RACE 的简介
目前，全长基因的获得是生物工程及分子生物学研究的一个重点。尽管已经有多种方法可以获得基因的全长序列，但在很多生物研究中，由于所研究的目的基因丰度较低，从而使得由低丰度mRNA 通过转录获得全长cDNA 很困难。近年来发展成熟的cDNA 末端快速扩增(RACE)技术为从低丰度转录快速获得全长cDNA 提供了一个便捷的途径。
cDNA 末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends，RACE)技术是一种基于mRNA 反转录和PCR 技术建立起来的、以部分的已知区域序列为起点，扩增基因转录本的未知区域，从而获得mRNA(cDNA)完整序列的方法。简单的说就是一种从低丰度转录本中快速增长cDNA5’和cDNA3’末端，进而获得获得全长cDNA 简单而有效的方法，该方法具有快捷、方便、高效等优点，可同时获得多个转录本。因此近年来RACE 技术已逐渐取代了经典的cDNA 文库筛选技术，成为克隆全长cDNA 序列的常用手段。
第二RACE 的原理
RACE 是采用PCR 技术由已知的部分cDNA 顺序来扩增出完整cD NA5’和3’ 末端，是一种简便而有效的方法，又被称为锚定PCR (anchoredPCR)和单边PCR(one2side PCR)。
3’RACE 的原理
一)加入oligo(dT)17 和反转录酶对mRNA 进行反转录得到(-)cDNA；
二)以oligo(dT)l7 和一个35bp 的接头(dT17-adaptor)为引物，其中在引物的接头中有一在基因组DNA 中罕见的限制酶的酶切位点。这样就在未知cDNA 末端接上了一段特殊的接头序列。再用一个基因特异性引物(3 amp)与少量第一链(-)cDNA 退火并延伸，产生互补的第二链(+)cDNA。
三)利用3amp 和接头引物进行PCR 循环即可扩增得到cDNA 双链。扩增的特异性取决于3amp 的碱基只与目的cDNA 分子互补．而用接头引物来取代dT17 一adaptor 则可阻止长(dT)碱基引起的错配。
5’RACE 的原理
5’RACE 与3’ RACE 略有不同。首先，引物多设计了一个用于逆转录的基因特异引物GSP-RT；其次，在酶促反应中增加了逆转录和加尾步骤，即先用GSP-RT 逆转录mRNA 获得第一链(-)cDNA 后，用脱氧核糖核酸末端转移酶和dATP 在cDNA5’ 端加poly(A)尾，再用锚定引物合成第二链(+)cDNA，接下来与3’ RACE 过程相同。用接头引物和位于延伸引物上游的基因特异性引物
(5amp)进行PCR 扩增。
全长cDNA 的获得
通过RACE 方法获得的双链cDNA 可用限制性内切酶酶切和southem 印迹分析并克隆。通常的克隆方法是同时使用一个切点位于接头序列上的限制性内切酶和一个切点位于扩增区域内的内切酶。由于大多数非特异性扩增的cDNA 产物不能被后一个限制性内切酶酶切，因而也就不会被克隆．从而增加了克隆的选择效率。还可以用在基因特异性引物的5’端掺人一个限制性内切酶的酶切位点的方法来克隆。最后，从两个有相互重叠序列的3’和5’RACE 产物中获得全长cDNA。或者通过分析RACE 产物的3’和5’端序列，合成相应引物来扩增mRNA 的反转录产物，从而获得全长cDNA。
第三RACE 的应用
RACE 技术主要是应用于对全长cDNA 序列的获得，但对该技术进行一定的修改后，也可在其它方面显示出极高的应用价值。
首先，RACE 技术可用于cDNA 文库的构建及筛选。Belyavaasky 等(1989)用10 个骨髓瘤细胞分离的总RNA，通过TdT 加同聚尾、(dT)16 引物反转录，接着用(dC)13 和锚定引物扩增的方法建立了一个106 克隆的cDNA 文库。同时，用该方法构建文库的优点是它们都只需要很少量的实验材料。建喜等(2001)利用RACE 技术从已经构建的cDNA 文库中成功克隆了家兔精子膜蛋白基因。
其次，应用RACE 克隆已知片段的旁侧内部序列(neighboring internal sequence)。Fritz 等(1991)以及Struck 等(1994)分别用该法获得了3’端和5’ 端的旁侧序列。Zhang (1996)应用LA-PCR 方法获得了特异基因的5’末端非编码和编码序列，省去了构建及筛选基因组文库的麻烦。王东等(2003)利用RT-PCR 和RACE 技术从玉米中获得一个长度为2469bp F2KP 蛋白基因的cDNA 克隆。此外，RACE 技术还可用于克隆同源基因的同源片断，为寻找同基因提供了一种方法。
除此之外，Whitcomb 等设计的随机引物/锚定PCR 能对克隆质粒载体上的靶序列进行定点删除，采用(N)10 锚随机引物和变性的质粒DNA 进行杂交，然后通过T7 聚合酶来延伸，这样单链DNA 就可被一随机引物和一基因特异性引物扩增，一端可达到缺失删除，缺失的片段可达2Kb。Balavoine 应用连接介导PCR 从一种扁虫中克隆得到8 个分别属于Hox，msh，NK-1 和NK-2 的含同源盒的片段，说明RACE 可用于克隆同源基因的同源片段，为寻找同源基因提供了一种手段。
RACE 技术与生物信息学，例如EST 库相结合，具有快速，高效克隆新基因的特点，为快速钓取基因家族候选新成员提供新思路，如果一个基因是多基因家族的一个成员，用基因特异引物(GSP)可能同时扩增几个高度同源的Cdna.李红等利用一条cDNA 作为探针，通过BLASTN 从GenBank 中整合出了7 条更长的EST，通过设计引物，利用RACE 扩增，得到了7 条新基因.相比单纯寻找新基因的全长，此种方法的结合充分利用了信息巨大的基因资源库，得到了更多的信息，获得新基因速度更快*效果更高，属一种颇具规模化的方法，很有应用前景。
总之，随着RACE 技术的不断改进和完善，优化PCR 扩增的条件以提高扩增的效率和忠实性，RACE 技术必将在基因克隆以及基因家族和基因表达变化等研究中发挥极大的作用。
第四RACE 的优点与局限性
RACE 技术相对于其他方法克隆全长cDNA 来说具有价廉、简单和快速等特点。用RACE 获得cDNA 克隆只需几天的时间，而且对丰度很低的起始反应物质，照样能迅速反馈是否有目的产物生成。因此，可根据不同的RNA 制备来修订反转录条件，以满足全长cDNA 的获得。同时，通过RACE 技术获得5’端调控序列和多聚腺苷化信号序列的信息，有助于选择引物以用于转录模型非常复杂的基因中扩增cDNA 的亚群。另外，RACE 技术能产生大量独立克隆，这些克隆可用来证实核苷酸序列，并使得被选择性剪接或开始用于很少使用的启动子的特殊转录物的分离成为可能。
