广西师范大学
硕士学位论文
罗汉果蛋白酶的分离纯化及性质研究
姓名：刘国雄
申请学位级别：硕士
专业：有机化学
指导教师：苏小建
20070101
罗汉果蛋白酶的分离纯化
及性质研究
年级：2004级学院：化学化工学院专业：有机化学
研究方向：天然产物化学研究生：刘国雄导师：苏小建高工
中文摘要
罗汉果（Siraitia grosvenorii）是我国特有的植物，主产于广西桂林，在医药、食品、保健等方面应用广泛，在国内外市场都受到极大的欢迎。但目前对罗汉果的加工利用仅仅局限于果实中少数几种成分，而其它许多有用成分并没得到充分利用，这既浪费了资源又给环境造成很大污染。此外，蛋白酶是目前工业用酶的三大主要酶制剂之一，在食品、化工、医疗、制药等方面应用广泛。而有限的蛋白酶源与逐年上升的市场需求相比已呈紧缺之势，因此有效地开发新的蛋白酶源已经迫在眉睫。
本论文在前人研究的基础上进一步对罗汉果蛋白酶的分离纯化、性质、应用以及提取工艺等方面进行了深入的研究，以便更全面地了解罗汉果蛋白酶的结构、性质和特点，为开发新的蛋白酶源和有效地综合利用我国特有的罗汉果资源提供一定的科学依据。现将研究结果总结如下：
一、罗汉果蛋白酶的分离纯化
以鲜罗汉果为原料，经洗净，去皮，粉碎，匀浆，离心去渣，得罗汉果汁，再经50%饱和度硫酸铵盐析，沉淀透析，冷冻干燥得罗汉果粗酶。粗酶通过CM Sepharose FF离子交换、Sepahcryl S-200 HR凝胶过滤、Sepahcryl S-100 HR凝胶过滤柱层析分离，得到纯化的罗汉果蛋白酶，再将其进行SDS-PAGE和凝胶过滤HPLC分析均显示单一的蛋白质条带或蛋白质峰。纯化后蛋白酶的酶比活为9.4×107U/g，与果汁相比蛋白酶活性回收率为4.2%，提纯倍数为31倍。
二、罗汉果蛋白酶的性质研究
由分离纯化得到的蛋白酶，经凝胶HPLC测定其纯度在98%以上，SDS-PAGE 和Sephacryl S-100凝胶过滤柱层析测定蛋白酶的相对分子质量分别约为37100D 和38200D。蛋白酶的活性在pH12时最大，可将该酶归类为碱性蛋白酶。紫外光谱显示酶在220nm和280nm处有强吸收，推测在酶分子中可能存在含苯环侧链的氨基酸残基。其它酶活性测定显示该酶不具有胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、过氧化物酶、淀粉酶及脂肪酶活性。此外，大豆胰蛋白酶抑制剂不能抑制该蛋白酶的活性，这也说明该蛋白酶不属于胰蛋白酶。
为了探索罗汉果蛋白酶活性所必需的氨基酸侧链基团，实验用对不同的氨基酸残基有专一性作用的各种化学修饰剂与罗汉果蛋白酶反应，结果显示羟基、吲哚基和咪唑基的修饰对罗汉果蛋白酶活性有很大的抑制作用。进一步用酪蛋白作底物保护蛋白酶中的羟基、吲哚基和咪唑基，以使它们不被修饰，结果显示蛋白酶活性与保护前的酶活性相比有很大的提高。由此确定羟基、吲哚基和咪唑基参与了罗汉果蛋白酶和酪蛋白底物的结合，为罗汉果蛋白酶的活性必需基团。
三、金属离子、化学试剂和表面活性剂对蛋白酶活性的影响
在常见金属离子中，Cu2+ 对蛋白酶活性影响最大，5mmol/L的Cu2+能使酶活性降低到原来的25.8%，此外Al3+、Ni2+、Mn2+也能部分抑制该酶的活性，而其它金属离子对酶活性没有大的影响，相反Fe3+和Mg2+能激活酶的活性。
0.02%的SDS 和0.1%的Triton X-100、吐温80、聚乙二醇和乙二醇对有酶活性有不同的抑制作用，其中0.01%Triton X-100对该酶活性影响最大，作用后活性仅保留57%；Na2B4O7?10H2O对酶活性有很大的增强，作用后使酶活性提高0.86倍，其它常见化学试剂和表面活性剂或增稠剂对酶活性没有明显的影响。
四、罗汉果蛋白酶的对其它蛋白质的水解作用和储存稳定性研究
实验结果显示，与对酪蛋白有很好的底物专一性相比，罗汉果蛋白酶几乎不水解牛白蛋白、卵蛋白和胰蛋白，但对明胶、溶菌酶有一定的水解活性。
罗汉果蛋白酶的稳定性研究表明，干燥、避光、低温储存和质量分数为1%半胱氨酸的添加都有利于罗汉果蛋白酶的稳定，20%的葡萄糖对储存三个星期后罗汉果蛋白酶的稳定有很好的保护作用。EDTA对罗汉果蛋白酶活性有一定抑制作用，但在储存75天后对酶活性有一定的稳定作用，以1%的浓度效果更佳。
五、罗汉果蛋白酶的提取工艺研究
以广西融安和荔蒲的不同生长期的鲜罗汉果为研究对象，罗汉果所含的蛋白质和蛋白酶活性随着生长时间延长逐渐增加，在一定的时间都有一个峰值，表现在不同的生长期，然后逐渐下将，而蛋白酶的比活力并没表现出明显的规律。
新鲜罗汉果经洗净，破碎，水提，离心去渣，得到罗汉果汁，再经100nm 陶瓷膜过滤和10,000D有机膜分离后，收集截留液经喷雾干燥得到产品罗汉果粗酶。经测定：与果汁相比，罗汉果蛋白酶活性回收率为45.4%，提纯倍数为2.67倍，浓缩了近6倍，喷雾干燥后酶活性没有明显变化。该工艺简单易行，分离快速，浓缩度和酶活性回收率都较高，对罗汉果蛋白酶的大规模生产和罗汉果的综合开发利用提供了一定的参考价值。
Studies on Purification and Properties of Protease from Siraitia grosvenorii
Abstract
Siraitia grosvenorii is especial plant of China, which is yielded from Guilin of Guangxi and applied abroad in medical treatment and pharmacy, chemical industry, food, health care etc. It was welcomed in China and overseas. At present, however, Siraitia grosvenorii was only processed and applied in its few compounds other than more available composition, which not only wasted resource but also polluted environment. Moreover, protease is one of important industry enzymatic preparations, which is abroad applied in food, chemical industry and medicine, pharmacy etc. Limited protease resource is lacked comparing to the increasing demand from market so that it is time to explore effectively new protease resource. So the study and exploitation of Siraitia grosvenorii protease can not only solve the problem of deficiency of protease but give a new way to explore comprehensively Siraitia grosvenorii as well.
This article further studied on purification, properties，applications and distillation techniques of protease on the base of the former achievement about the enzyme in order to know more fully the structure, properties and characteristic of the enzyme, which will offer some scientific reference for exploiting well the enzyme and using comprehensively special resource of Siraitia grosvenorii in China. Now the results of study as follows:
1. Purification of Protease from Siraitia grosvenorii
After rinsing, removing peels, mash, extraction by water, centrifuging, depositing of (NH4)2SO4 of 50% saturation, isolating by CM Sepharose FF chromatography and Sephacry S-200 and Sephacry S-100 gel chromatography, the protease purified from fresh Siraitia grosvenorii was acquired and showed one strip or one peak after SDS-PAGE and gel filtration HPLC. Activity of the protease purified is 9.4×107 U/g and the recovery of activity is 4.2% and was purified to 31 fold comparing the juice of Siraitia grosvenorii.
2. characteristic research of the protease
Studies on Purification and Properties of Protease from Siraitia grosvenorii
Abstract
Siraitia grosvenorii is especial plant of China, which is yielded from Guilin of Guangxi and applied abroad in medical treatment and pharmacy, chemical industry, food, health care etc. It was welcomed in China and overseas. At present, however, Siraitia grosvenorii was only processed and applied in its few compounds other than more available composition, which not only wasted resource but also polluted environment. Moreover, protease is one of important industry enzymatic preparations, which is abroad applied in food, chemical industry and medicine, pharmacy etc. Limited protease resource is lacked comparing to the increasing demand from market so that it is time to explore effectively new protease resource. So the study and exploitation of Siraitia grosvenorii protease can not only solve the problem of deficiency of protease but give a new way to explore comprehensively Siraitia grosvenorii as well.
This article further studied on purification, properties，applications and distillation techniques of protease on the base of the former achievement about the enzyme in order to know more fully the structure, properties and characteristic of the enzyme, which will offer some scientific reference for exploiting well the enzyme and using comprehensively special resource of Siraitia grosvenorii in China. Now the results of study as follows:
1. Purification of Protease from Siraitia grosvenorii
After rinsing, removing peels, mash, extraction by water, centrifuging, depositing of (NH4)2SO4 of 50% saturation, isolating by CM Sepharose FF chromatography and Sephacry S-200 and Sephacry S-100 gel chromatography, the protease purified from fresh Siraitia grosvenorii was acquired and showed one strip or one peak after SDS-PAGE and gel filtration HPLC. Activity of the protease purified is 9.4×107 U/g and the recovery of activity is 4.2% and was purified to 31 fold comparing the juice of Siraitia grosvenorii.
2. characteristic research of the protease
The results showed its purity is more than 98% by determination of gel filtration HPLC, whose molecular weight was 37100D and 48200D respectively by SDS-PAGE and Sephacryl S-100 gel chromatography. The protease showed optimum activity at pH12, so we considered it is basic protease. It appeared strong absorbance at 220nm and 280nm by UV, speculating that it contain amino acid groups of phenyl-containing. The protease did not show activity of trypsin, chymotrypsin, peroxidase, amylase and lipase by the study of other enzyme activities. Besides, trypsin inhibitor from soybean can not restrain activity of the protease, which suggested it was not classified trypsin.
To study the essential side chain groups of amino acid of activity of Siraitia grosvenorii protease, we added some chemical modification reagents to react specific against different amino acidresidues in the protease. It was found that the modification of the hydroxyl, indolyl and imidazolyl groups could inhibit greatly the activity of the protease. Protecting the hydroxyl, indolyl and imidazolyl groups in the protease by casein substrate to be not modified, it was found that the activity increased greatly comparing to the protease which not to be pretected. So we confirmed that the hydroxyl, indolyl and imidazolyl groups were proposed to participate in the binding of casein substrate and were the essential groups of protease activity.
3. Effects of Metal ions, chemistry reagents and surfactants on the protease
Cu2+ inhibited most significantly the protease activity in metal ions. 5mmol/L Cu2+ can decrease the activity to 25.8% of the primary enzyme. Besides, Al3+、Ni2+、Mn2+ can inhibit the activity partly as well. But all other metal ions didn’t affect the activity and Fe3+ and Mg2+ can activate it contrary.
0.02% SDS and 0.1% Triton X-100, Saturn 80, polyglycol, glycol could inhibit differently the activity and 0.1% Triton X-100 decreased almost the protease activity to 57%, which is most remarkable. On the other hand, Na2B4O7?10H2O can activate the activity, which made the activity to increase 0.86 fold. Other chemistry reagents and surfactants didn't inhibit the activity of the enzyme.
