生物样品分析前处理技术
生物样品的前处理涉及很多方面，但主要应考虑生物样品的种类，被测定药物的性质和测定方法三个方面的问题。1.样品的分离、纯化技术应该依据生物样品的类型。例如，血浆或血清需除蛋白，使药物从蛋白结合物中释出；唾液样品则主要采用离心沉淀除去粘蛋白；尿液样品常采用酸或酶水解使药物从缀合物中释出，当原型药物排泄在尿中时，可简单地用水稀释一定倍数后进行测定。2.根据被测定药物的结构、理化及药理性质、存在形式、浓度范围等，采取相应的前处理方法。例如，药物的酸碱性（pka）、溶解性质涉及到药物的提取手段；是否具有挥发性涉及到能否采用气相色谱法测定；药物的光谱特性及官能团性质涉及到分析仪器的选择、能否制成衍生物及应用特殊检测器的可能性。药物在样品中的浓度相差很大，浓度大的样品，对前处理要求可稍低；浓度越低则样品前处理要求越高。此外，药物在体内常产生许多代谢产物，其中一些代谢物仍具有药理活性，需要与原型药分别测定，因而也要了解药物的药理学性质和药物动力学特性。3.样品于测定前是否需要纯化以及纯化到什么程度均与其后采用的测定方法的不同而不同。即纯化程度与所用测定方法的专属性、分离能力、检测系统对不纯样品污染的耐受程度等密切相关。一般说来，放射免疫测定法由于具有较高的灵敏度和选择性，因此当初步除去主要干扰物质之后即可直接测定微量样品；而对灵敏度和专属性较差的紫外分光光度法，分离要求就要相应高一些；至于常用的高效液相色谱法，为防止蛋白质等杂质沉积在色谱柱上，上柱前需对生物样品进行去蛋白，有时对被测组分进行提取、制备衍生物等前处理。 样品处理步骤与分析方法的选择 (一）去除蛋白质 在测定血样时，首先应去除蛋白质。去除蛋白质可使结合型的药物均出来，以便测定药物的总浓度；去除蛋白质也可预防提取过程中蛋白质发泡，减少乳化的形成，以及可以保护仪器性能（如保护HPLC柱不被沾污），延长使用期限。去除蛋白法有以下几种。 1.加入与水相混溶的有机溶剂加入水溶性的有机溶剂；可使蛋白质的分子内及分子间的氢键发生变化而使蛋白质凝聚，使与蛋白质结合的药物释放出来。常用的水溶性有机溶剂有：乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氢呋喃等。含药物的血浆或血清与水溶性有机溶剂的体积比为1：（1～3）时，就可以将90％以上的蛋白质除去。水溶性有机溶剂的种类不同时，析出的蛋白质形状亦不同；并且所得上清液的pH值也稍有差别，如用乙腈或甲醇时，上清液pH为8.5～9.5，用乙醇或丙酮时，上清液pH为9～10。操作时，将水溶性有机溶剂与血浆或血清按一定比例混合后离心分离，取上清液作为样品。通常分离血浆或血清用的离心机（3000r/min）不能将蛋白质沉淀完全，而采用超速离心机（10000r／min）离心1～2min 便可将析出的蛋白质完全沉淀。离心时应用超速离心机专用的具塞塑料尖底管，可使析出的蛋白质牢固地粘在管底，便于上清液的吸取。 2.加入中性盐加入中性盐，使溶液的离子强度发生变化。中性盐能将与蛋白质水合的水置换出来，从而使蛋白质脱水而沉淀。常用的中性盐有：饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐及枸橼酸盐等。操作时，如按血清与饱和硫酸铵的比例为1：2，混合，离心（10000r/min）1～2min，即可除去90％以上的蛋白质。所得上清液的pH为7.0～7.7这种利用盐析的方法与有机溶剂提取法并用时，药物的回收率高，因而常常被采用。 3.加入强酸当pH低于蛋白质的等电点时，蛋白质以阳离子形式存在。此时加入强酸，可与蛋白质阳离子形成不溶住盐而沉淀。常用的强酸有：10％三氯醋酸、6％高氯酸、硫酸-钨酸混合液及5％偏磷酸等。含药物血清与强酸的比例为1：0.6混合，离心〈10000r／min）1～2min，就可以除去90％以上的蛋白质。取上清液作为样品。因加入了强酸，上清液呈酸性（pH0～4），在酸性下分解的药物不宜用本法除蛋白。过量的三氯醋酸可经煮沸，分解为氯仿和二氧化碳而被除去；也有用乙醚提取过量三氯醋酸的方法。过量的高氯酸可用碳酸钾、
化学实验中常见问题解析（50问） 1.测定熔点时，遇到下列情况将产生什么结果？ (1) 熔点管壁太厚；(2) 熔点管不洁净；(3) 试料研的不细或装得不实； (4)加热太快；(5) 第一次熔点测定后，热浴液不冷却立即做第二次； (6)温度计歪斜或熔点管与温度计不附贴。 答：(1) 熔点管壁太厚，影响传热，其结果是测得的初熔温度偏高。(2) 熔点管不洁净，相当于在试料中掺入杂质，其结果将导致测得的熔点偏低。(3) 试料研得不细或装得不实，这样试料颗粒之间空隙较大，其空隙之间为空气所占据，而空气导热系数较小，结果导致熔距加大，测得的熔点数值偏高。(4) 加热太快，则热浴体温度大于热量转移到待测样品中的转移能力，而导致测得的熔点偏高，熔距加大。(5) 若连续测几次时，当第一次完成后需将溶液冷却至原熔点温度的二分之一以下，才可测第二次，不冷却马上做第二次测量，测得的熔点偏高。 (6) 齐列熔点测定的缺点就是温度分布不均匀，若温度计歪斜或熔点管与温度计不附贴，这样所测数值会有不同程度的偏差。 2 是否可以使用第一次测定熔点时已经熔化了的试料使其固化后做第二次测定？ 答：不可以。因为有时某些物质会发生部分分解，有些物质则可能转变为具有不同熔点的其它结晶体。 3 测得A、B两种样品的熔点相同，将它们研细，并以等量混合(1) 测得混合物的熔点有下降现象且熔程增宽；(2)测得混合物的熔点与纯A、纯B的熔点均相同。试分析以上情况各说明什么？