RACE 技术从理论上来说是很简单的，但是实际操作中会面临许多技术上的难题。许多研究人员发现，利用RACE 来获得全长基因并非如想像中那般成功，甚至经常会发生错误的扩增和克隆结果，多数情况下，5’端的编码区经常会由于反转录过程的不彻底而丢掉，特别是由于有大的转录物或者存在复杂的二级结构的时候，而且连接反应通常是特异性差效率很低，这样PCR 成功进行就不能保证.尤其在长片段扩增时，PCR 就显得不那么有效.例如几个Kb 片段的产物就需要优化改变扩增条件，而且扩增结果经常出现非特异性扩增条带，使得选
择目的条带变得十分困难，而对于丰度较低，长度较长的基因RACE 方法困难更大，这是困扰研究人员的一大难题。由于RACE 扩增中经常出现由于引物的不匹配而导致的非特异性扩增，有时需要进行几轮巢式扩增来达到获得特异性扩增的目的，然而多轮扩增又容易提高PCR 反应的错误发生率，由于这些原因，利用RACE 技术通常不易获得所希望的结果。
尽管RACE 技术在应用中取得了很大的成功．但在实际操作过程仍有不少局限性。一般来说导致失败的原因主要有二：第一，在逆转录、TdT 加尾、PCR 扩增这三个连接的酶促反应过程中，任何一步的失败都会导致前功尽弃；第二，即便是上述反应平稳顺利．但结果也通常会出现一些非特异性产物或非全长的产物。因此，要保证RACE 技术的顺利进行，还需从不同方面进行改良优化。
RACE的简介 目前,全长基因的获得是生物工程及分子生物学研究的一个重点。尽管已经有多种方法可以获得基因的全长序列，但在很多生物研究中，由于所研究的目的基因丰度较低，从而使得由低丰度mRNA通过转录获得全长cDNA很困难。近年来发展成熟的cDNA末端快速扩增(RACE)技术为从低丰度转录快速获得全长cDNA提供了一个便捷的途径。 cDNA 末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术是一种基于mRNA反转录和PCR技术建立起来的、以部分的已知区域序列为起点,扩增基因转录本的未知区域,从而获得mRNA(cDNA)完整序列的方法。简单的说就是一种从低丰度转录本中快速增长cDNA5’和cDNA3’末端，进而获得获得全长cDNA简单而有效的方法，该方法具有快捷、方便、高效等优点,可同时获得多个转录本。因此近年来RACE技术已逐渐取代了经典的cDNA文库筛选技术,成为克隆全长cDNA序列的常用手段。 第二RACE的原理 RACE 是采用PCR 技术由已知的部分cDNA 顺序来扩增出完整cDNA5’和3’末端,是一种简便而有效的方法, 又被称为锚定PCR (anchoredPCR)和单边PCR(one2side PCR)。 3’RACE的原理 一)加入oligo(dT)17和反转录酶对mRNA进行反转录得到(-)cDNA；
二)以oligo(dT)l7和一个35bp的接头(dT17-adaptor)为引物，其中在引物的接头中有一在基因组DNA中罕见的限制酶的酶切位点。这样就在未知cDNA末端接上了一段特殊的接头序列。再用一个基因特异性引物(3 amp)与少量第一链(-)cDNA退火并延伸，产生互补的第二链(+)cDNA。 三)利用3amp和接头引物进行PCR循环即可扩增得到cDNA双链。扩增的特异性取决于3amp的碱基只与目的cDNA分子互补．而用接头引物来取代dT17一adaptor则可阻止长(dT)碱基引起的错配。 5’RACE的原理 5’RACE与3’ RACE略有不同。首先，引物多设计了一个用于逆转录的基因特异引物GSP-RT；其次，在酶促反应中增加了逆转录和加尾步骤，即先用
PCR 扩增反应的操作 第一节PCR 扩增反应的基本原理 一、聚合酶链式反应（PCR ）的基本构成 PCR 是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA ）的扩增反应，是模拟体内DNA 复制过程，在体外特异性扩增DNA 片段的一种技术，在分子生物学中有广泛的应用，包括用于DNA 作图、DNA 测序、分子系统遗传学等。 PCR 基本原理: 是以单链DNA 为模板，4 种dNTP 为底物，在模板3'末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA 得到极大程度的扩增。在微量离心管中，加入与待扩增的DNA 片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA 膜板、四种dNTP 溶液、耐热Taq DNA 聚合酶、Mg 2+等。反应时先将上述溶液加热，使模板DNA 在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在Taq DNA 聚合酶的催化下，以dNTP 为原料，引物沿5'→ 3'方向延伸，形成新的DNA 片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。因此PCR 循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、热稳定DNA 聚合酶在适当温度下催化DNA 链延伸合成（见图）。 1．模板DNA 的变性 模板DNA加热到90~95 C时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。变性温度与DNA 中G-C 含量有关，G-C 间由三个氢键连接，而A-T 间只有两个氢键相连，所以G-C 含量较高的模板，其解链温度相对要高些。故PCR 中DNA 变性需要的温度和时间与模板DNA 的二级结构的复杂性、G-C 含量高低等均有关。对于高G-C含量的模板DNA在实验中需添加一定量二甲基亚砜（DMSO）,并且在PCR循环中起 始阶段热变性温度可以采用97 C ,时间适当延长，即所谓的热启动。 2．模板DNA 与引物的退火 将反应混合物温度降低至37~65C时，寡核苷酸引物与单链模板杂交，形成DNA模板-引物复 合物。退火所需要的温度和时间取决于引物与靶序列的同源性程度及寡核苷酸的碱基组成。一般要求引物的浓度大大高于模板DNA 的浓度 ,并由于引物的长度显著短于模板的长度, 因此在退火时,引物与模板中的互补序列的配对速度比模板之间重新配对成双链的速度要快得多,退火时间一般为1?2min。 3．引物的延伸 DNA 模板-引物复合物在Taq DNA 聚合酶的作用下,以dNTP 为反应原料,靶序列为模板, 按碱基配对与半保留复制原理,合成一条与模板DNA 链互补的新链。重复循环变性-退火-延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。