4. The hydrolytic performance on other proteins and store stability of the protease
The results showed that the protease didn’t hydrolyze bovine serum albumin, egg albumin and pancreatic protein but had partial activity against glutin and lysozyme comparing good specificity against casein.
Besides, the results from the study of store stability of Siraitia grosvenorii enzymes indicated that dryness, no light, low temperature and adding 1% cysteine were beneficial to stability of the enzymes, and 20% glucose was helpful for protecting the protease after storing 3 weeks. EDTA can inhibit the activity, but can benefit it’s stability after 75 days and the effect was better when the content is 1%.
5. Study on extraction techniques of protease from Siraitia grosvenorii
The results of study showed that protein content and protease activity of Siraitia grosvenorii from Guangxi Rong’an and Lipu increased gradually along with its increase growth and appeared one maximum at different time, and then the number reduced. But the number of activity of every gram protein didn’t show any rule.
After rinsing，mash, extraction by water, centrifuging and removing residue, the solution from fresh Siraitia grosvenorii was acquired. Concentration and purification by using 100nm ceramic complex membrane and 10,000D organic membrane and spray drying was carried out. The results of study indicated that recovery rate of activity of the dried protease powder is 47.0% and purification is 2.79 fold comparing to the solution. With easy, convenient and fast operation as well as high Concentration activity of protease, the extracting process will offer reference value for the Large-scale production of Siraitia grosvenorii protease and comprehensive development and utilization of Siraitia grosvenorii fruits.
Key Words: Siraitia grosvenorii, Protease, Purification, Properties, Application Extracting process
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第一部分文献综述
1.1 罗汉果植物的研究概况
罗汉果(Siraitia grosvenorii)又名汉果、光果、光木鳖、罗晃子、拉江果和假苦瓜等，是葫芦科(Cucurbitaceae)罗汉果属植物(Siraitia grosvenorii(Swingle) C.Jeffery)的成熟果实，是我国特有的果品。罗汉果植物属藤木、多年生宿根，有地下块茎，叶互生、卵圆形，先端尖细；其果实圆形、卵圆形，表面有绒毛。广西壮族自治区永福县、临桂县交界的山区是栽培罗汉果的起源中心，已有200多年的栽培历史，也是我国罗汉果的主要生产基地。罗汉果多分布于我国华南地区，生长在气候凉爽且昼夜温差明显、雾气多、富含松软腐质的山坡斜面上。罗汉果同属的植物共有7种，我国共有4 种，其中2种入药：罗汉果、翅子罗汉果。罗汉果雌雄异株，开花期是每年的6--8 月，结果期 8--10月，果实成熟期9--11月[1，2]。
目前，国际上对罗汉果的需求日益增大，罗汉果已成为我国重要的出口商品之一，远销东南亚、日本、韩国、加拿大和美国等地，深受国际市场欢迎[3]。罗汉果在广西民间的药用历史已有300多年，其性凉味甘、无毒，有润肺止咳、凉血、润肠通便的功效，是家用良药，特别是用作祛痰剂，在治疗百日咳、慢性气管炎、咽喉炎、胃肠疾病方面疗效显著[4]，被收载于1977、1985、1990、1995年中华人民共和国药典,作为常用中药使用[5，6]，国家卫生部、中医药管理局将其列入第一批“既是食品又是药品的品种名单”[7]。
罗汉果中营养物质丰富，营养价值很高，从上世纪六十年代以来，国內外学者对它进行了广泛深入的研究。现在已从中测定出了罗汉果中含有约10%的蛋白质，13.5%的葡萄糖，10%的果糖，4%的糖甙（mogroside），0.08%的甘露醇，以及不少的维生素C和无机元素钾、钙、镁、硒等。罗汉果作为一种理想的天然甜味剂和营养保健品已获得大多数民众的喜爱，在国內外的销量也有上升的趋势。为了对罗汉果研究概况有个全面的了解，更好地开发利用我国特有的罗汉果资源，本文拟对罗汉果植物的主要化学成分及其提取分离方法、药理作用、开发利用等方面的研究作一综述。
1.1.1罗汉果植物的化学成分研究
1.1.1.1罗汉果果实的化学成分
一、非糖甜味物质自从1975年Lee[8]首先报告罗汉果果实含有三萜甜味甙以来，迄今已从罗汉果果实中分离并鉴定了罗汉果甙IV (mogroside IV)、罗汉果
甙V(mogroside V ) 、罗汉果甙III(mogroside III) 、罗汉果甙ПE(mogroside IIE)、罗汉果甙III E、罗汉果甙VI 、罗汉果甙A、罗汉果新甙(neomogroside)、赛门甙I (siamenside I )、11-oxo-mogroside、光果木鳖皂甙Ⅰ（grosmomoside）[9]、罗汉果二醇苯甲酸酯(mogroester)等共12种葫芦烷三萜甙类(cucurbitane glycosides)化合物，该类化合物是罗汉果果实中的主要活性物质，约占干果重的4%。除少数为无甜味如罗汉果甙IV (mogroside IV )或苦味如罗汉果新甙(neomogroside)物质外，大多数为甜味成分或微甜物质，其中罗汉果甜甙V 在罗汉果果实中含量和甜度(为蔗糖甜度的256～344倍)均较高[10]，是主要的甜味成分。这些甜甙的
[1]
图中R1,R2，代表以1、2, 1、4或1、6位结合的分子低聚-α-吡喃葡萄糖分子
图1-1 罗汉果甙的基本结构
赛门甙I是目前发现的葫芦烷三萜甙中最甜的成分，在万分之一浓度时其甜度为5%蔗糖的563倍[11]。徐位坤[12]等从新鲜的罗汉果果实中分离得到D-甘露醇，其甜味强度相当于蔗糖的0.55～0.65倍，医疗上常用D-甘露醇替代糖作糖尿病患者的甜味食品或甜味剂。此外，斯建勇[13]等从新鲜的罗汉果果实中分离得到两种黄酮甙：罗汉果黄素(grosvenorine I)和山奈-3,7-α-L-二鼠李糖(grosovenorineП)。它们的结构如图1-2和1-3。
图1-2 罗汉果醇（Mogrol)的结构图1-3罗汉果中所含的黄酮甙的结构
二、蛋白质氨基酸类、糖分及其它成分：徐位坤等[14]用凯氏定氮法分别测定野生罗汉果和罗汉果三个栽培品种（长滩果、拉江果和青皮果）干果的总含氮量,然后换算成蛋白质。结果表明：干果的蛋白质含量为8.67%～13.35%。此外，他们还对干果水解产物中的氨基酸种类以及各种氨基酸的含量进行测定，除色氨酸未被测定外，罗汉果干果中含有18种或17种氨基酸，其中人体必须的氨基酸有8种，含量最高的是天门冬氨酸和谷氨酸，最少的是γ-氨基丁酸，测定结果见表1-1。
据文献[15]报告，罗汉果干果中含糖量均高，总糖含量为25.17%～38.31%，还原糖含量为16.11%～32.74%，还原糖中的果糖含量为10.17%～17.55%，还原糖中的葡萄糖含量为5.71%～15.19%，见表1-2。李俊等[16]采用热水法提取，再用Sevag法去除蛋白质，通过用DEAE-纤维素柱和SephadexG-200柱的分离纯化得到2个多糖组分，其相对分子质量分别为Mr1=430000，Mr2=650000。得出组分1的单糖组成为葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖和葡萄糖醛酸，组分2的单糖组成为鼠李糖、葡萄糖醛酸。
孟夏林等[17]对罗汉果果实所含的无机元素进行了测定，结果如表1-3。成熟果实中有24种无机元素(含有人体必需的16种微量元素和广泛元素)，其中K、Ca和Mg含量较高，尤其是K(12290.8)，而对人体有害元素含量则很低，都没有超过国际辐射防护委员会(ICRP)的标准。罗汉果果实中含有较高的Se元素，其含量是在粮食中的2～4倍，而Se对防治冠心病、抗衰老、抗癌都有较好的效果[10]。另外，维生素C的含量也很高，每100克鲜果中含维生素C 350—517mg。
表1-1 罗汉果水解产物的氨基酸含量
表1-2 罗汉果干果糖分的种类及含量(%)
表1-3罗汉果果实中的无机元素的种类及含量(ppm)
三、其他成分程菊英等[18]报告，罗汉果种仁含油量41.07%，其中油酸和亚油酸分别占总脂肪酸的20.0%和52.3%，是医药上治疗冠心病和预防血管硬化较理想的油脂，此外还含有14.7%的棕榈酸，而这种脂肪酸是人体所必需的。
