基于CRISPR的核酸检测技术——SHERLOCK
CRISPR/Cas技术以出众的基因编辑能力闻名于世，但显然这技术应用范围绝不仅限于基因编辑。CRISPR/Cas技术的大牛Jennifer Doudna教授早在2016年就将该技术应用于RNA检测，只是由于灵敏度太低而缺乏应用价值。随后张锋利用Cas13蛋白的天然RNase活性将其改进，使之有了实际应用价值，并将其取名为SHERLOCK（Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing），并且开发了升级版的SHERLOCK v2。后来Jennifer Doudna的实验室利用Cas12a的非特异性ssDNA降解能力开发出另一种称为DETECTR的方法。
SHERLOCK的原理
SHERLOCK的核心是一种叫做Cas13的CRISPR相关蛋白。Cas13包含四个不同的家族成员（Cas13a-d），是一种RNA引导的RNase，靶向RNA的单链区域，在具有特定碱基的靶RNA区域产生多个切割位点。Cas13表现出靶依赖性的混杂RNA酶活性，导致旁观RNA分子的反式切割，这种效应被称为“collateral activity （附带活性）”。研究人员利用这一“脱靶缺陷”，加入一种可淬灭的荧光RNA，当荧光RNA被切开时，会发出荧光信号而显示检测结果。最近发现其它类型CRISPR-Cas系统的Cas酶也显示collateral activity ，如Cas12的亚家族。尽管Cas13具有称为原间隔物侧翼位点（PFS）的PAM样序列基序，仅对某些目标位点有活性，但是许多非常活跃的Cas13直系同源物，例如LwaCas13a，不显示PFS。
DETECTR技术的原理与SHERLOCK相似。Cas12a（Cpf1）通过crRNA靶向特定的双链DNA，切割目标双链DNA后，会对所有的单链DNA发动任意切割。将ssDNA-荧光淬灭（FQ）报道基团加入反应中，在ssDNA降解时就会产生荧信号。
SHERLOCK的流程
利用SHERLOCK系统检测样品的流程为：
?收集样品，提取样品的DNA或者RNA；
?以提取的DNA为模板在42℃下进行等温扩增反应，或者将RNA逆转录成cDNA，以cDNA 为模板在42℃下进行等温扩增反应；
?以等温扩增产物为模板体外转录单链RNA；
?转录产物与Cas13和检测探针孵育，检测荧光信号。
制备SHERLOCK系统需要原核表达和纯化Cas13，设计crRNA并且体外转录，制备带荧光标记的单链RNA探针。
SHERLOCKv2
与SHERLOCK比较，SHERLOCKv2具有有4个方面的改进：
? 4通道单反应多重分析，1个反应可以检测4种核酸，使用了1个Cas13a、两个不同菌株的Cas13b和1个Cas12a ，每个酶的crRNA不同，激活后能切割的核苷酸序列也不相同；
?可以定量测量低至2 attomolar（10-18摩尔）的底物；
?通过将Cas13与Csm6（一种与CRISPR相关的辅助酶）结合，使信号灵敏度提高3.5倍；
?切割后的报告基团可通过试纸条来检测，不用依赖荧光。
SHERLOCK的优势
与常用的诊断技术ELISA（酶联免疫吸附剂测定）、荧光RT-PCR（实时荧光反转录聚合酶链式反应）等比较，SHERLOCK的优势包括：
?检测范围广，SHERLOCK使用的LwaCas13a没有PAM，因此可以检测任何核酸序列；
?灵敏度高，可以定量测量低至2 attomolar（10-18摩尔）的底物；
?使用方便，用试纸条检测不需要特殊的设备；
?成本低，每次测试仅需要0.61美元（约为4.2元人民币）。
SHERLOCK的应用
SHERLOCK可以用于检测寨卡病毒、登革热病毒的特定株系，检测大肠杆菌和绿脓杆菌的基因组，对人类DNA进行基因分型，鉴定游离DNA中的低频率癌症突变（Gootenberg et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 2017, 356(6336):438-442）；检测大豆的草甘膦抗性基因（Abudayyeh et al. Nucleic Acid Detection of Plant Genes Using CRISPR-Cas13. CRISPR J. 2019, 2:165-171）。张锋团队已经开始利用SHERLOCK系统检测冠状病毒2019-nCoV。
分子信标：新型核酸分子探针 摘要： 分子信标是基于荧光共振能量传递原理设计的一种发夹型寡聚核酸分子荧光探针，能够与待测核酸序列分子相互作用发生结构变化产生不同强度的荧光信号及电化学信号等，具有高灵敏度、高选择性、适于活体检测等优点。本文介绍了分子信标的作用原理，不同的分子信标类型以及应用，最后对前景作出了预测。 关键词：分子信标荧光探针灵敏度选择性活体检测 引言： 从20世纪60年代初至今，分子信标（Molecular beacon,MB）已被广泛地应用于生物、药物、化学等多个领域【1,2,3,4】。近年来，MB特别是基于DNA结构的MB，已成为一种重要工具，用于核酸的复制、重组、翻译和表达的研究【5,7,12】。为了满足后基因组时代的发展需求，人们通过各种分子工程策略，发展了许多敏锐性更高、选择性更优的MB。 自从1996年Tyagi和Krame【6】首次建立了分子信标探针，由于其独特的性质和多功能性，如操作简单、灵敏度高、特异性强等。在它出色地完成了液相靶标测定(实时PCR测定)任务之后，人们又将其应用于核酸实时定量测定、活体分析、化学与生物传感、疾病基因检测与诊断等研究中【8,9,10,11】。又由于易于对其进行修饰和改性，在这十来年的发展中，人们在经典分子信标模型的基础上，设计出了许多新型的分子信标，如无茎分子信标，用PNA【13】链代替ssDNA形成的PNA分子信标，以及LNA分子信标等。这些新型的分子信标是为了满足不同的需要而设计的，特异性更强，稳定性更好，为许多新的研究领域提供了一个平台。为了满足基因组学和蛋白质组学的发展，对分子信标的固定化也成了必然的发展趋势，自从谭蔚泓【14】首次将分子信标固定在硅胶上以来，固定化分子信标也迅速发展起来。尤其是后来设计的将分子信标固定在金表面【15,16】，利用金的强摩尔消光系数进行淬灭，简化了分子信标的设计，更加方便对其进行操作，大大促进了基因微阵列技术的发展。