延伸所需要的时间取决于模板DNA的长度。在72 C条件下，Taq DNA聚合酶催化的合成速度大约为40?60个碱基/秒。经过一轮“变性-退火-延伸”循环,模板拷贝数增加了一倍。在以后的循环中,新合成的DNA 都可以起模板作用,因此每一轮循环以后, DNA 拷贝数就增加一倍。每完成一个循环需2?4min, —次PCR 经过30?40次循环，约2?3h。扩增初期，扩增的量呈直线上升，但是当引物、模板、聚合酶达到一定比值时,酶的催化反应趋于饱和,便出现所谓的“平台效应”,即靶DNA 产物的浓度不再增加。 PCR 的三个反应步骤反复进行,使DNA 扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y =（1 + X）n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平（Y）均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%,但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期, 靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数
提取组织或细胞中的总RNA以其中的mRN作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCF使测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量 RNA羊品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。 （一）反转录酶的选择 1. Moloney 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活 性相对较弱。最适作用温度为37 C。 2. 禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和 RNA 酶 H 活性。 最适作用温度为42 C。 3. Thermus thermophilus 、 Thermus flavus 等嗜热微生物的热稳定性反转录 酶：在Mn2存在下，允许高温反转录 RNA，以消除RNA模板的二级结构。 4. MMLV 反转录酶的 RNase H- 突变体：商品名为 SuperScript 和 SuperScript U。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一 特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的 m 模板合成较长 cDNA 。 （二）合成 cDNA 引物的选择 1. 随机六聚体引物：当特定 mRNA 由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝 其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长 mRNA 。 用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了 cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的 cDNA 中 96%来源 于 rRNA。 2. Oligo(dT) ：是一种对 mRNA 特异的方法。因绝大多数真核细胞 mRNA 具有
5 Race (2007-11-18 21:37:08) 转载▼ 分类：核酸技术 如果您顺的话，一个礼拜足矣！ 同意，5'-RACE确实比较难，但也有顺利的时候，我上周做5'-RACE也一次就成功了，我觉得关键还是RNA 的质量，如果RNA模板质量不好，后面做得再认真也是白费！ 当时要克隆基因的5'GC含量达到了80%，一般的反转录酶和PCR都拿不到，后来加了海藻糖60度反转录一个小时后，用TaKaRa的GC-Buffer和LA-Taq才扩出来，当时就为了这个5端，很是费了力气。 如果RCR产物不是很特异或没有目的条带的话，建议用nest PCR。在做5‘时，对RNA要求比较高，最好用新鲜的组织提，随即做逆转录，扩增。 做RACE PCR条带单一的不多，尽可能的回收与目的片段大小相近的条带。克隆的时候，一般kit上建议挑8-10个克隆，多一个，多一份希望，因为RACE，尤其是5’太难了，我作了约6个月。 偶没有买试剂盒，自己合成了3条引物，买了反转录酶。然后一次就出来了。 RACE的盒子最常用的是CLONTECH和INVITROGEN的， 这个方法我也试过很多次了，方法很简单，但是作出来效果非常的不理想。PCR出来的东西都是杂七杂八的东西，更多的时候是弥散的条带。 SmartRace 既然称之为Smart，因为它的引物能特异的识别5'端帽子位点，因此排除了所有非完全的逆转录。再加上使用基因特异性引物，使其做出来的可能性更大。 这个方法省钱，但是我不是很看好，祝好运。 另，建议你不要用oligodT进行逆转录，在基因mRNA300bp处设计一条或几条基因特异性逆转录引物更好。 希望你能有好结果。 我刚做过5’、3‘ RACE，我个人的经验如下： 1、首先，提的RNA必须完整，最好跑个RNA电泳来验证一下； 2、设计引物时要注意：Tm最好大于70度，两引物间要有100-200bp的重叠区； 3、用巢氏PCR相对容易出结果； 4、如果出现多个条带，要分别验证； 5、PCR过程中，我一般分两次，第一次用touchdowm PCR，后产物稀释50倍，
