生防枯草芽孢杆菌的研究进展
李晶1,2,杨谦1*
(1.哈尔滨工业大学生命科学与工程系,黑龙江哈尔滨150001;2.黑龙江省科学院应用微生物研究所,黑龙江哈尔滨150010)
摘要论述了枯草芽孢杆菌在植物病害生物防治中研究与开发应用的概况及其生防机制的研究进展。
关键词生物防治;枯草芽孢杆菌;作用机制
中图分类号S182文献标识码A文章编号0517-6611(2008)01-00106-06
Research Progress on Biocontr o l Bacillus subtilis
LI Jing et al(Department o f Life Science and En gineering,Harbin Uni versity o f T echno lo gy,Harbin,Heil on gjiang150001)
Abstract The survey o f the researches,d evelop ment an d applicatio n of Bac illus s ub tilis in biol og ical co ntro l o f plant di seases,and the research pro cess o n its bioco ntrol mec hani sm w ere discussed.
Key w ords Biol og ical con tro l;Bacillu s s ub tilis;Mechani sm
半个世纪以来,化学农药防治病虫害对农业生产起了重要的作用,但长期不合理使用化学农药产生了诸多问题。化学农药的高毒、高残留不仅对人、畜的健康造成危害,而且对土壤、水体、大气造成严重污染,破坏生态平衡。同时,由于病菌和害虫抗药性的不断增强[1-2],农药的使用量和使用频度不断加大,出现了用药量与病害相互递增的恶性循环,增加了农产品中农药的残留量,对人畜安全构成极大的威胁。一系列问题促使人们探寻一种对人类和环境友好并具良好防治效果的新的植物病虫害防治策略[3-4]。利用有益微生物防治植物病害始于1921年Har tely利用真菌防治猝倒病(Pythium de bar yanum da mping2off)[5]。1973年Ke rr利用放射土壤杆菌(A gro bac te rium radiob ac te r K84)成功防治植物根瘤病。80多年来植物病害生防微生物已涉及真菌、放线菌、细菌乃至病毒(噬菌体)等种群。
细菌因庞大的种群、高繁殖力、复杂的代谢活动、对病原物的作用方式多样、易于人工培养,在自然发生的生物防治和人类应用生物防治的活动中,拮抗细菌及其代谢产物都起到了重要作用。目前,应用较多的生防细菌主要有芽孢杆菌(Bac illus spp.)、假单胞杆菌(Pse udom onas spp.)、土壤放射杆菌(A gro bac te rium radiob ac te r)等[6]。而芽孢杆菌(Bac illus spp.)是目前生防细菌中研究较多的一类,因其能够产生耐热、耐旱、抗紫外线和有机溶剂的内生孢子,所以是理想的生防菌筛选对象[7-8]。芽孢杆菌的抑菌范围也很广,包括根部病害、枝干病害、叶、花部病害和收获后果品病害[9]。已报道的生防芽孢杆菌有枯草芽孢杆菌(B.s ub tilis)、蜡状芽孢杆菌(B.c e re us)、多粘芽孢杆菌(B.po lym yxa)、巨大芽孢杆菌(B.m e gate riu m)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)等[10]。而枯草芽孢杆菌因其抑菌谱广且对多种植物病害具较好防效而引起植保研究者的广泛关注[11-13]。
1枯草芽孢杆菌作为生防因子的研发概况
芽孢杆菌是土壤和植物微生态区系的优势生物种群,具有很高的抗逆能力和抗菌防病作用。许多性状优良的天然
基金项目国家科技部农业科技成果转化资金项目(05EFN212300089);
黑龙江省自然科学基金项目(C200522)。
作者简介李晶(1966-),女,辽宁宽甸人,在读博士,研究员,从事环境微生物方面的研究。*通讯作者。