红火蚁监测技术规范（试行） 为规范红火蚁疫情监测工作，及时发现新疫情，准确掌握疫情扩散、分布及发生动态，特制定本办法。本办法规定了红火蚁监测准备、监测区域、监测植物、监测时期、监测用品、监测方法、疫情诊断、监测记录与档案以及监测报告等要求，适用于全国各地开展红火蚁监测。 1监测准备 收集当地与红火蚁相关的信息并进行整理、分析，制定简要的监测计划。 2 监测区域 2.1发生区 重点监测发生疫情的有代表性地块和发生边缘区。监测目的是掌握红火蚁的发生动态和扩散趋势。 2.2未发生区 重点监测高风险区域，包括经过疫情发生区的交通沿线、近年来从红火蚁发生区调入高风险物品（包括土壤、垃圾、装盆用混合或有机覆盖物、干草或秸秆、其他如草皮、苗木、绿化树运载土壤的工具等任何含土壤或附着土壤的东西）的地区。监测目的是了解红火蚁是否传入。 3 监测范围 重点监测草坪、绿化带、苗圃、果园、荒地、堤坝、垃圾场、高尔夫球场、货场以及可能调入盆栽植物、垃圾、木材、肥料的场所。 4监测时期 在气温为20-32℃时间段进行。 5 监测用品 工具：诱瓶、扩大镜、解剖镜、挖掘工具、镊子、指形管、样品袋、标签、记录笔等； 材料：酒精（95%）和诱饵（火腿肠等）。 6 监测方法 6.1未发生区 6.1.1 访问调查 向当地居民或经常在该区域工作的人员询问是否有被蚂蚁叮咬后出
现红火蚁危害的症状，是否看见隆起高于地面呈金字塔状的蚂蚁巢，近年来是否从红火蚁发生区调入过高风险物品，每个社区或行政村随机询问调查10人以上，记录可疑蚁害发生地点、发生时间。对访问调查过程发现的可疑地点，进行重点踏查。 6.1.2 踏查 结合访问调查情况进行，在调查区域内步行观察附近有无可疑的蚁丘，计划行走的路线要覆盖整个调查区域。可用一根长80-100 cm、直径0.3-0.4 cm铁丝，拨开杂草或障碍物观察有无蚁丘。如有蚁丘，则用铁丝插入蚁丘5-10 cm，观察是否有蚂蚁迅速出巢并表现出很强的攻击行为。采集蚂蚁标本（方法见附录1），进行现场鉴定或送室内鉴定。填写红火蚁监测记录表（附表1）。 如确认有疫情发生，进一步按照发生区的要求进行监测。 6.2 发生区 6.2.1发生范围监测 参照6.1各方法采取访问调查和踏查。 6.2.2发生动态监测 6.2.2.1 诱饵制作及用量 用火腿肠作为诱饵。将火腿肠切成厚度约0.5cm 左右的薄片，放入专用的塑料诱瓶中，并固定在地面上进行诱集。注意使用的火腿肠要新鲜。 6.2.2.2诱瓶的放置与使用 诱瓶的放置应覆盖所有的村庄或社区，每个村庄或社区每类型场所设置3个监测点。每个监测点随机放置5个诱瓶,瓶间相距10m。对于条状的区域（如绿化带）则每10 m左右放置1个诱瓶。注意选择有蚂蚁活动的地方放置诱瓶。使用时将诱瓶置于地面，30分钟后取出蚂蚁，进行鉴定和计数，必要时制成标本。填写红火蚁诱集监测记录表（附表2）。 7 疫情诊断 7.1 现场诊断 监测过程中如发现可疑蚂蚁，可根据蚂蚁的形态特征、行为以及蚁丘的形状进行鉴定（附录2），必要时可采制标本。 7.2室内鉴定
核酸检测基本知识 1.什么是核酸检测 核酸的定义：核酸是由核苷酸或脱氧核苷酸通过3′，5′-磷酸二酯键连接而成的一类生物大分子。 核酸具有非常重要的生物功能，主要是贮存遗传信息 和传递遗传信息。 2.核酸的分类 核酸大分子可分为两类：脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）。 3.核酸的组成
DNA和RNA都是由一个一个核苷酸(nucleotide)头尾相连而形成的，由C、H、O、N、P，5种元素组成。DNA是绝大多数生物的遗传物质，RNA是少数不含DNA的病毒（如HIV病毒，流感病毒，SARS病毒等）的遗传物质。RNA平均长度大约为2000个核苷酸，而人的DNA却是很长的，约有3X10^9个核苷酸。 4.核酸的功能 在蛋白质的复制和合成中起着储存和传递遗传信息的 作用。核酸不仅是基本的遗传物质，而且在蛋白质的生物 合成上也占重要位置，因而在生长、遗传、变异等一系列 重大生命现象中起决定性的作用。 DNA与RNA都是核酸，它们在化学组成上有什么区别如 下： DNA与RNA的比较DNA RNA 主要存在部位细胞核细胞质 基本组成单位脱氧核苷酸核糖核苷酸碱基种类A、G、C、T A、G、C、U 五碳糖种类脱氧核糖核糖 核苷酸链两条脱氧核苷酸链一条核糖核苷酸链 5.检测方法 核酸检测方法，主要通过同时进行靶核酸扩增和可检 测信号的生成来检测样品中的靶核酸。可应用于临床微生
物学、血液筛选、遗传病诊断和预防、法医学等领域的核 酸检测。 目前主要使用的方法有以下几种： a.核酸序列依赖性扩增法 NASBA是由一对引物介导的、连续均一的、体外特异性 核苷酸序列等温扩增RNA的新技术。反应在42℃进行,可在2h内将RNA模板扩增约109倍。NASBA原理是提取病毒RNA,加入AMV逆转录酶、RNA酶H、T7RNA聚合酶和引物进行扩增。 整个反应分非循环相和循环相:在非循环相中,引物I与模板RNA退火后在AMV逆转录酶的作用下合成cDNA,形成RNA:DNA 杂合体,随即RNaseH降解RNA,引物Ⅱ与cDNA退火,在反转录酶作用下合成第2条DNA互补链。双链DNA可在T7RNA聚合酶的作用下,经其启动子序列起动而转录RNA，RNA又可在反转录酶的作用下反转录成DNA，进入循环相,对模板进行大量 扩增。 b.转录介导的扩增技术 TMA技术原理与NASBA基本一致，略有不同之处是TMA利用的是MMLV逆转录酶及T7RNA聚合酶两种酶，MMLV逆转录酶既有逆转录酶的活性又具有RNA酶H活性。反应在41.5℃进行,可在1h内将RNA模板扩增约109倍。 c.连接酶酶促链式反应(LCR) LCR是基于靶分子依赖的寡核苷酸探针相互连接的一种