答：(1)说明A、B两个样品不是同一种物质，一种物质在此充当了另一种物质的杂质，故混合物的熔点降低，熔程增宽。(2)除少数情况（如形成固熔体）外，一般可认为这两个样品为同一化合物。 4 沸石(即止暴剂或助沸剂)为什么能止暴？如果加热后才发现没加沸石怎么办？由于某种原因中途停止加热，再重新开始蒸馏时，是否需要补加沸石？为什么？ 答：(1)沸石为多孔性物质，它在溶液中受热时会产生一股稳定而细小的空气泡流，这一泡流以及随之而产生的湍动，能使液体中的大气泡破裂，成为液体分子的气化中心，从而使液体平稳地沸腾，防止了液体因过热而产生的暴沸。(2)如果加热后才发现没加沸石，应立即停止加热，待液体冷却后再补加，切忌在加热过程中补加，否则会引起剧烈的暴沸，甚至使部分液体冲出瓶外，有时会引起着火。(3)中途停止蒸馏，再重新开始蒸馏时，因液体已被吸入沸石的空隙中，再加热已不能产生细小的空气流而失效，必须重新补加沸石。 5 冷凝管通水方向是由下而上，反过来行吗？为什么？ 答：冷凝管通水是由下而上，反过来不行。因为这样冷凝管不能充满水，由此可能带来两个后果：其一，气体的冷凝效果不好。其二，冷凝管的内管可能炸裂。 6 蒸馏时加热的快慢，对实验结果有何影响？为什么？ 答：蒸馏时加热过猛，火焰太大，易造成蒸馏瓶局部过热现象，使实验数据不准确，而且馏份纯度也不高。加热太慢，蒸气达不到支口处，不仅蒸馏进行得太慢，而且因温度计水银球不能被蒸气包围或瞬间蒸
报批细节 1、技术档案： 技术人员简历表、培训档案、要求有实质性文件如每人的学历证书、上岗证、科研成果（课题）、技术文章、获奖证书等的复印件 2、仪器档案： 实验室所有仪器的购买、使用、校正、放置地点、出厂编号、说明书复印件等 实验室所有仪器维护校正记录如：加样器、温度计、温湿度计需出具计量局校正报告文件（可每种只校正一套作为标准）。 扩增仪需有仪器厂家专业技术人员维护校正报告，和校正后的参数。 加样器的出厂编号、使用时间、校正记录。 5700维护后验证记录—用同一公司或校准试剂或用自制质控血清并记录数值 3、其他细节: 垃圾处理：按生物污染性制品，交医院统一处理。 仪器简单操作流程 标记笔、枪头盒等一些小物品都要标明分区。 仪器的申请、采购、使用、验证程序 样本采集（针对临床医护人员）、运输、收集程序 样品的唯一编号原则—应区分开不同天、不同种类的标本 标本的保存程序—包括处理前、刚处理后、报告发放后的原始标本（原则上至少保留一周）应有专人负责。 检测结果的保存、备份记录、质控记录保存，除电脑记录外应有相应的手抄记录（类似于基因日检测统计表类型的）。 抱怨记录—应有时间、事件（项目）、接待人、处理方法、处理结果、处理人签字确认
注意事项 1、回答任何问题都应与自己写的SOP文件相一致."写你所做的,做你所写的". 2、SOP文件不能写的太虚,无法做到的东西不要写,比如公司版的SOP文件里的加样器的校准一般实验室就做不到.模棱两可也不要写,比如"消毒时间一到两小时"不能这样写,多少就是多少. 3、处理标本要在生物安全柜内,而加样则在柜外. 4、各区门口要贴有各区的工作制度,限入标志.还要准备两个登记本,一个来记录紫外消毒,一个来记录工作人员出入.区内还要有一个工作记录本,用来记录各区每天的工作内容,便于监测每天的工作全过程. 5、每把枪的用途要清楚,不能弄乱.比如稀释阳模的枪和处理标本的枪不可混用. 6、普通离心机处理分泌物标本时应在离心后静置20分钟才能开盖.(许斌这样认为) 7、所有仪器、设备都要有档案卡. 8、所有的清洁消毒要在实验结束后马上进行,尤其是仪器、设备.像扩增仪，每天都要清洁，做完的反应管决对不能留在样品槽内。 9、各区的拖把、抹布不得混用,标记清楚. 10、生物防护意识要强,手套要随时更换.生物防护安全的保证要从三个方面:制 度、硬件、意识。 11、爆管如何处理:立即停止实验,水浴里的水要倒掉,冲洗.所有可能污染的地方 要用消毒液擦洗,紫外照射,通风排风. 12、各区应有日常工作核查表,做为每天工作记录的补充. 13、各区要有泡有消毒液的生物污物桶,用来处理生物垃圾. 14、验收组带来的标本要按平时对待临床标本一样处理,要有接收记录,结果登记 等. 15、拒绝电话或代领等非正常方式发放报告单. 16、存放标本的冰箱要上锁,钥匙及电脑资料的密码要由本科室人员专人保管. 17、报告单上要注明试剂的检测下限,不能写成参考范围.除了有操作者,还要有 核校者,且两者姓名除了电子打印还要用手签.定量结果不能有阴阳性提示,
土工试验中常见问题分析及改善对策 发表时间：2018-06-06T16:08:49.663Z 来源：《基层建设》2018年第11期作者：刘军李润 [导读] 摘要：土工试验是工程勘察的一个重要组成部分，为各种工程建（构）筑物、公路、铁路、水利等的设计施工提供重要的参数，因此其准确性和真实性关系到整个建筑的安全和质量问题，除了要保证试验成果的可靠性外，对试验成果的应用也应结合现场实际情况进行，尤其对于当地存在的某些较为特殊的地质，而不是完全套用规范。 中国水利水电第十四工程局有限公司勘察设计研究中心云南省昆明市 650041 摘要：土工试验是工程勘察的一个重要组成部分，为各种工程建（构）筑物、公路、铁路、水利等的设计施工提供重要的参数，因此其准确性和真实性关系到整个建筑的安全和质量问题，除了要保证试验成果的可靠性外，对试验成果的应用也应结合现场实际情况进行，尤其对于当地存在的某些较为特殊的地质，而不是完全套用规范。本文根据这几年从事土工试验经验，浅谈土工试验成果在工程勘察中的应用及常见的一些问题。 