微生物的分子生物学鉴定方法1
胡雪莲1，张钧1，单保庆2
1北京理工大学生命科学与技术学院，北京（100081）
2中国科学院生态研究中心环境水化学国家重点实验室，北京（100085）
E-mail: zhangjun@https://www.doczj.com/doc/d917074395.html,
摘要：传统的微生物分类和鉴定方法主要是以微生物的形态学和生理生化等特性为依据，繁琐且费时。近年分子生物学的发展，为微生物的分类鉴定工作提供了较简便准确的方法。分子生物学方法一部分用到PCR扩增，比如：变性和温度梯度凝胶电泳，单链构建多态性，限制性片段长度多态性，自动核糖体间隔基因分析等。一些不依赖PCR的方法也得到广泛的应用，如荧光原位杂交，DNA联合分析等。本文重点综述了几种广泛应用的分子生物学技术并对其原理及优缺点进行了阐述。
关键词：微生物群落，分类和鉴定，分子生物学方法
近15年人们对微生物多样性进行了大量的研究，但是由于技术方法的局限，一些研究并不能深入展开。分子生物学方法的出现使人类可以在种属水平上对水生真核微生物群体的多样性进行鉴定和分类，但是对原核微生物的研究仍然很少。因为它们体积微小，表型特征多样，而且大部分原核微生物不能人工培养，因此实际上也只有0.5%～10%的原核生物被鉴定出。令人欣喜的是近年来出现的一些分子生物学方法为我们研究原核微生物开辟了新途径。
在本文中，我们讨论了研究水生态环境中微生物多样性的分子生物学方法，其中简要介绍PCR技术,重点介绍基于PCR技术和不依赖PCR技术的方法。
1. PCR技术
PCR技术的兴起是生物科学界的重要变革,它克服了原有技术的不足,使人类对微生物的研究有了大的进展，由于高度的特异性和敏感性PCR扩增技术已成为研究微生物的有力工具。随着PCR技术的成熟一些更为先进和灵敏的方法应运而生,例如:实时荧光PCR(real time-PCR),反转录PCR(Reverse Transcription(RT)-PCR)，触减PCR(Touchdown-PCR),嵌套PCR （Nested-PCR）, 最小循环数PCR(Minimum Cycles for Detectable Products(MCDP)-PCR)等。其中实时荧光PCR（real time-PCR）可以定量测定微生物，此方法可以检测到扩增过程中任一时间反应物的变化 [1].它可用于测定提取总DNA中靶基因的含量。如果靶基因含量较高，扩增几个循环就能检测到产物。反转录PCR（RT-PCR）中，用特殊的引物扩增可以得到大量的目的片段。RT-PCR是一种非常灵敏的扩增活性基因的方法，它还可以测出活性较大的基因,并可以找到含有大量RNA的活性细胞[2]。在触减PCR (Touchdown-PCR)技术中,退火温度在每个连续的循环中持续降低1～2℃，退火的起始温度要比T m高5～10℃,以后逐渐降低。起始扩增循环要在很严格的退火条件下进行,以后的扩增条件逐渐宽松这样可扩增出大量产物。此方法可以达到最理想的扩增效果而不需耗费时间[3]。最小循环数PCR(MCDP-PCR)技术可以找出能检测到微量产物的最少循环数，因此可以把循环数减少到最小以使反应受到的干扰也最小。基因盒PCR(gene Cassette-PCR)技术靶向重组位点，因此内含子两侧的基因被用于探索环境基因群中的新基因。这种方法事先不需要知道基因的序列[4]。尽管PCR技术是检测微生物多样性的最快的方法之一，但它本身也有着局限性，比如不同DNA模板的多
1本课题得到天津市科技创新专项资金项目（06FZZDSH00900）的资助。
样化扩增，扩增对模板浓度的敏感性，对不纯DNA的扩增，嵌合序列的构建都影响PCR 的测定结果[5]。
2. 基于PCR的分子生物学方法
2.1 克隆文库中的随机测序
克隆文库中的随机测序(Random sequencing in clone libraries)，此方法的第一步是PCR产物的克隆，然后进行克隆文库的随机测序。序列分析可以鉴定出初始PCR产物中的优势拷贝，把这些序列与序列库中相似序列做比较，就可以对新序列进行鉴定或分析其与已知物种的关系，并可以通过构建系统发育树从分子序列库中推断出生物发育的关系。
克隆测序方法首先被Giovannoni 等[6]应用于16SrDNA的定位，以对海域中浮游细菌的多样性作检测。Zwart等[7]分析了北美和欧洲处于不同生长PH值和营养条件下的微生物的16SrDNA，结果表明淡水细菌在全球都有分布。
2.2 变性梯度凝胶电泳（DGGE）和温度梯度凝胶电泳（TGGE）
变性梯度凝胶电泳（Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)和温度梯度凝胶电泳（Temperature gradient gel electrophoresis，TGGE)问世已有十年之久，它们常用于微生物群体多样性的检测并监测其动力学变化。用这两种方法可以对生物多样性进行定性或者半定量测定。邢薇等[8]利用DGGE技术研究了产甲烷污泥颗粒中的真细菌和古生菌。DGGE和TGGE 分别通过逐渐增加的化学变性剂线性浓度梯度和线性温度梯度可以把长度相同但只有一个碱基不同的DNA片段分离。DNA分子的双链在特定温度下会分离，这个温度取决于互补链的氢键含量（富含GC的区域融解温度较高）和相邻碱基的引力。在进行凝胶电泳时，首先融解的区域会使整个分子的运动性减慢从而导致整个片段的断裂，从而改变分子的迁移率。两条单链由于GC夹板结构的存在而不能完全分离，GC夹板是引物与模板形成的，它可增加模板与引物的结合率从而增加扩增效率。DGGE和TGGE可以快速测定优势菌群。
DGGE/TGGE已广泛用于分析自然环境中细菌、蓝细菌, 古菌、微型真核生物、真核生物和病毒群落的生物多样性[8]。这一技术能够提供群落中优势种类信息并同时分析多个样品，具有可重复和操作简单等特点, 适合于调查种群的时空变化, 并且可通过对条带的序列分析或与特异性探针杂交分析鉴定群落组成。
2.3 单链构象多态性（SSCP）
单链构象多态性（Single-strand conformation polymorphism，SSCP)分析可以检测DNA序列之间的不同。SSCP首先由Lee 等[9]用于研究自然微生物群体的多样性。在低温条件下，单链DNA呈现一种由内部分子相互作用形成的三维构象，它影响了DNA在非变性凝胶中的迁移率。相同长度但不同核苷酸序列的DNA由于在凝胶中的不同迁移率而被分离。迁移率不同的条带可被银染或者荧光标记引物检测，然后用DNA自动测序进行分析。
用PCR-SSCP技术可以进行序列差异的测定，而敏感度会随着片段长度的增加而降低。但是只要条带被凝胶电泳分离开就可以进行系统发育的研究。在Schmalenberger 和Tebbe[10]的研究中，测序技术表明一个单链也许包括多种序列，电泳条件也会因此影响基因结构的确定进而影响生物多样性的研究。
2.4 末端限制性片段长度多态性（T-RFLP)
末端限制性片段长度多态性（Terminal-restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）分析是一种分析生物群落的指纹技术，它的基础原理涉及末端荧光标记的PCR产物的限制性酶切。T-RFLP是一种高效可重复的技术，它可以对一个生物群体的特定基因进行定性和定量测定。16SrRNA基因片段通常作为靶序列，它可通过非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳和毛细管电泳分离,然后用激光诱导的荧光鉴定。此技术的优点是可以检测微生物群落中较少的种群。另外，系统发生分类也可以通过末端片段的大小推断出来。
本技术的局限包括假末端限制性片段的形成，它可能导致对微生物多样性的过多估计。引物和限制酶的选择对于准确评估生物多样性也是很重要的。
2.5 核糖体间隔基因分析（RISA)和自动核糖体间隔基因分析（ARISA)
核糖体间隔基因分析(Ribosomal intergenic spacer analysis , RISA)技术由Bornemam和Triplett[11]首先使用于对土壤中微生物多样性的研究。此技术应用到rRNA操纵子中16S和23S 之间的基因的PCR扩增。16S-23SrRNA基因间隔区（Intergenic Spacer Region, ISR)因其具有相当好的保守性和可变性而备受关注,可应用于种以下水平的分类鉴定,对16S-23SrRNA基因的ISR进行扩增所用的引物往往是根据16SrRNA和23SrRNA基因两侧高度保守的区域进行设计的。RISA技术可以揭示片段长度的不同。长度不同的扩增产物可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离然后银染显象。此技术可以准确评估指纹结构群体，每一条带至少代表一个物种。