陈全斌等[19]用索氏提取法对由桂林思特公司提供的提取甜甙后的罗汉果种仁中的油脂进行提取，并对含油率、含油性质进行了分析。实验结果表明：罗汉果种仁含有48.5%油脂，油脂中含不饱和脂肪较多，并含有大量的角鲨烯，具有较高的开发价值。此外，潘英明等[20]用超声波法从汉果渣中提取并测得罗汉果渣中碱木质素的总含量约为14.95%，具体提取工艺流程如下：以罗汉果渣为原料，以体积比为2:1的甲苯-乙醇溶液抽提6h得脱蜡样品，在KOH溶液中经超声波处理后过滤，滤液用pH2的酸水洗涤，自然干燥得到碱木质素。
1.1.1.2罗汉果块根的化学成分
一、淀粉陈全斌等[21]以罗汉果块根为原料，从中提出了了大量的淀粉，并对淀粉的含量、淀粉中还原糖的含量、以及淀粉的溶解度、糊的透明度及糊的沉降性质等进行了研究，结果表明：纯淀粉的含量为30.89%，（以二年生的干根计），淀粉的白度为94.5%。淀粉的水解液中含有一种还原糖为葡萄糖，其百分含量为
3.87%，直链淀粉的含量为0.84%，支链淀粉的含量为99.16%。
二、罗汉果酸中国学者王雪芬[22，23]，斯建勇等[24]从罗汉果根的脂溶性部位
分离得到一系列的葫芦烷型四环三萜酸，被分别命名为罗汉果酸甲、乙、丙和丁，其化学结构如图1-4和1-5。此外，还得到了一种白色粒状结晶VII，经确证为胡萝卜甙[22]。
三、无机元素孟夏林[17]等用原子吸光分光光度计和离子光度计对罗汉果根的无机元素的含量进行了测定，结果如表1-4，数据显示罗汉果根中含有人体必需的16种微量元素和广泛的无机元素，而对人体有害的元素含量则都很低，都没有超过ICRP (国际辐射防护委员会) 的标准。
表1-4 罗汉果根的无机元素含量（ppm）
元素种类元素含量元素种类元素含量元素种类元素含量
Mn Fe Ni Zn Mg Ca Pb Cu Si 34.27
71.23
2.57
15.43
434.05
929.79
0.11
3.98
1579
K
Na
Cd
Sr
Ba
Cr
Al
Be
F
4134.19
17.13
0.028
4.60
17.51
0.42
92.45
1.86
Ti
V
Mo
Co
Se
Sn
As
I
0.33
0.088
0.6416
0.081
0.1659
0.022
图1-4罗汉果酸甲、乙的化学结构式图1-5罗汉果酸丙、丁的化学结构式1.1.1.3 罗汉果叶的化学成分
目前，关于罗汉果叶的研究报道较少，也很少对其进行开发利用。文献[25]针对罗汉果叶进行了化学成分定性研究及氨基酸、茶多酚和黄酮定量分析。结果表明：罗汉果叶中含有氨基酸5.86%、茶多酚1.61%、黄酮化合物1.62%。此外，他们还对罗汉果叶中黄酮甙元进行了分离鉴定，证实其中的甙元分别为山奈酚和槲皮素，这与果实中含有的甙元一致[26]。
1.1.2罗汉果有效成分的分离测定方法
七十年代以来，国内外对罗汉果中的各种有效成分进行了广泛深入的研究，并已确认了它们中的大部分结构，其中所采用的方法也多种多样，而这些方法也主要集中在提取和分离罗汉果中的甜甙、黄酮等主要成分上。下面就一些文献主要用到的分离方法作一简述。
一、大孔树脂吸附[27] 干罗汉果粉碎、水溶、提取,至水溶液无甜味为止。水溶液压滤，滤出液经除杂、脱脂处理，得到含罗汉果甙Ⅴ的澄清水溶液。溶液经氧化铝柱脱色，流出液经吸附树脂吸附后，洗脱，洗脱液再经强碱树脂脱色，最后浓缩洗脱液，除去不溶物后结晶，得到高甜度、无臭白色结晶粉末产品，经红外光谱测定被鉴定为罗汉果甜甙Ⅴ。
罗汉果水浸膏水溶后过大孔树脂，以90%ETOH解吸所得物经硅胶柱层析，以三氯甲烷-甲醇-水(7:3:1)洗脱，200mL为一份，第88-93份合并有一浅黄色针晶析出，以甲醇-水(3:1)重结晶得罗汉果黄素[29]。
二、AB-8吸附树脂吸附干果粉碎，水溶，除去不溶物，过滤得滤液经AB-8吸附树脂吸附，用水洗后再用50%的乙醇水溶液洗脱，洗脱液浓缩干燥。再用甲醇溶解，过氧化铝柱，用50%甲醇水溶液洗脱，洗脱液浓缩后溶于正丁醇-冰乙酸-水(4∶1∶1)混合溶剂，溶解干燥物用硅胶层析柱分离，得到罗汉果甜甙[29]。
三、 Amberlite XAD-2树脂吸附[27]罗汉果水提取物通过Amberlite XAD-2树脂吸附甜味素，用50%ETOH洗脱，洗脱物经过Sephadex G-24及Amberlite XAD -2D-2柱处理后，以制备薄层层析纯化得Rf0.67部分，它的甜度为蔗糖的150倍，在开水中煮五小时不被破坏，再通过H-NMR鉴定为三萜罗汉果甙。
四、硅胶柱层析[27]罗汉果干果甲醇提取物，以已烷脱脂后经过Diaion HP-20层析50%和80%甲醇洗脱部分分别经硅胶柱层析，三氯甲烷-甲醇-水(6:4:1)洗脱得罗汉果甜甙。
五、活性碳及硅藻土柱吸附干果以石油醚脱脂后，甲醇提取物过活性碳和硅藻土柱，用20%ETOH和吡啶洗脱，前二者分别得罗汉果醇和11-氧化罗汉果醇，后者洗脱物经氧化铝柱，以100%及50%甲醇洗脱后在经硅胶柱层析得到罗汉果甙Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ[27]。
六、高效液相色谱法[30]
(1)粗品的制备取鲜罗汉果10个(约500g)，取其果瓤，加蒸馏水3L回流提取15ｈ，过滤，重复3次，合并提取液。将提取液注入AB 8吸附树脂柱，吸附完成后，以去离子水洗脱至柱流出液无色，再以2倍柱床体积的20%乙醇溶液洗脱，弃去柱流出液。最后以3倍的柱床体积的70%乙醇溶液洗脱，收集洗脱液。将洗脱液中的乙醇经旋转蒸发回收后，加入去离子水至1000ｍL，经D280离子
交换树脂脱色，将洗脱液减压干燥，得浅黄色产品，即3g罗汉果甜甙粗品。
(2)标准品的制备将上述粗品1g以70%甲醇溶液溶解，配制成100g/L的溶液，采用半制备型HPLC纯化。进样量为500μL，收集保留时间为40min的组分。收集物经减压浓缩干燥，得白色粉末150mg。产物经分析型高效液相色谱检测，采用归一化法定量，其纯度是98. 5%。
七、其他方法此外，微波、超声波辅助提取罗汉果甜甙以及一些色谱和光谱连用的技术也在有关文献中得到报道[31]。
1.1.3药用研究
(一)镇咳祛痰、泻下和保肝作用王勤等[32]报告，罗汉果果实水提物对浓氨水或二氧化硫诱发的小鼠咳嗽均有明显的抑制作用，可增加小鼠气管粉红和大鼠气管排痰量，使正常小鼠或便秘小鼠的排便粒数明显增加，降低四氯化碳或硫代乙酰胺损伤小鼠血清谷丙转氨酶的活性，说明该果实水提物有止咳祛痰、泻下和保肝的药理作用。
(二)增强免疫王勤等[33]报告，罗汉果果实水提物对免疫低下小鼠的单核细胞吞噬功能有增强作用，提示罗汉果果实水提取物可增强免疫低下机体的非特异性免疫功能。罗汉果果实提取物还可增强大鼠体液免疫和细胞免疫功能。
(三)对离体肠管活动的双向调节作用[34] 0.1--100mg/mL的罗汉果水提物可以增强兔和狗的离体肠管自发活动，拮抗氯化钡或乙酰胆碱引起的小鼠、家兔、狗离体肠管收缩，也对抗肾上腺素引起的肠管松弛，恢复肠管的自发活动等方面有明显作用。
(四)活血化瘀作用[35]采用尾静脉注射胶原蛋白和肾上腺素方法造成小鼠体内血栓，再测定罗汉果黄酮对小鼠体内血栓的影响。结论显示罗汉果黄酮具有一定的抗血栓形成、抗血小板聚集、降血脂、抗凝血等活血化瘀药理作用。而急性毒性试验结果表明：罗汉果黄酮对小鼠的最大给药量为 60.85g／kg。
(五)降血糖、降血脂及其抗氧化作用张俐勤[36]等人通过用不同剂量的罗汉果皂苷提取物连续30d给嘧啶糖尿病小鼠灌胃，末次给药后眼眶取血测定血糖、血脂指标，分离肝组织测定抗氧化指标。结果表明罗汉果皂苷提取物对糖尿病小鼠有明显的治疗作用，其降糖机制可能与提高糖尿病鼠抗氧化能力及改善血脂水平有关。
(六)抗炎导泻作用据文献[37]报道，罗汉果块根的水提物C对小鼠耳肿胀度有明显的影响，达到了抗炎的作用。而水提物D对豚鼠离体回肠平滑肌有兴奋作用，呈量效关系，并可用被不同浓度的硫酸阿托品竞争性拮抗，说明其兴奋平滑肌的作用可能与兴奋离体肠平滑肌M受体有关，并有望作为导泻药而进行开
发与研究。
(七)其它药理作用罗汉果提取物大剂量时有轻度降压作用[32]。其制剂有抗炎、镇痛和抑菌作用[38]。此外，据有关文献资料报告罗汉果中的甘味物质具有一定的抑癌作用[39]，罗汉果提取物对糖尿病的小鼠有降血糖的作用[40]。
(八)毒性对于罗汉果冻干水提取物，小鼠的LD50超过10g/kg；小鼠口服冻干水提物的溶液，每天0.3mLmL/10g(体重)，连续给药一周，无一例死亡；小鼠口服罗汉果粗水提物，在剂量15g/kg时，出现轻度镇静和缓泻；以上结果表明罗汉果的毒性较低，安全系数较大[34]。苏小建、徐庆等人用罗汉果甜苷3．0g
／kg(相当于人用量的250倍)灌胃4周，对家犬的血液学指标、肝、肾、功能、血糖与尿糖以及心、肝、肾、肺、脾的形态学变化进行观察和测定，发现均无明显的影响，进而得出罗汉果甜苷是一种基本无毒的物质的结论[41]。
1.1.4应用及产品开发
1.1.4.1医药上的应用
罗汉果根、叶、果均可入药。如根捣烂外用可治疮疖，对风湿性关节炎疗效显著[22]。叶可治癣外，还对致病菌金黄色葡萄球菌，白色葡萄球菌，卡他双球菌有较强的抑制作用[4]。罗汉果果实性凉味甘，无毒，有清热解毒、化痰止咳、凉血舒胃、清肺润肠和生津止渴等功能，是我国的传统中药。可治疗急慢性支气管炎、咽喉炎、哮喘、百日咳、胃热、便秘、急性扁桃体炎等症[10]。此外罗汉果果实所含的甜味剂甜度高，热量低，无毒，是肥胖病人和糖尿病人理想的调味品之一。
1.1.4.2 食品上的应用
罗汉果果实以它特有的甜度高，热量低营养丰富等许多天然有利性质被广大人们所喜爱，现在在很多食品工业上被用作甜味剂、保健品、营养补给品等等而大量生产，而且罗汉果甜甙产品在国际上的价格一直居高不下。此外，罗汉果果实加工的饮料香甜可口，有清热解毒消食健胃等作用，对糖尿病高血压便秘慢性支气管炎慢性咽喉炎患者是一种良好的保健饮料[4]。
1.1.4.3 产品开发
罗汉果是我国特有的资源，关于罗汉果的研究报道也很多，其中也申请了许多专利，而广西壮族自治区是我国独家生产罗汉果的省区。据有关资料显示其中
许多的科研成果已领先于国內先进水平，目前已成为国內规模最大的罗汉果甜甙生产基地。近年来，为了满足不断增长的罗汉果市场需求，商家们努力创新，已研制出了大量的袋装罗汉果、罗汉果粉、罗汉果膏、罗汉果糕、罗汉果糖、罗汉果饼干、罗汉果咖啡茶、罗汉果可乐、罗汉果冲剂等罗汉果果实系列产品，为进一步有效地开发利用我国特有的罗汉果资源开辟了新的途径。
1.2 蛋白酶（protease）
酶是生物细胞所产生的一种有机催化剂，其本质是蛋白质。有些酶是由蛋白质和核酸构成的，个别酶可能仅仅是一种有催化作用的核酸。大多数酶是由氨基酸组成的生物大分子化合物，具有蛋白质的性质，如有一、二、三、四级结构，带电荷，各有其等电点，相对分子质量很大，受环境因素影响大，容易失活等[42]。
酶具有反应专一性，一种酶只能催化一种或一类物质发生化学反应。酶广泛存在于动植物器官和微生物中，现在在自然界已经发现并命名的酶约有5000多种，已应用开发的有2000多种，而水解酶占了其中的大部分。