5'race 现在的通用方法是根据CLONTECH SMART RACE kit 改进而来的方法 那个试剂盒很坑爹的，价格高的离谱。其实在实验过程中完全没有必要买试剂盒，下面我来告诉你怎么玩。 原理：5'race的关键目的就是要克隆出已知片段上游的未知片段。方法就是在反转录的过程中人为的在5'端加上接头，然后利用接头上面的特异序列作为引物和你已知序列上面的一段引物扩增cDNA片段，就能得到5'未知序列片段。 方法：在反转录的过程中加入5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG–3' 这个接头引物。在反转录之后这段序列就会位于整个mRNA反转录出来的cDNA的最前端。 为什么？？ MMLV反转录酶有一种特性就是在反转录到序列末端的时候加上三个C来终止这个反转录过程，利用这添加上去的CCC和上面给你的那个接头引物的GGG碱基配对，MMLV就会以上面那个引物为模版将反转录出来的第一链继续延伸出接头引物的互补链，从而形成一个带接头的cDNA 5'-末端。 这个就是RACE的核心原理。具体不明白的看看这篇说明书就好，GOOGLE一搜，结果满天飞的，我就不给你传文件了。 SMART? RACE cDNA Amplification Kit User Manual 你肯定有一下问题 1.上面给你的那个接头引物能不能换掉。 上面那个引物看起来好像很普通，其实里面大有玄机，如果你用DNAMAN软件预测一下引物的二级结构就可以发现，这个引物自身能形成一个类似老虎钳子的形状，而且仅仅只有GGG三个核苷酸暴露在外面用来和MMLV添加出来CCC配对。所以这个引物的设计是非常巧妙的。不建议你更换，而且你换掉以后自己要在你实验动物的基因组中验证是否存在相同或互补序列，这也是另一个问题。 2.是不是用普通的方法合成该接头引物即可。 答曰，可以。clontech公司提供的试剂盒里面的这段引物其实并非全是单链DNA，用于配对的那关键的GGG用的是RNA单链，为什么？原因是DNA-RNA的结合能力强于DNA-DNA。明白了把，所以那个用来坑中国人钱的试剂盒提供的引物是很容易降解的，一旦那三个G降解掉了，好了，这8K+盒子就报销了。值得庆幸的是用全DNA引物是完全能满足RACE需求的。所以，随便找个单位合成一下这引物就可以了。 3.是不是所有的反转录酶都可以 答曰，不是。RACE的核心技术就是MMLV延伸的CCC。别的酶不具有这种特性。 4.其他方法 其他方法有很多，例如传统的方法，那种利用5'帽子结构筛选完整mRNA然后去帽子加接头的方法肯定是最好的。因为严格的说只有这种方法做出来的才真正称得上是准确的RACE。但是，同学，这方法麻烦，而且，价格不菲。这个贵是很有道理的，里面那么多种酶呀………… 5.实验要求 RNA的质量一定要好，越少的末端降解你得到的5'RACE结果就是越准确的。 6.中间已知序列特异性引物的设计，这个很容易，用primer 5 在已知序列里面随便挑一个分数高点的一般就行，实在不放心的话可以和接头引物配下对，看看有无引物二聚体，根据经验，一般没有。
AFLP分子标记实验 扩增片段长度多态性 Amplified fragment length polymorphism（AFLP 是在随机扩增多态性（RAPD和限制性片段长度多态性（RFLP技术上发展起来的DNA多态性检测技术,具有RFLP技术高重复性和RAPD技术简便快捷的特点,不需象RFLP 分析一样必须制备探针，且与RAPD标记一样对基因组多态性的检测不需要知道其基因组的序列特征，同时弥补了 RAPD技术重复性差的缺陷。同其他以PCR为基础的标记技术相比，AFLP技术能同时检测到大量的位点和多态性标记。此技术已经成功地用于遗传多样性研究，种质资源鉴定方面的研究，构建遗传图谱等。 其基本原理是：以PCR（聚合酶链式反应为基础,结合了 RFLP、RAPD的分子标记技术。把DNA进行限制性内切酶酶切，然后选择特定的片段进行PCR扩增（在所有的限制性片段两端加上带有特定序列的’接头”用与接头互补的但3-端有几个随机选择的核苷酸的引物进行特异PCR扩增,只有那些与3-端严格配对的片段才能得到扩增，再在有高分辨力的测序胶上分开这些扩增产物，用放射性法、荧光法或银染染色法均可检测之。 一、实验材料 采用青稞叶片提取总DNA 实验设备 1. 美国贝克曼库尔特CEQ8000毛细管电泳系统, 2. 美国贝克曼库尔特台式冷冻离心机， 3. 美国MJ公司PCR仪,
4. 安玛西亚电泳仪等。 三、实验试剂 1. 试剂:请使用高质量产品，推荐日本东洋坊TOYOBO公司的相关产品 DNA提取试剂盒； EcoRI酶,Msel酶,T4连接酶试剂盒； Taq 酶,dNTP, PCR reactio n buffer; 琼脂糖电泳试剂：琼脂糖，无毒GeneFinder核酸染料替代传统EB染料;超纯水（18.2M ? ? cm 2. 其他实验需要物品 微量移液枪（一套及相应尺寸Tip头,PCR管，冰浴等。 四、实验流程 1、总DNA提取 使用DNA提取试剂盒提取植物基因组DNA,通过紫外分光光度计检测或用标准品跑胶检测。一般来说，100ng的基因组DNA作为反应模板是足够的。 2、EcoR1酶消化（20ul体系/样品 EcoR1 1ul
凯氏定氮仪原理： 蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。 1.有机物中的胺根在强热和CuSO4，浓H2SO4 作用下，硝化生成(NH4)2SO4 反应式为： 2NH2+H2S04+2H＝(NH4)2S04 (其中CuSO4做催化剂) 2.在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3 ，收集于H3BO3 溶液中 反应式为: (NH4)2SO4+2NaOH＝2NH3+2H2O+Na2SO4 2NH3+4H3BO3＝(NH4)2B4O7+5H2O 3.用已知浓度的H2SO4(或HCI)标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量反应式为： (NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O＝(NH4)2SO4+4H3BO3 (NH4)2B4O7+2HCl+5H2O＝2NH4Cl+4H3BO3 凯氏定氮仪操作步骤： (一)消化
1、准备6个凯氏烧瓶，标号。1、 2、3号烧瓶中分别加入适当浓度的蛋白溶液，样品要加到烧瓶底部，切勿沾在瓶口及瓶颈上。再依次加入硫酸钾-硫酸铜接触剂，浓硫酸，30%过氧化氢。4、5、6号烧瓶作为空白对照，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质，对样品测定进行校正。4、5、6号烧瓶中加入蒸馏水代替样液，其余所加试剂与1、2、3号烧瓶相同。 2、将加好试剂的各烧瓶放置消化架上，接好抽气装置。先用微火加热煮沸，此时烧瓶内物质炭化变黑，并产生大量泡沫，务必注意防止气泡冲出管口。待泡沫消失停止产生后，加大火力，保持瓶内液体微沸，至溶液澄清后，再继续加热使消化液微沸15min。在消化过程中要随时转动烧瓶，以使内壁粘着物质均能流入底部，以保证样品完全消化。消化时放出的气体内含SO2，具有强烈刺激性，因此自始自终应打开抽水泵将气体抽入自来水排出。整个消化过程均应在通风橱中进行。消化完全后，关闭火焰，使烧瓶冷却至室温。 (二)蒸馏和吸收 蒸馏和吸收是在微量凯氏定氮仪内进行的。凯氏定氮蒸馏装置种类甚多，大体上都由蒸气发生、氨的蒸馏和氨的吸收三部分组成。 1、仪器的洗涤 仪器安装前，各部件需经一般方法洗涤干净，所用橡皮管、塞须浸在10%NaOH溶液中，煮约10min，水洗、水煮10min，再水洗数次，然后安装并固定在一只铁架台上。 仪器使用前，微量全部管道都须经水蒸气洗涤，以除去管道
