最终代谢产物，用乙酸乙酯提取酸化尿液中VMA，再用碳酸钾将VMA从乙酸乙酯中分离提出，利用重氮化对硝基苯胺与VMA生成复合物，再用氯仿抽取，然后用氢氧化钠水溶液萃取，水溶液显粉红色可进行比色。与标准液同样处理比色，可求其含量。
【试剂】
1．醋酸乙酯(AR)。
2．5mol/L盐酸溶液取浓盐酸42ml，加入蒸馏水100ml中，混匀。
3．1mol/L碳酸钾溶液称取无水碳酸钾69.1g，用蒸馏水溶解后稀释至500ml。
4．72.5mmol/L亚硝酸钠溶液称取亚硝酸钠0.5g，用蒸馏水溶解至100ml，临时配制。
5．7.2mmol/L对硝基苯胺溶液称取对硝基苯胺0.1g，溶于0.2mol/L盐酸中，加0.2mol/L 盐酸稀释至100ml。于棕色瓶中，置冰箱保存。
6．重氮化对硝基苯胺溶液将试剂4和5等体积混合，临时配制。
7．氯仿(AR)。
8．0.1mol/L氢氧化钠溶液。
9．100μg/ml VMA标准贮存液准确称取VMA 5mg于50ml容量瓶中，用0.01mol/L盐酸溶解并定容。
10．20μg/ml VMA标准应用液取上述贮存液5ml，于25ml容量瓶中，用0.01mol/L盐酸定容。
【操作步骤】
1．准确留取24h尿液集尿瓶中预先加浓盐酸10ml防腐，并记录尿液总量。
2．取8支具塞试管按表12-5 操作
表12-5 尿VMA的测定步骤
加入物(ml) 测定管标准管5mol/L盐酸0.5 0.5
尿液 2.0 －VMA标准应用液－ 2.0
5.0 5.0
醋酸乙酯
振摇1min，待分层，将醋酸乙酯抽提液移至另一具塞试管
醋酸乙酯抽提液 4.0 4.0
3.0 3.0
1mol/L碳酸钾溶液
振摇1min，待分层，吸取下层碳酸钾溶液，移至另一具塞试管
碳酸钾抽提液 2.0 2.0
1.0 1.0
重氮化对硝基苯胺溶液
混匀
4.0 4.0
氯仿
振摇1min，待分层将氯仿抽提液移至另一具塞试管
氯仿抽提液 3.0 3.0
立即加0.1mol/L氢氧化钠 4.0 4.0
振摇1min，吸取上层粉红色水溶液，在500nm波长，以0.1mol/L氢氧化钠作空白调零，读取各管吸光度。
【计算】
VMA(mg/24h) =
()
1000
24
20
ml
h尿量
标准管吸光度
测定管吸光管
?
?
按VMA分子量198计算，VMA(μmol/24h)=mg/24h×5.05。
【参考范围】17.7～65.6μmol/24h(3.5～13mg/24h)。
【临床意义】
嗜铬细胞瘤患者尿中VMA排出增高，VMA排出增高也可见于神经母细胞瘤和交感神经节细胞瘤。外科手术切除肿瘤后尿中VMA水平恢复到正常范围。
高血压是神经嵴肿瘤的症状之一，据统计高血压病人中有0.1%～1%是嗜铬细胞瘤的患者，摘除肿瘤后高血压问题便得以解决。
【注意事项】
1．用醋酸乙酯抽提VMA，应用力振摇，使抽提完全。
2．用氯仿抽取颜色复合物时动作应迅速，同时应注意避光，氯仿抽取可达到纯化目的。
3．本法测定结果略高，因去甲基肾上腺素、间甲基肾上腺素等也能参与显色。
4．如无VMA，亦可用香草醛作标准液，用水配制。所得结果乘以1.3换算成VMA的量。(VMA分子量=198，香草醛分子量=152)。
5．测定前两天要停用水杨酸盐、咖啡因、利血平、单胺氧化酶制剂、氯普吗嗪等药物，不要饮茶和咖啡，以免干扰实验结果。
6．吸取氯仿抽提液后，立即加入0.1mol/L NaOH。
【评价】VMA分析的所有方法都有干扰问题，因此几乎所有的VMA分析方法在分析前都要用有机溶剂提取纯化，从方法的特异性和灵敏度考虑，HPLC法最佳，其结果基本不受外界因素干扰，精密度也比较满意。但因仪器设备昂贵，国家卫生部临床检验中心推荐对硝基苯胺法为国内常规方法，本方法检测范围从1～80mg/L之间线性良好，显色后5h内吸光度无明显变化，该方法回收率为90.25%～93%，批内CV为2.2%。在尚不具备HPLC分析条件的实验室，该方法基本能满足临床要求。
实验78 放射免疫法测定血浆醛固酮
【原理】醛固酮是肾上腺皮质球状带分泌的盐皮质激素，样品中抗原与加入定量的标
记抗原和抗体产生竞争反应，经葡聚糖T 70（DCC ）分离，测定结合部分的脉冲数，根据校正曲线计算出含量。
【试剂】
1．标记抗原[1，2，6，7-3H]醛固酮 比活性（SA ）=2.96TBq/nmol(80Ci/nmol)，工作液用无水乙醇配制成3 400dpm/20μl 。
2．抗体 用醛固酮C 3肟-牛血清白蛋白作为抗原免疫兔而得，工作稀释度为1：20 000。 3．标准 D-醛固酮(层析纯)，用无水乙醇配成100pg/μl 。 【操作步骤】
收集24h 经冰醋酸防腐的混合尿，取10ml ，用HCl 调pH 至1置24℃水解24h ，用24h 总量1%的水解尿液，加蒸馏水补足到0.5ml ，或取血浆0.5ml ，加0.1mol/L NaOH 0.2ml 和二氯甲烷6ml 抽提5min ，弃上层水液，二氯甲烷用蒸馏水洗，每次1ml ，共洗2次，1 500r/min 离心5min ，弃水液，吸取二氯甲烷双份，每份2ml ，吹干。
其他操作步骤按表12-6进行。
表12-6 醛固酮RIA 测定程序
组别
编号 (复管) 醛固酮 标准* pg μl 氚标醛固酮 dpm μl
45
℃ 吹 干
1g/L GPS ml 抗血清ml 摇 匀 后 4 ℃ 放 置 过 夜
5g/L GPS ml 2.5g/L DCC ml 总计数 1 2(T) - - 0.7 - 0.1 - 空白
3 4(N) - - 1 700 10 0.2 - 0.1 0.5 校 正 曲 线
5
6(B 0) 0 0 1 700 10 - 0.2 0.1 0.5 7 8 10 10 1 700 10 - 0.2 0.1 0.5 9 10 20 20 1 700 10 - 0.2 0.1 0.5 11 12 50 50
1 700
10 - 0.2 0.1 0.5 13 14 100 100 1 700 10 - 0.2 0.1 0.5 15 16 200 200 1 700 10 - 0.2 0.1 0.5 17
18 400 400 1 700 10 - 0.2 0.1 0.5 样品
19 20 1 700 10 - 0.2 0.1 0.5 21
22
1 700
10
-
0.2
0.1
0.5
*血浆醛固酮校正曲线为0.2, 5, 10, 20, 50，100，200pg/管
加DCC 分离剂后置4℃ 10min, 3 000r/min 离心10min, 各管吸出0.4ml 上清液放入盛有8ml 闪烁液的计数杯中，在旋涡混合器上振旋30s 避光4h 后测脉冲数。
【计算】
结合率B% =
100 dpm
dpm
总计数管样品管或标准管
尿醛固酮(μg/24h) = pg 100??