关键词：土工试验室；试验；岩土工程 引言 在岩土工程施工过程中，勘察环节是其中最为关键的环节，土工试验利用试验项目测试的方式检测岩土工程参数，为岩土工程施工提供准确的物理与力学指标，以此明确岩土分层、地基处理确定以及沉降估算等相关环节，并完成工程勘察报告。需要通过土工实验室按规范要求对来样进行一系列试验，为岩土工程提供准确的数据参考。 1土工试验分析 对于岩土工程而言，其建设的目的在于更好的开发资源，为社会的生产、生活条件改善，提供足够的支持。可是以目前所掌握的情况来看，很多地方的岩土工程，都受到了自然环境的严重制约，如果不能通过合理的手段来改善，将很容易造成强烈的威胁，甚至是给地方发展构成严重的不良影响。分析认为，土工试验的特点，主要是集中在以下几个方面：第一，岩土工程的勘查工作，不可能完全通过经验模式来开展，必须具备足够的科学依据，要求在各项数据上、信息上、材料上，都达到健全的目标，我们利用土工试验，可以更好地了解到岩土工程的特色，在多个方面掌握好工作的重点，同时掌握好工作的具体方向，避免出现严重的恶性循环。第二，土工试验在开展的过程中，能够利用一些比较积极的手段来完成，这样就可以降低勘查工作的难度，在工作量方面也得到了良好的安排，对于之前的工作难题解决，基本上可以得到良好的效果。 2岩土工程勘查工作中土工试验的相关问题及改善对策 2.1含水量与天然密度问题 土工试验中天然密度通常是以环刀法进行测试的，其面对的问题体现在以下方面：①来样失真。在取样、运输过程中所造成的扰动较为显著、已经受损的土样，是无法代替原始状态的；②环刀切样操作不规范。例如没有削除四周多余的土体，切样的方向没有保证垂直度，加上环刀表面没有凡士林。所以需要根据自然沉积形成的方向堆放土样，使用钢丝弓将四周多余的土切掉，并将环刀缓慢下压，切记不能摇晃。对于易破裂或形状不规则的土样，可以使用蜡封法对其密度进行测定，但实践中这一方式并不是十分常用且以经验值为主。对于土含水量的测定一般是使用烘干法，其中面临的问题体现为以下几点：①选样缺乏合理性。接近样皮的部分经常出现水分流失现象，此外渗流也会导致各个部位含水量存在差异，对于此需要选择中间段代表性强的土体。②烘干时间以及温度控制有失合理性。当试验标准中取样的要求是15~30g，那么黏土的烘干温度则最好处在110℃以下，烘干时间要长于8个小时。在实践操作期间，取土样重量往往大于 30g，若烘干时间依然为8h，则会导致出现烘干不透的现象，致使含水量最终检测结果不准确。 2.2试验方法 从主观的角度来分析，岩土工程在实施勘查的过程中，并不能通过简单的方法来实施，一定要走长期发展的路线。在既往的工作当中，有些地方的岩土工程勘查工作，表面上执行的手段是比较积极的，可是在实际工作中，并没有得到预期的工作效果，反而是造成了很大的隐患，给工程造成的不良影响较为严重。针对试验方法的问题，建议从以下几个角度来解决。第一，原位测试方法的选取过程中，应该按照合理的原则来选择。现如今的土工试验，已经得到了各个地方的高度关注，具体的试验结果、方法等，都会给岩土工程勘查工作造成较大的影响。我们在操作原位测试方法的过程中，要提前开展对比分析，找到合理的测试方案，从多个角度来观察是否能够达到预期的要求，是否可以将工作的可靠性充分提升，如果不符合要求，则必须考虑将2种原位测试方法联合应用，最大限度地降低安全隐患，减少测试的误差现象。第二，对于土石抗剪强度的测定，需要通过多种有效的试验方法来完成，这其中包括了无侧限抗压试验、直接剪切试验等等，不同的试验方法，适合在差异化的条件下完成，这就需要在具体的工作中，采用合理的手段来操作，不能完全凭借主观上的经验来实施。 2.3仪器设备问题 现阶段，我国众多土工试验中使用的设备仍然是上世纪购买的仪器。因使用年限比较长，很多设备存在着磨损与老化的情况，就一定程度上来说，设备的磨损与老化会直接影响到土工试验仪器测量的可靠性和准确性。如果仪器存在明显故障，有的实验室可能为了获取最大利益，仍然使用即将报废的仪器设备，使得岩土工程勘察土工试验受到不良影响。另外，岩土工程勘察土工试验的设备不符合实际规范的要求。有很多企业刚开始从事土工试验设备的生产与经营，其成立年限比较短，经验也不足，其生产出现的产品质量可能很难得到保障。还有的企业规模比较小，资金在周转中常会出现问题，为了进一步维护企业的生产，只能通过降低产品的质量水平来保证市场竞争力，这样企业生产出来的产品质量是无法满足实际生产需求的。针对岩土工程勘察土工试验中的仪器设备问题，需要对仪器设备的质量进行提升，定期进行实验仪器检查与更新工作。结合实验室仪器设备的老化情况，应该积极进行资金争取，对于使用年限较长的、无法进行准确检测的仪器设备进行及时更换。若实验室的资金比较紧张，就要定期检查设备的使用情况，保证仪器设备的正常运行，保证其还能测量出准确的数据。针对一些已经不能准确提供测量数据的仪器设备来说，可以请专业维修人员进行仪器设备的评估，及时修理出现故障的设备，一些无法修理的设备就要及时更换。 2.4人员素质问题 岩土工程在当代的重要性是不言而喻的，同时在很多方面都必须采用合理的手段来完成。我国作为一个发展中国家，土工试验的落实，必须要在高素质的人员操作下完成。可是在实际的调研当中，发现试验人员的素质，并没有最大限度地满足需求，由此造成的不良影