Fisher和Triplett[12]发展了RISA技术使其达到自动化，此技术被称为自动核糖体间隔基因分析（Automated ribosomal intergenic spacer analysis，ARISA) ,它可以更快更高效的评估生物群体的多样性。16S-23S之间区域的PCR扩增用的是荧光标记的快速引物，此引物可使自动毛细管电泳的进度得到直观检测。ARISA中可以分辨的荧光峰的总数代表被分析样品中物种的总体数目，片段的大小也可以与基因库中的数据进行比较，以得到更多生物信息。
2.6 随机扩增多态DNA（RAPD）
随机扩增多态DNA（Random amplification of polymorphic DNA, RAPD）使用一系列单链随机引物(通常10bp),对基因组的DNA全部进行PCR扩增以检测多态性。若遗传特性发生变化,对每一随机引物单独进行PCR 后,则导致一系列PCR产物表现其差异性,由于使用一系列引物,几乎整个基因组差异就会显露出来[13]。其中利用一个随机引物对严谨性较低的多态DNA进行扩增时引物可以和靶DNA的不同位点进行不太严谨的退火,也就是说引物和DNA
的结合部位的序列不是严格的互补。分散的DNA带也可以经过引物的退火在适于扩增的反向位置上进行扩增。尽管RAPD分析快速方便，但是它的可重复性差，甚至Tap聚合酶或者buffer的很小的改变就能影响结果。因此RAPD技术的应用条件必需被优化后它才能发挥最大的作用。
总之,基于PCR的技术似乎都适用于水生微生物群体的结构和多样性的研究。各种技术都有自身的优缺点,我们应用时要视具体实验情况选择最有利的实验方法。
3. 不涉及PCR的分子方法
3.1 磷脂脂肪酸分析技术（PLFA）
磷脂脂肪酸(Phospholipid fatty acid, PLFA)分析技术是基于不同物种PLFA的不同而进行的分析技术。PLFAs的提取,鉴定和定量分析可以提供水环境中总的生物群体的有关信息。群体中生物的大体代谢地位和此群体的应力也可以表现出来。对样品中磷脂脂肪酸的常规分
析可以与放射标记的特定菌种结合起来应用，再对放射性的PLFAs进行分析。此技术提供了微生物放射性标记的指纹图谱。它可用于研究生物群落中代谢选择的自然生物和非生命物质的混合物。目前PLFA技术还不能很好地对微生物群落进行准确分类，因为一些微生物也可能含有差别不大的PLFA，这成为应用此技术的一大障碍。
3.2 荧光原位杂交技术(FISH)
荧光原位杂交（Fluorescence in-situ hybridization , FISH)技术检测核酸序列通过荧光标记的探针在细胞内与特异的互补核酸序列杂交,通过激发杂交探针的荧光来检测信号。探针可以设计成物种特异，属特异序列或者界特异的序列的互补序列。细胞被固定并被处理成对探针有渗透性，以便探针在特异位点进行杂交。一般情况下,对细菌特定基因区域的探针是与其它特异性探针联合使用。杂交以后微生物群体被荧光显微镜特异性检测。尽管FISH有很多优点,用它研究自然样品还是会产生一些误差,因为实验方法和环境因素都可能影响它的准确性。荧光染料和探针的选择,反应条件的限制,杂交的温度等都明显影响此技术的准确性。
最近，FISH技术的发展已得到重视。一些改进的技术比如TSA-FISH(Tyramide Signal Amplification of FISH)，它使杂交的荧光信号增强了20～40倍,它已被成功应用于实际研究。
3.3 DNA联合分析技术
DNA联合分析技术（DNA re-association analysis），此技术是用于两个生物群体的全部DNA序列的比较或者同一群体中不同序列的比较。在这两种应用中都需要对物种的总DNA 进行提取和纯化，其中一个种群的DNA被放射性标记并用作模板。两种DNA样品的交叉杂交也有所应用，相似程度也能被检测出来。为了研究序列的复杂性就要对DNA变性单链及其相似序列的联合动力学进行监测，它可以反应基因组的大小及DNA的复杂性。两个群体之间的相似度越大，同一个群体中序列相似性越高分析速度越快，反之亦然。此技术的主要局限性在于要从整个的群体DNA中提取目的基因，并且要进行高度纯化，这些大大限制了本技术的应用范围与前景。
4. 结论和展望
基于PCR扩增技术的指纹技术（DGGE, T-RFLP, SSCP等）省去了建立克隆基因文库的麻烦，因此被广泛应用于水生微生物群体多样性的研究。尽管很多技术都有其不足之处，但它们都在特定方面有其重要作用。尽管存在不足，在过去的十年中我们还是通过这些技术得到大量关于水生微生物群体多样性的信息。这些技术只是提供了群体中不同物种的信息，很少涉及到细胞代谢和生态功能。
我们现在只是处于分子生物学发展的开始阶段，在以后的时期会有大量的更有效的技术出现，它可以使我们对复杂的微生物群体的分类和功能有更深入的研究，使我们更加了解生物多样性及其与生态功能的关系。
参考文献
[1] Belgrader P, Benett W, Hadley D, et al. PCR detection of bacteria in seven minutes. Science，1999, 284: 449～450.
[2] Felske A, Wolterink A, Van Lis R, et al. Phylogeny of the main bacterial 16S rRNA sequences in Drentse A grassland soils. Appl Environ Microbiol, 1998, 64: 879.
[3] Jensen S, Holmes AJ, Olsen RA, et al. Detection of methane oxidizing bacteria in forest soil by monooxygenase PCR amplification. Microbiol Ecol, 2000, 39: 282～289.
[4] Stokes HW, Holmes AJ, Nield BS, et al. Gene cassette PCR: sequence independent recovery of entire genes
from environmental DNA. Appl Environ Microbiol, 2001, 67: 5240～5246.
[5] Hugenholtz P, Goebel BM, Pace NR. Impact of culture independent studies on the emerging phylogenetic view
of bacterial diversity. J Bacteriol, 1998, 180: 4765～4774.
[6] Giovannoni SJ, Rappé MS. Evolution diversity and molecular ecology of marine prokaryotes. In: Kirchman,
D.L. (Ed.), Microbial Ecology of the Oceans. Wiley, New York, 2000, pp47～84.
[7] 邢薇，左剑恶，孙寓姣，等. 利用FISH和DGGE对产甲烷颗粒污泥中微生物种群的研究.环境科学, 2006，27(11): 2268～2270.
[8] 马悦欣. 变性梯度凝胶电泳(DGGE) 在微生物生态学中的应用.生态学报，2003，23(8): 1561.
[9] Lee DH, Zo YG, Kim SJ. Nonradioactive method to study genetic profiles of natural bacterial communities by PCR-single-strand-conformation polymorphism. Appl Environ Microbiol, 1996, 62, 3112～3120.
[10] Schmalenberger A, Tebbe CC. Bacterial diversity in maize rhizospheres: conclusions on the use of genetic profiles based on PCR-amplified partial small subunit rRNA genes in ecological studies. Mol Ecol, 2003, 12,
251～262.