RACE 的简介 目前，全长基因的获得是生物工程及分子生物学研究的一个重点。尽管已经有多种方法可以获得基因的全长序列，但在很多生物研究中，由于所研究的目的基因丰度较低，从而使得由低丰度mRNA 通过转录获得全长cDNA 很困难。近年来发展成熟的cDNA 末端快速扩增(RACE)技术为从低丰度转录快速获得全长cDNA 提供了一个便捷的途径。 cDNA 末端快速扩增 (rapid amplification of cDNA ends，RACE)技术是一种基于 mRNA 反转录和 PCR 技术建立起来的、以部分的已知区域序列为起点，扩增基因转录本的未知区域，从而获得mRNA(cDNA)完整序列的方法。简单的说就是一种从低丰度转录本中快速增长cDNA5’和cDNA3’末端，进而获得获得全长cDNA 简单而有效的方法，该方法具有快捷、方便、高效等优点，可同时获得多个转录本。因此近年来RACE 技术已逐渐取代了经典的cDNA 文库筛选技术，成为克隆全长 cDNA 序列的常用手段。 第二 RACE 的原理 RACE 是采用PCR 技术由已知的部分cDNA 顺序来扩增出完整cDNA5’和3’ 末端，是一种简便而有效的方法，又被称为锚定PCR (anchoredPCR)和单边 PCR(one2side PCR)。 3’RACE 的原理 一)加入 oligo(dT)17 和反转录酶对 mRNA 进行反转录得到(-)cDNA； 二)以 oligo(dT)l7 和一个 35bp 的接头(dT17-adaptor)为引物，其中在引物的接头中有一在基因组 DNA 中罕见的限制酶的酶切位点。这样就在未知cDNA 末端接上了一段特殊的接头序列。再用一个基因特异性引物(3 amp)与少量第一链(-)cDNA 退火并延伸，产生互补的第二链(+)cDNA。 三)利用 3amp 和接头引物进行 PCR 循环即可扩增得到 cDNA 双链。扩增的特异性取决于 3amp 的碱基只与目的 cDNA 分子互补．而用接头引物来取代 dT17 一 adaptor 则可阻止长(dT)碱基引起的错配。
浅谈Rockshox前叉的原理和部分特性技术 发布日期:2012-10-16 绿色的部分适合菜鸟看 首先普及下前叉常识，前叉可以分为弹簧，油簧，油气，双气，下面就每一个名字做一下介绍： 弹簧：顾名思义，就是以弹簧作为避震介质的。比如Rockshox，manitou的底端叉子如：J1，SIX，都是使用弹簧作为避震介质的。其结构简单，一般都是在前叉的一边有一根弹簧，或者两边都有弹簧，一般前者居多。这种叉子成本低，价格不贵，名牌的一般在300元左右，二线品牌一般都在200元上下。这种叉子一般都具有软硬调节功能通过压缩弹簧来获得不同的软硬(即弹簧压缩的越厉害，叉子就越硬，反之就越软)，同时，要损失一定的行程。一根标称80mm的叉子在调到最硬的清况下，会损失20mm 左右的行程。 油簧：这个词要分开来理解：油阻+弹簧。这类叉子就是在上者的基础上，一边叉是弹簧，另外一边叉是油阻尼。油阻尼就是使用油调节弹簧回弹的速度快慢。这类叉子一般在调节软硬的基础上，同时具有回弹调节(即龟兔调节)，锁死功能，部分具有形成调节功能。市面上的这类产品有Rockshox J3，Manitou Axel，Suntour Axon（本人正在使用）。这种产品价格差别很大，从400-1000元不等。一般情况下，这种叉子重量上没有优势，但是锁死功能在平路和爬坡时能体现出较大优势。
油气：这个和上面的油簧叉类似，只是用气压代替了弹簧作为避震介质。通过打气来调节软硬。一般对于不同体重的车手，会有不同的气压值对应。Rockshox 的TORA，Manitou的R7 super就属于这类产品。目前，有些二线厂家也生产这种前叉，比如Suntour 的xc pro，Axon气压版，斯普Aries系列。这类前叉由于使用空气代替了弹簧，所以重量上可以更轻，一般都在1.8kg以下。但相对来说，价格更高，一般都在1500元以上。这类叉子同样具有回弹，锁死的功能。 双气：这是Rockshox高端产品的一个特点。其采用正负气压，比如Reba team, sid team都使用了这种技术，这种叉子更轻，重量在1.6KG左右。相对价格更高，一般都在2K以上。 还有一种避震值得一提，就是智能避震。FOX将这种技术在的其X系列的产品上。其主要特点是，当车手送从面向下压避震的时候，避震并不动作，而在骑行过程中，当路面不平坦时，从下面传导上来的力可以让避震动作。目前这类叉子非常昂贵，价格在4k 左右。 下面说下RockShox几款具体的叉子，首先要说明的是，这里只说2011年款的。ROCKSHOX的Cross Country前叉中，档次从高到低排，有REBA和SID，RECON，TORA，DART。我用过REBA，TORA和DART，SID是试用过,其中REBA和SID都为顶级前叉。 REBA是XC-trail叉，真正意义上的XC越野叉，其强度为这里所有叉中最高的，而TORA的强度是仅次于它。REBA的重量仅次于SID（最轻的RLT Ti Dual Air版是1620g），同时它又是功能最多叉，官方的定义是“变色龙”。其系列有REBA RL ，REBA RLT，REBA RLT Ti，REBA XX 29''。其中RL RLT RLT Ti中都有Dual Air，Air U-Turn，和Dual Air for Trail 29''，XX则只有Dual Air和Dual Air for trail。所有的型号回弹介质都是双气压。 RL和RLT的阻尼是避震油+Motion Control阻尼棒，RLT Ti则是避震油+Blackbox Motion Control钛合金阻尼棒+双重回弹。XX则是用避震油+XX Motion Control，且压缩调节直接采用液压装置。 SID是XC-Race叉，是XC竞速叉。其强度可以说仅比DART强点，但其重量是所有系列中最轻的，其中SID WORLD CUP仅重1345g。其系列有SID RLT，SID RLT Ti，SID World cup，SID XX，SID XX World cup。所有型号中都是Dual Air版。回弹介质都是双气压。阻尼系统照搬REBA，World cup与RLT Ti一样。 RECON是中间型产物，是探索未知路段的首选。回弹介质通常是单气压或者弹簧。阻尼全部都是避震油。其系列有RECON Sliver RL，RECON Sliver TK，RECON Gold R，RECON Gold RL，RECON Gold TK。RECON还是推荐弹簧作为回弹介质，弹簧线性比较好。而ROCKSHOX的单气压技术，轻易越用越不润，无法跟FOX的智能单气压技术相比（RS的双气压调整好后与其不相上下） TORA则是专门为高强度越野而生，价格便宜，强度很高，很润，而且作为油簧叉其2.2kg的重量并不太重。2011年款中只有TORA Trail 289，TORA Trail 302，TORA TK。其中289和302的特点是Coil U-Turn，而TK则是Preload（预压行程可调）。