生物试样分析的前处理 户田昭三 钟辉译友岩校 一、前言 以电感耦合等离子发射光谱法〈ICP〉或原子吸收法〈AAS〉对生物试样中金属元素进行一般性测定时，必须预先处理水分及有机物等试样主体成分。生物体中含有70％以上的水分，各种生物体中水分含量列于表1。 也有按照灰分重量计算元素含量的。在某些特定的情况下，也有根据某种特定成分的含量计算其它成分含量的。以新鲜生物体为准计算测定成分的含量时，由于取样后试样的经历和保存方式的不同，水分含量也不同，测定值的重现性很差。 二取样保存 生物试样中微量元素的含量与工业制品的情况不同，即使从同一场所采取试样，每个生物体之间也有很大差别。还必须考虑到由于采样环境、粘附或混入试样中物质的影响，如粘在根上的土及叶子上的灰尘等应该洗净。由于海水、河水中金属元素含量非常低，不必顾虑试样粘上的水会使金属元素的含量发生很大变化，可用滤纸或纱布将水轻轻擦拭干净。 生物死亡之后，由于自身新陈代谢的加剧，组织腐败，NA ﹑K﹑CA﹑C I等离子随渗出的细胞液流失，会使得测定值发生很大变化。因此，最好是在采取试样后尽可能快地处理。植物的种子和薯类那样的生物组织如果处于暂时的生长状态，即使经过数日，除水分之外其它成分也不会发生很大变化，动物的肌肉
红血球等细胞膜脆弱的试样，冷冻会破坏细胞膜，使细胞液流出与细胞外液 〈如血清〉混合而得不到真正的分析数值。红血球[1]内Zn、K、Ca﹑Fe、Na的 含量分别为10, 3600, 0.67, 1000, 200ug/ml, 而血清中上述元素的含量分别为0.6 ~1.2, 160, 100, 1.0, 3300ub/ml,应该注意到这种悬殊的差别。测定血液中的成分 时，取样后必须尽快进行分离处理，然后再保存，或者采样于定量容器内，分析 时处理全部试样后测定，以全血中的含量表示。 保存干燥试样时应置于干燥、避光的场所，可用硅胶等降低试样保存环境的 温度。用干燥氮气置换保存容器内的空气，或封入防老化箱、一次性手炉那样的 装有脱氧剂的包装之内，可长期保存。只是这类包装含有铁、钙等物质，启封时 必须注意。 三干燥 从生物试样的保存和运输方面考虑，干燥的试样较为方便，为了准确、精密 地分析和表达试样中金属元素含量，最好使用干燥试样并按照干燥试样的单位重 量计算成分含量。某些种类的试样，在一定的条件下干燥会造成低分子有机化合 物的分解和挥发，Se、Hg、As等元素也会损失。 生物试样的干燥条件应根据试样的种类而异，例如碳水化合物含量高的试样 水分与碳的结合力很强，需要较高的干燥温度。对于脂肪含量低水分含量 高的试样，应预先在60～70°Ｃ通风干燥，使之与大气中蒸汽压达到平衡之后 再做作进一步处理。表2中列出了日本科学技术厅和资源调查委员会颁布的食品 标准分析方法中为测定水分含量所规定的干燥条件。表内所列的条件对于分析食 品中无机成分是毫无问题的，但分析其中某些易挥发成分时则需要更稳妥的干燥 方法。分析美国商务部标准局（NBS）和日本环境厅国立公害研究所制备的用于 分析金属元素成分的生物试样时，分析前的干燥条件如表3所示。同时也指出， 分析Hg、Se、As时所用的试样不经干燥直接使用。另行取样在指定条件下干燥， 测定试样的水分，将分析试样换算成干燥试样重量后计算测定成分含量。 蔬菜、水果、藻类等水分含量高达90％左右的试样，若水分含量变化0.5％ 就意味着干燥体的重量相差5％，因而对金属成分含量的分析影响很大。可见干 燥是必须注意的前处理之一。 表2 食品分析中规定的干燥条件（用于测定水分）<1>
从新的角度进行 电子产品稳定性及可靠性测试（1）现有电子产品稳定性测试偏重于环境和机械测试，产品企业相关的测试流程已经完善。从现在的行业来看，包括三星的爆炸事件与苹果的异常关机事件都在表明，供电系统的稳定及可靠是亟待解决的问题。 一款产品要达到客户端，一般分为功能测试，性能测试及稳定性测试。从普遍经验来看，产品的损坏或者异常大部分出现在开关机及特殊状态（干扰或者意外）。正常工作状况下损坏几率微乎其微。 从电子产品的维护经验来看，元器件问题导致的损坏在20%左右，生产工艺问题导致的损坏一般在20%-30%（与生产规模相关），供电及特殊状态导致的损坏高达50%以上。前两者的讨论及改善我们已经做了很多和深入的研究，有各种有益的结果。现在更大的改善空间在于对供电及特殊状态的适应改善。 现有的可靠性测试一般分为环境测试和机械测试，环境测试一般进行温度、湿度、盐雾、粉尘对产品的影响，机械测试一般进行各种外力、震动及跌落等对产品的影响。现在社会上影响比较大的事件却跟供电部分的保护与供电适应范围有关系，那么电子产品的供电对产品有哪些影响，怎么测试呢？ 电子产品的供电部分分为充电>电池----工作电路，三星的事件与充电与电池及其保护有关，苹果的事件与电池及其保护与工作电路的配合有关。 供电部分一般进行的测试项目：
开关机：功能性测试，测试产品能否正常开关机；性能测试，测试产品的开机电压，关机电压，开机时间，关机时间，电源的变化速度对产品的影响，开关机是否会导出产品的性能或者功能异常；稳定性测试，测试产品的相应功能是否在开关机时偶发性逻辑或者功能异常，不同的开关机配合环境测试，是否会导致异常。 电源瞬时跌落或者中断：电源的电压因为接触，或者其他原因会导致到工作电路部分的电源瞬时供应不足或者中断。这种异常状况会导致芯片本身的数据存储，处理，芯片间的通讯，芯片和元器件的控制及逻辑进行影响。要进行产品在允许的供电异常状态下，能够正常工作。 电源供电保护：电源的供电电压长时间过压欠压，短时间过压欠压，保护动作，保护时间，保护状态，保护逻辑及保护稳定性的测试。 电源干扰：所有的电路布线及连接对于干扰来说都是天线，一个供电有多个用电器（汽车，飞机，舰艇）时的供电互相干扰。比如汽车电子，就有ISO18650的行业测试标准，来专门测试供电部分对电子产品的影响。 其他异常：其他行业性的特色测试要求。或者实际使用又特殊环境的要求 电池保护及配合：具有电池的电子产品，在进行相关测试的时候，模拟电池的充放电特性及过充过放状态，来进行相关的配合充电器及与工作部分的配合。 以上测试配合环境测试同时进行，更能充分模拟产品在实际使用时的工作状况。 具体详细测试，请参考后续应用文章：