修订内容 1 进一步明确基桩检测方法选择原则及抽检数量的规定； 3.1.1 基桩检测可分为施工前为设计提供依据的试验桩检测和施工后为验收提供依据的工程桩检测。基桩检测应根据检测目的、检测方法的适应性、桩基的设计条件、成桩工艺等，按表3.1.1合理选择检测方法。当通过两种或两种以上检测方法的相互补充、验证，能有效提高基桩检测结果判定的可靠性时，应选择两种或两种以上的检测方法。 3.3.1 为设计提供依据的试验桩检测应依据设计确定的基桩受力状态，采用相应的静载试验方法确定单桩极限承载力，检测数量应满足设计要求，且在同一条件下不应少于3根；当预计工程桩总数小于50根时，检测数量不应少于2根。 3.3.3 混凝土桩的桩身完整性检测方法选择，应符合本规范第3.1.1条的规定；当一种方法不能全面评价基桩完整性时，应采用两种或两种以上的检测方法，检测数量应符合下列规定： 1 建筑桩基设计等级为甲级，或地基条件复杂、成桩质量可靠性较低的灌注桩工程，检测数量不应少于总桩数的30%，且不应少于20根；其他桩基工程，检测数量不应少于总桩数的20%，且不应少于10根； 2 除符合本条上款规定外，每个柱下承台检测桩数不应少于1根； 3 大直径嵌岩灌注桩或设计等级为甲级的大直径灌注桩，应在本条第1～2款规定的检测桩数范围内，按不少于总桩数10%的比例采用声波透射法或钻芯法检测； 4 当符合本规范第3.2.6条第1～2款规定的桩数较多，或为了全面了解整个工程基桩的桩身完整性情况时，宜增加检测数量。 对干作业挖孔桩和单节预制桩，数量可减半。——取消 3.3.4 当符合下列条件之一时，应采用单桩竖向抗压静载试验进行承载力验收检测： 1 设计等级为甲级的桩基； 2 施工前未按本规范第3.3.1条进行单桩静载试验的工程； 3 施工前进行了单桩静载试验，但施工过程中变更了工艺参数或施工质量出现了异常； 4 地基条件复杂、桩施工质量可靠性低； 5 本地区采用的新桩型或新工艺； 6 施工过程中产生挤土上浮或偏位的群桩。
编号：2-9 主题：digital PCR 概述： Digital PCR（dPCR)即数字PCR，它是一种核酸分子绝对定量技术。相较于qPCR，数字PCR可以直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量。数字PCR是最新的定量技术，基于单分子PCR方法来进行计数的核酸定量，是一种绝对定量的方法。由于数字PCR能够直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量，因此特别适用于依靠Real-time PCR的Ct值不能很好分辨的应用领域，例如：拷贝数变异、突变检测、基因相对表达研究（如等位基因不平衡表达）、二代测序结果验证、miRNA表达分析、单细胞基因表达分析等。目的： 对DNA分子的个数进行绝对定量。 原理： 其主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。 步骤： 1.分离并纯化基因组DNA； 2.计划数字PCR实验，确定样品的最佳稀释度，以获得数字PCR答案；
3.上样，将DNA样品与TaqMan Assay以及OpenArray数字PCR预混液上样到OpenArray 384孔板； 4.循环和成像，利用OpenArray AccuFill 系统将反应上样到OpenArray平板。将OpenArray平板插入OpenArray箱中，装满浸液，并用封箱胶水密封。利用OpenArray? 实时定量PCR系统开展读取。 5.快速轻松地获取和分析数据。 流程图：
核酸检测实验室应急预案SICOLAB SICOLAB主要分7个步骤： 织织体系建设、生物安全事件分类、事件报告、应急处置方案、应急措施、预案管理 一、参考依据 《中华人民共和国传染病防治法》 《中华人民共和国国境卫生检疫法》 《中华人民共和国突发事件应对法》 《突发公共卫生事件应急条例》 《病原微生物实验室生物安全管理条例》 《可感染人类的高致病性病原微生物菌(毒)种或样本运输管理规定》 《人间传染的病原微生物名录》、《医疗机构临床实验室管理办法》 《国家突发公共卫生事件应急预案》 《广州市突发公共卫生事件应急预案》 各地区卫生系统病原微生物实验室生物安全事件应急预案相关标准 二、预案基本内容及建设程序 1、织织体系建设 医务部：对感染者进行医疗救治及生物安全事件的应急处理工作。 预防保健科、医院感染管理科：医学观察及预防用药，并上报卫生行政部门及CDC机构。 感染科：对感染者和可疑接触者进行临床诊治、实施医学观察及预防用药。 临床检验中心及各实验室：成立生物安全应急小分队；检测工作；现场清洁消毒工作。保卫科：对发生泄漏的现场进行封锁，并按有关规定向公安部门报告。 总务科、设备科、药学部：储备、提供相应的防护用品、设备、必备的救助、消毒药品，协助有关科室进行环境的清洁、消毒工作等。 2、生物安全事件分类 重大生物安全事件：实验室人员确诊感染《人间传染的病原微生物名录》规定的第一、