[11] Borneman J, Triplett EW. Molecular microbial diversity in soils from Eastern Amazonia: evidence for
unusual microorganisms and microbial population shifts associated with deforestation. Appl Environ Microbiol, 1997, 63, 2647～2653.
[12] Fisher MM, Klug JL, Lauster G. Effects of resources and trophic interactions on freshwater bacterioplankton diversity. Microb Ecol, 2000, 40, 125～138.
[13] 邓墨渊，王伯初，杨再昌，等. 分子生物学技术在植物内生菌分类鉴定中的应用. 氨基酸和生物资源，2006, 28(3): 9～14.
The molecular methods for identification of hydrophytic
microbes
Hu Xuelian1, Zhang Jun1, Shan Baoqing2
1. School of Life Science and Technology, Beijing Institute of Technology, Beijing (100081)
2. Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences,
Beijing (100085)
Abstract
The classification and identification of the microorganisms is an important way to the study of microorganism. Traditionally, it is tedious and time-consuming because it follows the character of bioecology .With the development of molecular biology, the way of microbic identification becomes more precise. Most of the molecular biology methods are involved in PCR, for instants, temperature gradient gel electrophoresis, denaturing gradient gel electrophoresis, random sequencing in clone libraries, single-strand conformation polymorphism, terminal-restriction fragment length polymorphism, and so on. Some methods which are not involved in PCR are also be used widely, such as fluorescence in-situ hybridization, DNA re-association analysis. On the whole, we can get different information from different methods. In this paper, we introduce some useful methods and show their advantages and disadvantages.
Keywords: Microbe community, Classification and identification, Molecular methods
第三节微生物的分类鉴定方法 一、微生物鉴定的依据 获得纯化的微生物分离菌株后，首先判定是原核微生物还是真核微生物，这实际上在分离过程中所使用的方法和选择性培养基已经决定了分离菌株的大类的归属，从平板菌落的特征和液体培养的性状都可加以判定。然后，如是原核微生物，便可根据表14-3 所示的经典分类鉴定指标进行鉴定，如条件允许，可做碳源利用的BIOLOG-GN 分析和16S rDNA 序列分析。多项结果结合起来确定分离菌株的属和种。 表14-3 微生物经典分类鉴定方法的指标依据 二、微生物鉴定的技术与方法 根据目前微生物分类学中使用的技术和方法，可把它们分成四个不同的水平：①细胞形态和行为水平，②细胞组分水平，③蛋白质水平，④基因组水平； 在微生物分类学发展的早期，主要的分类鉴定指标是以在细胞形态和习性为主，可称为经典的分类鉴定法。其他三种实验技术主要是60 年代以后采用的，称为化学分类和遗传学分类法，这些方法再加上数值分类鉴定法，可称为现代的分类鉴定方法。 （一）、经典分类鉴定法 经典分类法是一百多年来进行微生物分类的传统方法。其特点是人为地选择几种形态生理生化特征进行分类，并在分类中将表型特征分为主、次。一般在科以上分类单位以形态特征、科以下分类单位以形态结合生理生化特征加以区分。最后，采用双歧法整理实验结果，排列一个个的分类单元，形成双歧检索表（图14-4 ）。 A. 能在60 o C 以上生长 B. 细胞大，宽度1.3~1.8mm ……………………………………… 1. 热微菌属 ( Thermomicrobium )
BB. 细胞小，宽度0.4~0.8mm C. 能以葡萄糖为碳源生长 D. 能在pH4.5 生长…………………………………………… 2. 热酸菌属 ( Acidothermus ) DD. 不能在pH4.5 生长………………………………………………… 3. 栖热菌属( Thermus ) CC. 不能以葡萄糖为唯一碳源……………………… 4. 栖热嗜油菌属( 栖热嗜狮菌 属Thermoleophilum ) AA. 不能在60 o C 以上生长 图14-4 双歧法检索表例样 应用BIOLOG-GN 仪检测分离菌株对众多碳源的利用情况判断分离菌株的分类地位，近年来也时有应用。在BIOLOG-GN 仪上有96 个小孔，其中95 孔内分装有95 种不同碳源的缓冲液，1 孔为无碳源的缓冲液对照，各孔接入适宜菌浓度和液量的分离菌株培养物，定温培养，每日定时读取BIOLOG-GN 仪计算机上各碳源利用情况，一般为时1 周，BIOLOG-GN 仪可显示出该鉴定菌株的最可能归属。 （二）、数值分类法 又称阿德逊氏分类法() 。它的特点是根据较多的特征进行分类，一般为50 ～60 个，多者可达100 个以上，在分类上，每一个特性的地位都是均等重要。通常是以形态、生理生化特征，对环境的反应和忍受性以及生态特性为依据。最后，将所测菌株两两进行比较，并借用电子计算机计算出菌株间的总相似值，列出相似值矩阵( 图14-5) 。为便于观察，应将矩阵重新安排，使相似度高的菌株列在一起，然后将矩阵图转换成树状谱(dendrogram)( 图14-6) ，再结合主观上的判断( 如划分类似程度大于85 ％者为同种，大于65 ％者为同属等) ，排列出—个个分类群。 图14-5 显示 6 个细菌菌株的遗传相似矩阵图
微生物常规鉴定技术 一、形态结构和培养特性观察 １、微生物的形态结构观察主要是通过染色，在显微镜下对其形状、大小、排列方式、细胞结构（包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性进行观察，直观地了解细菌在形态结构上特性，根据不同微生物在形态结构上的不同达到区别、鉴定微生物的目的。 ２、细菌细胞在固体培养基表面形成的细胞群体叫菌落（colony）。不同微生物在某种培养基中生长繁殖，所形成的菌落特征有很大差异，而同一种的细菌在一定条件下，培养特征却有一定稳定性。，以此可以对不同微生物加以区别鉴定。因此，微生物培养特性的观察也是微生物检验鉴别中的一项重要内容。 １）细菌的培养特征包括以下内容：在固体培养基上，观察菌落大小、形态、颜色（色素是水溶性还是脂溶性）、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等。在液体培养中的表面生长情况（菌膜、环）混浊度及沉淀等。半固体培养基穿刺接种观察运动、扩散情况。 ２）霉菌酵母菌的培养特征：大多数酵母菌没有丝状体，在固体培养基上形成的菌落和细菌的很相似，只是比细菌菌落大且厚。液体培养也和细菌相似，有均匀生长、沉淀或在液面形成菌膜。霉菌有分支的丝状体，菌丝粗长，在条件适宜的培养基里，菌丝无限伸长沿培养基表面蔓延。霉菌的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝都常带有不同颜色，因而菌落边缘和中心，正面和背面颜色常常不同，如青霉菌：孢子青绿色，气生菌丝无色，基内菌丝褐色。霉菌在固体培养表面形成絮状、绒毛状和蜘蛛网状菌落。