生物样品前处理 2010-01-08 12:02:45| 分类：生物样品预处理 生物样品的前处理 .生物样品预处理 生物样品的前处理是体内药物分析的一个重要环节,也是整个分离分析过程中最繁琐的一个步骤。与原料药物和制剂相比,生物样品更为复杂:微量药物分布在大量生物介质中,对分析仪器的灵敏度提出了更高的要求;样品中含有大量内源性物质,不仅能与药物及其代谢物结合,而且常干扰测定。因此,生物样品中的药物必须经过分离、纯化与浓集,必要时还需对待测组分进行化学改性处理,从而为最后测定创造良好的条件。传统的样品前处理方法仍为溶剂萃取法,方法耗时、危害人体、污染环境,萃取使用大量溶剂,分析时需浓缩,会导致有效组分的损失。本文仅对近年相关文献报道的几种药物分析过程中生物样品预处理技术及应用进行综述。 超临界流体萃取( supercritical fluid extraction ,SFE) 是环保型分离浓集技术,具有萃取效率和选择性高、省时、萃取溶剂(如便于挥发、提取物较为“干净”、环境污染少、操作条件易于改变等特点,不仅广泛应用于食品、化妆品、环境、医药及一些天然产物的分析,在生物体内药物分析方面也显示出一定的优势[1]。 超临界流体萃取技术的原理是控制超临界流体在高于临界温度和临界压力的条件下,从目标物中萃取成分,当恢复到常压和常温时,溶解
在超临界流体中的成分立即与气态的超临界流体分开。该技术对于挥发性成分、脂溶性成分、小分子萜类及热敏物质等的提取,较传统方法有很多优越性。 常用萃取剂为。由于超临界流体是非极性溶剂,对于低极性和非极性的化合物表现出优异的溶解性能,而对于大多数无机盐、极性较强的物质几乎不溶。通过添加改性剂,如甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯和水等,并通过加压改善其溶解性能,使超临界流体萃取技术对生物碱类、黄酮类、皂甙类等的应用也日趋普遍。 针对生物样品中通常含有不同极性组分或含有大量脂溶性成分干 扰的特点,当前研究工作主要集中在如何提高超临界流体的萃取能力及消除脂类干扰两个方面[2]。 固相萃取技术以选择性吸附与选择性洗脱的液相色谱分离原理,对样品进行分离和纯化。 按照所采用固相萃取剂的种类,可将固相萃取法分为3类:正相、反相和离子交换固相萃取。当前固相萃取剂的开发主要侧重于扩大萃取剂的适用范围,将极性、非极性基团,离子交换基团或高分子树脂混合使用的混合型吸附剂,成为目前研究的热点。 根据分析物的极性、溶解度、pKa等理化性质,选取适合的固相萃取柱。对于非离子性物质而言,优先使用极性相似的固相萃取柱,如弱极性或非极性化合物选用、、等非极性柱,极性较强的则使用CN、柱。强离子型分析物则采用离子交换固相萃取。对于某些弱酸或弱碱性化合物,
一文汇总实验室出现的日常问题及其解决办法 实验室出现的诸多小问题解决技巧汇总： 在酸性或碱性条件下做的反应，如果可能的话，产品后处理的时候，尽量中和一下。否则，产品放久之后可能会分解。 我们这儿用完重氮甲烷后，总会加点酸去破坏剩余的重氮甲烷。有位哥们胆子大直接用浓盐酸（应该用稀的盐酸或醋酸），结果和残余的碱剧烈放热，重氮甲烷的乙醚溶液呀~~~~就这样把他征服~~爆炸了！还有一位老师就是分液漏斗的塞子上没涂真空脂，一摩擦就把乙醚给烧起来了好恐怖呀。 大家用重氮甲烷时一定要千万注意，第一次最好有个有经验的人在旁指导，不要自己随便做，量也不要太大，亚硝基甲基脲最多25 克别贪多，要是需要量大就分几批去做。 夏天用乙醚的时候一定要注意。我今年8 月用乙醚萃取，只在分液漏斗里轻摇了一下，正要准备放气，炸了，还好没伤到我。我的产品阿！！！ 有一次我做分液萃取，先是用50ml HCl 洗涤有机相（含产品），然后再用50ml 5% NaHCO3 洗涤产品，结果振摇的时候，塞子被冲开了，产品全部喷出来了。原因是没有放气。 大家洗涤产品的时候一定要小心，如果洗涤会生成气体的话，一定要注意放气。 在有机所的五年，耳闻目睹了很多安全事故，深感多一份细心，多一份保障。现将我所知道的实验室里面的潜在危险总结如下：欢迎大家就自己知道的进行补充： 一、溶剂处理方面的潜在危险： A、溶剂无水处理前，一定要预处理 对于低沸点的溶剂，如乙醚，正戊烷等一定要先用干燥剂预先干燥，然后再加入钠丝进行回流，并且加热不能过快过高。因为，一旦溶剂里面的含水量过大，那么生成氢气很剧烈的话，溶剂极易冲出体系，然后遇见明火或正在加热的电阻丝，发生爆炸。这一点在有机所是有先例的，当时的惨状是，爆炸的冲击波从三楼冲到顶楼，把通风装置炸的粉碎。包括对面实验室的整扇窗都被推倒。 对于醚类溶剂，如果生产时间较长，或者久置不用的话，一定不要震动，同时要加入还原剂，除掉生成的过氧化合物。也是一个博士生，在处理久置不用的处理THF 的装置的时候，刚一拔磨口活塞，就发生爆炸，满脸血肉模糊。 用钠处理的溶剂和卤代烷溶剂处理装置不能公用一个与大气相连的装置。有些同学为省事或节约空间，把所有溶剂处理装置中保证与大气相通的装置相连，这样做的危险是很可能如果卤代烷，特别是二氯甲烷，加热的时候温度较高，无法冷凝下来，这样，有可能密度较大的卤代烷就会顺着相同的管道，进入用钠丝干燥的溶剂的体系。一旦出现这样的事情，肯定是爆炸。大家知道，卤代烷在金属钠的作用下的偶联反应非常剧烈。 B、废溶剂的处理，绝对不要发生酸性液体和碱性液体，氧化性液体和还原性液体的混装，这样非常危险。在有机所，废液桶爆炸不是一次两次。对于SOCl2, PCl5, PCl3 绝对不能未经处理就放入废液桶，后果也很危险。 二、实验操作方面的潜在危险： 1、对于加热、生成气体的反应，一定要小心不要成了封闭体系。 2、应该小心滴加、冷却的反应，一定要严格遵守，不要图省事。 3、反应前，一定要检查仪器有无裂痕。对于反应体系气压变化大的反应，大家一般都会注意。但是，有些问题就是在你想不到的时候出现。我在一次萃取的时候，量在2 升左右，发现分液漏斗有一个裂痕，以为没有问题。结果，在手中