蛋白酶是催化肽键水解的一群酶类，它广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。蛋白质在蛋白酶的作用下，能逐渐水解为氨基酸，不同来源的蛋白酶在工业上有不同的用途。蛋白酶作为一种最重要的工业酶制剂，其最大的用途是制造加酶洗涤剂、嫩化肉类、改良面团、制造蛋白水解物，以及在制革、毛皮工业上用作为脱毛和软化剂，此外，还用于啤酒生产、二肽甜味剂的合成以及作为医药等。
蛋白酶商品生产始于上世纪初，1908年德国Rōhm等人开始用胰酶制革；1921年美国华勒斯坦公司生产木瓜蛋白酶作为啤酒澄清剂；上世纪30年代微生物蛋白酶开始用在食品和制革工业；上世纪50年代初，日本学者首先发现霉菌中存在着几种类型的蛋白酶，特别是酸性蛋白酶；上世纪60年代初，荷兰生产了添加碱性蛋白酶的的洗涤剂。近二十多年来，微生物蛋白酶的研究蓬勃发展，到1998年，国际市场上商品蛋白酶品种在80—100种以上，我国生产的蛋白酶，已经广泛用在皮革、毛衣、毛纺、丝绸、医药、食品、酿造等方面[43，44]。
1.2.1蛋白酶的来源
蛋白酶主要来源于植物器官、动物内脏和微生物，其中植物、动物来源的蛋白酶大多数是食品工业的重要用酶，而且酶化学研究也大致围绕它们进行，但其数量有限，大多数工业用酶都来源于微生物。在产业为背景的前提下微生物蛋白酶已成为最重要的酶资源之一，已被广泛用于食品、工业、药物、医疗等行业，但与植物、动物酶源相比，微生物蛋白酶需要更严格的毒性和安全性检测。
1.2.1.1 植物蛋白酶
植物蛋白酶是研究较早的蛋白酶，目前已发现含有蛋白酶的植物的有木瓜、菠萝、生姜、无花果、番麻、剑麻、猕猴桃等，其中木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶研究较早，现被广泛用于食品、化工、医药等行业。现已木瓜蛋白酶为代表简单介绍一下植物蛋白酶的研究进展。
自从上世纪九十年代开始，木瓜蛋白酶的研究得到广泛开展，主要研究方面包括木瓜蛋白酶的分离纯化、性质及应用等方面。
木瓜蛋白酶[45]是一类巯基蛋白酶，主要存在于番木瓜(carica papaya)根、茎、叶与果实中，未成熟果实的乳汁中含量最丰富，具有较强的蛋白酶水解和合成能力,还具有凝乳、解脂和溶菌活力，具有耐高温、活性强、稳定性好、蛋白质水解能力强等特征，对pH变化和金属离子及去垢剂不敏感，其用途很多，目前被广泛地用于食品行业,如啤酒的澄清、肉类的嫩化以及制革、纺织和日化用品等行业中。由于此酶为纯天然产物,其开发前景越来越受到人们的重视。
工业用的木瓜蛋白酶是由四种主要酶类组成的多酶体系，包括木瓜蛋白酶（papin EC3.4.22.2）、木瓜凝乳蛋白酶（chymopapain EC3.4.22.6）、木瓜蛋白酶?（papaya proteinase ? EC3.4.22.30）和木瓜凝乳蛋白酶M(chymopapain M EC3.4.22.25)，其中凝乳蛋白酶的含量最高。它们的一级结构都含半胱氨酸残基，且都具有高度的同源性，其氨基酸数目和同源性比较结果如表1-5所示。除木瓜凝乳蛋白酶含有8个半胱氨酸外，其余三种酶都只含有7个半胱氨酸。其中25位的巯基是活性位点，不参与二硫键的形成(chymopapain的117位巯基也不参与二硫键的形成)，其余巯基以相同的方式形成三个二硫键，具有同样的保守性[46]。
表1-5 四种蛋白酶氨基酸数目和同源性比较
papain chymopapain papaya proteinase? chymopapainM
氨基酸数目 212 218 216 216
同源性 100% 59.4% 69.8% 67.9%
工业制备木瓜蛋白酶是直接将木瓜乳汁加入某些保护剂后在50-60℃的条件下低温真空干燥或喷雾干燥,再经粉碎得到。而医药用酶则需进一步分离纯化以
得到精制的木瓜蛋白酶，常采用的方法有 (NH
4)
2
SO
4
沉淀、超滤浓缩、凝絮法、
双水相萃取法和利用各种凝胶介质分离等[47，48]。
木瓜蛋白酶目前在食品、化工、轻纺、医疗卫生等行业得到广泛的应用。在食品行业[49，50，51]，木瓜蛋白酶在肉类加工中常用作嫩化剂降解肉类结缔组织中胶
原蛋白和弹性蛋白；木瓜蛋白酶还用于对冷冻贮存过程中水解啤酒内蛋白质，部分水解一些已形成的复合物，产生更多的多肽或氨基酸，保证啤酒在冷冻过程中的高清澈度, 同时改善啤酒口感及原有多肽和氨基酸的组成和比例, 有效地改良啤酒品质；木瓜蛋白酶作为饲料添加剂添加到饲料中能促进蛋白质的吸收和利用, 提高畜禽的生长速度和质量；木瓜蛋白酶被肖凯军等人通过加热用来水解大豆分离蛋白，酶解2小时后，大豆的水解度比未处理提高到2倍[52]。木瓜蛋白酶在饮料制作中也有一定的应用，张驰等[53]利用木瓜蛋白酶进行莼菜饮料的研制, 经过一系列工艺后可制成具有良好风味和优良品质的莼菜饮料。
在轻纺工业，利用木瓜蛋白酶只溶解丝胶而对纤维蛋白全无作用,能令丝织物等滑爽柔软的性质，木瓜蛋白酶在纺织工业中得到广泛的应用；在制革生产中，皮胶原经浸水、脱毛、浸灰和脱灰处理后, 等电点大约为5.0, 因此, 在酸性条件下软化, 对皮胶原的损害较小, 可有效防止软化过度。木瓜蛋白酶属酸性植物蛋白酶, 由于其具有较强的水解黏蛋白和类粘蛋白的能力, 因此有可能作为软化剂或软化助剂应用于制革工业[54]。
在医药方面，木瓜蛋白酶在医药上除了可以帮助消化, 消除消化紊乱以及作为驱虫剂以外还有以下的一些用途: 木瓜蛋白酶可以清除挫伤、切断伤、烫伤等各种皮肤表面的溃疡, 而对健康组织无影响。在冈比亚这些缺乏药物的地方, 人们利用木瓜果肉中含的酶来治疗小儿烧伤, 可以有效地除去腐烂组织而防止烧伤皮肤的感染[55]。此外, 木瓜蛋白酶还可以促进中药成分的有效煎出, 用于辅助Rh血型的鉴定, 用于关节炎实验模型的建立, 还可用于肿瘤的辅助治疗, 将木瓜蛋白酶中分离纯化得到的木瓜凝乳蛋白酶可以用于治疗腰椎间盘突出症。
1.2.1.2 动物蛋白酶[56]
在动物体内，蛋白酶不仅参与动物消化道内蛋白质的消化，还参与细胞内蛋白质的代谢、血液的凝固及溶解，并且还与血压调节物质的生成有关，在生理上起着重要的作用。此外，在胃中还有对乳的凝固作用，对幼小哺乳动物的消化来说也是必要的。这类蛋白酶，在制造乳酪时已用于使牛乳凝固。动物蛋白酶主要来源于动物的各种脏器，一般是胃和胰脏，主要包括胃蛋白酶、胰蛋白酶（trypsin3.4.21.4）、胰凝乳蛋白酶A(chymotrypsin A 3.4.21.1)、凝乳酶(rennin 3.4.4.3)等。
胃蛋白酶(日本药典称肠胃蛋白酶):1825年由ScLnann首先从胃壁分离，命名为胃蛋白酶。由Northro所结晶的胃蛋白酶，在消化液中开始分泌时不是作为胃蛋白酶，而是胃蛋白酶原，在盐酸的作用下才成为胃蛋白酶。它存在于所有脊椎动物的胃液中，已从猪、牛、羊等的胃液中精制。
第一章绪论 1.药物分离与纯化过程分为机械分离与传质分离，机械分离针对非均相混合物，传质分离（物质传递）针对均相混合物，分为平衡分离过程与速度控制分离。 2.分离剂可以是能量或物质（质量）。 第二章药物分离纯化前的预处理技术 1.预处理的目的：将目的产物转移到易于分离的相态中（液相），同时除去大部分杂质，改变流体特性，利于后续分离。 2.药物成分的形成阶段只能获得含有目的药物成分的混合物，难以进行药物分离。 3.预处理主要完成任务： （1）去除大部分可溶性杂质（阳离子、生物大分子） （2）采用凝聚或絮凝技术，将胶体状态的杂质转化为易于分离的较大颗粒。（3）改善料液的流动性，便于固液分离 （4）固液分离 （5）将胞内产物从细胞内释放出来 4.沉淀技术： （1）高价离子：Ca2+、Mg2+、Fe3+ a影响离子交换 b对药物降解加速催化作用 （2）生物大分子（可溶性黏胶状物）：蛋白、核酸、多糖 a粘度增大，影响固-液分离。 b乳化作用，吸附离子基团。 5.沉淀法去除杂质常用的方法：等电点沉淀法，变性沉淀法，盐析法，有机溶剂沉淀法，反应沉淀法。 6.等电点沉淀法原理：蛋白质是两性电解质，当溶液PH值处于等电点时，分子表面净电荷为0，双电层和水化膜结构被破坏，由于分子间引力，形成蛋白质聚集体，进而产生沉淀。
7.变性沉淀法原理：利用蛋白质、酶、核酸等生物大分子对某种物理或化学因素的敏感性差异，实现分离。 8.盐析法概念：在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生沉淀的过程。 9.盐析法影响因素： （1）盐析剂的性质和加入量 （2）溶液的pH值 （3）蛋白类化合物的性质 （4）蛋白浓度 （5）温度 10.常用的凝聚剂：AlCl3·6H2O、Al2(SO43·18H2O(明矾）、 K2SO4·Al2(SO43·24H2O、FeSO4·7H2O、FeCl3·6H2O、ZnSO4和MgCO3等。 11.凝聚作用与絮凝作用的区别：凝聚作用是指某些电解质（凝聚剂）作用下，破坏胶体系统分散状态，而使胶体粒子聚集过程，而絮凝作用是通过架桥作用将许多微粒聚集在一起，形成粗大的松散絮团的过程。 12.助滤剂：具有一定刚性的颗粒或纤维状的固体。 13.常用助滤剂：硅藻土，珍珠岩，活性碳等。 14.细胞破碎方法 （1）机械法：高压均浆法（可大规模操作），珠磨法（可较大规模操作）、超声破碎法、X－press法 （2）非机械法：酶解法、化学渗透法、渗透压法、冻结融化法、干燥法。 15.高压匀浆法原理：细胞悬浮液在高压的作用下从阀座与阀之间的环隙高速喷出，每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化，从而造成细胞破碎。 第三章萃取技术