革兰氏染色: 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。 该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色步骤： （1）涂片：涂片方法与简单染色涂片相同。 （2）晾干：与简单染色法相同。 （3）固定，与简单染色法相同 （4）结晶紫色染色：将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色1分钟。 （5）水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。 （6）媒染：滴加卢哥氏碘液，媒染1min。 （7）水洗：用水洗去碘液。 （8）脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色20—25s至流出液无色，立即水洗。 （9）复染：滴加蕃红复染5min。 （10）水洗：用水洗去涂片上的蕃红染色液。 （11）晾干：将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干。 （12）镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。 （13）实验完毕后的处理： ①将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净，a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦 去。b.用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦2—3次。c.再用干净的擦镜纸将 镜头擦2—3次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。 ②看后的染色玻片用废纸将香柏油擦干
微生物的鉴定方法总结2020 微生物鉴定技术新技术新方法 32、1 细胞壁组分分析 32、2 红外光谱IR 32、3 气相色谱GC 42、4 高效液相色谱HPLC 42、5 质谱分析MS43 微生物鉴别方法传统方法在传统的分类鉴定中，微生物分类鉴定的主要依据是形态学特征、生理生化反应特征、生态学特征以及血清学反应、对噬菌体的敏感性等。在鉴定时，我们把这些依据作为鉴定项目，进行一系列的观察和鉴定工作。 1、1 细菌微菌落技术细菌的形态、大小、颜色及其它特征与细菌的基本生物学特性如代谢类型、分裂方式、繁殖速度等有密切关系。肉眼所见菌落，即大菌落是由大量的菌体紧密堆积而成，有不少生物学特性不能辨别；微菌落则是指细菌生长繁殖早期在固相载体上形成的只能借助显微镜进行观察的细菌集落。与大菌落相比，微菌落边缘及中央有明显不同的表形特征。可据此对微生物的种类进行鉴定。缺点：受操作人员主观性影响大。（1）细胞形态在显微镜下观察细胞外形大小、形状、排列等，细胞构造，革兰氏染色反应，能否运动、鞭毛着生部位和数目，有无芽孢和荚膜、芽孢的大小和位置，放线菌和真菌的繁殖器官
的形状、构造，孢子的数目、形状、大小、颜色和表面特征等。（2）群体形态群体形态通常是指以下情况的特征：在一定的固体培养基上生长的菌落特征，包括外形、大小、光泽、黏稠度、透明度、边缘、隆起情况、正反面颜色、质地、气味、是否分泌水溶性色素等；在一定的斜面培养基上生长的菌苔特征，包括生长程度、形状、边缘、隆起、颜色等；在半固体培养基上经穿刺接种后的生长情况；在液体培养基中生长情况，包括是否产生菌膜，均匀浑浊还是发生沉淀，有无气泡，培养基的颜色等。如是酵母菌，还要注意是成醭状、环状还是岛状。 1、2 生理生化反应特征（1）利用物质的能力包括对各种碳源利用的能力（能否以CO2为唯一碳源、各种糖类的利用情况等）、对各种氮源的利用能力（能否固氮、硝酸盐和铵盐利用情况等）、能源的要求（光能还是化能、氧化无机物还是氧化有机物等）、对生长因子的要求（是否需要生长因子以及需要什么生长因子等）。（2）代谢产物的特殊性这方面的鉴定项目非常多，如是否产生H2S、吲哚、CO 2、醇、有机酸，能否还原硝酸盐，能否使牛奶凝固、冻化等。（3）与温度和氧气的关系测出适合某种微生物生长的温度范围以及它的最适生长温度、最低生长温度和最高生长温度。对氧气的关系，看它是好氧、微量好氧、兼性好氧、耐氧还是专性厌氧。
第一章微生物检验常规鉴定技术 课堂教学计划（1学时） 第一章微生物检验基本知识 包括显微镜、染色技术、培养基制备技术、接种、分离纯化和培养技术等。 接种、分离纯化和培养技术
一、接种 将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。 １、接种工具和方法 接种和分离工具 1．接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀 常用的接种方法有以下几种： １）划线接种这是最常用的接种方法。即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可达到接种的作用。常用的接种工具有接种环，接种针等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。 ２）三点接种在研究霉菌形态时常用此法。此法即把少量的微生物接种在平板表面上，成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察、研究它们的形态。除三点外，也有一点或多点进行接种的。 ３）穿刺接种在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常采用此法。做穿刺接种时，用的接种工具是接种针。用的培养基一般是半固体培养基。它的做法是：用接种针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有鞭毛而能运动，则在穿刺线周围能够生长。 ４）浇混接种该法是将待接的微生物先放入培养皿中，然后再倒入冷却至45°C 左右的固体培养基，迅速轻轻摇匀，这样菌液就达到稀释的目的。待平板凝固之后，置合适温度下培养，就可长出单个的微生物菌落。 ５）涂布接种与浇混接种略有不同，就是先倒好平板，让其凝固，然后再将菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作来回左右的涂布，让菌液均匀分布，就可长出单个的微生物的菌落。 ６）液体接种从固体培养基中将菌洗下，倒入液体培养基中，或者从液体培养物中，用移液管将菌液接至液体培养基中，或从液体培养物中将菌液移至
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微生物鉴定指导原则