来自dxy 22003luocong 植物基因全长克隆几种方法的比较 基因是遗传物质基本的功能单位，分离和克隆目的基因是研究基因结构、揭示基因功能及表达的基础，因此，克隆某个功能基因是生物工程及分子生物学研究的一个重点。经典克隆未知基因的方法比如通过筛选文库等有个共同的弊病, 即实验操作繁琐, 周期较长、工作量繁重,且不易得到全长序列。又由于在不同植物中目的基因mRNA丰度不同，所以获得目的基因的难易程度又不一样，特别是对于丰度比较低的目的基因即使使用不用的方法也不一定能获得成功。近年来随着PCR技术的快速发展和成熟.已经有多种方法可以获得基因的全长序列, 比如经典的RACE技术，染色体步移法和同源克隆法等，本文主要综述几种重要的克隆方法的原理和运用，并且比较分析这几种方法的优缺点，为你的实验节约时间和成本。 1 RACE技术 1985年由美国PE-Cetus公司的科学家Mulis等[1]发明的PCR技术使生命科学得到了飞跃性的发展。1988年Frohman等[2] 在PCR技术的基础上发明了一项新技术, 即cDNA末端快速扩增技术( rapid amplification of cDNA ends, RACE), 其实质是长距PCR( long distance, PCR)。通过PCR由已知的部分cDNA 序列, 获得5′端和3′端完整的cDNA, 该方法也被称为锚定PCR ( anchored PCR) [3] 和单边PCR( one-sidePCR) [4]。RACE技术又分为3?RACE和5?端RACE。3′RACE 的原理是利用mRNA 的3′端天然的poly(A) 尾巴作为一个引物结合位点进行PCR, 以Oligo( dT) 和一个接头组成的接头引物( adaptor primer, AP)反转录mRNA得到加接头的第一链cDNA。然后用一个正向的基因特异性引物( gene-specific primer, GSP) 和一个含有接头序列的引物分别与已知序列区和poly(A) 尾区退火, 经PCR扩增位于已知序列区域和poly( A) 尾区之间的未知序列，若为了防止非特异性条带的产生, 可采用巢式引物( nested primer) 进行第二轮扩增, 即巢式PCR( nested PCR) [5，6]。5?RACE 跟3?RACE原理基本一样，但是相对于3?RACE来说难度较大。 5'-RACE受到诸多因素的影响而常常不能获取全长，因此研究者都着手改进它。这些措施主要是通过逆转录酶、5'接头引物等的改变来实现的，因此出现了包括基于“模板跳转反转录”的SMART RACE技术( switching mechanism at 5′ end of RNA transcript) [7] , 基于5′脱帽和RNA酶连接技术的RLM-RACE技术(RNA ligase mediated RACE)[8], 利用RNA连接酶为cDNA第一链接上寡聚核苷酸接头的SLC RACE技术(single strand ligation to single-stranded cDNA)[9] , 以及以内部环化的cDNA第一链为模板进行扩增的自连接或环化RACE技术(self-ligation RACE or circular RACE)[10]，和通过末端脱氧核苷酸转移酶( TdT)加尾后引入锚定引物的锚定RACE技术( anchored RACE)[11]。 笔者主要介绍两种比较新的RACE技术，基于…模板跳转?的SMART RACE 技术和末端脱氧核苷酸转移酶( TdT)加尾技术。 1.1基于‘模板跳转’的SMART RACE技术[7，12]
3 实验原理 3.1人工抗原的制备原理（以奥沙普秦为例） 奥沙普秦为小分子物质（分子质量小于500），本身不具有诱导产生抗体的能力，必须设法先将奥沙普秦与载体蛋白质偶联制备出相应的人工完全抗原，这是半抗原免疫分析的关键所在。合成人工抗原的机理为：水溶性的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的羟基与奥沙普秦的羧基在脂溶性缩合剂二环己基碳二亚胺（DCC）的作用下，脱水缩合形成活泼酯化奥沙普秦中间化合物，然后载体蛋白在某一PH值下，一般是大于其等电点，是蛋白质中的氨基暴露出来，从而成为提供伯胺的底物，然后亲核进攻活性中间产物活泼酯化奥沙普秦，从而达到小分子化学物偶联到载体蛋白的目的。 3.2 ELISA技术的原理 ELISA 是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。免疫酶技术是将酶标记在抗体/抗原分子上，形成酶标抗体/酶标抗原，称为酶结合物。该酶结合物的酶在免疫反应后，作用于底物使之呈色，根据颜色的有无和深浅，定位或定量抗原/抗体。ELISA 法是免疫酶技术的一种，其特点是利用聚苯乙烯微量反应板(或球)吸附抗原/抗体，使之固相化，免疫反应和酶促反应都在其中进行。在每次反应后都要反复洗涤，这既保证了反应的定量关系，也避免了末反应的游离抗体/抗原的分离步骤。在ELISA 法中．酶促反应只进行一次，而抗原、抗体的免疫反应可进行一次或数次，即可用二抗(抗抗体)、三抗再次进行免疫反应。 目前常用的几种ELISA 方法有：测定抗体的间接法，测定抗原的双抗体夹心法和测定抗原的竞争法等。 3.3 ELISA竞争抑制法的原理 包被好的抗原与加入的抗原（标准抗原）形成竞争，如果抗体石特异性抗体，它就会与游离的标准抗原结合，而不与板上的检测