罗汉果[Siraitia g r osv enorii (Sw in g le) C.Jeffre y]为我国传统保健药材,是一种极具开发潜力的天然产物资源,罗汉果甜苷是罗汉果中主要有效成分,具有广泛的生物特性,其中罗汉果苷Ⅴ为罗汉果果实中含量和甜度均较高的成分,其含量约为1%,甜度相当于蔗糖的350倍,是主要的甜味成分[1]。罗汉果甜苷属于葫芦烷三萜甙类(cucurbitane g l y cosides)型化合物,具有安全,味质好,没有异味;甜度高;热稳定性好;颜色浅;使用简便;使用时不受p H值影响(p H值介于2～10间)等特性。FDA(美国食品药物管理局)于1995年批准罗汉果甜苷应用于食品上,我国也于1996年7月的全国食品添加剂委员会第十七次会议上批准该产品作为食品添加剂,目前,允许罗汉果甜苷作为食品添加剂的国家和地区有:日本、韩国、台湾、香港、泰国、新加坡和英国等[2]。本文对1993年以来在罗汉果甜苷提取分离纯化、测定及生物活性等方面的研究进行综述。 1罗汉果甜苷提取分离与测定1.1提取分离如何将有效成分高效率地提取是中药开发和中药现代化研究的关键技术之一。罗汉果甜苷是罗汉果主要活性成分,随着罗汉果甜苷在食品药品等领域的广泛应用,如何最大限度利用罗汉果资源,提高罗汉果甜苷品质特别引起人们的重视。 李雁群等[3]采用国产材料和 较为简单的方法来提取和纯化罗 汉果甜苷,以水为溶剂的甜苷得率 比乙醇水溶液的得率高,溶剂量以 原料重6倍为宜;Ca(OH)2作澄清 剂比明矾、AlC l3效果好,而且不会 带来很大的甜苷损失,澄清宜在室 温下进行;强碱树脂D290和D280 比酸性树脂的脱色效果好,脱色宜 在25℃下慢速操作;A B-8吸附树 脂吸附罗汉果甜苷的操作宜在 20℃左右的室温下以SV2的流速 操作;用50%乙醇水溶液可以使罗 汉果甜苷从A B-8吸附树脂上解 吸。李俊等[4]采用正交试验设计对 干罗汉果中罗汉果甜苷的乙醇提 取工艺进行了系统研究,优选了工 艺参数,为规模化生产提供理论依 据,采用最佳工艺:用30倍原料重 的30%乙醇,在75～80℃微沸状态 下提取3h,得提取物中罗汉果甜苷 含量为60%。朱晓韵等[5]采用了正 交试验法考察了微波技术对水提 罗汉果甜苷收率的影响,优选出最 佳工艺为:鲜罗汉果投料物液比 为1∶8、微波输出功率为750W、提 取时间15m in,微波提取罗汉果甜 苷的效率明显优于常规水煮法,罗 汉果甜苷得率达7.346m g/g,比常 规水煮法提高21.87%,是一种省 时、省能、操作简便的新提取方 法。马少妹等[6]采用超声提取,探 索乙醇提取罗汉果甜苷的新工艺, 采用超声波辅助提取这一新型提 取技术,提高了罗汉果甜苷的提取 率,为罗汉果甜苷的工业化提取提 供参考依据和方法。最佳工艺分3 次提取。李军生等[7]认为超声波处 理能明显提高罗汉果甜苷的提取 率,高频率的超声波对罗汉果甜苷 提取的影响要比低频率的明显。在 同一频率下,罗汉果甜苷的提取率 随着输出功率的提高而提高,另外 值得注意的是使用频率为50kH z 的超声波,其输出功率虽然只有 80w,但是其提取效果比频率为 28kH z输出功率为200W或400W 的超声波都好。说明罗汉果甜苷提 取与超声波的频率相关。 1.2分离纯化为获得高纯度的 罗汉果甜苷,从20世纪70年代开 始,不少学者对罗汉果甜苷纯化工 艺进行研究,但所用的分离纯化方 法多是采用无机吸附剂和无机脱 色剂,如活性炭、氧化镁、硅酸镁 等,操作工艺复杂,难以工业化生 产。随着仪器设备技术的发展,不 少研究者对罗汉果甜苷精制工艺 进行优化研究,李雁群等[8,9]初步 研究了大孔吸附树脂A B-8对罗 汉果皂甙的吸附性能,比较了15℃ 和65℃下的吸附速度,获得了在 SV2、SV5、SV8三种空速下的穿漏 吸附量;并提出用正丁醇-冰乙酸 -水(4∶1∶1)的混合溶剂做流动 相,硅胶做固定相的层析柱用来分 离罗汉果甜苷,效果明显。刘钟栋[10] 提出采用大孔吸附树脂与离子交 换树脂联用对罗汉果甜苷Ⅴ的精 制工艺,交换树脂对经过吸附处理 的罗汉果洗脱液的处理条件为: p H5.0,洗脱液浓度1%,罗汉果甜 罗汉果甜苷的提取与药理作用研究概况 农毅清广西壮族自治区南宁食品药品检验所530001南宁市明秀东路228号 蒋林广西中医学院制药厂530023 关键词罗汉果甜苷;提取;药理作用;综述 中图分类号:R284.2;R285.5文献标识码:A文章编号:1003-0719(2008)01-0006-03 6 ?6?(总)广西中医药2008年2月第31卷第1期
蛋白酶产生菌的筛选 组别：第*组 班级：生工**班 组员：*** 指导老师：*** 一、实验目的 学习从自然界中分离蛋白酶产生菌
二、实验内容 蛋白酶产生菌的分离 三、实验原理 许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是最常见的蛋白酶产生菌。本实验将土壤样品悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到奶粉培养平板并进行培养，根据奶粉平板的水解圈做初筛。将初筛的蛋白酶产生菌接入产酶培养基振荡培养，测定蛋白酶的活力，最终得到产蛋白酶的芽孢杆菌。也可直接将细菌接种到奶粉培养平板进行培养，分离筛选其他蛋白酶产生菌。 四、实验材料和用具 1.材料：土壤样品 2.试剂：牛肉膏蛋白胨培养及平板、奶粉培养基平板、45mL 无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液、 3.仪器及用具：紫外分光光度计、显微镜、恒温水浴锅、摇 床、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液 管、无菌试管、量筒、容量瓶、漏斗、试剂 瓶、漏斗、载玻片、滤纸、擦镜纸。 五、操作步骤
（一）配制所需培养基 按照以下配方配制所需的培养基 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，NaCl 0.5g， 琼脂 1.5～2.0g，水 100ml，pH 7.2 配制200mL 奶粉培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，NaCl 0.5g， 琼脂 2.0g，水 100ml，pH 7.0～7.2 脱脂奶粉 3g，配制200mL （二）分离 1.采集土壤样品，用无菌水植被1:10土壤悬液。 2.取1:10土壤悬液5 mL，注入已灭过菌的试管中，将此试 管放入75～80℃水浴中热处理10min以杀死非芽孢细菌。 3.取加热处理过的土壤悬液100～200μL，涂布接种到牛肉 膏蛋白胨培养平板，后将平板倒置，于30～32℃下培养24～48h. 4.对长出的单菌落进行编号，选择表面干燥、粗糙、不透明 的菌落，挑取少许菌苔涂片，做芽孢染色，判断是否为芽孢杆菌。 （三）筛选 1、从判定为芽孢杆菌的菌落处，分别挑取少许菌苔，先接种奶粉斜面培养基，再转接奶粉培养基平板上，30～32℃下培养24～48h。
碱性蛋白酶的分离纯化与性质初探 一、综述本课题国内外研究动态，说明选题的依据和意义: 1.国内外研究现状 碱性蛋白酶(Alkaline protease)广泛存在于微生物中,最早发现在猪的胰脏中，1913年Rhom首先将胰蛋白酶作为洗涤浸泡剂使用。1945年瑞士的Dr.Jagg 等发现了微生物碱性蛋白酶,使其成为洗涤剂的主要添加剂之一。碱性蛋白酶在丝绸、制革工业、饲料工业、动物食品加工中也有广泛用途。由于市场的需求，高产、高效、耐高温、耐高碱的四高型碱性蛋白酶成为国内外当前研究的热点之一[1]。 研究结果发现，海洋酶具有作用pH 范围宽，最适pH 和反应温度适中，随反应温度的降低酶活性下降缓慢等特点。海洋酶所具有的独特性质，引起学术界高度重视，日、美等国就此展开了深入的研究。迄今为止，由海洋微生物生产海洋酶的专利已达20 余项。海洋微生物酶的研究正逐渐成为发达国家开发新型酶制剂的重要途径[2,3]。 相比之下，国内在海洋碱性蛋白酶研究方面差距较大。综合多篇文献分析，目前针对海洋细菌产生的碱性蛋白酶，分离提纯的方法大致多采用饱和硫酸铵分级盐析和层级技术。首先是从发酵液取上清制备粗酶液（此酶为一种外分泌蛋白，无需通过溶菌酶溶解或超声波破碎细胞来制备粗酶液），通过超速离心沉淀，饱和硫酸铵分级盐析，透析，凝胶层析或离子交换层析来分离提纯该菌所产生的碱性蛋白酶。其中一些已经对酶的性质、序列等进行了研究[4-7]。 2.选题依据及意义 此毕业设计的课题为《碱性蛋白酶的分离纯化及性质初探》，主要是对海洋细菌进行培养及分离提纯方案的改进，并对其性质进行初步探究。大致是将各种相关参数和实验数据建立正交关系得到最佳培养条件，并对其产生的碱性蛋白酶进行分离提纯，同时得出最佳分离提纯方案。最后对碱性蛋白酶的性质进行初步研究。本设计针对目前研究较少的产碱性蛋白酶的海洋微生物新菌株，研发新型高效的碱性蛋白酶，这对满足人类生活、生产与技术开发的需求至关重要。这种积极采用微生物代替化学法的探究，有利于开发现代生物新产品的工业化生产技术研究，有利于加快现代生物领域产业的发展。 二、研究的基本内容，拟解决的主要问题 1.海水中碱性蛋白酶高产菌株的筛选；
响应面法优化枯草芽孢杆菌产蛋白酶的 发酵条件 张 智，朱宏亮，钮宏禹，罗欢华 （东北林业大学林学院，黑龙江 哈尔滨 １５００４０） 摘 要：在单因素试验的基础上，应用响应面分析法对影响枯草芽孢杆菌产蛋白酶的因素进行分析，得到了最佳发酵条件为温度４０℃、ｐＨ８．０４、接种量８．３％、发酵时间５６ｈ，此条件下的蛋白酶酶活为２４７．８ Ｕ／ｍｌ，比单因素试验的最高酶活２２８．３Ｕ／ｍｌ提高了８．５４％。关键词：枯草芽孢杆菌；蛋白酶；响应面 Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｂｙ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｗｉｔｈ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ＺＨＡＮＧ Ｚｈｉ，ＺＨＵ Ｈｏｎｇ－ｌｉａｎｇ，ＮＩＵ Ｈｏｎｇ－ｙｕ，ＬＵＯ Ｈｕａｎ－ｈｕａ（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ， Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｈａｒｂｉｎ １５００４０，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ ：Ｏｎ ｔｈｅ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ－ｆａｃｔｏｒ ｔｅｓｔ， ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ｔｈｅ ｍａｉｎ ｆａｃｔｏｒｓ ａｆｆｅｃｔｉｎｇｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｂｙ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ． Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ａｒｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ：４０ ℃， ｐＨ ８．０４ ａｎｄ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ａｍｏｕｎｔ ８．３％， Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅｓｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ， ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｓ ｕｐ ｔｏ ２４７．８ Ｕ／ｍｌ ａｆｔｅｒｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ ５６ ｈｏｕｒｓ． Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｓ ｈｉｇｈｅｒ ８．