ml ml
用作测定抽提液总抽提液
血浆醛固酮(nmol/L) = pg 0277.01000
1
05100????
ml ml 用作测定抽提液总抽提液 【参考范围】
尿醛固酮含量为7.7μg/24h 尿(范围3.4～12.7)；血浆醛固酮0.41±15nmol/L 。 【临床意义】
醛固酮是调节机体水、电解质平衡的重要激素，它的作用排钾保钠，醛固酮的分泌受肾素-血管紧张素系统，垂体ACTH 及心钠素等调控和影响，引起增高的病为原发性醛固酮增多症，先天性肾上腺皮质增生，高血压，肾脏病，肝硬化。生理性增高为立位比卧位高，低钠饮食比一般饮食要高，例如在每天摄入钠在240mmol 时，血浆醛固酮为0.27nmol/L ，而饮食中含20mmol Na/d 时即升高到1.88nmol/L 。
【注意事项】 测定尿醛固酮其氚标抗原可用SA=1 665GBq/mmol 抽提万分之一的24h 混合水解尿液，所用二氯甲烷为5ml ，以后取抽提液1ml(复管)。改变的目的主要使含量落在校正曲线的灵敏部位，具体操作可根据实际情况而定。
(郑铁生)
植物激素检测方法 一、什么是植物激素？ 植物激素是植物体内合成的一系列痕量有机化合物，它在植物的某一部位产生，运输到另一个或一些部位，在极低的浓度下便可引发生理反应，几乎参与了调控植物从种子休眠、萌发、营养、生长和分化到生殖、成熟和衰老的每个生命过程，既可调控植物自身的生长发育，又通过与植物所生存的外部环境互相作用调节其对环境的适应。通过调控如细胞分裂素、油菜素内酯和生长素等植物激素的代谢可显著地改良作物的株型结构和产量构成，从而大幅度提高作物产量和品质。 植物激素主要包括生长素(auxin)、赤霉素(gibberellin，GA)、细胞分裂素(cytokinin，CTK)、脱落酸(abscisic acid，ABA)、油菜素甾醇类(brassinosteroids，BRs)、茉莉酸(jasmonic acid，JA)及其甲酯(MeJA)、水杨酸类(salicylic acids，SA)、乙烯(ethylene)和多肽激素(peptide hormones)等。 二、检测方法 科标生物检测中心可以提供各种植物样品检测服务，中心是通过权威认证的第三方机构，检测后出具权威检测报告。 三、主要分析技术 1、生物鉴定法是一类经典的植物激素检测方法，它利用激素作用于植物的组织或器官时产生的特异性反应对植物激素进行测定。 2、免疫检测技术是测定植物激素的常用方法。该方法是基于抗原和抗体的特异性结合，因此有较好的专一性。采用放射性元素标记的方法，即放射免疫分析(radioimmunoassay，RIA)，其检测灵敏度高，重复性好，但对实验条件的要求较高。 3、气相色谱火焰离子化检测法(GC-FID)和气相色谱质谱法(GC-MS)能够对所分析样品进行准确、高灵敏度测量，但由于气相色谱对样品的特殊要求，使得待测组分需具有一定挥发性，因此在植物激素样品的前处理过程中需对样品进行衍生化。 4、高效液相色谱紫外检测法(HPLC-UV)、高效液相色谱荧光检测法(HPLC-FL)和高效
性激素检查时间 对于女性不孕者或者月经不调者，通常医生会开出的月经来潮第2-5天的性激素六项检查，包括垂体分泌的促性腺激素——卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）、催乳激素（PRL），卵巢分泌的性激素——雌激素（E）、孕激素（P）、雄激素（T）。通过检测这些血清的激素水平，可了解女性的卵巢基础功能，并对生殖内分泌疾病进行诊断。 检查内分泌最好在月经来潮的第2-3天，这一段时间属于卵泡早期，可以反应卵巢的功能状态。但对于月经长期不来潮而且又急于了解检查结果者，则随时可以检查。 查基础性激素前至少一个月不能用性激素类药物，包括黄体酮、雌激素类及避孕药类，否则结果不靠谱，当然治疗后需要复查性激素者除外。 确定是来月经第3-5天，检查性激素5项即可，可以不查孕酮，孕酮应该在黄体期检查（月经21天或排卵后7天）；但不能肯定阴道流血是否月经，应该检查6项，根据孕酮P数据可以大概判断月经周期时段。月经稀发及闭经者，如尿妊娠试验阴性、阴道B超检查双侧卵巢无≥10mm卵泡，EM厚度﹤5mm，也可做为基础状态。 卵泡刺激素（FSH）和黄体生成素（LH） 1.卵巢功能衰竭：基础FSH﹥40IU/L、LH升高或﹥40IU/L，为高促性腺激素（Gn）闭经，即卵巢功能衰竭；如发生于40岁以前，称为卵巢早衰（POF）。 2.基础FSH和LH均﹤5IU/L 为低Gn 闭经，提示下丘脑或垂体功能减退，（1）下丘脑-垂体功能低下；（2）用GnRH-a垂体抑制性药物注射后；（3）妊娠期、哺乳期、雌孕激素（避孕药）治疗期间。而二者的区别需借助促性腺激素释放激素（GnRH）试验。 3.卵巢储备功能不良（DOR）：基础FSH/LH﹥2-3.6提示DOR（FSH可以在正常范围），是卵巢功能不良的早期表现， 4.基础FSH﹥12IU/L，下周期复查，连续﹥12IU/L提示DOR。 5.多囊卵巢综合征（PCOS）：基础LH/FSH﹥2-3，可作为诊断PCOS的主要指标（基础LH水平﹥10IU/L即为升高，或LH维持正常水平，而基础FSH相对低水平，就形成了LH与FSH比值升高）。 6.检查2次基础FSH＞20IU/L，可认为是卵巢早衰隐匿期，提示1年后可能闭经。 雌二醇（E2） 雌二醇：由卵巢的卵泡分泌，主要功能是促使子宫内膜增殖，促进女性生理活动。 1、基础雌二醇E2＞165.2-293.6pmol/L(45-80pg/mL)，无论年龄与FSH如何，均提示生育力下降。基础E2≥367pmol/L(100pg/mL)时，卵巢反应更差，即使FSH﹤15IU/L，也基本无妊娠可能。 2、基础雌二醇E2水平＜73.2 pmol/L，提示卵巢早衰(premature ovarian failure,POF)。 3、监测卵泡成熟和卵巢过度刺激综合征（OHSS）的指标 （1）促卵泡排出：促超排卵治疗时，当卵泡≥18mm，血E2达1100pmol/L (300pg/mL)时，停用HMG，当日或于末次注射HMG后24-36小时注射 HCG10000IU。 （2）E2﹤3670pmol/L(1000pg/mL)，一般不会发生OHSS。