二类病原微生物，或出现有关症状、体征，临床诊断为疑似感染《人间传染的病原微生物名录》规定的第一、二类病原微生物及样本漏失、流失事件。 一般生物安全事件：实验室人员确诊感染《人间传染的病原微生物名录》规定的第三类病原微生物，或出现有关症状、体征，临床诊断为疑似感染《人间传染的病原微生物名录》规定的第三类病原微生物及样本漏失、流失事件。 生物恐怖事件：病原微生物实验室设施被蓄意破坏；感染性样本或其他感染性材料被盗；在实验室内故意播撒高致病性病原微生物菌(毒)种或样本；病原微生物实验室出现不明原因或人为造成的火灾、断电、爆炸事故。 3、事件报告 报告单位：医院各科室 时限：2小时内向同级卫生局 报告内容：医院名称、实验室名称、事件发生地点、发生时间、涉及病原体名称、涉及的地域范围、感染或暴露人数、发病人数、死亡人数、密切接触者人数、发病者主要症状与体征、可能原因、已采取的措施、初步判定的事件级别、事件的发展趋势、下一步应对措施、报告单位、报告人员及通讯方式等。 4、应急处置方案 即关闭事件发生的实验室； 对周围已经污染或可能污染的环境进行封闭、隔离； 组织专业消毒人员消毒现场； 核实在相应潜伏期时间段内进出实验室人员及密切接触感染者人员的名单； 对被感染人员进行医学观察，对在事件发生时间段内、相应潜伏期时间段内进出实验室人员进行医学观察，必要时进行隔离和预防接种；提供微生物实验室布局、设施、设备、实验人员等情况；配合有关部门做好感染者救治及现场调查和处置工作。 如怀疑生物恐怖事件，要立即同时上报天河区卫生局、天河区公安局和国家安全部门。 5、应急措施 实验室生物安全事件发生后，立即组织生物安全应急小分队成员和相关专家穿用防护装进入现场了解事件信息、处理污染、评估危害。离开现场时，必须脱去防护装、严格手消毒，不得将污染、可疑污染物带离控制区域，消除污染扩散可能性。
环境噪声监测技术规范 环境噪声监测技术规范 1适用范围结构传播固定设备噪声本标准规定了结构传播固定设备噪声监测测量计划制定、现场调查方法、监测点位设置、室 内低频噪声测量方法、监测数据处理与评价、资料整编和监测质量保证等的技术要求。 本标准适用于结构传播固定设备噪声引起的室内低频噪声污染监测。 2规范性引用文件 本标准内容引用了下列文件的条款。凡不注明日期的引用文件，其有效版本适用于本标准。 GB3785声级计电、声性能及测量方法 GB12348 GB22337 GB/T3241 GB/T15173 GB/T17181工业企业厂界环境噪声排放标准社会生活环境噪声排放标准 倍频程和分数倍频程滤波器 声校准器 积分平均声级计 3术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。
3 .1倍频带声压级soundpressurelevelinoctave采用符合GB/T3241规定的倍频程滤波器所测量的频带声压级。本标准规定的噪声频谱分析 时使用的倍频带中心频率为31. 5Hz、63Hz、125Hz、250Hz、500Hz，其频率覆盖范围为22Hz～ 707Hz。 3 .2低频噪声LowFrequencyNoise测量仪器性能应符合 （IECGB3785和GB/T17181对1型声级计的要求且符合国际电工协会 GB/T3241中对滤波器的要求，61260）Class1标准；噪声频谱分析滤波器性能应符合具备实 时频谱分析功能，测量范围应满足所测量噪声的需要。 4 .1.2声校准器 校准所用仪器应符合 率为GB/T15173对1级声校准器的要求。A 声级测量时，校准声源频20～250Hz区间1000Hz；低频频谱测量时，校准声源频率至少有一个点频率应设在内。 测量仪器和声校准器应定期检定合格，并在检定有效期内使用。声级计每次测量前、后应进 行校准，其前、后校准示值偏差不得大于0 .5dB，否则本次测量无效。使用延伸电缆时，应注意 长电缆对声波信号的衰减，因此在进行校准时，应使延伸电缆与声级计一起进行校准。 传声器应 加防风罩。
核酸检测和抗体检测 核酸检测和抗体检测 究竟什么是病毒核酸检测？什么是抗体检测？为什么可以用核酸检测结果作为新型冠状病毒肺炎的确诊依据？我们来了解一下这些问题。 病毒核酸检测是什么？ 病毒核酸检测是常见的病毒感染检查方法，并不局限于新型冠状病毒。在埃博拉、流感、禽流感等多种病毒性疾病诊断中，都会应用到病毒核酸检测技术，区别就在于所检测的病毒特异性基因不一样。 核酸检测是实验室确诊的主要方法。可通过实时荧光PCR检测咽拭子、痰液或血液等标本中2019-nCoV核酸阳性，或通过病毒基因测序，如与已知的2019-nCoV高度同源即为病原学阳性。 它既不需要开刀也不需要打针，采集人体分泌物后，进行留样保存，在实验室条件下，利用PCR技术进行检测，进行临床病原学的确诊。 抗体检测是什么？ 血清抗体检测，简称抗体检测。血清检测大多使用三类方法：间接免疫荧光（IIFT）、间接法 ELISA 和胶体金法。 血清抗体检测冠状病毒感染并不能像病毒核酸检测阳性一样作为病毒感染的“金标准”，因为抗体检测的准确性受制于检测方法、灵敏度、特异性、血样制备等因素。 如何判断有没有新冠病毒？ 最直接的方法就是通过分子生物学技术检测出属于新型冠状病毒的RNA，这就像法医找到嫌疑人的DNA一样，是可以帮助我们找到“幕后凶手”的直接证据。目前检测新型冠状病毒核酸的方法主要包括实时荧光RT-PCR（简称为定量PCR）检测和基因测序，而新型冠状病毒核酸检测试剂盒就基于前者，也是最常用的方法。 核酸检测的流程 新型冠状病毒核酸检测样本一般来自咽拭子。检测时，医生会用一个像棉签一样的拭子去擦拭扁桃体和咽隐窝附近的分泌物，也可以通过鼻腔取鼻咽后部的分泌物，然后放到试管里面，再交给检验部门做相应的病毒核酸的检查。因此，咽拭子采样前应提前漱口。 核酸检测需要经过取样、留样、保存、核酸提取、上机检测五个步骤。