５４％ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｏｎｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ－ｆａｃｔｏｒ ｔｅｓｔ， ｗｈｉｃｈ ｉｓｏｎｌｙ ２２８．３ Ｕ／ｍｌ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ；ｐｒｏｔｅａｓｅ；ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ 中图分类号：Ｑ８１５ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００２－６６３０（２００８）１２－０４００－０５ 收稿日期：２００７－１０－１８ 作者简介：张智（１９６４－）女，研究员，硕士，研究方向为食品发酵与食品微生物。Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈｌｗｚ０７＠１６３．ｃｏｍ 枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）是一种安全的蛋白酶 生产菌［１］，它可产生大量的胞外蛋白酶，在工业生产中应用广泛。主要应用有以下五个方面：（１）在食品工业中应用：如奶酪生产、焙烤食品、大豆、玉米的深加工［２－３］ 、水解产物的脱苦以及阿斯巴甜的合成等。（２）在制革行业中应用：如脱毛、脱皮等。（３）洗涤剂行业［４－５］，衣服的主要污染是汗液、血迹、食迹等。在汗液中除脂肪外，干物质的１／３是蛋白质。织物上的蛋白质，特别是陈化以后很难洗除，加入蛋白酶可大大的提高洗涤效果，延长织物的寿命，目前全世界洗涤剂用酶的消费量已达到１００００多吨。现已将蛋白酶加入牙膏、牙粉、漱口水中有助于去除牙垢。（４）医药行业，可作为消化、消炎、化痰止咳等药物以及治疗跌打伤、水肿血肿、消除坏死组织等。（５）除了应用于工业及医药行业外，还可以应用于基础研究中，蛋白酶的选择性肽键裂解可用于阐明结构功能关系、肽链合成以及蛋白质测序［６］等。现在蛋白酶的生产日趋火热。 响应面分析法［８］（ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ，ＲＳＭ）是一种优化工艺条件的有效方法，可用于确定各因素及其交互作用在工艺过程中对指标（响应值）的影响，精确地表述因素和响应值之间的关系，已被广泛地用于同时存在多因素影响的实验优化上。为了得到最佳产酶条件，本实验采用响应面分析法对影响菌种产酶的几个条件做了优化。１材料与方法１．１ 菌种 枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）本实验室保存，是经过选育筛选出来的产蛋白酶性能稳定的菌株。１．２ 培养基 斜面培养基：葡萄糖０．５％、酵母膏１％、蛋白胨０．５％、氯化钠０．２％、琼脂２％、自然ｐＨ值。
蛋白酶产生菌的筛选
蛋白酶产生菌的筛选 组别：第*组 班级：生工**班 组员：*** 指导老师：*** 一、实验目的 学习从自然界中分离蛋白酶产生菌
二、实验内容 蛋白酶产生菌的分离 三、实验原理 许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是最常见的蛋白酶产生菌。本实验将土壤样品悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到奶粉培养平板并进行培养，根据奶粉平板的水解圈做初筛。将初筛的蛋白酶产生菌接入产酶培养基振荡培养，测定蛋白酶的活力，最终得到产蛋白酶的芽孢杆菌。也可直接将细菌接种到奶粉培养平板进行培养，分离筛选其他蛋白酶产生菌。 四、实验材料和用具 1.材料：土壤样品 2.试剂：牛肉膏蛋白胨培养及平板、奶粉培养基平板、 45mL无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液、 3.仪器及用具：紫外分光光度计、显微镜、恒温水浴锅、 摇床、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌 移液管、无菌试管、量筒、容量瓶、漏 斗、试剂瓶、漏斗、载玻片、滤纸、擦镜 纸。
五、操作步骤 （一）配制所需培养基 按照以下配方配制所需的培养基 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，NaCl 0.5g，琼脂 1.5～2.0g，水 100ml，pH 7.2 配制200mL 奶粉培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，NaCl 0.5g， 琼脂 2.0g，水 100ml，pH 7.0～7.2 脱脂奶粉 3g，配制200mL （二）分离 1.采集土壤样品，用无菌水植被1:10土壤悬液。 2.取1:10土壤悬液5 mL，注入已灭过菌的试管中，将此试 管放入75～80℃水浴中热处理10min以杀死非芽孢细 菌。 3.取加热处理过的土壤悬液100～200μL，涂布接种到牛肉 膏蛋白胨培养平板，后将平板倒置，于30～32℃下培养 24～48h. 4.对长出的单菌落进行编号，选择表面干燥、粗糙、不透 明的菌落，挑取少许菌苔涂片，做芽孢染色，判断是否 为芽孢杆菌。 （三）筛选
2010年第19卷第20期 罗汉果又名光果木鳖、拉汗果、假苦瓜、神仙果等，为葫芦科(Cucurbitaceae)罗汉果属多年生草质藤本植物罗汉果Momordica grosvenori Swingle的果实，为广西桂北地区的传统特产，是我国特有的经济、药用植物，营养价值高，含有丰富的果糖、蛋白质和多种维生素。其性凉味甘，具有清热解暑、抗菌消炎、止咳润肺等功效。现就其药理活性研究进展介绍如下。 1药理活性 1．1止咳祛痰 罗汉果具有明显镇咳、祛痰活性，主要活性成分为甜苷V。陈瑶等[1]采用氨水致咳试验以及酚红刺激气管分泌试验，观察罗汉果水提物对小鼠咳嗽和气管分泌物的影响，结果罗汉果甜苷的口服剂量大于15g/kg时可显著降低小鼠咳嗽次数、增加气管分泌物量，提示其有明显的镇咳祛痰作用。刘婷等[2]观察罗汉果水提成分、体积分数95%醇提成分、体积分数50%醇提成分（主含罗汉果甜苷V）对浓氨水所致小鼠咳嗽次数及咳嗽潜伏期的影响，以及50%醇提成分中的罗汉果甜苷V对小鼠酚红排泄量的影响。结果灌胃罗汉果水煎剂50g生药/kg，50%醇提成分50g生药/kg及甜苷V300，150，75mg/kg均能明显减少小鼠的咳嗽次数；灌胃50%醇提成分50g生药/kg及甜苷V300mg/kg还能明显延长小鼠咳嗽潜伏期；灌胃甜苷V150mg/kg能明显增加小鼠气管酚红排泄量。说明罗汉果甜苷V具有显著的镇咳祛痰作用。李坚等[3]采用豚鼠枸橼酸引咳法、辣椒素引咳法和机械刺激引咳法，观察罗汉果水提物对动物咳嗽次数和咳嗽潜伏期的影响，结果罗汉果水提物能明显减少枸橼酸或辣椒素引起的豚鼠咳嗽次数和延长咳嗽潜伏期，抑制机械刺激所致豚鼠咳嗽次数。 1．2抗氧化 罗汉果皂苷是一种有效的自由基清除剂，对大强度运动产生的自由基对组织的损伤有明显保护作用，提高机体的抗氧化能力，主要抗氧化活性成分为甜苷V。姚绩伟等[4]探讨了罗汉果提取液对昆明种雄性小鼠运动耐力及肝组织抗氧化损伤的影响，结果灌服罗汉果提取液小鼠游泳至力竭的时间明显延长；力竭运动后即刻和24h恢复后灌服罗汉果提取液的实验组小鼠血红蛋白与肝组织超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性显著高于未灌服罗汉果提取液的对照组，而血乳酸、血清乳酸脱氢酶、丙氨酸氨基转移酶及肝组织丙二醛含量显著低于对照组。丙二醛是过氧化脂的代谢产物，它能间接反映体内自由基水平。证明罗汉果能显著抑制小鼠肝组织丙二醛含量增高，及时清除运动过程中产生的过量自由基，有效地阻止或抑制机体脂质过氧化。戚向阳等[5]采用D－脱氧核糖法、抗超氧阴离子试剂盒法及比色法分析罗汉果皂苷清除自由基及抗脂质过氧化的效果，结果罗汉果皂苷提取物能有效地清除自由基，抑制大鼠肝组织的脂质过氧化，对Fe2+和H2O2诱导的肝组织过氧化损伤具有保护作用，能减少红细胞溶血的发生；罗汉果甜苷V清除羟基自由基的效果与皂苷提取物相当，对O2－的清除作用优于皂苷提取物。 1．3保肝 罗汉果对小鼠急性肝损伤、免疫性肝损伤有保护作用。肖刚等[6]研究了罗汉果甜苷对四氯化碳诱导的昆明种小鼠急性肝损伤和卡介苗加脂多糖诱导的免疫性肝损伤的保护作用，结果罗汉果有降低急性、免疫性肝损伤小鼠血清丙氨酸氨基转移酶、天门冬酸氨基转移酶活性的作用；对免疫性肝损伤的肝组织匀浆有升高超氧化物歧化酶活性、降低丙二醛含量的作用，并能显著减轻肝组织病理变化程度。罗汉果保肝机制可能与抗脂质过氧化有关。 1．4增强机体免疫功能 罗汉果皂苷提取物能通过免疫调节机制对糖尿病小鼠脾脏淋巴细胞的抗原表达进行调控，拮抗糖尿病时出现的细胞免疫功能失衡；有显著提高免疫抑制小鼠巨噬细胞吞噬功能和T细胞增殖，增加免疫器官质量，增强机体免疫功能的作用。陈维军等[7]探讨了罗汉果皂苷提取物对糖尿病Balb/c小鼠脾脏淋巴细胞亚群及细胞因子表达的影响，结果罗汉果皂苷提取物尤其是低剂量能降低血糖，改善胰腺的病变程度以及下调干扰素－γ(IFN－γ)、肿瘤坏死因子－α(TNF－α)的表达水平，增加糖尿病小鼠脾脏CD4+淋巴细胞数目，使CD4/CD8比值恢复正常；还可显著增加正常小鼠和糖尿病小鼠脾脏淋巴细胞白细胞介素－4(IL－4)的表达水平，但对正常小鼠其他各项指标均无明显影响。李俊等[8]给小鼠灌胃罗汉果皂苷提取物，30d后测定小鼠胸腺指数、脾脏指数、腹腔巨噬细胞吞噬功能、血清溶血素形成和淋巴细胞转化率，结果罗汉果皂苷提取物在高、低剂量下均明显使小鼠胸腺、脾脏等免疫器官质量增加，使小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞百分率及吞噬指数增加，提高小鼠血清溶血素水平，增加小鼠淋巴细胞转化率及胸腺、脾脏指数。1．5对血脂的影响 罗汉果具有调节血脂、抗血小板聚集、防止血栓形成等活血化瘀药理作用，有正向调节机体血脂代谢的功能。赵燕等[9]利用高脂饲料饲喂ICR小鼠建立高血脂动物模型，同时饲喂自来水、2%的罗汉果浓缩汁及0．08%的罗汉果甜苷溶液，60d后测定各组小鼠血清总胆固醇、甘油三酯和高密度脂蛋白胆固醇含量。结果表明，罗汉果浓缩汁组及罗汉果甜苷组小鼠血清平均总胆固醇含量分别为98．14mg/dL和86．07mg/dL，分别比饲喂自来水的高脂模型组降低了17．3%和27．5%；平均甘油三酯含量分别为153．54mg/dL 和118．98mg/dL，分别降低了28．4%和44．5%；平均高密度脂蛋白胆固醇含量分别为73．89mg/dL和70．01mg/dL，分别升高了34．4%和27．3%。证明罗汉果能显著降低高血脂动物模型血清总胆固醇和甘油三酯水平，以及明显提高高密度脂蛋白胆固醇水平。陈全斌等[10]以20 25g NIH种小鼠和200 250g SD系大白鼠为研究对象，探讨罗汉果黄酮的活血化瘀药理作用。结果表明，罗汉 罗汉果药理活性研究进展 张静，吴友良，张婵娟，吴天碧 （中国人民解放军第324医院药剂科，重庆400020） 摘要：目的为罗汉果已知药理作用的更好利用和未知药理活性的探索提供参考依据。方法查阅相关文献资料，对近10年的研究结果进行概述。结果罗汉果具有止咳祛痰、抗氧化、保肝、增强机体免疫功能、正向调节机体血脂代谢、降血糖、提高生理机能、抑菌、解痉、泻下以及抗癌的作用，且基本无毒。结论罗汉果药理活性多样，可作为药品、食品及添加剂使用，极具进一步开发利用的价值。 关键词：罗汉果；药理活性；进展；展望 中图分类号：R282．71；R285文献标识码：A文章编号：1006－4931(2010)20－0084－03 综述报告