植物激素测定方法述评 鲁 哲,邹振华,路 婧,王若仲* (湖南农业大学植物激素与生长发育湖南省重点实验室,长沙410128) 摘 要:分析了传统植物激素测定的方法,提出了新的技术发展下,对植物激素快速、原位实时、高灵敏、高通量检测的必要性,对植物激素测定方法的前沿技术做出分析,并初步探讨了植物激素测定技术的未来趋势。 关键词:植物激素;测定方法;原位实时;生物传感器 中图分类号:Q94-331 文献标识码:A 文章编号:1001-5280(2011)05-0531-04 DOI:10.3969/j.issn.1001-5280.2011.05.28 Research Progress on Determination of Phytohormones LU Zhe,ZOU Zhen-hua,LU Jing,WAN G Ruo-zhong* (Hunan Pr ov incial Key L abo rat or y o f Phyt ohor mo nes and G r ow th Develo pment, Hunan A g ricultural U niv ersit y,Chang sha,Hunan410128,China) Abstract:In this ar ticle,the tr aditional methods for deter mination o f phy toho rmo nes w er e analy zed,and the necessity of rapid,in situ real-t ime,hig h sensitivit y and hig h thro ughput detectio n of phy to ho rmo nes w as put fo rw ar ded under co nditio n of the development of new techniques.A t the sam e time,the fr ontier techniques fo r det erminat ion of phy toho rmo nes w er e a nalyzed,and t he developmental trend of determinatio n techniques o f phyt ohor mo nes w as discussed. Key words:P hyto hor mones;Det erminat ion metho d;Situ and r eal-time;Biosensor 植物激素是植物体内合成的对植物生长发育有显著作用的微量物质。目前,植物激素有六大类,即生长素类(Auxins)、赤霉素类(GAs)、细胞分裂素类(CTKs)、脱落酸(abscisicacid,A BA)、乙烯(ethyne, ETH)和油菜素甾醇(Brassinosteroids,BR)[1]。植物激素作为植物体内的微量信号分子,调节植物几乎所有的生长发育过程。长期以来,植物激素与植物生长调节剂一直是生物学和农学领域的研究热点,其成果为农业科技进步做出了巨大的贡献。例如,各种植物生长调节剂的广泛使用,已成为实现农作物高产优质的重要措施之一,在推动“绿色革命”、大幅度提高作物产量和保证国家粮食安全方面发挥了不可替代的作用[2]。由于植物激素在植物体内含量极低(一般每克植物组织鲜样中的含量为1～100ng),易被光解、热解和氧化,因此,如何对微量植物激素进行简便、快速和准确的定量分析,一直是植物激素研究领域的难题之一。近年 收稿日期:2011-03-23 作者简介:鲁 哲(1984-),男,内蒙古赤峰人,硕士研究生。*通讯作者。 基金项目:湖南省科研条件创新专项重点项目(2010T Y1004);教育部新世纪优秀人才支持计划项目(NCET-10-0143)。来,随着功能基因组学、代谢组学(m etabolom ics)等整体性“组学”方法的提出以及生物学研究对活细胞单分子行为测定的日益关注,对植物激素等重要代谢调节物的测定技术提出了更高的要求。同时植物激素的生理功能具有时空特异性,植物激素作用机理和信号转导等前沿领域更是迫切需要对微量植物样品的超微量植物激素进行高灵敏、原位、实时测定。研究植物激素在植物组织或细胞中的分布特点及消长规律,目前常采用化学手段对内源激素水平进行检测,但测定结果的准确性较差[3],而且无法对激素进行定位研究,因为许多激素引起的很多生理反应常发生在激素受体分布的细胞器内[2],因此对植物激素的高灵敏、高通量、原位实时测定新技术提出了迫切要求。 传统植物激素和植物生长调节剂测定方法主要有以早期简单的小麦胚芽鞘切段伸长法为代表的生物测定法[4]、以气相色谱法[5](Gas Chro matography,GC)和高效液相色谱法[6](Hig h Performance Liquid Chr omatogr aphy,HPLC)为代表的理化测定法,及以酶联免疫吸附法[7](Enzy me Linked Immune sorbent Assays,ELISA)为代表的免疫测定法。传统植物激素和植物生长调节剂测定方法各有优缺点,下面分别进行评述。
附件1 化妆品中激素类成分的检测方法Determination of Hormone Components in Cosmetics 1 范围 本方法规定了采用高效液相色谱-质谱法测定化妆品中的激素类成分，包括定性与定量。 本方法适用于膏霜乳液类、液态水基类、液态油基类、凝胶类、面膜类等化妆品中激素类成分的定性与定量。 2 方法提要 样品以乙腈为溶剂提取，采用高效液相色谱仪分离，质谱检测器检测，根据保留时间和特征离子对的相对丰度比定性、定量离子对峰面积定量，以标准曲线法计算含量。 本方法对63种激素类成分的检出限、定量下限和取样量为0.2 g时的检出浓度、最低定量浓度见表1。 表1 63种激素类成分的检出限、定量下限、检出浓度和最低定量浓度 序号中文名称英文名称检出浓度 （μg/g） 最低定量浓 度（μg/g） 检出限 （ng/mL） 定量下限 （ng/mL） 1 曲安西龙Triamcinolone 0.03 0.1 0.6 2 2 泼尼松龙Prednisolone 0.03 0.1 0.6 2 3 泼尼松Prednisone 0.03 0.1 0.6 2