收稿日期2007208231分离株已成功应用于植物病害的生物防治。枯草芽孢杆菌通过成功定殖至植物根际、体表或体内,与病原菌竞争植物周围的营养,分泌抗菌物质以抑制病原菌生长,同时诱导植物防御系统抵御病原菌入侵,从而达到生防的目的。其主要防治对象为丝状真菌所引起的植物病害,如水稻纹枯病(S tagonos pora c urtisii)、小麦纹枯病(Rhiz oc tonia c e re alis)、番茄叶霉病(C lados po rium fulv um)、豆类根腐病(Fusa riurn gramine rarum)(Rhiz oc to nia spp.)、苹果霉心病(Alte rnaria alte r2 nata)、棉花立枯病(R hizoc tonia so lani)、棉花枯萎病(Fusa rium o x yspo rum f.sp.vasin fe c tum)等[14]。
枯草芽孢杆菌(B ac illus subtilis)是一种嗜温、好氧、产芽孢的杆状细菌,其生理特征多样,分布广泛,极易分离培养。该菌在自然界中广泛存在,对人畜无毒无害,不污染环境,能产生多种抗菌素和酶,具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力。枯草芽孢杆菌不仅可以在土壤、植物根际体表等外界环境中广泛存在,而且是植物体内常见内生细菌,尤其是在植物的根、茎部。目前该菌已经在水稻、大豆、棉花、小麦、辣椒、番茄、玉米等农作物上显示出很好的病害防治效果。由于枯草芽孢杆菌具有生长快、营养简单以及产生耐热、抗逆芽孢等突出特征,而使其不仅有利于生防菌剂在生产、剂型加工及在环境中的存活、定殖与繁殖,并且批量生产工艺简单,成本较低,施用方便,储存期长,现已成为一种理想的生防细菌[15]。如,美国Alaba ma州用枯草芽孢杆菌处理多种作物种子,平均产量增加9%,根病明显减轻。日本用枯草芽孢杆菌及其分泌物防治西红柿立枯病,获得良好防效。国内研究表明,枯草芽孢杆菌对小麦赤霉病、棉花枯萎病、番茄叶霉病、烟草青枯病等病害都有良好的田间防治效果,并有明显的增产效应。江苏省农业科学院植物保护研究所与国际水稻研究所长期合作研究,研制出生物杀菌剂B s2916。经大面积示范推广,B s2916对水稻纹枯病防效达75%~85%,对稻曲病防效达63.8%~85.7%。
1.1国外枯草芽孢杆菌的应用状况1945年Johnson等报道,枯草芽孢杆菌具有防治植物病害的作用。此后,用枯草芽孢杆菌制备生防制剂防治植物病害的研究成为国内外研究的热点。1980年Pa pa viz a s G C报道,枯草芽孢杆菌可以防治水稻等作物的多种土传真菌病害[16]。1992年Hwa ng等报道,用枯草芽孢杆菌可以防治豌豆的R hi zoc tonia根腐病[17]。
安徽农业科学,Jo urnal o f Anhu i Ag ri.Sci.2008,36(1):106-111,132责任编辑刘月娟责任校对马君叶
20世纪90年代后,国外已有多种枯草芽孢杆菌制剂投放市场。美国Agraq ue st公司用枯草芽孢杆菌(B.subtilis)QS T713菌株和QS T2808菌株分别开发出活菌杀菌剂Se renade T M和So na ta AS,已在美国登记使用,叶面施用可防治蔬菜、樱桃、葡萄、葫芦和胡桃的白粉病、霜霉病、疫病、灰霉病等细菌和真菌病害。GB O3(商品名为Kodiak)和M BI600(商品名为S ub2 tilex)分别由美国Gusta fso n公司和Micro bio Ltd公司开发,根部施用或拌种可防治镰刀菌(Fusa rium spp.)、曲霉属(A s2 pe rgillus spp.)、链格孢属(A lte rna ria spp.)和丝核菌属(R hiz oc2 tonia spp.)引起的豆类、麦类、棉花和花生根部病害。2001年Gustaf son将解淀粉枯草芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌混合制成混合生防药剂,称为B ioYield。解淀粉枯草芽孢杆菌变种(B. subtilis var.am ylolique fac ie ns FZ B24)作为植物促长剂被Tae nsa 公司商品化生产,商品名T aeg ro T M。施用于温室或室内栽培树苗、灌木和装饰植物根部,可防治由镰刀菌和丝核菌引起的根腐病和枯萎病[18]。