一般来讲，进行real-time qPCR MasterMix都是2×的浓缩液，只需要加入模板和引物就可以。由于real-time qPCR灵敏度高，所以每个样品至少要做3个平行孔，以防在后面的数据分析中，由于Ct相差较多或者SD太大，无法进行统计分析。通常来讲，反应体系的引物终浓度为100-400mM；模板如果是总RNA一般是10ng-500，如果cDNA，通常情况下是1ul或者1ul的10倍稀释液，要根据目的基因的表达丰度进行调整。当然这些都是经验值，在操作过程中，还需要根据所用MasterMix，模板和引物的不同进行优化，达到一个最佳反应体系。在反应体系配置过程中，有下面几点需要注意： 1. MasterMix不要反复冻融，如果经常使用，最好溶解后放在4度。 2. 更多的配制Mix进行，减少加样误差。最好能在冰上操作。 3. 每管或每孔都要换新枪头！不要连续用同一个枪头加样！ 4. 所有成分加完后，离心去除气泡。 5. 每个样品至少3个平行孔。 参比或者校正染料（reference dye，passive dye）常用的是ROXTM（现在已经是ABI的注册商标了！）或者其他染料，只要不影响检测PCR产物的荧光值就可以。参比染料的作用是标准化荧光定量反应中的非PCR震荡，校正加样误差或者是孔与孔之间的误差，提供一个稳定的基线。现在很多公司已经把ROXTM配制在MasterMix或者Premixture 里。如果反应曲线良好或已经优化好反应体系，也可以不加ROXTM染料校正。 通常来讲，real-time qPCR的反应程序不需要像常规的PCR那样，要变性、退火、延伸3步。由于其产物长度在80-150bp 之间，所以只需要变性和退火就可以了。SYBR@Green等染料法，最好在PCR扩增程序结束后，加一个溶解程序，来形成溶解曲线，判断PCR产物的特异性扩增。而溶解程序，仪器都有默认设置，或稍有不同，但都是一个在产物进行溶解时候，进行荧光信号的收集。 3. 仪器设置 所有仪器的操作都基本一致。设置的时候包括反应板设置（plate setup）和程序设置（program setup）。我们以 ABI StepOne为例，详细看一下反应设置： A. 首先是实验目的选择：定量还是其他。我们命名为“BioTeke”，进行“定量”实验。 B. 实验方法的选择：我们选用的比较Ct的SYBR Green方法， Fast程序，以cDNA为模板进行。
1、ELISA试验的稳定性问题 做ELISA实验时，结果老是重复性不上，相同的材料和相同的操作方法做出的结果就截然不同，上午做时其OD在1.5，下午做时就是0.9了，所以都没有办法下结论，为什么会差异这么大呀？ （1）多设平行空孔，请别人代劳，以判断究竟是否操作问题 （2）对于活性非常高的包被物和酶标记物，如果第一次选择的范围恰好在其平台位置边缘，那么在重复的时候，每次取样带来的微量误差就很容易导致大的偏差了，特别是线性比较好的原料试剂，这个就很正常了。建议每次取样的时候只使枪尖一点点位于液面下，以免吸嘴外面沾有少量抗原or抗体or酶而使结果重复不上。 2、酶不稳定，有何高招？ （1）保存浓度尽量高些， （2）另外可以添加牛血清白蛋白等蛋白保护剂，以避免其被吸附或沉降以及被蛋白酶所降解。 （3）加入50%甘油-20度保存、避免反复冻融。 （4）还可以加入防腐剂防止长菌（注意不能用叠氮钠，其对HRP活性有很大影响）（5）现在一些公司也有商品化的酶标保护剂供应，可以考虑一下 酶类的稳定性与保存方法的很大关系。干燥的制品一般比较稳定，在低温情况下其活性可在数日甚至数年无明显变化，贮藏要求简单，只要将干燥的样品置于干燥器内（内装有干燥剂）密封，保持0－4度冰箱即可。液态稳定性较差，贮藏时应注意以下几点：1、样品不能太稀，必须浓缩到一定浓度才能封装贮藏，样品太稀易降解、变性。2、一般需加入防腐剂和稳定剂，酶常用的稳定剂有硫酸铵糊、蔗糖、甘油等，也可加入底物和辅酶以提高其稳定性。此外，钙、锌、硼酸等溶液对某些酶也有一定保护作用。3、贮藏温度要求低，避免反复冻融。 3、ELISA试验中不加标本的OD值反而高于加人的阴性标本的OD值，是什么原因呀？ 做夹心法ELISA试验中不加标本的OD值反而高于加人的阴性标本的OD值，是什么原因呀？ 最大的原因是封闭的效果不好，应该调整封闭液； 可以尝试不同的封闭剂（BSA、胶脂奶粉、明胶等）、不同的封闭浓度、时间，试试哪个效果好 阴性的里面的其他蛋白起到了封闭的效果 4、边缘的阴性OD值老是比中间的偏高，什么原因呢？ 我做ELISA时，有一段时间在板的最后一条板孔的阴性的OD值经常比在中间的高，有时候高出0.1个OD，导致实验经常重复，但原因也找不到在哪里？ 这可能是由于ELISA的边缘效应造成的。ELISA的边缘效应是指边缘孔与中心孔反应条件不一致，由于边缘效应的影响，同一标本在边缘孔测定的结果明显高于中央孔，且随边缘孔与中央孔的距离的增加而增强。原因在于试验过程中边缘孔与中央孔的温度、液体蒸发程度不同以及各孔表面存在光洁度等物理性状的差异有关。为克服其影响，应尽可能使用中
生物等效性实验生物样品处理注意事项(严)