序号中文名称英文名称检出浓度 （μg/g） 最低定量浓 度（μg/g） 检出限 （ng/mL） 定量下限 （ng/mL） 4 异氟泼尼松9-fluoroprednisolone 0.03 0.1 0.6 2 5 氢化可的松Hydrocortisone 0.03 0.1 0.6 2 6 可的松Cortisone 0.03 0.1 0.6 2 7 甲基泼尼松龙Methylprednisolone 0.03 0.1 0.6 2 8 倍他米松Betamethasone 0.03 0.1 0.6 2 9 地塞米松Dexamethasone 0.03 0.1 0.6 2 10 氟米松Flumethasone 0.03 0.1 0.6 2 11 倍氯米松Beclomethasone 0.03 0.1 0.6 2 12 曲安奈德Triamcinolone acetonide 0.03 0.1 0.6 2 13 地索奈德Desonide 0.03 0.1 0.6 2 14 氟尼缩松Flunisolide 0.03 0.1 0.6 2 15 氟轻松Fluocinolone acetonide 0.03 0.1 0.6 2 16 曲安西龙双醋酸酯Triamcinolone diacetate 0.03 0.1 0.6 2 17 氟氢缩松Fludroxycortide 0.1 0.3 2 6 18 泼尼松龙醋酸酯Prednisolone 21-acetate 0.03 0.1 0.6 2 19 氟米龙Fluoromethalone 0.03 0.1 0.6 2 20 氢化可的松醋酸酯Hydrocortisone 21-acetate 0.03 0.1 0.6 2 21 氟氢可的松醋酸酯Fludrocortisone 21-acetate 0.03 0.1 0.6 2 22 地夫可特Deflazacort 0.03 0.1 0.6 2 —2 —
当你因为不孕、自然流产、月经失调、闭经到医院看病时，医生经常会给你开一项检查：性激素六项。你拿到这个检验报告单的时候，常被上面密密麻麻的数字弄得云山雾罩，即使医生给你做了解释，也只是寥寥数语(原谅医生，她们的确没有足够的时间给你解释)，结果你还是不得要领。本文教你如何去做、去阅读、去解释这六项激素 一、六项激素的名字分泌场所常用单位 激素名字分泌场所常用单位 --------------------------------------------------------------------- 卵泡刺激素（FSH）脑垂体IU/L （mIU/mL） 黄体生成素（LH）脑垂体IU/L（mIU/mL） 泌乳素（PRL）脑垂体ng/ml（ug/L） 雌二醇（E2）* 卵巢pg/ml ，或pmol／L 孕激素（P）** 卵巢ng/ml，或nｍoｌ／L 睾酮（T）卵巢ng/ml ，或nｍoｌ／Ｌ ------------------------------------------------------------------ * 雌二醇：1 pg/ml =3.67pmol/L ** 孕酮：1 ng/ml =3.18 nmol/L 二、如何抽血？ 除了孕激素（P）以外，其它五项的抽血时间应该是在月经周期的第2-4天（见血算是第一天），这时候查的结果代表一个人的进基础激素水平。通常空腹、上午抽血为宜。抽血前静坐半小时以上，避免激素水平因为运动而产生波动。孕激素（P）应该在月经周期的第22-24天抽血（见血算是第一天）。睾酮(T)和泌乳素（PRL）不受月经周期的限制，也就是说在任何一天抽血均可。泌乳素抽血最好在上午10:00至11:00之间，抽血之前静坐1小时以上方好。如果你闭经3-6个月以上，并且没有怀孕，你可以任何一天抽血均可。如果你已经怀孕了，那么通常只查孕激素和雌激素（和HCG），其它激素就不必查了。 雌二醇（E2），月经期和早卵泡期通常维持在较低的水平。在排卵前有一个高峰，黄体期则维持较长时间的平台期，月经来潮则迅速下降。 孕激素（P）在排卵前始终维持低水平。排卵后黄体逐渐成熟并分泌大量孕激素。排卵后8-9天（就是周期的第22-24天）黄体达到成熟的高峰，这就是为什么大夫通常在月经期让你查的是内分泌五项，而不是六项。因为排卵前检查孕激素没有意义。大夫建议你在月经的第22-24天抽血查孕激素水平，目的是检查有没有排卵。
甲状腺激素及有关蛋白测定 甲状腺分泌的激素包括甲状腺素(thyroxine,T4)和少量三碘甲腺原氨酸(triiodothyronine, T3)，它们都是含碘的氨基酸衍生物。甲状腺上皮细胞可通过细胞膜上的“碘泵”主动摄取血浆中的碘。经细胞中过氧化物酶的作用，碘可转变生成形式尚不清楚的“活性碘”，故临床常利用抑制过氧化物酶的药物如硫氧嘧啶、他巴唑等治疗甲状腺功能亢进（hyperthyroidism）。“活性碘”与存在于甲状腺滤泡上皮细胞内的甲状腺球蛋白（thyroglobulin，TG）上的酪氨酸残基结合（碘化），逐步缩合生成T4、T3。含有T4和T3的TG随分泌泡进入滤泡腔中储存。在垂体分泌的促甲状腺激素（thyroid stimulating hormone,TSH）的作用下，TG被蛋白酶水解，释放出T4、T3，扩散入血。 血液中的甲状腺激素中90%为T4，T3仅为2%。T3的主要来源是周围组织中T4在5’位脱碘后生成。但是T3的生理活性比T4高，占正常甲状腺激素总活性的2/3。如T4在5位上脱碘，则生成反三碘甲腺原氨酸（reverse T3, rT3），rT3基本没有甲状腺激素的生理活性，但在甲状腺疾病和许多非甲状腺疾病时出现有病理意义的变化。 血浆中的T3和T4绝大部分与血浆甲状腺素结合球蛋白（thyroxin binging globulin, TBG）结合运输，但只有游离的甲状腺激素才有生物活性。血清中甲状腺激素测定包括总T4（TT4），总T3（TT3），游离T4（FT4），游离T3（FT3）和反T3(rT3)，FT4和FT3不受血液TBG的影响，直接反映甲状腺功能状态。另外还有TBG和抗甲状腺自身抗体检测等。 ㈠适应症：用于评价甲状腺功能状态以及对甲状腺功能亢进（甲亢）、甲状腺功能低下（甲低）、自身免疫性甲状腺疾病、其他疾病所致甲状腺功能异常等疾病的诊断、疗效观察及预后估计。 ㈡标本采集：血清或血浆，一般多用血清。 ㈢检测方法：甲状腺激素的测定大多采用标记免疫的方法直接测定血清中的激素浓度。