流式细胞仪原理及操作步骤 流式细胞仪（FCM）是八十年代集单克隆抗体、荧光化学、激光、计算机等高技术发展起 来的一种先进仪器，已广泛应用于免疫学、生物化学、生物学、肿瘤学以及血液学等方面的 研究和临床常规工作。其中检测人白细胞表面标志可对白血病、淋巴瘤作用迅速正确的诊断， 对淋巴细胞群和亚群进行精确分类，还能分离纯化某一群或亚群细胞。活细胞免疫荧光技术 是用于FCM检测的标本准备，染色后也能在荧光显微镜下进行观察，在某些实验条件下，活细胞免疫荧光染色后的特异性和敏感性要优于滴片固定的常规间接免疫荧光的结果。 （一）原理一 活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。 （二）操作步骤 制备活性高的细胞悬液（培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用 于本法） 用10% FCS RPMI1640调整细胞浓度为 5X 106?IX 107/ ml 取40卩1细胞悬液加入预先有特异性McAb（5?50卩I） 的小玻璃管或塑料离心管，再加50卩I 1 : 20（用DPBS （或兔抗鼠）荧光标记物，充分振摇 J 4 C 30mi n 用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右 1000rpmx 5mi n J] 加适量固定液（如为FCM制备标本，一般加入1ml固定液，如制片后在荧光 显微镜下观察，视细胞浓度加入100?500 ^1固定液） FCM检测或制片后荧光显微镜下观察 （标本在试管中可保存5?7天） （三）试剂和器材 1. 各种特异性单克隆抗体。 2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。 3. 10% FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液（见附录）。 4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。
分析仪操作及原理 注意： 1、标定前请确认标气背景气、标定气含量，保证通入仪器的是对应的标气。 2、百分含量仪器通入标气后需稳定10分钟以上方可标定，微量仪器需稳定时间更长一 些，待数值稳定以后再进行标定。 CO2红外气体分析仪(AIA1203) 这台仪器为ABB生产EL2020系列型号为Uras26，测量范围0~5~20ppm.vol.CO2，精度为±1% 一、测量原理（红外式） 根据不同组分气体对不同波长的红外线具有选择性吸收的特性而工作的分析仪表。测量这种吸收光谱可判别出气体的种类；测量吸收强度可确定被测气体的浓度。 各种多原子气体（CO,CO2,CH4等）对红外线某一段电磁波的辐射都能具有一定的吸收能力，而且这种吸收能力对波长具有选择性，只有当红外光谱中某一段光谱的频率与物质分子本身的频率一致时，该物质分子才吸收这一段红外光谱的辐射能。我们把能吸收的这一段红外线光谱称为该气体的特征吸收波段。气体吸收了红外线光谱的辐射能后，一部分可转变成热能，使温度升高。红外线光谱的辐射又特别显著，这就能让我们利用各种元件，如热电堆、热敏电阻等去测量红外线辐射能的大小。 二、标定 1、选择校准菜单：menu calibrate manual calibration. 2、用箭头键选择zero gas。 3、接通零点气。操作零点气钢瓶减压阀组件，使输出压力控制在20kpa，将操作面板上 多通阀（5MV）切向“零点气”，打开测量流量计，调整“测量”转子流量计旋钮，使进气量控制在30L/H左右。 4、确认零点气连接上并且零点气浓度值输入后。按ENTER键确认。 5、当测量示值显示稳定，按ENTER键开始校准零点。 6、接受校准结果按ENTER键；不接受校准结果返回步骤6按BACK键；不接受校准结 果返回测量状态按MEAS键。 7、用箭头键选择SPAN GAS（零点标定完成后会自动跳到zero 和span的选择窗口。 8、按4步骤接通量程气。
3D打印工作原理及操作步骤 3D打印机正如其名，是一种能够打印出3D实体的机器。如我们普通的打印机一样，能够在纸面上打印出任意形状的画面。理想的3D打印机能够在3维空间中打印出任意形状的实体模型，能够不受结构工艺限制，直接将零件的3维数据资料打印成实体零件 在传统的机械设计程序上，一个零件需要由设计者设计完成，并绘制好2维图纸（通常是3视图的形式，并且有些细节部位还需要追加详细图）。然后把这个零件的图纸交给机械工艺师，机械工艺师会根据你的零件图纸排列加工制造工序，再然后工人会按照机械工艺师设计安排的工序来制造零件。通常这个流程还不能一次性完成。机械设计者设计的零件可能会有部分结构不容易加工制造，机械工艺师会将信息反馈给机械设计师，机械设计师再修改图纸。而一旦有了3D打印机，整个流程就简化了。设计者设计完成零件后，就可以直接制造。不需要绘制3视图，不需要细节描述的详细图，不需要工艺师的编排工序，不需要工人加班，而且极少有结构工艺限制，只需要3维数据 本文分为两个部分，第一部分将为简要介绍FDM式3D打印机的工作原理，第二部分介绍打印机的硬件和软件操作。 第一部分：FDM式3D打印机原理简介 任何3维物体都可以看成是由一个个面堆叠累积而成的。就像宝塔一样，是由一层一层的楼堆起来的。比如说，一个球形物体，就可以看成是由一个个厚度很小直径不同的圆柱堆在一起形成的。对于任何一个物体，都可以看成是由一个个厚度很小的菱形物体堆起来的。如果引用数学中的概念，那么就是，当这些菱形的厚度趋近于无穷小的时候，这个堆砌起来的实体与目标实体就是完全一致的。遗憾的是，现实中任何物体都是有厚度的。可是我们可以把这个厚度做到很小，小到我们能容忍的误差以下，就够了。FDM式的3D打印机就是利用这个原理，将任意一个三维数据实体，切割成一个个面来分析。那么理论上只要这台打印机能够实现打印出任意形状的面，它就可以打印出任意形状的物体了（不考虑重力对结构的限制因素）。所以FDM式的3D打印机有一个喷嘴，它能够稳定连续的喷出直径一定的塑料（或者其他热融性的材料）。这个喷嘴一般由步进电机来控制移动。就像我们捏牙膏一样，我们一边用力捏牙膏，一边移动牙膏，就可以把牙膏在牙刷上涂一条直线出来。3D打印机的原理就和我们捏牙膏是一模一样的，只是它的运动由3D实体数据来控制，而且喷出来的材料是稳定的，它一边喷一边按照特定的方式移动。这样它就可以打印出特定的形状来了。等热融性的材料冷却下来，这个实体就定形了。那么我们怎么从手头一无所有，到打印出一个实体呢？世界上3d设计软件千奇百怪，我们怎么把自己设计的3维实体做成能够被打印机应用的数据呢？这里一定要感谢世界上的开源组织和标准化组织（通常是行业的龙头老大）。是他们让我们虽然使用不同的软件，但是我们仍然可以用同样的数据来交流。所有的3D模型都可以导出同样格式的数据，比如说stl，x_t，step等等格式。还有控制机床运动的加工语言：G语言。因为这些标准的存在，让我们整个流程可以走得更顺畅。从技术实现角度来看，要实现FDM式3D打印机，就只需要实现以下三个技术： 1、能够将3维数据格式（如：stl,x_t,step）解析成机械加工的G语言。 正如前文所说，这一个步骤实质上就是生成“捏牙膏的方法”。在这个步骤里，3维数据被解析成一层层面，面被解析成一条条线。线被解析成一条条的G代码。这里的解析方法可以有开源社区提供。这里也稍微简介一下G代码：G代码是用来控制机械加工刀具（喷嘴）运动的代码。 2、能够解析G代码的机器。 通过第1个技术手段，我们有G代码。接下来就需要一台能够“读懂”G代码的机器。要