第六章核酸检验基本技术 第一节分子生物学基本知识 一、DNA和RNA DNA是脱氧核糖核酸的英文缩写。DNA以核苷酸排列顺序形式储存遗传信息。 DNA分子由4种核苷酸组成，由碱基互补维持DNA双螺旋结构。 在动植物、细菌和真菌中都含有DNA，但在病毒中不一定含DNA。 DNA为长丝状分子相互纠缠，其溶液十分黏稠。 它对紫外线有最强的吸收，通常用260nm波长测DNA溶液浓度，它在近中性环境中带负电荷，DNA变性后OD值会升高。 因DNA不溶于乙醇，常用二倍量乙醇沉淀DNA。 在变性温度时，它的黏性突然降低。淬火是为了保持DNA单恋状态。 DNA变性后溶液慢慢冷却，DNA会自动回复双螺旋结构。 RNA是核糖核酸的英文缩写，在大多数生物类型中，RNA起遗传信息传递作用并指导合成蛋白质，但在一部分病毒中，RNA也是遗传信息的保存者。 RNA分子中除了含有核糖而不是脱氧核糖外，凡DNA中出现胸腺嘧啶的地方都代之以尿嘧啶。 二、DNA的复制和修复 细胞分裂一次，染色体DNA就合成一次。 DNA分子拆开成两条链，每一条单链按照碱基配对的原则合成另一条新的单链，成为半保留复制。 在合成DNA时限制性核酸内切酶不是合成DNA的必要条件。 DNA多聚酶只能结合在一长段DNA单链的一小段局部双链结构上，才能顺利开始DNA合成。 在DNA合成中单核苷酸分子必须顺序以共价链连接在已形成核酸链3?末端的羟基上。 在合成大声错误时，DNA多聚酶会切除错误核苷酸，在那个位置上重新加一个正确核苷酸。 在人工合成DNA时，至加一种或两种三磷酸单核苷酸，那么和成就会停止在缺失的核苷酸位置上。 在大肠菌DNA损伤修复时填补缺口最重要的酶是DNA聚合酶Ⅰ，而复制最主要的DNA聚合酶是DNA聚合酶Ⅱ。 该酶的核心聚合酶中，具有3?-5?外切酶活性。DNA修复过程中尿嘧啶糖基酶系统不包括SⅠ核酸酶。 逆转录酶的RNAaseH活性是一般DNA聚合酶所不具备的。 三、转录 在生物体内，DNA知道的RNA合成过程称为转录。 它是按照储存在DNA尚的遗传信息合成。 合成RNA时DNA双链也要解旋，解旋部位称启动子。 大肠菌的RNA聚合酶有5个亚基，其σ亚基有启动子作用。 四、翻译 再合成各种不同RNA中，tRNA具有搬运氨基酸功能。 构成核糖体骨架的是rRNA，而mRNA直接决定蛋白质的结构。 4种核苷酸排列组成遗传信息，很撑蛋白质时转换成20种氨基酸的排列顺序，遗传信息的这种转换称为翻译。 3个核苷酸排列顺序代表一种氨基酸密码，表示蛋白质合成开始的密码有一种，DNA3个终止密码子分别是UAA、UAG、UGA。 在细菌里，依靠rRNA和mRNA之间一段互补序列能发现蛋白质合成开始的位置。 元和生物核糖体是由16SrRNA、23SrRNA和5SrRNA组成，在振和生物核糖体的五种主要的组蛋白中，H1在进化中最不保守。 在核糖体上，有2个位置上暴露出mRNA分子相邻的2个密码子，当蛋白质合成进行到没有携带任何
核酸检测技术的应用 规ELISA检测。部分标本因为ELISA检测项目不合格直接被淘汰而未 进入到核酸检测环节，有303616份标本分别实行混样核酸检测（191222人份）和单人份核酸检测（112394人份）。⑴混样核酸检测：按照试剂盒说明书要求，筛选ELISA检测合格标本实行8个标本混样 核酸检测，无反应性pooling的8个标本视为该项目核酸检测合格， 有反应性pooling实行标本的拆分单检，拆分无反应性的标本判为合格，拆分亦有反应性的标本判为该项目核酸检测不合格。⑵单人份核 酸检测：采用单个标本核酸检测模式，按照试剂盒和全自动核酸检测 设备要求实行检测，检测无反应性的标本视为HBVDNA、HCVRNA、HIV- 1RNA项目联检合格，检测有反应性的标本则视为HBVDNA、HCVRNA、 HIV-1RNA项目联检不合格。 1.2统计学处理采用x²检验,比较各项目不合格率的差异， p<0.05为差异有统计学意义。 2结果 其中112394人份采用单人份核酸检测系统实行检测，检出单独NAT不 合格数148例，不合格率为1.32‰；191222人份标本采用另外的混样 核酸检测系统实行检测，检出单独NAT不合格数63例，不合格率为 0.33‰.两者不合格率比较，有显著性差异（P<0.05）。 单采血小板标本中，采用ELISA方法检测全血标本278214人份，HBsAg、抗-HCV、抗-HIV-1/2三项不合格数2536例，不合格率为 9.1‰；采用ELISA方法检测单采血小板标本27698人份，HBsAg、抗-HCV、抗-HIV-1/2三项不合格数78例，不合格率为2.8‰.两者不合格 率比较，有显著性差异（P<0.05）。 类，一类为NAT反应性而ELISA无反应性，即为单独NAT不合格结果, 此类不合格的检出即为NAT在血液筛查中所发挥的检测效能。另一类 为NAT反应性ELISA亦为反应性。303616份标本中全血标本和单采血
SICOLAB核酸检测实验室设计建设重点核酸检测实验室在系统运行中必须保证实验室内的负压和压力梯度稳定，为防止任何一个误动作或故障的发生，在极短的时间内诊断故障和应急处理尤为重要。 1、电源保证。为确保安全，实验室在工作期间不得停电，应考虑多线（源头）供电，并充分考虑最大供应量和有足够的负荷余量，设置应急电力供应系统，做到三路以上电源 保障。 ①双路供电：应确保供电来自2个不同的上级变电站。 ②备用发电机组：在双路供电发生故障或断电时提供电力保障。主要保障实验室通风空调系统、负压通风设备、自动控制系统、压缩空气系统、实验室关键工艺仪器设备等用电， 在双路供电断开时可自动切换。 ③UPS：保障在主供电源断电而备用发电机启动和电压稳定前（约10～30s）的不间断供电，与主供电源并联设置。 2、通风系统保障。通风系统是生物安全实验室最核心的设备，维持稳定的负压和压力梯度与通风系统的性能密切相关，通风系统一旦出现故障，稳定的负压和压力梯度很快就会被打破，导致实验室正压或超负压，造成危害生物因子的外逸，甚至围护结构的损坏，导致意外事故的发生。因此，送排风机组均需一用一备，送排风机的容量一定要有余量，当出现防压力故障时，可通过电动风量调节阀以及调节送排风量，维持稳定的负压和压力梯度。 3、（必要时）生命维持系统。为实验人员提供稳定、舒适的呼吸空气；一旦断供，正压服压力将失衡，实验人员将出现头晕、憋气症状；一旦出现负压，实验人员将可能遭受危害生物因子的污染。因此，生命维持系统压缩空气供应装置必须为2套独立的双空气气源，保持可靠的一用一备运行状态和应急供应状态，并有压力报警装置，压缩空气储罐容量要考虑在压缩机故障情况下保证实验人员至少维持15min的用量（正常退出实验室的时间）。