包括放射免疫法(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、均相酶放大免疫法(EMIT)、化学发光免疫分析(LIA)及荧光免疫法等。 ㈣参考范围 1、TT4：①新生儿129~271 nmol/L，②婴儿90~194 nmol/L，③1~5岁94~194 nmol/L，④6~10岁83~172 nmol/L，⑤10~60岁65~155 nmol/L；⑥妊娠5个月79~227 nmol/L；⑦＞60岁：男65~129nmol/L，女71~135 nmol/L（RIA）。 2、TT3：①脐带血~ nmol/L，②新生儿~ nmol/L，③1~5岁~ nmol/L，④6~10岁~ nmol/L，⑤11~15岁~ nmol/L，⑥15~60岁~ nmol/L，⑦大于60岁：男~ nmol/L 女~ nmol/L（RIA）。 3、FT4：~ pmol/L，FT3 ~ pmol/L，rT3 ~ nmol/L，TBG 15~34 mg/L（RIA）。
性激素六项临床意义 1.促黄体生成素（LH） 在女性体内，LH在月经周期的卵泡期与FSH一起促进卵泡的成熟，雌性激素的合成和分泌，促进排卵和使排卵后的卵泡转变成黄体并促进黄体合成孕激素和雌性激素。因此LH测定可用预测排卵和排卵异常的诊断。但口服避孕药、超排卵药、激素替代治疗、卵巢切除术等也可影响黄体生成素水平，男性LH则促进睾丸间质细胞增生，并促进合成和分泌睾丸酮。临床意义：增高常见于称为克氏综合征的先天性曲细精管发育不良、促性腺激素分泌细胞瘤、原发性性腺功能减退症等。减低常见于西蒙氏病、席汉氏综合征、肥胖性生殖器退化综合征、睾丸肿瘤、卵巢肿瘤等。 促卵泡激素（FSH）： 主要作用是促进和维持正常的性腺发育和生殖功能。FSH对男性是促进产生精子、刺激睾丸支持细胞发育。对于女性有促进卵泡生成和成熟以及促进颗粒细胞增殖的作用，促进卵泡分泌激素，并与LH协同作用促进排卵。测定FSH是研究和判断下丘脑-垂体-性腺轴功能的主要检查方法。常用于排卵时向，内分泌治疗的检测及对不孕症的诊断等。临床意义：增高常见于原发性性腺功能减退症、卵巢或睾丸发育不良、原发性卵巢功能低下、卵巢排卵功能障碍、原发性不孕、等。减低常见于多囊卵巢综合征、假性性早熟、原发性不孕、子宫内膜异位症等 垂体泌乳素（PRL）： 是腺垂体分泌的一种蛋白质激素，腺垂体是合成PRL的主要部位，主要性功能是维持产后的泌乳，同时与卵巢激素共同作用促进分娩前乳房导管和腺体的发育。临床意义：催乳素合成和释放过多将导致性腺功能低下综合症，女性PRL水平升高可引起泌乳、原因不明的不育症，无排卵伴闭经，严重者可出现重度雌激素降低。高催乳素血症是导致女性不育的常见原因。常有异常泌乳、原因不明的不育、垂体腺瘤时，是检查促乳素的适应症。应激刺激如麻醉、手术、运动、胰岛素所致低血糖等均引起PRL的分泌。手术时血清PRL可以增高5倍。 雌二醇（E2）： 为体中生物活性最强的雌激素。主要由卵巢中发育卵泡膜细胞和颗粒细胞协同分泌妊娠期间中E2 主要来源于胎儿胎盘复合体。男性主要由睾丸间质细胞合成分泌。临床意义：增高常见于女性各型性早熟，另外男性乳房发育多与激素代谢紊乱有关其中一部
对于女性不孕者或者月经不调者，通常医生会开出的月经来潮第2-5天的性激素六项检查，包括垂体分泌的促性腺激素——卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）、催乳激素（PRL），卵巢分泌的性激素——雌激素（E）、孕激素（P）、雄激素（T）。通过检测这些血清的激素水平，可了解女性的卵巢基础功能，并对生殖分泌疾病进行诊断。 检查分泌最好在月经来潮的第2-3天，这一段时间属于卵泡早期，可以反应卵巢的功能状态。但对于月经长期不来潮而且又急于了解检查结果者，则随时可以检查。 查基础性激素前至少一个月不能用性激素类药物，包括黄体酮、雌激素类及避孕药类，否则结果不靠谱，当然治疗后需要复查性激素者除外。 确定是来月经第3-5天，检查性激素5项即可，可以不查孕酮，孕酮应该在黄体期检查（月经21天或排卵后7天）；但不能肯定阴道流血是否月经，应该检查6项，根据孕酮P数据可以大概判断月经周期时段。月经稀发及闭经者，如尿妊娠试验阴性、阴道B超检查双侧卵巢无≥10mm卵泡，EM厚度﹤5mm，也可做为基础状态。 卵泡刺激素（FSH）和黄体生成素（LH） 1.卵巢功能衰竭：基础FSH﹥40IU/L、LH升高或﹥40IU/L，为高促性腺激素（Gn）闭经，即卵巢功能衰竭；如发生于40岁以前，称为卵巢早衰（POF）。
2.基础FSH和LH均﹤5IU/L 为低Gn 闭经，提示下丘脑或垂体功能减退，（1）下丘脑-垂体功能低下；（2）用GnRH-a垂体抑制性药物注射后；（3）妊娠期、哺乳期、雌孕激素（避孕药）治疗期间。而二者的区别需借助促性腺激素释放激素（GnRH）试验。 3.卵巢储备功能不良（DOR）：基础FSH/LH﹥2-3.6提示DOR（FSH可以在正常围），是卵巢功能不良的早期表现， 4.基础FSH﹥12IU/L，下周期复查，连续﹥12IU/L提示DOR。 5.多囊卵巢综合征（PCOS）：基础LH/FSH﹥2-3，可作为诊断PCOS的主要指标（基础LH水平﹥10IU/L即为升高，或LH维持正常水平，而基础FSH 相对低水平，就形成了LH与FSH比值升高）。 6.检查2次基础FSH＞20IU/L，可认为是卵巢早衰隐匿期，提示1年后可能闭经。 雌二醇（E2） 雌二醇：由卵巢的卵泡分泌，主要功能是促使子宫膜增殖，促进女性生理活动。
第十六章内分泌功能检验 第一节概述 一、激素的概念与分类 （一）概念是由内分泌细胞合成并分泌，随血液循环于全身，对特定的组织或细胞产生生物效应的一类活性物质。 广义的内分泌包括： 1.内分泌腺分泌的激素进入血液至全身，发挥远距离的调节作用。 2.旁分泌作用于邻近的靶细胞，发挥局部调节作用。 3.自分泌经细胞分泌至细胞外后，又经本身的膜受体作用于自身。 （二）分类按化学本质的不同分为四类 1.肽类和蛋白质下丘脑激素、胰岛激素、甲状旁腺素、胃肠道激素。 2.氨基酸衍生物甲状腺素、肾上腺髓质激素、松果体激素。 3.类固醇肾上腺皮质激素、性激素。 4.脂肪酸衍生物前列腺素 二、激素分泌的调节 体内的各种激素是在神经系统的参与下，通过复杂而精细的调节机制，保持在与机体发育阶段及功能状态相适应的水平。 三、激素的作用机制 （一）通过膜受体的作用机制肽、蛋白质、肾上腺髓质激素通过膜受体发