生物等效性实验生物样品处理注意事项一、样品采集后的的处理和贮存 鉴于生物样本的特点，为了避免样品中被测药物发生分解或产生其他化学变化，取样后最好立即进行分析测定，但实际工作中几乎无法做到，常需将收集到的样品冷藏、冰冻，临用前再融化并放至室温后使用。在样本冷冻贮藏前，需及时进行处理。 1.1血液样本处理注意事项 1.1.1. 在肌肉注射或静脉输含有葡萄糖或电解质(含钾、钠、氯离子)的液体时，建议3小时以后采集静脉血样本进行这些项目的检验，以防止上述检验项目因输液引起的假性升高。 1.1.2保定非麻醉状态的动物时应尽量避免用力挤压动物头颈和胸腹，以免引起血液淤滞，局部组织缺氧，造成血液某些成分的改变，特别是测定乳酸，血液含氧量等指标时。 1.1.3血液中红细胞内外成分有很大差异，溶血可造成红细胞内的物质向细胞外转移，如K+、Mg2＋和某些酶类(LD、AST、ALT、ACP)；另外，溶血还可干扰某些化学项目(TBil、DBil、TC等)的测定，严重影响结果的准确性，血样本应防止溶血。引起溶血的原因有：注射器采血时抽吸力太大；血液与抗凝剂比例失调；混匀样本时过度振荡；注射器或采血容器带水或容器污染；全血放置时间长或突然受冷或受热；注射器中的血沫注入采血容器；真空采血时如未
采满至相应刻度，残存负压造成红细胞破裂；不拔针头直接注入采血容器；样本离心时离心力过大等。为避免溶血，取血时应注意： ①、抽拉注射器时应尽量避免注射器内产生大量真空； ②、添加抗凝剂后的容器在除必要干燥流程后应及时密封； ③、混匀样本时避免用力过度，切勿产生泡沫； ④、避免重复使用注射器、针头、采血管、毛细玻璃管等一次性用品，手术刀片和剪刀等器材取材时尽量洗去残留血液； ⑤、采血时的室温应控制在22℃至25℃，采取的血液容器在需要放入冰盒时，切勿紧贴冰袋，冰水； ⑥、当注射器内因吸入空气产生血沫时，注意弃掉血沫，在将血液注入采血容器时勿将血沫一并注入； ⑦、使用真空采血管需抽取负压时切勿过量； ⑧、将血液注入采血容器时要除去针头，轻柔推入； ⑨、离心带有血细胞的血样时，按照规格设定离心参数； 1.1.4. 正确选择采集管。通常情况下多采用血清为样本(不抗凝)，部分检测项目需注意样本属性为血清或血浆，两者不可替代。一些特殊检验项目需要使用抗凝剂时，应注意选择合适的抗凝剂并注意抗凝剂与血液的比例，以防止样本凝血或红细胞形态的改变；抗凝血样本采集后立即轻轻摇匀至少上下颠倒8次，以防凝血发生。 1.1.5. 多项化验采血顺序：血培养瓶(厌氧瓶优先)→蓝帽管→黑帽管→红/黄帽管→绿帽管→紫帽管→灰帽管→其他。
实验室常见岗位职责大全 检测实验室有哪些岗位？这些岗位又有什么职责呢？13种实验室常见的岗位职责，但每个实验室情况不一样，此职责不必生搬硬套，仅参照使用。 1实验室主任 1.1 实验室主任为本公司最高管理组，负责贯彻执行国家有关的方针政策和贯彻执行CNAS-CL01（即《检测和校准实验室能力认可准则》）、《检验检测机构资质认定评审准则》及相关要求和持续改进管理体系有效性； 1.2 确立质量方针、质量目标，领导建立管理体系，为体系建立和运行提供资源保障，并确保管理体系在策划和实施变更时的完整性； 1.3 审批《质量手册》、《程序文件》等管理体系重要文件； 1.4 确定实验室的组织结构与人员配备，明确岗位职能分工，任命技术负责人和质量负责人，聘任专业技术人员和部门负责人，任命关键岗位人员，指定关键管理岗位的代理人； 1.5 规定岗位任职资格条件，确定人员技能发展目标； 1.6 在实验室内部建立适宜的沟通机制，并就确保与管理体系有效性的事宜进行沟通，充分发挥各职能部门的作用，协调各部门的工作； 1.7 负责设备配置，确保满足检测工作需要； 1.8 审批管理评审计划，主持管理评审会议； 1.9 最高管理者应将满足客户要求和法定要求的重要性传达到组织。
2.1 全面负责本公司技术工作管理，贯彻执行CNAS-CL01（即《检测和校准实验室能力认可准则》）、《检验检测机构资质认定评审准则》及相关要求和持续改进管理体系有效性； 2.2 负责本公司技术作业指导文件、技术记录表格、第三层文件的批准及相关体系文件的审核； 2.3 负责新开展项目的提出、论证审批工作； 2.4 组织有关人员解决检测活动中的技术问题，并保证资源的提供； 2.5 制定本公司员工年度培训、考核计划； 2.6 审批年度质量监控计划、参加能力验证计划与实验室间比对计划； 2.7 审批期间核查计划、方案、作业指导书及不确定度报告； 2.8 制订技术改造的措施和方案，并负责规划措施的论证和审定工作； 2.9 负责检验人员技术能力和水平及其资格的确认； 2.10 负责环境设施的配置、改造或维修报告的审批； 2.11 批准允许偏离的申请，批准仪器设备量值溯源计划，批准标准物质报废申请； 2.12 主持选择合格的分包方，审批分包方评审结论和合格分包方名册； 2.13 审核供应品和服务采购申请中的技术内容； 2.14 主持不符合工作的评价； 2.15 审批仪器设备周期检定、校准计划，确保量值溯源。