本指导原则为非无菌产品微生物限度控制菌检查中疑似菌的鉴定， 以及药物 原料、辅料、制药用水、生产环境、中间体和终产品中检出微生物的鉴定提供指 导。当微生物的鉴定结果有争议时，以《伯杰氏系统细菌学手册》 (《Bergey， s Manual of Systematic Bacteriology》)现行版的鉴定结果为准。 微生物鉴定是指借助现有的分类系统，通过对未知微生物的特征测定，对其 进行细菌、酵母菌和霉菌大类的区分，或属、种及菌株水平确定的过程，它是药 品微生物检验中的重要环节， 药典附录相应章节中对检出微生物的鉴定做了明确 规定，如“非无菌产品的微生物检查:控制菌检查” （通则 1106）中选择培养 基或指示培养基上发现的疑似菌落需进行鉴定； 对“无菌检查法” （通则 1101） 的阳性实验结果中分离的微生物进行鉴定，以判定试验是否重试；药品洁净实验 室微生物监测和控制指导原则（通则 9203）建议对洁净室和其他受控环境分离 到的微生物进行鉴定，以掌握环境微生物污染情况，有助于污染调查。此外，在 药品生产中，有时亦需对药物原料、辅料、制药用水、生产环境、中间产物和终 产品中检出的微生物进行适当水平的鉴定。 微生物鉴定需达到的水平视情况而定，包括种、属鉴定和菌株分型。大多数 非无菌药品生产过程和部分无菌生产环境的风险评估中， 对所检出微生物的常规 特征包括菌落形态学、细胞形态学(杆状、球状、细胞群、孢子形成模式等)、革 兰染色或其它染色法，某些能够给出鉴定结论的关键生化反应(如氧化酶、过氧 化氢酶和凝固酶反应)进行分析，一般即可满足需要；非无菌药品产品的控制菌 检查应达到种的水平；无菌试验结果阳性和无菌生产模拟工艺（如培养基灌装） 失败时，对检出的微生物鉴定一般需达到菌株水平。 一、微生物的鉴定程序 微生物鉴定的基本程序包括分离纯化和鉴定，鉴定时，一般先将待检菌进行 初步的分类。鉴定的方法有表型微生物鉴定和基因型微生物鉴定，根据所需达到 的鉴定水平选择鉴定方法。微生物鉴定系统是基于不同的分析方法，其局限性与 方法和数据库的局限性息息相关， 未知菌鉴定时通过与微生物鉴定系统中的标准 微生物（模式菌株）的特征(基因型和/或表型)相匹配来完成。如果数据库中没 有此模式菌株，就无法获得正确的鉴定结果。在日常的微生物鉴定试验中，用户
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（生物科技行业）微生物常 规鉴定技术
微生物常规鉴定技术 壹、形态结构和培养特性观察 １、微生物的形态结构观察主要是通过染色，在显微镜下对其形状、大小、排列方式、细胞结构（包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性进行观察，直观地了解细菌在形态结构上特性，根据不同微生物在形态结构上的不同达到区别、鉴定微生物的目的。 ２、细菌细胞在固体培养基表面形成的细胞群体叫菌落（colony）。不同微生物在某种培养基中生长繁殖，所形成的菌落特征有很大差异，而同壹种的细菌在壹定条件下，培养特征却有壹定稳定性。，以此能够对不同微生物加以区别鉴定。因此，微生物培养特性的观察也是微生物检验鉴别中的壹项重要内容。 １）细菌的培养特征包括以下内容：在固体培养基上，观察菌落大小、形态、颜色（色素是水溶性仍是脂溶性）、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等。在液体培养中的表面生长情况（菌膜、环）混浊度及沉淀等。半固体培养基穿刺接种观察运动、扩散情况。 ２）霉菌酵母菌的培养特征：大多数酵母菌没有丝状体，在固体培养基上形成的菌落和细菌的很相似，只是比细菌菌落大且厚。液体培养也和细菌相似，有均匀生长、沉淀或在液面形成菌膜。霉菌有分支的丝状体，菌丝粗长，在条件适宜的培养基里，菌丝无限伸长沿培养基表面蔓延。霉菌的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝都常带有不同颜色，因而菌落边缘和中心，正面和背面颜色常常不同，如
青霉菌：孢子青绿色，气生菌丝无色，基内菌丝褐色。霉菌在固体培养表面形成絮状、绒毛状和蜘蛛网状菌落。 革兰氏染色: 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）俩大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。 该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这俩类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色步骤： （1）涂片：涂片方法和简单染色涂片相同。 （2）晾干：和简单染色法相同。 （3）固定，和简单染色法相同 （4）结晶紫色染色：将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色1分钟。 （5）水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。 （6）媒染：滴加卢哥氏碘液，媒染1min。 （7）水洗：用水洗去碘液。
微生物的分类鉴定方法 1. 内容 微生物分类鉴定：经典方法、现代方法。 2. 练习 一、填空题 1.不论鉴定哪一累微生物，其工作步骤都离不开一下3项________，________，________。 答案：获得该微生物的纯培养，测定一系列必要的鉴定指标，查找权威性的菌种鉴定手册。 2.DNA碱基比是指________值，简称GC值。 答案：（G+C）mol% 3. 测验 一、填空题 1.按碱基的互补配对原理，用人工方法对两条不同来源的单链核酸进行________，以重 新构建一条新的________技术，称为核酸杂交。 一、简答题 1.现代微生物鉴定的经典指标有哪些？ 2.核酸分子杂交在微生物的分类鉴别中有何应用？ 4. 案例 5. 资源下载 课程讲义资源（Word文档）、教学课件资源（PPT）、视频录像资源（视频录像）。6. 扩展学习 使用教材： 微生物学教程第3版周德庆主编高等教育出版社2011 参考书目：
1.沈萍主编，《微生物学》，高等教育出版社，2000； 2.沈萍、范秀容、李广武编，《微生物学实验》第3版，高等教育出版社，1999； 3.Prescott LM, Harley JP, and Klein DA. Microbiology (5th ed.), Higher education press and McGraw-Hill Companies, 2002. 4. 闵航（2005）：微生物学. 浙江大学出版社 参考期刊： 微生物学报中国科学院微生物研究所；中国微生物学会主办 微生物学通报中国微生物学会；中国科学院微生物研究所主办 参考网址： 中国微生物信息网络hppt://159.226.80.1/chinese.html 中国微生物资源信息共享https://www.doczj.com/doc/d917074395.html,/sdinfo 中国微生物信息网络https://www.doczj.com/doc/d917074395.html,/
第十章微生物的分类与鉴定 一、选择题 1.真菌的分类单元-门的词尾为（A ） 2.A、–mycota B、–mycetes C、–mycotina D、-mycetidae 3.下列传统分类指标中始终被用作微生物分类和鉴定的重要依据的是（A ） 4.A、形态学特征 B、生理特征 C、生态学特征 D、分子生物学特征 5.下列拉丁文哪个书写格式正确（ C ） 6.A、Fusarium oxysporium B、Aspergillus japonicus Saito 7. C、Bacillus amyloliquefaciens D、Clostridium Kluyveri 8.1978年，根据16S rRNA和18S rRNA的碱基序列将生物分为“三域”的科 学家是（D ） 9.A、Ainsworth B、Bergey C、Leedale D、Woese 10.1995年，Ainsworth分类系统把菌物列入真核生物域，将其分为3个界， 下面哪项不属于其中（ D ） 11.A、原生动物界 B、假菌界 C、真菌界 D、菌物界 12.有关菌株的说法，下列哪项说法不对（ B ） 13.A、菌株强调的是遗传型纯的谱系 B、菌株的名称不可随意确定 14.C、菌株与克隆相同，为一个物种内遗传多态性的客观反映 15.D、菌株实际上是某一微生物达到遗传型纯的标志， 二、是非题 1．微生物的种是微生物分类的基本单元，但是目前还没有一个公认的、明确的定义。（√） 2．两个微生物菌株具有相同G+C含量表明它们之间的亲缘关系一定很相近。（×）