挥作用。 1. 激素与膜受体结合的特点： （1）高度专一性激素只能与它相应的受体结合。 （2）高度亲和性激素与受体有很强的亲和力，激素浓度很低亦能与受体结合。 （3）可逆性结合激素与受体是非共价键结合。 （4）量-效成正比激素与受体结合量与激素效应成正比。 （5）类似物的竞争性与激素相似的化合物可竞争性地与受体结合而抑制激素效应。 2. 作用机制 大部分含氮激素（肽类、蛋白质类、儿茶酚胺类）→激素-膜受体复合物→G 蛋白活化→激活AC→细胞内cAMP↑→激活cAMP蛋白激酶（A激酶）→某些蛋白质和酶磷酸化→变构和功能改变→生物效应。 cGMP也是细胞内传递激素信息的第二信使，但生物效应与cAMP相反。 （二）通过细胞内受体的作用机制类固醇激素、甲状腺激素。疏水性较强。 类固醇激素→通过细胞膜进入细胞内→激素-受体复合物→进入细胞核→与染色体中某基因结合→基因活化→转录出特异mRNA→释放到胞浆→翻译出相应的功能性蛋白质和酶蛋白→生物效应。 四、激素测定方法的选择和评价 （一）常用测定方法 内分泌疾病的临床生化诊断方法主要有以下三类： 1.激素调节的生理、生化过程的检测甲状腺功能紊乱时测定基础代谢率，甲状旁腺功能紊乱时血钙测定。 2. 直接检测体液激素或其代谢物的浓度可对判断有无某种内分泌病提供有价值的客观指标，在内分泌病诊断中普遍应用。 3. 动态功能试验即应用对激素分泌的前述反馈调节系统中某一环节具有特异性刺激或抑制作用的药物、激素，分别测定使用前后相应靶激素水平动态变化。动态功能试验结合其他检查手段，对导致内分泌紊乱的病变部位（环节）及病变性质的诊断很有价值。 （二）影响因素 1.生物节律性变化 2.年龄影响 3.药物影响 4.妊娠影响
甲状腺激素及有关蛋白测定 甲状腺分泌得激素包括甲状腺素(ｔhyrｏxinｅ,T4)与少量三碘甲腺原氨酸(tr ｉiodothyroｎiｎｅ, T３),它们都就是含碘得氨基酸衍生物。甲状腺上皮细胞可通过细胞膜上得“碘泵”主动摄取血浆中得碘、经细胞中过氧化物酶得作用,碘可转变生成形式尚不清楚得“活性碘”,故临床常利用抑制过氧化物酶得药物如硫氧嘧啶、她巴唑等治疗甲状腺功能亢进(hｙperｔhｙｒoidism)。“活性碘”与存在于甲状腺滤泡上皮细胞内得甲状腺球蛋白(thyroglｏbｕlin,ＴG)上得酪氨酸残基结合(碘化),逐步缩合生成Ｔ4、T3。含有T4与T３得TG随分泌泡进入滤泡腔中储存。在垂体分泌得促甲状腺激素(thyroid sｔimulａtｉng hormone,T ＳH)得作用下,ＴG被蛋白酶水解,释放出Ｔ4、T3,扩散入血、?血液中得甲状腺激素中９0％为Ｔ4,Ｔ3仅为2％。T3得主要来源就是周围组织中Ｔ4在５’位脱碘后生成。但就是T3得生理活性比T4高,占正常甲状腺激素总活性得2/3、如T ４在５位上脱碘,则生成反三碘甲腺原氨酸(ｒeveｒｓe T3, rT3),rT３基本没有甲状腺激素得生理活性,但在甲状腺疾病与许多非甲状腺疾病时出现有病理意义得变化、?血浆中得T3与T4绝大部分与血浆甲状腺素结合球蛋白(thyroxin b ｉｎgiｎｇ globulin, ＴBG)结合运输,但只有游离得甲状腺激素才有生物活性。血清中甲状腺激素测定包括总T４(TT４),总T3(TT3),游离Ｔ4(FT4),游离 T3(FT3)与反T3(ｒT３),FT4与FＴ３不受血液TＢＧ得影响,直接反映甲状腺功能状态。另外还有TBG与抗甲状腺自身抗体检测等。 ㈠适应症:用于评价甲状腺功能状态以及对甲状腺功能亢进(甲亢)、甲状腺功能低下(甲低)、自身免疫性甲状腺疾病、其她疾病所致甲状腺功能异常等疾病得诊断、疗效观察及预后估计、 ㈡标本采集:血清或血浆,一般多用血清。?㈢检测方法:甲状腺激素得测定大多采用标记免疫得方法直接测定血清中得激素浓度。包括放射免疫法(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、均相酶放大免疫法(ＥMＩT)、化学发光免疫分析(LIA)及荧光免疫法等、?㈣参考范围 1、TT4: ①新生儿1２9~271 nｍoｌ/Ｌ,②婴儿90~１９4 ｎmｏl/L,③1～5 岁 94～194 nｍol/L, ④６~10岁 8３~１７2 ｎｍｏｌ/L,⑤１0~６0岁65～ 15５ nmol/L;⑥妊娠5个月７9~２27 nmｏl/L;⑦＞６０岁:男 65~12９nmol/L,女 71~１35 ｎmoｌ/Ｌ(RIＡ)。 2、ＴＴ3: ①脐带血 0、5~1。1 nmol/Ｌ,②新生儿１。2~4、0 ｎｍｏｌ/Ｌ, ③１～5岁１、5～４。0 nｍol/Ｌ,④6~10岁 1、4～３、7 ｎｍol／L, ⑤1１～15岁 1.2～3.2 nｍoｌ/Ｌ,⑥１5～6０岁1。８～2、９ｎmol/Ｌ,⑦大于60岁:男 1、６~2。７ nmol/L女１.7～3.2 nmol/L(RIA)。 3、FT4:1０。3～2５.8 pmoｌ／L,ＦＴ3 2.16～6、78 pmol/L,rT3 ０。3８～１、16 nmol/L,TBG 15～3４ｍｇ/Ｌ(RIA)。?㈤临床意义 1、ＴT4、TT3?⑴血清TT４得增加见于甲亢与TBG增加,TＴ４降低见于甲低、TＢG减少、甲状腺炎、药物影响(如服用糖皮质激素等)。?⑵血清TT3就是诊 断甲亢最可靠与灵敏得单项指标,尤其就是对诊断T3型甲亢得病人有特殊意义,这类甲亢病人血清ＴT4浓度不高但ＴT3却显著增高。?⑶低Ｔ3综合征:在饥饿、慢性消耗性疾病(如肝硬化、未控制得糖尿病等)时,外周Ｔ4转变为rＴ3增加, 转变为Ｔ3减少,此时血清T４正常而Ｔ３减少,即所谓得低T３综合征、?2、FT ４、ＦT3