核酸检测技术的应用 1资料与方法 1.1检测方法及判定规则305912份全血标本和单采血小板标本进行常规ELISA检测。部分标本因为ELISA检测项目不合格直接被淘汰而未 进入到核酸检测环节，有303616份标本分别进行混样核酸检测（191222人份）和单人份核酸检测（112394人份）。⑴混样核酸检测：按照试剂盒说明书要求，筛选ELISA检测合格标本进行8个标本混样 核酸检测，无反应性pooling的8个标本视为该项目核酸检测合格， 有反应性pooling进行标本的拆分单检，拆分无反应性的标本判为合格，拆分亦有反应性的标本判为该项目核酸检测不合格。⑵单人份核 酸检测：采用单个标本核酸检测模式，按照试剂盒和全自动核酸检测 设备要求进行检测，检测无反应性的标本视为HBVDNA、HCVRNA、HIV- 1RNA项目联检合格，检测有反应性的标本则视为HBVDNA、HCVRNA、 HIV-1RNA项目联检不合格。 1.2统计学处理采用x²检验,比较各项目不合格率的差异， p<0.05为差异有统计学意义。 2结果 2.1单检模式及混检模式下的NAT结果303616人份标本进行核酸检测，其中112394人份采用单人份核酸检测系统进行检测，检出单独NAT不 合格数148例，不合格率为1.32‰；191222人份标本采用另外的混样 核酸检测系统进行检测，检出单独NAT不合格数63例，不合格率为 0.33‰.两者不合格率比较，有显著性差异（P<0.05）。 2.2全血标本和单采血小板标本ELISA检测结果305912份全血标本和单采血小板标本中，采用ELISA方法检测全血标本278214人份，HBsAg、抗-HCV、抗-HIV-1/2三项不合格数2536例，不合格率为 9.1‰；采用ELISA方法检测单采血小板标本27698人份，HBsAg、抗-
汽车检测技术标准 第一章概述 1、汽车检测（vechicle inspection）：1、汽车不解体 2、利用汽车检测设备和计算机技术 3、对 汽车性能进行快速、准确、定量的检测4确定汽车技术状况或工作能力的检查和测量5、汽车继续运行或进厂维护或修理提供可靠的依据 2、汽车检测的目的：1、预防故障。2、建立科学的汽车维修体系。 3、汽车检测的分类：1、汽车安全环保检测（年检，安全性、环保性）。2、汽车综合性能检测 （动力性、燃料经济性、安全性、环保性、可靠性、操纵稳定性）。 4、检测参数：1、工作过程参数（发动机功率、制动力）2、伴随过程参数（振动、噪声、异响） 3、几何尺寸参数（气门间隙、自由行程）。 5、检测参数的选择原则：1、灵敏性：检测参数相对于技术状况参数的变化快慢。2、单值性： 单调性，汽车技术状况参数:初始值uf终了值ue的范围内，检测参数的变化不应出现极值（即dP/du≠0）3、稳定性：在相同的测试条件下，多次测的统一检测参事的测量值，具有良好的重复性。 6、检测参数标准的类型：国家标准（GB）、行业标准（JT-交通，/T-推荐性）、3、地方标准 （DB）、企业标准（Q/…） 7、检测参数标准的组成：初始值、许用值、极限值。 8、测量：利用测量仪表通过实验和计算方法获取检测参数的量值。 9、汽车检测设备的组成：试验条件模拟装置、取样装置、附加装置、测量系统。 10、测量系统的组成：传感器（把非电物理量转换成电量信号的一种变换器）、信号调理电路、 测量仪表。 11、信号调理电路：传感器输出的信号各种形式的信号处理（如电量转换、阻抗转换、离 屏蔽、小信号放大、温度补偿、滤波和调制等）将其调整为适合后续处理电路（A/D卡）应用的规范信号（0～5V、0～10mA及4～20mA等电信号）。（热电偶） 12、智能仪表与虚拟仪表：智能仪表（微处理器与电子仪器相结合的产物）、虚拟仪表（计算 机和电子仪器结合的产物）。区别？ 13、汽车检测线的检车单元布置的4个原则：1、对现场的环境污染最小。2、对检测精度影响 小。3、应考虑每个检车单元的检测等时行。4、空间布置上要合理，不能发生空间上的干涉，占地面积少。 第二章发动机性能检测 1、发动机综合检测仪的组成：信号拾取系统、信号与处理系统、采控显示系统。 2、起动系测试前的连接：蓄电池电压拾取器、起动电流拾取器。 3、充电系测试前的连接：蓄电池电压拾取器、充电电流拾取器、充电电压探针。 4、无外载测功：无外部负荷时，猛踩加速踏板，发动机突然加速所发出的动力除克服各种阻力 外,有效转矩全部用于加速自身各运动部件的运转，即发动机以自身运动部件为负载加速运转。 5、无外载加速时间测功法的原理：在节气门全开时，测量在给定转速范围(n2-n1)内的加速时间 Δt。点火系的点火脉冲一缸信号拾取器夹在一缸高压线上获取发动机的转速信号；当驾驶员迅速踩下油门，发动机转速迅速升高，计算机自动判断转速并且分别记下转速从n1到n2时的时间t1和t2。计算功率。 6、无外载加速时间测功法用哪些拾取器？一缸信号拾取器。