3．亚种是进一步细分种时所用的单元，一般指除某一明显而稳定的特征外，其余鉴定特征都与模式种相同的种，其命名方法按“三名法”处 理。（√） 4．变种是亚种的同义词，在《国际细菌命名法规》中不主张使用。（√）5．在微生物分类中，DNA（G+C）mol%的比较只能做否定判断。（√）6．微生物DNA之间的同源性越高，说明它们之间亲缘关系就越近，反之亦然。（×） 7．菌株是一个物种内遗传多态性的客观反应，是遗传型纯的谱系，其名称可以随意确定。（√） 8．模式菌株是一个种的具体活标本。（√） 9．据科学家1992年估计，地球上生存的菌物约有150万种。（√）10．微生物自动化鉴定技术一般都是利用微生物的生理生化反应特性而设计的。（√） 11．细菌分子鉴定常用16S rRNA序列分析，而真菌分子鉴定常用ITS序列分析。（√） 12．所谓“模式菌株”通常是指一个细菌的种内最具代表性的菌株。（×）13．对微生物生理生化特征的比较也是对微生物基因组的间接比较，加上测定生理生化特征比直接分析基因组要容易得多，因此生理生化特征对于微生物的系统分类仍然是有意义的。（√） 14．现代微生物分类中，任何能稳定地反映微生物种类特征的资料，都有分类学意义，都可以作为分类鉴定的依据。（×） 15．DNA-DNA杂交主要用于种、属水平上的分类研究，而进行亲缘关系更远(属以上等级)分类单元的比较，则需进行DNA-rRNA杂交。（√）
微生物鉴别方法 一、微生物鉴别方法——传统方法 在传统的分类鉴定中，微生物分类鉴定的主要依据是形态学特征、生理生化反应特征、生态学特征以及血清学反应、对噬菌体的敏感性等。在鉴定时，我们把这些依据作为鉴定项目，进行一系列的观察和鉴定工作。 1、形态学特征 （1）细胞形态 在显微镜下观察细胞外形大小、形状、排列等，细胞构造，革兰氏染色反应，能否运动、鞭毛着生部位和数目，有无芽孢和荚膜、芽孢的大小和位置，放线菌和真菌的繁殖器官的形状、构造，孢子的数目、形状、大小、颜色和表面特征等。（2）群体形态 群体形态通常是指以下情况的特征：在一定的固体培养基上生长的菌落特征，包括外形、大小、光泽、黏稠度、透明度、边缘、隆起情况、正反面颜色、质地、气味、是否分泌水溶性色素等；在一定的斜面培养基上生长的菌苔特征，包括生长程度、形状、边缘、隆起、颜色等；在半固体培养基上经穿刺接种后的生长情况；在液体培养基中生长情况，包括是否产生菌膜，均匀浑浊还是发生沉淀，有无气泡，培养基的颜色等。如是酵母菌，还要注意是成醭状、环状还是岛状。 2、生理生化反应特征 （1）利用物质的能力
包括对各种碳源利用的能力（能否以CO2为唯一碳源、各种糖类的利用情况等）、对各种氮源的利用能力（能否固氮、硝酸盐和铵盐利用情况等）、能源的要求（光能还是化能、氧化无机物还是氧化有机物等）、对生长因子的要求（是否需要生长因子以及需要什么生长因子等）。 （2）代谢产物的特殊性 这方面的鉴定项目非常多，如是否产生H2S、吲哚、CO2、醇、有机酸，能否还原硝酸盐，能否使牛奶凝固、冻化等。 （3）与温度和氧气的关系 测出适合某种微生物生长的温度范围以及它的最适生长温度、最低生长温度和最高生长温度。对氧气的关系，看它是好氧、微量好氧、兼性好氧、耐氧还是专性厌氧。 3、生态学特征 生态学特征主要包括它与其他生物之间的关系（是寄生还是共生，寄主范围以及致病的情况）。在自然界的分布情况（pH情况、水分程度等）、渗透压情况（是否耐高渗、是否有嗜盐性等）。 4、血清学反应 很多细菌有十分相似的外表结构（如鞭毛）或有作用相同的酶（如乳酸杆菌属内各种细菌都有乳酸脱氢酶）。虽然它们的蛋白质分子结构各异，但在普通技术下
目录 1 微生物鉴定技术—传统方法 (1) 1.1 细菌微菌落技术 (1) 1.2 生理生化反应特征 (1) 1.3 生态学特征 (2) 1.4 血清学反应 (2) 1.5 选择、鉴定用培养基法 (3) 1.6 微量多项实验鉴定系统 (3) 2 微生物鉴别方法—新技术新方法 (3) 2.1 细胞壁组分分析 (3) 2.2 红外光谱IR (3) 2.3 气相色谱GC (4) 2.4 高效液相色谱HPLC (4) 2.5 质谱分析MS (4) 3 微生物鉴别方法—分子生物学方法 (4) 3.1分子生物学技术 (4) 3.2 PCR技术 (4) 3.3 基因探针技术 (4) 3.4 16SrDNA基因同源性分析 (5)
微生物的鉴定方法 1 微生物鉴定技术—传统方法 在传统的分类鉴定中，微生物分类鉴定的主要依据是形态学特征、生理生化反应特征、生态学特征以及血清学反应、对噬菌体的敏感性等。在鉴定时，我们把这些依据作为鉴定项目，进行一系列的观察和鉴定工作。 1.1 细菌微菌落技术 细菌的形态、大小、颜色及其它特征与细菌的基本生物学特性如代谢类型、分裂方式、繁殖速度等有密切关系。肉眼所见菌落，即大菌落是由大量的菌体紧密堆积而成，有不少生物学特性不能辨别；微菌落则是指细菌生长繁殖早期在固相载体上形成的只能借助显微镜进行观察的细菌集落。与大菌落相比，微菌落边缘及中央有明显不同的表形特征。可据此对微生物的种类进行鉴定。缺点：受操作人员主观性影响大。 （1）细胞形态 在显微镜下观察细胞外形大小、形状、排列等，细胞构造，革兰氏染色反应，能否运动、鞭毛着生部位和数目，有无芽孢和荚膜、芽孢的大小和位置，放线菌和真菌的繁殖器官的形状、构造，孢子的数目、形状、大小、颜色和表面特征等。（2）群体形态 群体形态通常是指以下情况的特征：在一定的固体培养基上生长的菌落特征，包括外形、大小、光泽、黏稠度、透明度、边缘、隆起情况、正反面颜色、质地、气味、是否分泌水溶性色素等；在一定的斜面培养基上生长的菌苔特征，包括生长程度、形状、边缘、隆起、颜色等；在半固体培养基上经穿刺接种后的生长情况；在液体培养基中生长情况，包括是否产生菌膜，均匀浑浊还是发生沉淀，有无气泡，培养基的颜色等。如是酵母菌，还要注意是成醭状、环状还是岛状。 1.2 生理生化反应特征 （1）利用物质的能力
一、填空： 1．微生物菌种的命名采用"双名法",即由属名和种名加词构成。 2．来源于一个细胞在固体平板培养基上形成的群体称菌株。 3．1969年将生物界分成了五界，分别是动物界、植物界、原生生物界、真菌界、原核生物界。4．细菌的分类单元分为七个基本的分类等级，由上而下依次为_界、_门__、纲、目、科、属、种。 5．生物分类的传统指标为形态特征、生理生化反应、和生态特性。 6．形态学特征始终被用作微生物分类和鉴定的重要依据之一，其主要原因为具有相对稳定性_和易观察。 7．分类学的内容包括_细菌分类_、放线菌分类和真菌分类_三部分，目前进行细菌分类和鉴定的重要参考书目是_《伯杰氏细菌鉴定手册》。 8．微生物分类和鉴定的特征包括_形态特征_和_生理生化反应_，其中__形态特征_对鉴定微生物的系统发育有决定性作用，而_生理生化反应_可作为判断亲缘关系的参考而且对以实用为目的的分类鉴定仍有重要价值。 9．核酸分子杂交_和_rRNA寡核苷酸编目分析__是目前通过直接比较基因组进行生物分类最常用的两种方法。 10．1978年，Woese等提出新的生物分类概念，根据16SrRNA的碱基序列将生物清晰地划分为三原界，即细菌域、古生菌域和真核生物域。 11．对微生物命定学名的表示方法分双名与三名两种。 12．在生物的界级分类学说研究中,1978年由R．H．whittake和“提出了一个崭新的三域学说。13．填写以下10个数据：(1) 对牛奶等进行巴氏消毒时常用 63 ℃的温度；(2)用液氮保藏微生物的温度为 -196 ℃；(3)通常细菌的最适培养温度为 37 ℃：(4)用烘箱进行的干热灭菌温度一般为 150～170 ℃；(5)的代时一般为 17 min；(6)典型的酵母菌S．cerevisiae的代时一般为 120 min，其大小一般为～10 X ～21um 。（7）至今已记载的微生物约 20万种（1995）；(8)我国卫生部门规定自来水中所含的大肠菌群数不得超过 3个/L ；(9)细菌总数不得超过 100个/ml 。 14．血清学反应是抗原和抗体之间发生的反应。 15.在鉴定菌种的一些现代方法中，有核酸分子杂交，rRNA寡核苷酸编目分析，全基因组测定，数值分类等方法。 二、选择题： 1．同种菌不同来源的纯培养称为（ C ） （A）种 (B)变种 (C)菌株 (D)群 2．试排出生物分类等级的正确顺序（D） (A)目→纲→界→门 (B)界→纲→目→门 (C)目→纲→门→界 (D)界→门→纲→目 三、判断题 1．目前种是生物分类中最小的分类单元和分类等级。√ 2．具有相同G+C含量的生物表明它们之间一定具有相近的亲缘关系。× 四、名词解释 1.种：是一个基本分类单位,它是一大群表型特征高度相似、亲缘关系极其接近、与同属内其他种有着明显差异的菌株的总称。 2.新种：从自然界中分离得到的某一微生物的纯种，如果与文献上记载的典型种的特征有明显差异，即为新种。 3．培养物：根据一定的目的，在培养基上培养的微生物称为培养物。