枯草芽孢杆菌发酵产碱性蛋白酶的研究 XXX （XXX农业与生物技术学院，XX XX，XXX） 摘要：通过单因子实验对枯草芽孢杆菌发酵产碱性蛋白酶的培养基条件进行优化，采用此优化培养基对发酵菌株进行单因素试验，结果表明在其他条件均不变 且以牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉、（NH 4） 2 SO 4 、KNO 3 作为枯草芽孢杆菌发酵产碱 性蛋白酶培养基的唯一氮源时，最佳的氮源为蛋白胨，在此条件下碱性蛋白酶活力可达209.7U/ml。 关键字:枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶发酵 引言：碱性蛋白酶是指pH值为碱性的条件下水解蛋白质肽键的酶类,其最适pH值一般为9-11，属于肽酶中的丝氨酸蛋白水解酶类，除可催化蛋白质水解为氨基酸外，在有机溶剂中还可催化多肽的合成，是一类非常重要的工业用酶, 其产量约占整个世界酶制剂产量的30 %, 广泛存在于动、植物及微生物体中,在食品、医药、化工等工业有着广泛用途[1]。由于微生物碱性蛋白酶与来自动、植物的相比具有下游技术处理相对简单、价格低廉、来源广、菌体易于培养、产量较高、选育简单快速, 易于实现工业化生产等特点, 因此, 微生物碱性蛋白酶已成为研究的热点[2]。碱性蛋白酶等工业化酶制剂主要是通过复杂而成本较高的微生物培养基制备的, 其培养基成本约占工业化成本的30 %-40 %；另外, 碱性蛋白酶具有潜在的工业化应用前景, 因此经价格低廉的培养基选育较高产量的菌株以降低产酶成本显得尤为重要[3]。目前,国产碱性蛋白酶主要在酶活、成本和酶学性质等方面还不能满足工业发展要求, 大规模工业用碱性蛋白酶主要依赖进口[4]，本实验主要通过单因子试验优化枯草芽孢杆菌发酵培养基，以进一步提高枯草芽孢杆菌所产碱性蛋白酶粗酶的活力。 1材料和方法 1.1 试剂与器材 碱性蛋白酶菌种；Na 2CO 3 (0.4mol/L)；干酪素（10g/L）；三氯乙酸(0.4mol/L)； 福林试剂；100ul/ml酪氨酸标准液；胰蛋白胨；酵母浸粉；葡萄糖；糊精；CaCl 2 ； K 2HPO 4 ；牛肉膏；柠檬酸钠；（NH 4 ） 2 SO 4 ；KNO 3 恒温水浴锅，分光光度计；试管若干；移液管；吸耳球；洗瓶；漏斗；离心 机；高压灭菌锅；5L发酵罐体系；pH计；恒温摇床。 1.2 操作方法 1.2.1 福林法制作标准曲线 取11支试管，按表1所示标号加入试剂（除0号做空白对照，其余每只重复一次计算时取平均值），混匀，再加入1ml福林试剂摇匀，水浴20min，以不含酪氨酸的0号管作为空白，于分光光度计下测A680的值。以A680的值为横坐标，酪氨酸浓度为纵坐标作图如图1。
实验一产蛋白酶菌株枯草芽孢杆菌的分离 一、教学目标及基本要求 1. 学习从各种样品中分离微生物的操作技术 2. 掌握分离微生物时定性测定产物的筛选方法 3. 学习和掌握枯草芽孢杆菌的分离技术 4. 掌握高产蛋白酶菌株的初筛方法 二、实验原理 枯草杆菌是属于芽孢杆菌属的一类细菌。枯草芽孢杆菌的分布十分广泛，主要存在于土壤或腐烂的稻草之中。由于能够形成芽孢，因此能够抵抗高温，低温等不良环境，所以是实验室及工业生产中主要污染菌之一，危害极大。但是许多枯草芽孢杆菌能分泌蛋白酶、淀粉酶、抗菌素等物质，是工业酶制剂生产的重要菌种。例如，我国使用的BF7658枯草芽孢杆菌生产а-淀粉酶，用于淀粉水解，纺织品退浆等。又如AS1398枯草杆菌是生产蛋白酶的重要菌株。 1. 枯草芽孢杆菌的芽孢耐热的特点。 由于芽孢具有较强的抗高温能力，分离纯化时可采用热处理的方法，即通过高温加热杀死其中不生芽孢的菌种，使耐热的芽孢菌得到富集。 2. 枯草芽孢杆菌的产酶特征。 利用枯草芽孢杆菌产生水解酶的特性，可以选择酪蛋白或淀粉为主要营养成分的分离培养基，因菌体分泌的酶可以将大分子的蛋白或淀粉水解而在菌落周围形成透明圈。根据透明圈直径(H)和菌落直径(C)之比值(H/C)可以初步确定酶活力，其比值越大，酶活力越高，进而可筛选出高产酶活的菌株。 3. 枯草芽胞杆菌的形态特征 枯草芽孢杆菌的细胞大小0.7×2～3 μm，营养细胞为杆状，杆端钝圆、单生或者短链，着色均匀，无荚膜，周边运动，革兰氏染色阳性。有芽孢0.6×1～1.5 μm，芽孢中生或近中生，壁薄，不膨大，孢子呈椭圆或长筒形，常为两端染色。菌落变化很大，枯草芽孢杆菌在麦芽汁琼脂培养基斜面上，菌落呈细皱状，干燥或颗粒状。在土豆培养基上菌落呈细皱状，干燥，有时呈现天鹅绒状的菌苔，在液体培养基表面形成银白色的菌膜。菌落粗糙，扁平、扩展，不透明，不闪光，表面干燥，污白色或微带黄色。 4. 枯草芽胞杆菌的生理生化特性 枯草芽孢杆菌能够液化明胶，冻化牛乳，还原硝酸盐，不产生吲哚，H2S，V-P反应阳性，水解淀粉。葡萄糖发酵产酸不产气，需氧，适温25～31℃生长。 三、实验材料 1. 样品：从地表下10~15cm的土壤或者枯枝烂叶、腐烂稻草中用无菌小铲、纸袋取土样， 并记录取样的地理位置、pH、植被情况等。（学生自取） 2. 培养基 ①肉汤培养基（附录Ⅱ-1.1）：100 mL/组，其中20 mL液体培养基/250 mL△中（内装玻璃
分离产蛋白酶的芽孢杆菌菌株的分离方案 一．取样环境及原因 选择一块污染较少且植被丰富，腐殖质较厚的地块，取表层一下5—10cm处的土样，这样可以保证土壤中有多种类和多数量的高活性的微生物，并且可以避免污染物对菌种的影响。 二．筛选流程 1)将采集的土壤样品用无菌水制备1:10的土壤悬液。 2)取1:10土壤悬液5mL，注入已灭菌的试管中，将试管放入75—80℃水浴中 热处理10min，以杀死非芽孢细菌及其他微生物。 3)取热处理过的悬液100—200μL，涂布接种到牛肉膏白胨培养基平板，将平板倒置， 于30—32℃培养24—48小时。 4)对长出的单菌落进行编号，选择表面干燥、粗糙、不透明的菌落，挑取少许菌苔涂片， 做芽孢染色，选出芽孢杆菌菌落。 5)从芽孢杆菌菌落处分别挑取少许菌苔，接种到含酪蛋白的斜面培养基上，再点接于含酪 蛋白的平板，30—32℃培养24—48h，测定平板上菌落苔直径和水解圈的直径。 6)筛选出水解圈于菌落直径比值大的菌落进行发酵培养，取发酵液进行酶活力测定。再取 发酵液酶活力大的菌落进行接种培养。 三．筛选模型的选择及原因 芽孢杆菌是常见的蛋白酶产生菌，并且广泛存在于土壤中，且其性质稳定，可较容易与其它细菌分离，繁殖速度快，体积较大，在培养时可抑制有害菌生长。而且对人体无害，可代谢生产多种酶和有机酸。 四．如何检验筛选所得的菌株是所需的目的菌种 芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，可用革兰氏染色法初步判定，且其在酪蛋白平板上会产生水解圈，并且其菌种有体积较大，表面干燥、粗糙、不透明等特征，较易和其它菌种分辨。还可以利用显微镜观察比较其形态特征来判定是否为芽孢杆菌。
个人收集整理仅供参考学习 枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌产酶分析 一、概述 1. 枯草芽孢杆菌 枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属地一种.单个细胞0.7～0.8 ×2～3微米，着色均匀. 无荚膜，周生鞭毛，能运动.革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9 ×1.0～1.5 微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大.菌落表面粗糙不透明， 污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭.需氧菌.可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚.b5E2RGbCAP 有地菌株是α-淀粉酶和中性蛋白酶地重要生产菌；有地菌株具有强烈降解核苷酸地酶系，故常作选育核苷生产菌地亲株或制取5'-核苷酸酶地菌种.在遗传学研究中应用广泛，对此菌地嘌呤核苷酸地合成途径与其调节机制研究较清楚.广泛分布在土壤及腐败地有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名.p1EanqFDPw
2.地衣芽孢杆菌 地衣芽孢杆菌，种属芽孢杆菌科细菌为革兰氏阳性杆菌；细胞大小：0．8μm×（1．5～3．5）μm；细胞形态及特点：细胞形态和排列呈杆状、单生.细胞内无聚-β-羟基丁酸盐（PHB ）颗粒，产生近中生地椭圆状芽孢，孢囊稍膨大. 在肉汁培养基上地菌落为扁平、边缘不整齐、白色、表面粗糙皱褶，24h 后菌落直径为3mm.本菌有动力.可调整菌群失调达到治疗目地，可促使机体产生抗菌活性物质、杀灭致病菌.能产生抗活性物质，并具有独特地生物夺氧作用机制，能抑制致病菌地生长繁 殖.DXDiTa9E3d 二、产酶地种类 1.枯草芽孢杆菌代谢产酶种类枯草芽孢杆菌产生多种酶和其他代谢产物，主要由以下几个方面：枯草芽孢杆菌菌体在生长过程中产生地枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质对致病菌或内源性感染地条件致病菌有明显地抑制作用；RTCrpUDGiT 枯草芽孢杆菌能迅速消耗消化道内环境中地游离氧，形成肠道低氧环境，促进有益厌氧菌生长，并产生乳酸等有机酸类，降低肠道PH 值，间接抑制其它致病菌地生长；5PCzVD7HxA 枯草芽孢杆菌能刺激动物免疫器官地生长发育，激活淋巴细胞，提高免疫球蛋白和抗体水平，增强细胞免疫和体液免疫功能，提高群体免疫力； jLBHrnAILg 枯草芽孢杆菌菌体能自身合成消化性酶类，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪
酶的分离纯化方法介绍 酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶。 关键词：酶抽提纯化结晶制剂细胞破碎cell disruption 盐析亲和沉淀有机溶剂沉淀 生物细胞产生的酶有两类： 一类由细胞内产生后分泌到细胞外进行作用的酶，称为细胞外酶。这类酶大都是水解酶，如酶法生产葡萄糖所用的两种淀粉酶，就是由枯草杆菌和根酶发酵过程中分泌的。这类酶一般含量较高，容易得到； 另一类酶在细胞内产生后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为细胞内酶，如柠檬酸、肌苷酸、味精的发酵生产所进行的一系列化学反应，就是在多种酶催化下在细胞内进行的，在类酶在细胞内往往与细胞结构结合，有一定的分布区域，催化的反应具有一定的顺序性，使许多反应能有条不紊地进行。酶的来源多为生物细胞。生物细胞内产生的总的酶量虽然是很高的，但每一种酶的含量却很低，如胰脏中期消化作用的水解酶种类很多，但各种酶的含量却差别很大。 因此，在提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料，如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制，如不能综合利用，成本又很大。目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。从微生物中来生产酶制剂的优点有很多，既不受气候地理条件限制，而且动植物体内酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，产酶量又丰富，还可以通过选育菌种来提高产量，用廉价原料可以大量生产。 由于在生物组织中，除了我们所需要的某一种酶之外，往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质，因此为制取某酶制剂时，必须经过分纯化的手续。 酶是具有催化活性的蛋白质，蛋白质很容易变性，所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱，保持在较低的温度下操作。在提纯的过程中通过测定酶的催化活性可以比较容易跟踪酶在分离提纯过程中的去向。酶的催化活性又可以作为选择分离纯化方法和操作条件的指标，在整个酶的分离纯化过程中的每一步骤，始终要测定酶的总活力和比活力，这样才能知道经过某一步骤回收到多少酶，纯度提高了多少，从而决定着一步骤的取舍。 酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶制剂。下面就酶的分离纯化的常用方法作一综合介绍： 一、预处理及固液分离技术 1.细胞破碎（cell disruption） 高压均质器法：此法可用于破碎酵母菌、大肠菌、假单胞菌、杆菌甚至黑曲霉菌。将细胞悬浮液在高压下通入一个孔径可调的排放孔中，菌体从高压环境转到低压环境，细胞就容易破碎。菌悬液一次通过均质器的细胞破碎率在12%-67%。细胞破碎率与细胞的种类有关。
蛋白酶产生菌的分离、活化选育、发酵及酶活力的测定 许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是常见的蛋白酶产生菌。本实验将土壤样品悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其它微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到酪蛋白平板进行培养，根据酪蛋白平板的水解圈做初筛。也可直接将细菌或霉菌接种到酪蛋白平板进行培养，分离筛选其它蛋白酶产生菌。本实验主要包括：蛋白酶产生菌的分离纯化、产酶微生物菌种的选育、产酶微生物的发酵与酶活力的测定、蛋白酶产生菌的生长及生长曲线、培养基优化。 通过本实验项目，使学生学会从自然界中分离蛋白酶产生菌的方法，菌种的纯化技术、高产菌的选育技术；了解蛋白酶产生菌的生长情况，学会绘制其生长曲线；学会培养基优化的方法；了解蛋白酶的性质及蛋白酶的测定原理；掌握蛋白酶的发酵及酶活力测定方法。 1 实验材料 1.1 实验样品 校园内土壤样品 1.2实验仪器与材料 牛肉膏蛋白胨培养基平板、酪蛋白平板、无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液番红；显微镜、恒温水浴锅、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、血球计数板、试管、三角烧瓶、烧杯、量筒、，玻棒、电子天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH试纸（ pH 5．5—9．0）、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、培养皿、胶头滴管、分光光度计（应符合GB9721的规定）等。 2实验方法与步骤 2.1 培养基的配制方法 1.称量 按培养基配方比例依次准确地称药品放入烧杯中。 2.溶化 在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。 3.调pH 4.分装 按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。 5．包扎 塞好棉花的试管和锥形瓶应盖上厚纸用绳捆扎，用记号笔注明培养基名称、组别、日期。
药食两用的天然产物之罗汉果的研究应用化学0901 刘彦云0915020107 西安科技大学化学与化工学院 ［摘要］本文综述了国内外学者近年来对中国特有药食同源植物罗汉果化学成分及生理活性的研究，以及罗汉果生理活性物质的提取分离方法、化学结构鉴定方法，为进一步深入地研究和开发应用罗汉果及其功能性罗汉果苷类成分提供数据资料。 [关键词] 罗汉果; 提取分离; 结构鉴定；生理活性 1. 罗汉果的简介 罗汉果又名拉汗果、假苦瓜、罗晃子等，是一年 种多年收的葫芦科植物罗汉果的果实。罗汉果具有三 个比较突出的特点。一是甜度高，热量低5 J，是糖 尿病患者良好的甜味剂；二是具有较强的保健功能，具有提高免疫功能、保护肝脏及抑菌作用、降血糖、抗氧化等作用；三是毒性低，安全系数高，其水提物的LD50大于10g／kg。因此，罗汉果作为一种理想的天然功能性甜味剂，具有广阔的市场发展空间 2. 罗汉果的主要化学成分 2.1 葫芦素烷三萜类化合物 葫芦素烷三萜类皂苷是罗汉果的主要有效成分之一，约占干果的3％，这类化合物具有共同的苷元罗汉果醇，大部分具有甜味，但它不属于糖类物质，因此是糖尿病等忌食糖类病患者的理想甜味物质。罗汉果皂苷具有无毒、甜度高、热量低、色泽好、热稳定性好、水溶性好的特点。此外，它属非发酵物质，不易霉变，可以应用于饮料、医药、食品等。
图1 汉果醇结构图 2.2 蛋白质、氨基酸 罗汉果中含蛋白质7.1%-7.8%在其水解物中，除色氨酸未被测定外，18种氨基酸齐全。谷氨酸是人体中需要量最大的非必需氨基酸，是合成谷胱甘肽的重要原料，可见，罗汉果具有较高的营养价值。 2.3 其他成分 罗汉果中含有甘露醇、维生素、黄酮苷类、多糖及其它微量元素。 3. 生理活性［1］ 1）汉果提取物有镇咳平喘祛痰通便解痉作用，罗汉果作为祛咳平喘，润肠通便的传统中药使用； 2) 罗汉果提取物有抗氧化作用，提高超氧化物岐化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的含量，提高血清总抗氧化能力； 3）汉果苷提取物显著降低糖尿病，能有效改善糖尿病的临床症状和胰岛素反应,加胰腺总胰岛素的分泌和减轻胰岛的病理性损伤。 4）罗汉果提取物对肝脏的作用研究显示汉果甜苷降低血清谷丙氨酸氨基转移酶和谷草氨酸氨基转移酶的活性，提高肝组织超氧化物岐化酶的活性，减轻肝组织的病理变化，对肝损伤具有保护作用 5）罗汉果提取物有抗癌作用，罗汉果皂苷对肿瘤启动子TPA 诱导的EB 病毒早期抗原具有抑制作用。 6）罗汉果提取物对免疫系统有重要作用，能提高环磷酰胺免疫抑制巨噬细胞的吞噬功能和T 细胞的增殖作用。提高血清溶血素水平，增加淋巴细胞转化率，提高免疫功能[2] 7）罗汉果提取物的抗菌抗炎作用研究表明，罗汉果提取物显著抑制了诱导性一氧化氮合成酶和环氧合酶-2 的蛋白和mRNA 的表达，具有抗炎活性。罗汉果水提物、浓缩汁和甜苷明显抑制变形链球菌的生长、产酸和对玻棒的黏附，具有较强的抑菌活性。 4. 罗汉果有效成分的提取分离及提纯 4.1 大孔树脂吸附 干罗汉果粉碎水溶提取,至水溶液无甜味为止。水溶液压滤,滤出液经除杂、
北方民族大学学生实验论文论文题目:产蛋白酶芽孢杆菌的分离、纯化与选育 院(部)名称:生物科学与工程学院 学生姓名:杨嘉怡 专业:生物工程学号:20103371班级:102班 指导教师姓名:刘雅琴 实验小组成员:高瞻，邢艳东，刘帅，阳波 组别:第五组 实验成绩: 北方民族大学教务处制
产蛋白酶芽孢杆菌的分离、纯化与选育 摘要 酶（英语：Enzyme，又称酵素），指具有生物催化功能的高分子物质。几乎所有的细胞活动进程都需要酶的参与，以提高效率。酶作为催化剂，本身在反应过程中不被消耗，也不影响反应的化学平衡。酶具有高度的专一性，只催化特定的反应或产生特定的构型。酶是生物体内进行生物化学反应的催化剂，在生物体中已发现的酶有2500多种。目前已知的可以被酶催化的反应有约4000种。在生物体内，酶发挥着非常广泛的功能。由于酶促反应的特异性强，反应条件温和，安全无毒，环境污染少，在洗涤剂、皮革、纺织、造纸、诊断、制药等领域具有广泛的应用价值。目前，能由工业生产的50多种酶制剂包括蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、葡萄糖氧化酶，葡萄糖异构酶等，这些酶大部分是由霉菌、细菌、链霉菌和酵母菌产生的。通过本实验项目，使学生学会从自然界中分离产酶微生物的方法，菌种的纯化技术及其高产菌的选育技术。 许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是常见的蛋白酶产生菌。本实验将土壤样品（或其他样品）悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到酪蛋白平板进行培养，根据酪蛋白平板的水解圈作初筛。也可直接将细菌或霉菌接种到酪蛋白平板进行培养，分离筛选其他蛋白酶产生菌。 生物的遗传信息的改变是通过基因突变、基因重组和基因转移来进行的。基因突变，又称点突变（point mutation），包括自发突变和诱发突变，前者是未经人为施加诱变剂处理而发生的突变，后者是经人为施加诱变剂处理而获得的突变。两种突变都是由于一个或几个碱基的增加、缺失或置换而引起的，因此本质相同，不同的只是诱发突变的频率比自发突变的频率要高得多。这一部分的实验是以紫外线和亚硝基胍为例介绍了物理因素和化学因素对微生物的诱变作用。本实验中，将筛选出的蛋白酶的产生菌株作为出发菌株通过紫外线对微生物诱变作用，对菌株进行选育工作。 关键字：芽孢杆菌，分离，突变，筛选