A.精密度、准确 2.基因芯片技术的本质是(单项)该题正确答案: A、核酸分子杂交技术 3.新型冠状病毒肺炎患者行有创机械通气时,正确的方法是(。(单项)该题正确答案: D.小潮气量和低吸气压力 4.合成RNA的原料是:(单功该题正确答案: C、NTP 5.个人防护装置是用于防止人员个体受到生物性、化学性或物理性等()伤害的器材和用品。(单项该题正确答案:A危险因子 6.标记的参与杂交反应的已知核酸序列是(单项该题正确答案 探针 7.级A1型和A2型生物安全柜的通风连接是使用:(单项该题正确答案 A套管“或“伞型罩“连接 8.第三代测序技术的特征(单项该题正确答案 E、单分子测序 9.新冠病毒核酸检测实验室中,不属于净化实验室专用门特点的是:(单项该题正确答案D以上均不是 10.以下对应关系正确的是()(单项)该题正确答案: B.敏感性一一真阳性/真阳性+假阴性)*100% 11.目前的DNA自动化测序技术可以一次性读取的序列长度约(单项) 该题正确答案 D、1000bp 关于分子信标技术的描述,不正确的是(单项该题正确答案 E、分子信标设计简单 13.国内的生物安全实验室一定要按照国务院发布的()进行管理。(单项)该题正确答案: A《病原微生物实验室生物安全管理条例》 14.从鼻咽拭子中提取的检测新型冠状病毒的剩余核酸提取物不可用于哪种病原体诊断(单项该题正确答案 D丙型肝炎病毒 15.退火温度是决定PCR反应特异性的关键因素,通常退火温度为()该题正确答案 减5℃ 16.实验室人员培训的主要内容:0(单项该题正确答案E以上都是 17.下列关于 Taq DNA聚合酶的描述,正确的是(单项该题正确答案 E、在引物的3-OH末端加入脱氧单核苷酸,形成3',5磷酸二酯键 18.下列关于恒温金属浴的使用说法错误的是()(单项该题正确答案 D孔位不足时,可将管放入加热孔中进行热裂解,加热时间不变。 9.脱卸三级防护装备的顺序是:0(单项该题正确答案: A.鞋套→护目镜→外层手套→防护服→帽子→内层手套→口罩 20.下列哪项不是临床分子生物学检验分析前质量控制的内容()(单功该题正确答案 E.进行核酸提取的有效性评价 21.在核酸检测体系中加入内质控,其作用不是监控的是(单项) 该题正确答案
建筑地基检测技术规范 JGJ340-2015 批准部门：中华人民共和国住房和城乡建设部 施行日期：2015年12月1日 中华人民共和国住房和城乡建设部公告第786号 住房城乡建设部关于发布行业标准《建筑地基检测技术规范》的公告现批准《建筑地基检测技术规范》为行业标准，编号为JGJ340-2015，自2015年12月1日起实施。其中，第5.1.5条为强制性条文，必须严格执行。 本规范由我部标准定额研究所组织中国建筑工业出版社出版发行。 中华人民共和国住房和城乡建设部 2015年3月30日 前言 根据住房和城乡建设部《<关于印发2010年工程建设标准规范制订、修订计划＞的通知》（建标[2010]43号）的要求，规范编制组经过广泛调查研究，认真总结实践经验，参考有关国际标准和国外先进标准，并在广泛征求意见的基础上，编制本规范。 本规范的主要技术内容是：1总则；2术语和符号；3基本规定；4土（岩）地基载荷试验；5复合地基载荷试验；6竖向增强体载荷试验；7标准贯入试验；8圆锥动力触探试验；9静力触探试验；10十字板剪切试验；11水泥土钻芯法试验；12低应变法试验；13扁铲侧胀试验；14多道瞬态面波试验。 本规范中以黑体字标志的条文为强制性条文，必须严格执行。 1总则 1.0.1为了在建筑地基检测中贯彻执行国家的技术经济政策，做到安全适用、技术先进、确保质量、保护环境，制定本规范。 1.0.2本规范适用于建筑地基性状及施工质量的检测和评价。 1.0.3建筑地基检测方法的选择应根据各种检测方法的特点和适用范围，考虑地质条件及施工质量可靠性、使用要求等因素因地制宜、综合确定。 1.0.4建筑地基检测除应符合本规范外，尚应符合国家现行有关标准的规定。 2术语和符号
核酸检测技术及其在国内外血液筛检中的应用 输血相关传染病的预防和控制已经成为全社会关注的焦点,新技术的引进是进一步提高血液安全性的重要一环。本文就病原体核酸检测技术(nucleic acid testing, NAT)及其在国内外血液筛检中的应用情况和结果作一介绍,并对该方法在我国推广和应用的必要性和可行性作初步探讨。 1. NAT在血液筛检中的必要性 酶免检测(EIA)技术已经广泛运用于血液筛检,该方法的灵敏度和特异性也在不断地改进和提高,但每年仍有少数新发输血后肝炎病例报道,如美国无偿献血者每单位供血传播HBV、HCV和HIV 的危险性分别为1∶66000、1∶103000和1∶676000[1]。这些危险的主要原因是: 病毒感染者“窗口期”献血,病毒变异,免疫静默感染(immuno silent infection)以及人工操作错误[2]。所谓“窗口期”,是指从感染病原开始,直至用某种检测方法能够检测到该病原存在为止的这一段时间[3]。血清学抗原、抗体检测的“窗口期”较长, 如HBsAg、抗-HIV、抗-HCV检测的“窗口期”分别为45-56ｄ、22ｄ、72ｄ[4,5],故美国90%以上输血传播HIV和HBV以及75%以上输血传播HCV的危险性来自“窗口期”感染献血[6]。EIA“窗口期”漏检是当前影响血液安全性进一步提高的瓶颈,对于献血者的筛选,单纯抗原或抗体血清学检测不能有效地保障血液安全。 NAT检测是直接检测病原体核酸的一系列技术的总称。其基本步骤包括核酸提取、扩增、和检测。NAT敏感性高,可检出标本中极微量的核酸,在病毒感染后数天即能检出,可大大缩短“窗口期”。初步研究表明,混合血样NAT检测可将HBV、HCV和HIV感染的平均“窗口期”缩短9d(缩短“窗口期”20%)、59d(82%)和11d(50%)[5,7];此外NAT还可以检出因上述其它3种原因而漏检的被感染献血。如法国应用NAT,从大约150万份献血中筛检出4份HCV RNA阳性、抗体阴性的样本,其中1份即为免疫静默感染[8]。尽管NAT从理论上并不能完全消除感染“窗口期”,但病毒核酸转阳之前的血液传染性极低,可以有效地预防经输血传播病毒性疾病[9]。因此,NAT的引入可使输血传播疾病的危险性降到最低[10]。 2. NAT检测的技术方法 1985年具有划时代意义的聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)的发明,标志着NAT 的诞生。随后,在PCR的基础上,派生出许多其它原理的体外NAT方法[11]。这些技术灵敏度和特异性或高或低,操作或简单或复杂,适合在各自不同的领域运用，目前适用于大样本量血液筛查并能满足高灵敏度要求的扩证扩增技术主要为PCR技术和TMA技术。 