下丘脑-垂体-卵巢构成一个轴系（HPOA），下丘脑调节垂体功能，垂体调节卵巢功能，卵巢激素再作用于多种靶器官如子宫等，同时卵巢激素对下丘脑-垂体有正、负反馈调节作用。HPOA的功能正常，是维持女性生育功能的基本条件之一。月经的正常生理、卵子的发育成熟、受精、早期胚胎的着床发育，均是在内分泌系统和神经系统调控下进行的，有赖于体内正常的内分泌环境。正常女性卵巢每月经历1次周期性变化。在卵泡早期，血清卵泡刺激素（FSH）水平逐渐升高，卵巢内一组窦状卵泡群被募集，FSH使颗粒细胞继续增殖，激活颗粒细胞的细胞色素P450芳香化酶，促进雌二醇（E2）的合成与释放。到月经周期第7天，被募集的发育卵泡群，FSH 阈值最低的卵泡优先发育成为优势卵泡，优势卵泡生成和分泌更多的E2，反馈抑制了垂体FSH 的分泌，使其它卵泡逐渐退化。优势卵泡决定了该周期卵泡期的期限，血清及卵泡液E2水平与优势卵泡的体积呈正相关关系。月经周期第11～13天，优势卵泡迅速增大，分泌E2，达到300pg/ml（1100pmol/L）左右，由于E2高峰的正反馈作用，垂体大量释放黄体生成素（LH）及FSH，使卵母细胞最终成熟并发生排卵。排卵后的优势卵泡壁细胞结构重组，颗粒细胞与卵泡内膜细胞黄素化，约在排卵后5天内先后形成血体及黄体，黄体可生成与分泌孕酮（P）及E2，为接纳孕卵着床及维持早期胚胎发育做准备，排卵后5～10天黄体功能最旺盛。若卵子未受精，黄体的寿命为14?2天，黄体退化使血E2、P水平下降，FSH水平又升高，新的卵巢周期开始；若卵子受精着床，则黄体在人绒毛膜促性腺激素（HCG）作用下转变为妊娠黄体，至妊娠3个月末才退化。检测女性H-P-O-A各激素的水平，对不孕症的病因诊断、疗效观察、预后判断及生殖生理作用机制的研究具有重要意义。激素水平的测定一般抽取外周血检验，常用方法有放射免疫测定法和化学发光法。 一、性激素6项测定要求 1．血清生殖激素检查前至少1个月内未用过性激素类药物，避免影响检查结果（雌孕激素治疗或促排卵治疗后复查除外）。月经稀发及闭经者，如尿妊娠试验阴性、阴道B超检查双侧卵巢无＞10mm卵泡，子宫内膜（EM）厚度＜5mm，也可做为基础状态。 2．按临床需要检查 ⑴基础性激素：月经周期2～5天测定性激素称为基础性激素测定。基础LH、FSH、E2测定时间应选择月经周期2～5天进行，第3天最佳；周期短于28天者，检查时间不超过第3天，周期＞30天者，检查时间最晚不超过第5天。泌乳素（PRL）、睾酮（T）可在月经周期任一时间测定。 ⑵卵泡晚期（D12～16）：卵泡接近成熟时测定E2、LH、P，预测排卵及注射HCG的时机和用量；测定P值估计子宫内膜容受力。 ⑶PRL测定：可在月经周期任一时间测定，应在上午9～11时、空腹、安静状态下抽血。PRL 显著升高者，一次检查即可确定，轻度升高者，应进行第二次检查，不可轻易诊断高泌乳素血症（HPRL）而滥用溴隐亭治疗。 ⑷雄激素：常用的检测指标为血清睾酮、雄烯二酮、硫酸脱氢表雄酮。单独检测睾酮意义较小，评价高雄激素血症的生化指标主要依靠游离睾酮。 ⑸P：选择黄体期测定（D21～26天），了解排卵与否及黄体功能。 二、性激素6项测定的临床意义 ㈠雌激素 育龄期妇女体内雌激素（E）主要来源于卵巢，由卵泡分泌，分泌量多少取决于卵泡的发育和黄体功能。孕妇体内雌激素主要由卵巢、胎盘产生，少量由肾上腺产生。妊娠早期E主要由黄体产生，于妊娠10周后主要由胎儿-胎盘单位合成。至妊娠末期，E2为非妊娠妇女的100倍。 雌激素包括雌二醇（E2）、雌酮(E1)、雌三醇(E3)。E2是生物活性最强的雌激素，是卵巢产生的主要激素之一；E3是E2和E1的降解产物，活性最弱，其相对比为100:10:3。 雌二醇检验值系数换算：pg/ml?3.67=pmol/L
生殖激素测定常用方法研究 在女性不育不孕、生殖内分泌疾病、月经不规则等疾病的诊治及激素替代治疗（HRT）时体内激素监测中，生殖激素的测定是必需的手段之一。临床上经常测定的激素有：性激素（包括雌激素、孕激素、雄激素）、促性腺激素（包括卵泡刺激素、黄体生成素）、垂体泌乳素等。 目前临床上用于激素测定的常用方法有：（1）放射免疫分析法（radioimmunoassay，RIA）；（2）酶联免疫吸附分析法（enzyme labled immunosorbent assay ELISA）；（3）免疫放射分析法（immuno radio metric assay，IRMA）；（4）时间分辨荧光免疫分析法（DELFIA）；（5）酶放大化学发光法（IMMULITE）；（6）电化学发光法（ELECSYS）。 虽然，随着技术的进步新的测定方法在不断问世，但各种测定方法并没有离开标记免疫学测定的基本原理，只是测定的速度、精度和自动化程度有所不同。因此，同一份标本用不同的测定方法，其结果可有所不同，但总的趋势是一致的。 3 激素含量常用的单位有 （1）LH、FSH：IU/L，mIU/ml;（2）PRL：ng/ml或μg/L （3）E2：pg/ml（旧），pmol/L（法定）（旧→法定转移系数3.67）；（4）P：ng/ml（旧），nmol/L（法定）（旧→法定转换系数3.18）；（5）T：ng/dl（旧），nmol/L（法定）（旧→法定转换系数0.0347）。用不同的单位表示，其正常范围的数值可不同。 4 激素测定的目的与选择 4.1 辅助诊断月经紊乱、闭经的原因 生殖激素紊乱常常是月经紊乱、闭经的主要原因，对月经紊乱、闭经患者做LH、FSH、E2、P、PRL测定，结果可表现为：（1）PRL升高，同时伴有E2、P水平降低，此为高PRL血症引起的卵泡发育与排卵障碍；（2）PRL正常范围，LH、FSH水平增高但在正常范围，尤其LH 增高较多，可达天天论文网编辑初审扣扣1550116010FSH的2倍，E2正常，P持续低水平，提示排卵障碍-多囊卵巢综合征可能；（3）PRL正常范围，LH、FSH、E2、P均低水平，提示垂体或垂体以上部分功能障碍，需做垂体兴奋试验以明确诊断；（4）PRL正常范围，E2、P持续低水平，如E2<73 pmol/L，P<2 nmol/L，而LH、FSH均>40 IU/L，提示卵巢功能衰退。 4.2 判断体内激素水平是否真正处于绝经期 对疑为更年期综合征的病人，有条件的情况应做LH、FSH、E2直