由于ELISA(酶联免疫试验)具有灵敏度较高、特异性好的特点，已广泛应用于各种传染性疾病的筛查如肝炎、爱滋、优生优育等。虽然洗板只是ELISA实验重要环节中的一个，但作为专业的洗板机生产厂家，我们必须对影响ELISA实验结果各因素有一定的认识。优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证ELISA 检测结果准确可靠的必要条件。如不注意，就易出现白板、花板、色弱和假阳性等现象。尤其是花板现象（就是空白、阴性、阳性对照以及室内质控孔结果正常，而标本孔的OD值却明显偏高）是各个厂家洗板机调试中经常遇到的问题。现将ELISA实验操作中注意事项总结如下，以期给大家带来一些启发，以改善洗板机的安装调试水平，提高临床检测质量。 1 标本及采集、贮运因素 严重溶血，以HRP 为标记的ELISA 测定中，残留在孔内的血红蛋白具有过氧化物酶样活性，催化底物显色造成假阳性；混有红细胞的血清易沉淀或附着在聚乙烯孔内不易洗净；如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应；标本凝固不全，有时为了争取时间快速检测，常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清，使血清中仍残留部分纤维蛋白原，在ELISA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果；采血试管洗涤不彻底、反复使用易交叉污染；塑料试管能吸附抗原物质，样本久置在塑料管内会使样本内抗原含量下降造成假阴性。 血清标本宜在新鲜时检测，严重溶血标本禁用。一般说来，在5 天内测定的血清标本可放置于4℃，标本在冰箱中保存时间过长导致血清IgG 聚合，使间接法的试剂本底加深。超过一周测定的需－20℃保存。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀并避免产生气泡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存；最好使用一次性玻璃试管或真空管采血管；并使用非抗凝标本，肝素抗凝血浆会增加OD值，可能与高浓度肝素具有强大的负电荷能吸附酶标记物不易洗脱有关；EDTA、酶抑制剂（如NaN3）可抑制ELISA系统中辣根过氧化物酶活性；血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清，或标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂。 2、试剂的影响 ELISA 诊断试剂经历了从合成肽向基因工程抗原的过渡。由于历史的原因，人们往往以反应本底的好坏来衡量ELISA 反应试剂盒，因此有些厂家为了保持较好的本底采用了单片段基因工程抗原及合成肽包被，该类试剂盒的流行病学敏感度不够，稳定性也成问题。也有厂家坚持试剂盒高的流行病学敏感度，科学地对待反应结果。基因工程抗原较合成肽抗原有无可比拟的优越性，就HCV-ELISA 试剂盒来讲，第一代产品为合成肽抗原，主要是HCV 特异性抗原决定簇的肽片段；第二代产品包被的抗原既有基因工程抗原又有合成肽，只是当时的基因工程抗原不全，仅包括了HCV 的核心区片段；第三代产品基本上采用了基因工程抗原，而且这些抗原包括更多、更稳定、纯度更高的HCV 特异性抗原。第三代试剂的敏感度大大提高了。基因工程抗原与合成肽抗原的区别如下： 基因工程抗原是抗原基因在质粒载体中原核或真核表达的蛋白质抗原，多以大肠杆菌或酵母菌为表达系统。该类抗原与合成肽相比具有以下特点： a.分子量大。合成肽采用化学方法制备，由于工艺的局限，合成数量有限，只能达到数百个氨基酸；而利用基因工程制备的抗原，分子量更大。 b.稳定性好。包被的抗原的稳定性可使试剂盒的效期得到保证，早期以合成肽为包被抗原的试剂盒效期只有3-4 个月，采用基因工程抗原后效期大大延长了。
生物学科试卷分析 本次调研考试是在各科刚完成新课教学的情况下展开的。生物学科虽然说不是新课，但因在七、八年级打下的底子较薄，到当前为止也是像上新课一样实行归纳性的教学，学生掌握的知识有限，所以本次考试情况不容乐观是意料之中的。但是考试情况如此不佳又是意料之外的。 从学生答题情况看，他们与参加中考还存有着相当远的距离。我校九年级四个教学班的平均分分别为：13.60分、13.06分、14.39分、13.25分。及格人数分别为：13人、11人、10人和8人。低分人数均占了各班的一半还多。和往届相比，这样的成绩是不可想象的。 我认为造成这种现状的原因是多方面的。首先，我校本届九年级有相当一部分学生存有厌学情绪，这种情况比往届都表现得突出，面对这种情况，教师上课时一方面要照顾这些学生的学习进度，另一方面要让学习水平较好的学生得到较深层次的知识储备，还是有很大困难的，所以，学生当前的知识积累还远远不够。 其次,学生掌握的知识过于格式化、不能快速的将所学知识转变为解决问题的工具。其表现就是将概念性的东西照搬而不考虑特例，如：选择题第4小题，很多学生只考虑毛细 血管的概念，而忽视了肾小球中的毛细血管是连接于小动脉之间的。这种问题造成的另一个结果是做题的速度太慢，很多学生特别是一些平时学习较好的学生在完成整个理综考试的过程中，没有把握好时间，导致生物学科的非选择题部分没有做完或是交了白卷，这也是本次考试出不了成绩的一个重要原因。 第三，学生对所学知识掌握得不够牢靠。这与上学期我们的教学模式有一定的关系，因为条件的限制，我们上学期的练习主要是利用每节新课结束后的时间完成一些基础性较强的习题，这种方法只能即时反馈对当堂知识的掌握情况，但对学生解题水平的训练不够，课后需要增强记忆的东西也没记住。考后很多学生就说“没记住”，如“胰岛素” 和“维生素D”这两个空，学生就是没有记住相关知识点而丢分。 第四，学生对概念性的知识还存有着理解上的距离，如相关“气体扩散”的填空题，学生理解到了呼吸系统内的气体交换是气体浓度差和压力差造成的结果，但就是不能用合适的概念把这个现象表述出来。可见，一些理论性较强的概念特别是生僻的概念必须要通过联系实际，多提多问才能让他们真正理解其含义，才能变成可用的语言。 面对上述诸多问题，我们必须一一对症，针对不同层次的学生做出教法、学法上的调整。