第十章微生物的分类和鉴定 一、名词解释： 01.系统学（systematics）：是研究生物多样性及其分类和演化关系的科学。分子 系统学是检测、描述并揭示生物在分子水平上的多样性及其演化规律的科学。研究内容包括了群体遗传结构、分类学、系统发育和分子进化等领域。 02.系统树：在研究生物进化和系统分类中，常用一种树状分支的图型来概括各 种（类）生物之间的亲缘关系，这种树状分支的图型也称为发育树（phylogenetic tree）。 03.分子系统树：通过比较生物大分子序列差异的数值构建的系统树称为分子系 统树。 04.微生物分类学（microbial taxonomy）：是一门按微生物的亲缘关系把它们安 排成条例清楚的各种分类单元或分类群的科学，其具体任务有三，即分类、鉴定和命名。 05.分类（classification）：根据文献资料，经过科学的归纳和理性的思考，整理 成一个科学的分类系统。即解决从个别到一般或从具体到抽象的问题。06.鉴定（identification）：通过详细观察和描述一个未知名称纯种微生物的各种 性状特征，然后查找现成的分类系统，以达到对其知类、辨名的目的。即解决从一般到特殊或从抽象到具体的问题 07.命名（nomenclature）：为一个新发现的微生物确定一个新学名的过程。
08.培养物（culture）：是指一定时间一定空间内微生物的细胞群或生长物。如微 生物的斜面培养物、摇瓶培养物等。如果某一培养物是由单一微生物细胞繁殖产生的，就称之为该微生物的纯培养物（pure culture)。 09.菌株（strain）：从自然界分离得到的任何一种微生物的纯培养物，都可以称 为微生物的一个菌株；用实验方法（如通过诱变）所获得的某一菌株的变异型，也可以称为一个新的菌株，以便与原来的菌株相区别。菌株是微生物分类和研究工作中最基础的操作实体。 10.标准菌株：指能代表这个种的各典型性状的一个被指定的菌株。 11.种群（population）：也有人译为群体、居群或群丛等，是指一定空间中同种 个体的组合。每一个物种在自然界中的存在，都有一定的空间结构，在其分散的、不连续的居住场所或分布区域内，形成不同的群体单元，这些群体单元就称为居群。 12.种（species）：是生物分类中基本的分类单元和分类等级。它是一大群表型特 征高度相似、亲缘关系极其接近、与同属的其他物种有明显差异的一大群菌株的总称。 13.型（form / type）：常指亚种以下的细分，当同种或同亚种不同菌株之间的性 状差异，不足以分为心的亚种时，可以细分为不同的型。例如，按抗原特征的差异分为不同的血清型；按对噬菌体裂解反应的不同分为不同的噬菌型等等。
9204 微生物鉴定指导原则 本指导原则为非无菌产品微生物限度控制菌检查中疑似菌的鉴定，以及药物原料、辅料、制药用水、中间体、终产品和环境中检出微生物的鉴定提供指导。当微生物的鉴定结果有争议时，以《伯杰氏系统细菌学手册》 (《Bergey，s Manual of Systematic Bacteriology》)现行版的鉴定结果为准。 微生物鉴定是指借助现有的分类系统，通过对未知微生物的特征测定，对其进行细菌、酵母菌和霉菌大类的区分，或属、种及菌株水平确定的过程，它是药品微生物检验中的重要环节，药典附录相应章节中对检出微生物的鉴定做了明确规定，如“非无菌产品的微生物检查:控制菌检查” （通则1106）中选择培养基或指示培养基上发现的疑似菌落需进行鉴定； 对“无菌检查法”（通则1101）的阳性实验结果中分离的微生物进行鉴定，以判定试验是否重试；药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则（通则9203）中建议对洁净室和其他受控环境分离到的微生物进行鉴定，以掌握环境微生物污染情况，有助于污染调查。此外，在药品生产中，有时亦需对药物原料、辅料、制药用水、生产环境、中间产物和终产品中检出的微生物进行适当水平的鉴定。 微生物鉴定需达到的水平视情况而定，包括种、属鉴定和菌株分型。大多数非无菌药品生产过程和部分无菌生产环境的风险评估中，对所检出微生物的常规特征包括菌落形态学、细胞形态学(杆状、球状、细胞群、孢子形成模式等)、革兰染色或其它染色法、及某些能够给出鉴定结论的关键生化反应(如氧化酶、过氧化氢酶和凝固酶反应)进行分析，一般即可满足需要；非无菌药品产品的控制菌检查应达到种的水平；无菌试验结果阳性和无菌生产模拟工艺（如培养基灌装）失败时，对检出的微生物鉴定一般需达到菌株水平。 一、微生物的鉴定程序 微生物鉴定的基本程序包括分离纯化和鉴定，鉴定时，一般先将待检菌进行初步的分类。鉴定的方法有表型微生物鉴定和基因型微生物鉴定，根据所需达到的鉴定水平选择鉴定方法。微生物鉴定系统是基于不同的分析方法，其局限性与方法和数据库的局限性息息相关，未知菌鉴定时通过与微生物鉴定系统中的标准微生物（模式菌株）的特征(基因型和/或表型)相匹配来完成。如果数据库中没有此模式菌株，就无法获得正确的鉴定结果。在日常的微生物鉴定试验中，用户
本科生物技术、生物科学专业《微生物学》分章节试题库 （命题人：柯野） 第八章微生物生态（8分） 第十章微生物的分类和鉴定（8分） 第十章微生物的分类和鉴定 一、名词解释 1 系统发育树： 2 培养物： 3 菌株： 4 种： 6 属： 7 数值分类法： 8 模式（或典型）菌株： 9 DNA（G+C）mol%值： 10 三域学说： 二、是非题 1、“大肠埃希氏菌”才是俗称“大肠杆菌”的学名。（） 2、所谓“模式菌株”通常是指一个细菌的种内了具代表的菌株。（） 3、两种细菌的G+C含量相近，说明它们亲缘关系近，反之，G+C含量差别大说明它们亲缘关系远。（） 4、DNA-DNA杂交主要用于种、属水平上的分类研究，而进行亲缘关系更远（属以上等级）分类单元的比较，则需进行DNA-rRNA杂交。（） 5、数值分类由于采用了先进的计算想技术，减少了大量的特征测定的实验操作，所以它是比较科学的现代微生物系统分类方法。（） 6、“吹口气查胃病”的原理是：幽门螺杆菌具有人体不具有的尿素酶，受检者口服13C标记的尿素，如有该菌感染，则尿素被尿素酶分解生成NH3和13CO2，用
质谱仪能快速灵敏地测出受检者呼气中13CO2的量，准确地鉴定是否被幽门螺杆菌感染。（） 7、亚种名为三元式组合，即由科名、属名加词和亚种名加词构成。 8、现代微生物生理生化特征的比较也是对微生物基因组的间接比较，加上测定生理生化特征比直接分析基因组要容易得多，因此生理生化特征对于微生物的系统仍然是有意义的。 9、蛋白质氨基酸顺序的进化速率大体上是恒定的，但功能不同的蛋白质常以不同的速率进化。功能重要的分子序列或序列区域往往进化变化速率高。 10．目前种是生物分类中最小的分类单元和分类等级。（） 11．G+C含量的比较主要用于分类中否定。（） 12.菌株是微生物分类和研究工作中最基础的操作实体。（） 三、选择题（4个答案选1） 1、血清学试验，尤其在医学细菌的分类鉴定中的重要意义，但它主要用于划分（）。 （1）种内血清型（2）种间血清型（3）属间血清型（4）属以上血清型2、根据你所掌握的知识，人为认为形态学特征学特征在以下几类微生物中的哪严分类鉴定中显得更加重要？（） （1）病毒（2）细菌（3）酵母菌（4）霉菌 3、现在自动化程度最高、功能最多的微生物专用检测仪是（） （1）气相色谱仪（2）高压液相色谱仪 （3）自动微生物检测仪（4）激光拉曼光谱仪 4、目前微生物的快速检测和自动化分析中，广泛地采用的免疫学技术是（）。（1）DNA探针（2）聚合酶链反应技术 （3）DNA芯片（4）酶联免疫吸附测定法 5、第一个古生菌的全基因组序列测定结果初步证实了它是独立于其他两域生物的第三生命形式。该古生菌是（）。 （1）种名（2）属名（3）人名（4）科名 6. Micrococcus的译名为：（） A. 链球菌属 B. 微球菌属 C. 小单胞菌属 D. 四联球菌属 7. Bacillus的译名为：（）
