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DIG试剂盒说明书(CSPD)中文翻译版

只用于生命科学研究,不能用于诊断程序

仅用于体外实验

DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅡ

采用地高辛-dUTP进行随机引物DNA标记,碱性标记,利用CSPD化学发光检测,随时即用。

货号:11 585 614 910

此试剂盒储存条件:-15℃到-25℃。

此试剂盒可对10ng-3μgDNA进行12次标记反应,

可检测10×10cm2面积的杂交膜24张。

指导手册

2005.12 版

1 前言

1.1 内容表

1 前言

1.1 内容表

1.2 试剂盒成分

2.介绍

2.1 产品简介

3. 操作步骤和所需材料

3.1 在你开始前

3.2 流程图

3.3 地高辛标记DNA

3.4 标记效率的确定

3.5 DNA的转移和固定

3.6 杂交

3.7 免疫检测

3.8 DNA印记的洗脱和再杂交

4. 附录

4.1 故障排除

4.2 参考文献

4.3 订购信息

1.2 试剂盒的成分

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附加仪器与所需试剂

除了上表中列出的试剂外,你必须准备一些溶液。在下表中,你可以找到不同操作程序需要准备的设备概要。

在每个操作程序的前面提供了详细的信息。

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*标记的产品可以从Roche Applied Science 获得。

2.介绍

2.1 产品概况

实验原则

此试剂盒采用DIG(地高辛),一种甾类半抗原,steroid hapten 去标记DNA探针用于杂交和后续的免疫检测[1,2,3]。

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图1 DIG-dUTP ,碱性标记

图2 CSPD反应

应用

地高辛标记DNA探针可以用于:所有类型的滤膜杂交

总基因组DNA中单拷贝基因的检测,甚至对于高度复杂的生物体也可以进行检测,如人,大麦和小麦。

样品材料

至少100bp的DNA片段

线性的质粒,cos质粒或者DNA

超螺旋的DNA

实验时间

此表格列出了每一步实验所需的反应时间。

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检测数量

一个试剂盒足够用于:

12个标准的标记反应,每个反应的膜板DNA不超过3μg;并可以检测24张10×10cm2的杂交膜。

质量控制

根据操作步骤中的说明对未标记的对照DNA pBR328进行标记,并按照下面的标准检测操作方法在点杂交中用50ng的异源的DNA稀释0.1pg 同源DNA,用即时可用的CSPD,X光片曝光30分钟进行检测。试剂盒的储存和稳定性

未开封的试剂盒在保质期内可以稳定的存放在-15℃到-25℃(保质期印在标签上)。在干冰中运输。

一旦开封,请根据下表选择适宜的储存条件。

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灵敏度和特异性

采用southern杂交从0.3μg人胎盘 DNA(经BglⅡ或EcoRⅠ酶切)中检测到单拷贝基因(组织纤溶酶原激活因子tPA)。

优点

此表描述了这个试剂盒的优点和特征

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3.实验步骤和所需材料

3.1 在你开始前

主要的操作要求

此表中描述了地高辛标记和检测中主要的提示:

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3.2 流程图

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3.3 地高辛标记DNA

介绍

随机引物标记的DNA带有地高辛-11-dUTP,这一标记采用的是地高辛高效引物试剂,这是一种含有随机六碳糖,dNTP混合物的5×浓度标记混合物,其中dNTP混合物包括碱性标记的地高辛-11-dUTP,

标记级的Klenow酶和适合的反应缓冲液。

附加设备和所需试剂

此表中列出了成分,储存条件和除了试剂盒成分外所需试剂的用途。

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模板DNA

下表中列出了模板DNA所需特征:

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标记从琼脂糖凝胶上分离的DNA

如果你想要完成基因组的southern 杂交,你应该利用琼脂糖凝胶电泳将插入载体的模板DNA从载体上分离出来。

为了从凝胶中分离DNA,你可以用琼脂糖凝胶DNA提取试剂盒(the Agarose Gel DNA Extraction Kit)进行大小在400bp-5kbp范围内DNA片段的回收。这一试剂盒既可以用于标准琼脂糖凝胶也可用于低熔点琼脂糖凝胶。然后,不需要进一步纯化即可对DNA片段进行高效的地高辛标记。然后标记好的探针应该用高效的PCR产物纯化

试剂盒(High Pure PCR Product Purification Kit)进行纯化,以去除残留的琼脂糖颗粒。

步骤

此步骤用于标记10ng-3μg DNA 。可以通过扩大所有成分和体积标记更大量的DNA(最高达10μg)。

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标记反应的产量

表1:

此表向您展示了在适宜条件下地高辛高效引物标记的产量。在标准反应中每个实验采用1μg DNA 作为模板。1小时内,大约有15%的核苷酸参与到了0.8μg新合成的地高辛标记DNA中。20小时后消耗了大约38%的核苷酸。

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使用DIG-High-Prime溶液,增加不同模板DNA的量进行反应,并检

测反应1小时和反应20小时的差异。地高辛标记DNA的产量由放射线示踪器进行测定,并通过斑点杂交进行证实(10个独立标记实验的平均值)。

图3 来自于不同量模板DNA的地高辛标记DNA在37℃孵育1小时和20小时后的产量

3.4 标记效率的确定

介绍

地高辛标记DNA产量的确定对于获得最佳的,具有可重现性的杂交结果十分重要。在杂交混合物中探针浓度过高容易产生背景,而太低浓度则容易导致信号弱。

实验原则

检测标记探针质量的好方法是直接检测法。

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所需附加溶液的制备

请找出下表中的成分和所需制备的试剂。下表中的缓冲液也可以在地高辛洗涤和封阻缓冲液无DNA酶和RNA酶系列产品中获得。

请注意:标记效率确定实验中检测部分所需的试剂和工作试剂应与你的杂交实验(请看3.7章)中化学发光检测使用的试剂一致。这些试剂可以大量制备,在第3.7章中也将用到。

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试剂盒工作溶液的制备

下表中列出试剂盒工作溶液的制备方法:

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稀释系列

根据合成核苷酸的预期产量开始下面的的系列稀释,标记的探针和地高辛标记的对照DNA(2号管)应该稀释到1ng/μL。利用第3.3

章中图表可以最好的估计出在你的探针中地高辛标记DNA的预期产量。产量取决于起始时的模板量和孵育时间。

注意:表1中给出的产量是采用高纯度的DNA模板在最佳条件下生产出的。

按照下表中的描述对你标记的探针和你的对照DNA进行一系列的梯度稀释。

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