Transwell实验原理与操作步骤 Trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解， 这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell 小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子， 不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张 有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0μm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。 将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培 养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内， 由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。 应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。这里主要谈几种大家常用的实验： （1）共培养体系： 小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不 需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择 3.0μm以下孔径。常用0.4、3.0μm。我们实验室用的是0.4μm。将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。 （2）趋化性实验： 可用5.0、8.0、12.0μm膜，上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室，计数进入下室的细 胞量可反映下室成分对上室细胞的趋化能力。 ①细胞B对细胞A的趋化作用：将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞 B分泌或代谢产生的物质对细胞A的趋化作用。 ②趋化因子对细胞的趋化作用：将细胞种于上室，下室加入某种趋化因子，可研究该趋化因子对细胞的趋化作用。 （3）肿瘤细胞迁移实验： 常用8.0、12.0μm膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤 细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。
《生物工程进展》1997,V ol.17,No.5 RA CE:cDNA末端快速扩增技术进展 明 洪 黄秉仁 中国协和医科大学基础医学院 中国医学科学院基础医学研究所 国家分子生物学重点实验室 北京100005 基因表达水平和模式的变化驱动着生物体内主要的生物学过程。分离和克隆基因是研究基因结构、功能以及表达的基础。以往建立和筛选cDNA和DNA文库来分离克隆目的基因的经典方法繁琐而且工作量大。PCR技术的出现极大地提高了分离克隆目的基因的效率。反向PCR、锅柄PCR(Panhandle PCR)、vector ette PCR、连接介导PCR(Lig ation mediated PCR)和捕获/寡盒介导PCR(Capture/Oligocassette mediated PCR)等PCR技术为扩增已知序列旁侧的未知DNA片段提供了捷径[1]。然而,这些方法实验周期长、费用高,而且常出现PCR扩增效率或特异性低等问题。因而利用这些方法很不容易得到完整的全长基因,尤其是基因的5′-端。利用RNase保护、S1酶谱和引物延伸等技术[2]可以获得m RNA的5′端。但这些方法需要大量的mRNA。cDNA末端快速扩增技术(RACE:Rapid amplification of cDNA ends)[3]解决了这些难题。它是一种从低丰度转录本中快速扩增cDNA5′和3′末端简单而有效的方法。本文着重讨论RACE方法学的最新进展,同时也对RACE的原理、应用及其发展前景进行论述。 原理及方法 RACE是基于PCR技术由已知的部分cDNA顺序来获得完整cDNA5′和3′端的方法。该方法也被称为锚定PCR(Anchored PCR)[4]和单边PCR(One-sided PCR)[5]。要获得cDNA3′末端(图1a),以Oligo dT17和一个35bp的接头[(dT)17-adaptor]为引物反转录总RNA得到(-)cDNA。引物的接头有一个在基因组DNA中罕见的限制性内切酶的酶切位点,这样就在未知的cDNA末端接上了一段特殊的接头序列。接着,用一个基因特异性引物(3′amp)与少量第一条(-)cDNA链退火(一般<1ng)并延伸,产生互补的第二条(+)cDNA 链。然后用3′am p和接头引物进行PCR循环即可扩增得到cDNA双链。扩增的特异性取决于3′amp的碱基只与目的cDNA分子互补。用接头引物来取代(dT)17-接头引物则阻止了长dT 碱基引起的错配。 同样的原理可用来获得cDNA5′末端(图1b),利用基因特异性引物(5RT)反转录总RNA,分离反转录产物,用脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)加上poly(A)尾。第二条(+)链以d(T)17-adapto r为引物合成。然后用接头引物和位于延伸引物序列上游的基因特异性扩增引物(5′amp)(这个“中间”引物提高了扩增反应的特异性和效率)进行PCR扩增。 扩增得到的双链cDNA用限制性内切酶酶切和Southern blot分析并克隆。最佳克隆的方法是同时使用一个切点在接头序列上的限制性内切酶和一个切点在扩增区域内的内切酶。由于大部分非特异性扩增的cDNA产物不能被后一个内切酶酶切,因而也就不会被克隆,从而大大增加了克隆过程的选择性。另外还可以用在基因特异性引物5′末端掺入一个限制性酶切位点的方法来克隆RACE产物。最后,从两个有相互重叠序列的3′和5′RACE产物来 7