第十章微生物的分类与鉴定(参考答案) 一、填空： 1．微生物菌种的命名采用"双名法",即由属名和种名加词构成。 2．来源于一个细胞在固体平板培养基上形成的群体称菌株。 3．1969年将生物界分成了五界，分别是动物界、植物界、原生生物界、真菌界、原核生物界。4．细菌的分类单元分为七个基本的分类等级，由上而下依次为_界、_门__、纲、目、科、属、种。 5．生物分类的传统指标为形态特征、生理生化反应、和生态特性。 6．形态学特征始终被用作微生物分类和鉴定的重要依据之一，其主要原因为具有相对稳定性_和易观察。 7．分类学的内容包括_细菌分类_、放线菌分类和真菌分类_三部分，目前进行细菌分类和鉴定的重要参考书目是_《伯杰氏细菌鉴定手册》。 8．微生物分类和鉴定的特征包括_形态特征_和_生理生化反应_，其中__形态特征_对鉴定微生物的系统发育有决定性作用，而_生理生化反应_可作为判断亲缘关系的参考而且对以实用为目的的分类鉴定仍有重要价值。 9．核酸分子杂交_和_rRNA寡核苷酸编目分析__是目前通过直接比较基因组进行生物分类最常用的两种方法。 10．1978年，Woese等提出新的生物分类概念，根据16SrRNA的碱基序列将生物清晰地划分为三原界，即细菌域、古生菌域和真核生物域。 11．对微生物命定学名的表示方法分双名与三名两种。 12．在生物的界级分类学说研究中,1978年由R．H．whittake和“提出了一个崭新的三域学说。13．填写以下10个数据：(1) 对牛奶等进行巴氏消毒时常用 63 ℃的温度；(2)用液氮保藏微生物的温度为 -196 ℃；(3)通常细菌的最适培养温度为 37 ℃：(4)用烘箱进行的干热灭菌温度一般为 150～170 ℃；(5)的代时一般为 17 min；(6)典型的酵母菌S．cerevisiae的代时一般为 120 min，其大小一般为～10 X ～21um 。（7）至今已记载的微生物约 20万种（1995）；(8)我国卫生部门规定自来水中所含的大肠菌群数不得超过 3个/L ；(9)细菌总数不得超过 100个/ml 。 14．血清学反应是抗原和抗体之间发生的反应。 15.在鉴定菌种的一些现代方法中，有核酸分子杂交，rRNA寡核苷酸编目分析，全基因组测定，数值分类等方法。 二、选择题： 1．同种菌不同来源的纯培养称为（ C ） （A）种 (B)变种 (C)菌株 (D)群 2．试排出生物分类等级的正确顺序（D） (A)目→纲→界→门 (B)界→纲→目→门 (C)目→纲→门→界 (D)界→门→纲→目 三、判断题 1．目前种是生物分类中最小的分类单元和分类等级。√ 2．具有相同G+C含量的生物表明它们之间一定具有相近的亲缘关系。× 四、名词解释 1.种：是一个基本分类单位,它是一大群表型特征高度相似、亲缘关系极其接近、与同属内其他种有着明显差异的菌株的总称。 2.新种：从自然界中分离得到的某一微生物的纯种，如果与文献上记载的典型种的特征有明显差异，即为新种。 3．培养物：根据一定的目的，在培养基上培养的微生物称为培养物。
第三章微生物的分类及其分类方法 本章的核心内容是微生物的分类单元、微生物的命名法则；目前国内外最权威的原核微生物分类系统；用于分离菌株分类鉴定的方法和技术；微生物菌种的保藏。 微生物的分类单元有界、门、纲、目、科、属、种；微生物的命名依林奈氏双名法法则进行；《伯杰氏细菌学鉴定手册》，《伯杰氏系统细菌学手册》是当今进行细菌鉴定的最权威的手册；微生物分离菌株的分类鉴定有经典分类鉴定法、数值分类鉴定法、化学分类鉴定法、遗传学分类鉴定法， DNA中GC mol%分析、DNA-DNA杂交、DNA-rRNA杂交、16Sr RNA(16S rDNA)寡核苷酸的序列分析，微生物系统发育地位分析等不同层次的技术方法。微生物菌种的保藏对于研究和发酵生产都具有不可忽视的意义。保藏方法可依不同条件选择不同方法。 第一节微生物的分类单元和命名 分类是人类认识微生物，进而利用和改造微生物的一种手段，微生物工作者只有在掌握了分类学知识的基础上，才能对纷繁的微生物类群有一清晰的轮廊，了解其亲缘关系与演化关系，为人类开发利用微生物资源提供依据。 微生物分类学 (microbial taxonomy) 是一门按微生物的亲缘关系把它们安排成条理清楚的各种分类单元或分类群 (taxon) 的科学，它的具体任务有三，即分类(classification) 、命名 (nomenclature) 和鉴定 (identification) 。分类指的是根据相似性或亲缘关系，将一个有机体放在一个单元中。命名是按照国际命名法规给有机体一个科学名称。鉴定则是确定一个新的分离物是否归属于已经命名的分类单元的过程。因此，概括来说，微生物分类学是对各个微生物进行鉴定，按分类学准则排列成分类系统，并对已确定的分类单元进行科学命名的科学。 一、微生物的分类单元 微生物的主要分类单位，依次为界 (kingdom) 、门（ phylum 或 division ）、纲(class) 、目 (order) 、科 (fami1y) 、属 (genus) 、种 (species) 。其中种是最基本的分类单位。具有完全或极多相同特点的有机体构成同种。性质相似、相互有关的各种组成属。相近似的届合并为科。近似的科合并为目。近似的目归纳为纲。综合各纲成为门。由此构成一个完整的分类系统。以下以柠檬浮霉状菌为例加以说明。
第10章微生物的分类鉴定 填空题 1，以进化论为指导思想的分类学，其目的已不仅是物种的识别和归类，而主要是通过分类追溯系统发生，推断进化谱系，这样的分类学也称。 2，大量资料表明：功能重要的分子或功能重要的分子区域比功能不重要的大分子或大分子区域进化变化的。 3．微量多项试验鉴定系统，实际上是一类专门设计制作的特征检测卡。 4．《伯杰氏系统细菌学手册》第一版分卷出版，它将原核生物分成组。 5．微生物种的学名由和两部分构成。 6．分类学的内容涉及3个互相依存又有区别的组成部分，即、命名和。 7．如果相似性系数(S AB)等于1，说明所比较的两菌株rRNA序列，若S AB值小于0.1，则表明两菌株亲缘关系。 8．API／ATB是微量多项试验鉴定系统，它包括众多的，共计有几百种生理生化反应，可鉴定几乎所有常见的。 9．微孔滤膜菌落计数板是一种可携带的检测水中大肠菌数的大肠菌测试卡，适于工作和使用，因可以放在人体内衣口袋中培养。 10．伍斯用寡核苷酸序列编目分析法对微生物的16SrRNA序列进行比较后，提出将生物分成为三界(域)：、和。 11．伍斯为了避免把古细菌也看作是细菌的一类，他又把三界(域)改称为：、和。并构建了三界(域)生物的系统树。 选择题(4个答案选1) 1．《伯杰氏系统细菌学手册》第二版把葡萄球菌属和微球菌属分别放在不同的门中，最可能的原因是( )。 (1)生理生化特征不同(2)DNA—DNA杂交同源性不同(3)革兰氏染色反应不同 (4)G+C含量和rRNA序列不同 2．如果需要查阅枯草芽孢杆菌及相关种的分类学资料，并假定《伯杰氏系统细菌学手册》第二版已经全部出版，你将选择该书的( )。 (1)第一卷 (2)第三卷 (3)第四卷 (4)第五卷 3．血清学试验，尤其在医学细菌的分类鉴定中有重要意义，但它主要用于划分( )。 (1)种内血清型 (2)种间血清型 (3)属间血清型 (4)属以上血清型 4．根据你所掌握的知识，你认为形态学特征在以下几类微生物中的哪一类分类鉴定中显得更加重要?( ) (1)病毒 (2)细菌 (3)酵母菌 (4)霉菌 5．在下列4种细菌中，哪一种最有可能属于 (3)自动微生物检测仪 (4)激光拉曼光谱仪 8．目前微生物的快速检测和自动化分析中，广泛地采用的免疫学技术是( )。 (1)DNA探针 (2)聚合酶链反应技术 (3)DNA芯片 (4)酶联免疫吸附测定法 9．第一个古生菌的全基因组序列测定结果初步证实了它是独立于其他两域生物的第三生命形式。该古生菌是( )。 (1)螺旋体 (2)淋病奈瑟氏菌 (3)变形杆菌 (4)詹氏甲烷球菌 10．细菌的种名也用双名法命名，即种的学名由属名和种名加词两部分组合而成。第一个词的首字母要大写，该词是( )。 (1)种名 (2)属名 (3)人名 (4)科名是非题