植物激素的酶联免疫吸附测定法（ELISA）---小麦 材料、试剂及设备 1 材料 各种新鲜植物材料 2 仪器设备 研钵，冷冻离心机，台式快速离心浓缩干燥器或氮气吹干装置，酶联免疫分光光度计，吸水纸，恒温箱，冰箱，酶标板（40孔或96孔），可调微量液体加样器（10μl，40μl,200μl,1000μl），带盖瓷盘（内铺湿纱布）。 3 试剂 (1) 磷酸盐缓冲液（PBS）：称取8.0g NaCl, 0.2g KH2PO4 , 2.96g Na2HPO4 ·12H2O，用量筒加1 000 ml蒸馏水，pH为7.5。 (2) 样品稀释液：500 ml PBS中加0.5 ml Tween-20，0.5g明胶（稍加热溶解）。 (3) 底物缓冲液：称取5.10g C6H8O7·H2O（柠檬酸）， 18.43g Na2HPO4·12H2O，用量筒加1 000ml蒸馏水，再加1 ml Tween-20，pH为5.0。 (4) 洗涤液：1000ml PBS加1mlTween-20。 (5) 终止液：2mol/L H2SO4。 （6）提取液：80％甲醇，内含1 mmol/L BHT(二叔丁基对甲苯酚，为抗氧化剂，先用甲醇溶解BHT，再配成80%的浓度))。 操作步骤 1．样品中激素的提取 （1）称取0.5g左右新鲜植物材料，加2ml样品提取液，在冰浴下研磨成匀浆，转入10ml 离心管，再用3ml提取液分次将研钵冲洗干净，一并转入试管中，摇匀后放置在4℃冰箱中。（2）4℃下过夜提取，3500转/min离心8min, 取上清液，残渣弃去。 （3）上清液过C-18固相萃取柱。具体步骤是： 80%甲醇（1ml）平衡柱→上样→收集样品→移开样品后用100%甲醇（5ml）洗柱→100%乙醚（5ml）洗柱→100%甲醇（5ml）洗柱→循环。 （4）将过柱后的样品转入25ml小烧杯中，真空浓缩干燥或用氮气吹干，除去提取液中的甲醇，用1ml样品稀释液定容。 2．样品测定（本指南所用的量是按一块96孔板计算的） 竞争：即加标准物、待测样和抗体。 加标样及待测样：取适量所给标样稀释配成： ABA， ZR标准曲线的最大浓度为100ng/ml,然后再依次2倍稀释8个浓度（包括2个0ng/ml，加入前两行的最后两排）。将系列标准样加入96孔酶标板的前两行，每个浓度加2孔，每孔50μl,其余孔加待测样，每个样品重复3孔，每孔50μl。 加抗体：在5ml样品稀释液中加入一定量的抗体（最适稀释倍数见试剂盒标签,如稀释倍数是1：2000，就要加2.5μl的抗体）,混匀后每孔加50μl，然后将酶标板加入湿盒内开始竞争。 竞争条件37℃左右0.5h。
浅谈内分泌科室常见激素的检测方法 1.糖化血红蛋白 离子交换高效液相色谱分析法-检测糖化血红蛋白HbA1c的金标准。基于血红蛋白b链N末端缬氨酸糖化后所带电荷不同而建立。在中性pH条件下，HbA1c 携带的正电荷相对较少,因此可通过HPLC法将其与其它组(HbA1c，HbA1b，HbA1a，HbF，HbA0)区分开，得到分离。此方法曾应用于美国DCCT的研究，是目前检测HbA1c的金标准。 2.肾素-血管紧张素-醛固酮系统 2.1放射免疫学方法：这是历史最长也是目前应用最广泛的方法。基本原理是通过测量肾素催化血管紧张素原反应产生血管紧张素I的速度来评价RAS的活性。现在我国普遍使用的是由北方生物技术研究所生产的放射免疫法制剂，肾素的线性范围0.19-6.10ug/L，灵敏度是0.1ug/L。 2.2高效液相色谱法：目前这种方法仅用于科研，还未对人类得标本的检测报道。 2.3酶联免疫吸附法：这种方法的局限性是测得总的肾素含量，包括无活性的肾素。由于ELISA的灵敏性不如放射免疫法，而血浆中的肾素含量又比较少，限制了ELISA方法在肾素检测中的应用。 2.4荧光免疫法：近年来有人用荧光免疫法测肾素的浓度，而且与放射免疫法和ELISA的方法比较，敏感度更好，检测限为0.1mU/L的肾素，样品回收率>90%，标准差比放射免疫法低32%，而且延长全血在室温下放置的时间不影响结果。 虽然目前有许多方法可以测RAS的活性，但是，各自都有一些局限性限制了它们的广泛应用。放射免疫法是现在RAS检测中的金标准。它测的是有活性的肾素，而其他方法测得是总的肾素。但实验中需要用到放射性物质，不可避免地会
植物激素的检测方法 摘要：植物激素是植物体内的微量信号分子，它们几乎调节着植物生长发育的所有过程，植物，植物激素的检测常用方法有 关键词：植物激素的检测；生物试法；色谱检测法；免疫检测法 1 植物激素的介绍 植物激素是指植物细胞接受特定环境信号诱导产生的、低浓度时可调节植物生理反应的活性物质。 植物激素有六大类：即生长素（auxin）、赤霉素（GA）、细胞分裂素（CTK）、脱落酸（abscisic acid，ABA）、乙烯（ethyne，ETH）和油菜素甾醇（brassinosteroid，BR）。它们都是些简单的小分子有机化合物，但它们的生理效应却非常复杂、多样。 2 植物激素检测方法研究 2.1 生物试法 生物试法是最早检测植物激素的方法，它是依据植物激素的生理活性，通过某些植物的组织或器官产生的特异性反应来进行检测。 1928年F W Went首先建立了检测植物生长素的燕麦芽鞘弯曲测试法,但方法复杂,若没有熟练的技巧,就很难取得准确的结果。因此在1933年, Thimann K V 和J Bonner把这个方法改变了一下建立了燕麦叶鞘切断伸长法,简化了操作方法。此后,随着ABA、CTK、GA等激素的逐一发现,相应的各类激素的测定方法也被广泛建立。例如,小麦胚芽鞘切断抑制法检测ABA;烟草髓愈伤组织鉴定法和胡萝卜根愈伤组织鉴定法鉴定CTK;矮生豌豆法、大麦胚芽鉴定法和点滴法鉴定GAs等等[1]。生物试法具有简便易行的特点，能够反应植物激素的生理活性，还可以鉴定新的植物激素和生理活性物质，因此至今仍然得到广泛的应用。但其不足之处在于，植物体内往往存在许多激素分子的类似物、代谢物、拮抗物或其他干扰物质，从而影响生物试法的检测结果[2]。此外还要尽量控制环境因子和使用的植物材料的均一性，以便检测结果的准确、可靠。 20世纪90年代Wout Boerjan[3]等建立的重组DNA技术定量检测生长素和细胞分裂素的方法可谓是这一领域的一个重要进展。这一方法主要利用生长素和细胞分裂素诱导构建Pg5-GUS基因表达,通过测量表达产物定量检测IAA和CTK建立起来的,其检测灵敏度为IAA达5×10-8mol,反ZT达5×10-11mol。此法不象经典的生物试法那样,只对一种激素专一,它能同时检测生长素和细胞分裂素的活性;此法从分子水平着手,以茎段、胚芽鞘和愈伤组织作为分析材料,细胞更具同源性和一致性。 2.2 生物鉴定法 生物测试法是最早采用的植物激素测定方法，它是利用植物激素的生理活性，通过某些植物的组织和器官对植物激素，产生的特异性反应进行测定的。但