2.1 PCR扩增方法 PCR是一种体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术,以其高敏感性、高特异性和快速简便等优势得到了广泛的应用。通过简单的技术改进和联合,涌现出了各种各样不同的PCR方法,如检测RNA的逆转录PCR(RT PCR)、敏感性和特异性均较高的巢式PCR (nested PCR)、可对靶序列进行定量检测的定量PCR、检测基因超长分布的多重PCR以及PCR结合酶标技术(PCR ELISA)、PCR结合寡核酸探针杂交技术(PCR SSOP)、荧光PCR和免疫PCR等。 目前在临床检测中使用较多的是荧光定量PCR,主要用于各种传染病的诊断、病毒滴度监测以及疗效评估,因采用荧光标记的探针杂交或直接使用能和双链DNA结合的荧光素检测PCR扩增产物,
RT-PCR是检测新型冠状病毒核酸最广泛、最准确的筛选和确认方法。大规模的核酸检测将不可避免地引起相关机构和单位重视建立标准化的临床PCR实验室。 如何避免污染是临床基因扩增实验室装修设计的关键问题，因此实验室的布局、空调通风系统设计、风量控制等都是围绕这一核心问题展开的。 核酸检测实验室装修要求： 核酸检测实验室有设计理念、装修要求、净化空调系统、通风、自控、工艺设备等几个关键点。 材质：隔墙及吊顶——净化彩钢板、地面——同质透芯PVC地板、净化实验室专用门、观察窗要求： 1.墙面：光洁、不产尘积尘、耐腐蚀，易清洁消毒、无缝隙。 2.地面：防静电、耐腐蚀、无缝隙、无渗漏。 3.阴阳角：均用圆弧角密封处理。 4.门：必须设置自动互锁(机械或电子)。 净化空调、通风系统、自控系统要求： 1.避免交叉污染，采用全新风空调系统。 2.样品制备区严格按照BSL-2设计施工。 3.排风系统全部按照要求采用高效过滤器净化。 4.气流组织：采用上送下排形式。 5.压力梯度控制通过微压差计及精密自控系统控制。 6.实验室入口处显示房间内各项指标参数，并设置偏离报警。
工艺设备要求： 1.实验台下部均留空，无死角。 2.全部采用不锈钢304制作。 3.样品制备区设置洗眼装置，必要时应有应急喷淋装置。 4.非接触式操作理念(感应式水龙头、感应式自动门、互锁传递窗等)。 核酸检测实验室装修关键点： 1.平面布局：不论是组合式还是分散式布置的PCR实验室，各功能房间均宜设置独立缓冲间 2.区域空气流向：为避免交叉污染，PCR实验室空气流向必须严格遵循单一方向进行，即只能从试剂贮存和准备区→标本制备区→扩增反应混合物配制和扩增区→扩增产物分析区。 3.通风空调：为避免交叉污染，各功能用房内空气不能掺混。混合式PCR实验室应采用新风直流空调系统，当采用新风系统有困难时，各区域的空气只能在自己的房间内循环。 4.生物安全：按照新型冠状病毒实验室生物安全指南（第二版）的规定，2019-nCoV病原体暂按照第二类病原微生物进行管理，则样本植被区宜为负压或加强型P2实验室，核酸操作应在生物安全柜内进行。 核酸检测关键技术措施包括： 绝对负压（避免室内潜在污染外泄） 气流组织（室内定向流，从低污染风险区流向高污染风险区）
如何自制核酸探针？ 什么是核酸探针？ 核酸探针是能与特定的靶分子发生特异性结合的一段核苷酸分子。通过在核酸探针上连接一些小分子化合物，如生物素、荧光素、地高辛等，或者放射性同位素标记核苷酸，可以达到检测靶基因序列和纯化的目的。这一过程被称为核酸杂交。其原理是碱基互补的两条核酸分子退火形成双链。 探针应用 核酸探针技术作为分子生物学中最常见的技术之一，是印记杂交，原位杂交，实时荧光PCR，microarray（微阵列）等技术不可或缺的组成部分。探针技术能定性或者检测特异性DNA/RNA序列，还可用于病原微生物和寄生虫的检测，疾病诊断等领域。 探针制备 探针标记主要分为放射性和非放射性标记法。探针制备流程如图1所示。Southern印迹、Northern印迹等需要较长的DNA探针，常使用缺口平移法和随机引物法进行标记。而这些方法对于较短的DNA（200 bp以下）来说，效率很低，常使用末端标记法。除了这三种方法，常见的还有PCR标记法。 图1. 探针制备流程。 随机引物法 随机引物法的原理是利用随机引物（random primer，即DNA 水解、分离得到的六聚脱氧核苷酸作）与单链DNA随机互补结合，在Klenow大片段酶的作用下，合成互补链，直至下一个引物。如果模板是RNA，则使用反转录酶。随机引物法可以使标记均匀跨越探针全长。相比于缺口平移法，探针的活性更高，但是产量相对较低。
图2. 随机引物法的原理。 Protocol 试剂： [α-32P]dCTP (3000Ci/mmol), dATP,dTTP,dGTP (5 mmol/L),Klenow大片段（2U/uL），模板，随机引物， NA终止/贮存缓冲液（50 mmol/L Tris-Cl (pH 7.5)，50 mmol/L NaCl，5 mmol/L EDTA (pH 8.0)，0.5% (m/V) SDS） 5X 随机引物缓冲液（250 mmol/L Tris (pH 8.0)，25 mmol/L MgCl2，100 mmol/L NaCl，10 mmol/L 二琉苏糖醇（DTT)，1 mol/L HEPES ( 用 4 mol/L NaOH 调至 pH 6.6），1 mol/L DTT 贮存于 -20℃，临用前用水稀释，使用后弃去稀释的 DTT。） 实验步骤： 1、在一个 0.5 mL 的微量离心管中加入溶于 30 uL 水的模板 DNA ( 25 ng ) 及 1 uL 随机脱氧核苷酸引物（约 125 ng）。 2、使用PCR或者预热的水浴锅95℃热变性10min，迅速放冰上1min。 3、4℃离心混合物10s，重新置于冰上。 4、引物和模板的混合物中加入： dATP, dTTP, dGTP 各1 uL 5X 随机引物缓冲液 10 uL