俄罗斯全俄植保所开发了枯草芽孢杆菌可湿性粉剂Alirine2B,可用于防治多种作物真菌(Fusari2 um,Rhiz oc to nia,A sc oh yta,Co lle totric hu m,S c le rotinia,Bo trytis, e tc)病害,田间防效高达60%~95%,增产达25%~35%;另一枯草芽孢杆菌产品Gam air由活菌和代谢物组成,主要防治由Clav ibac te r m ic higane nse subsp.Michiganense,Erwinia c ara2 to vo ra subsp.C ara to vora和Pse udo m onas c orrugata引起的番茄细菌病害。韩国B io公司将枯草芽孢杆菌与链霉菌抗生素、植物抗真菌多糖混合制成生物杀菌剂Milde wcide,叶面喷施可防治蔬菜和葡萄霜霉病、白粉病,也可防治花卉、水果和水稻真菌病害。
1.2国内枯草芽孢杆菌的研究概况国内一些单位也对具有生防作用的枯草芽孢杆菌进行了研究,涉及的防治对象有大田作物的叶部病害、土传病害和果实病害等。不同菌株的抑菌谱、抑菌作用乃至抑菌机理等亦有较大差异。现已从作物的根际土壤、根表、植株及叶片上分离筛选出多株对不同作物的真菌和细菌病害具有拮抗作用的枯草芽孢杆菌菌株,并采用人工诱变方法提高了菌株的防病效率,对这些菌株进行了发酵条件的研究,分离出一些抗菌物质并对其特性进行了研究,同时开展了生防菌剂的温室和大田试验。1992年王雅平等室内平皿试验、盆栽和田间小区试验表明,枯草芽孢杆菌A014菌对小麦赤霉病的防效达50.6%[19]。1993年他们从丝瓜根际土壤分离到枯草芽孢杆菌TG26菌株[20]。该菌株对小麦赤霉病和西瓜枯萎病有较强的抑制作用,对小麦赤霉病的盆栽防效达89.8%,对西瓜枯萎病的苗期防效达100%。田间小区试验表明,对小麦赤霉病、西瓜枯萎病的防效分别为73.1%和79.6%,并且有明显的增产效应。1994年张学君等用枯草芽孢杆菌B3菌株防治小麦纹枯病,田间防效为50%~80%,并确定了它在小麦根系及茎基部的定殖能力[21]。孔建等从苹果园中分离出枯草芽孢杆菌B2903菌株[22-23]。该菌株代谢产生的抗菌物质对多种植物病原真菌具有强抑制作用,已经分离提取出该抗菌物质(为一种蛋白质),研究了产生条件、理化特性及对植物病原菌的抑制作用和防治效果发现对棉花炭疽病和菠菜枯萎病的苗期防效分别达69.4%和76.2%。1997年胡剑等从枯草杆菌B S298中分离纯化抗真菌蛋白,对该蛋白进行了分子量测定和氨基酸组分分析,发现该抗菌蛋白对苹果轮纹病、芦笋枯萎病具有很强的抑制作用[24]。1997年陈志谊等用枯草芽孢杆菌B2916防治水稻纹枯病,防效达50.0%~81.0%[25]。2002年顾真荣等用枯草芽孢杆菌G3防治菜豆和茄子苗期炭疽病和菌核病,防效分别为35.4%和64.1%,对番茄叶霉病防效为78.8%[26]。纪明山等研究表明,用芽孢杆菌B67菌株对西瓜枯萎病的防效达80%以上[27]。我国台湾从土壤中分离出对尖镰孢有抗性的枯草芽孢杆菌菌株W113和W118,并从其几丁质中提取出高度耐热的杀菌剂,发现在100e高温中30 min仍有活性[28]。
1.3国内枯草芽孢杆菌的应用状况国内已开发成功并投入生产的枯草芽孢杆菌商品制剂有百抗、麦丰宁、纹曲宁、依天得、根腐消等。云南农业大学和中国农业大学共同研制的微生物农药/百抗0(10亿/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂)获得农业部登记注册,已在多个省推广使用,推广面积约4667 hm2,主要防治水稻纹枯病、三七根腐病、烟草黑胫病。百抗的主要有效成分是枯草芽孢杆菌B908。大田应用中,百抗对水稻纹枯病防效70%以上。其抑菌机制为营养竞争、位点占领等。南京农业大学研发的麦丰宁是由枯草芽孢杆菌菌株B3制成的活体生物杀菌剂,对小麦纹枯病田间防效达50% ~80%,其防病机制主要表现在产生抑制小麦纹枯病病菌菌丝生长、菌核形成和菌核萌发的抗菌物质。江苏苏科农化有限公司的纹曲宁是100亿活芽孢/ml枯草芽孢杆菌水剂和
2.5%井冈霉素的复混制剂,主要防治水稻纹枯病和稻曲病。根腐消为昆明沃霖生物工程公司登记注册的由枯草芽孢杆菌和荧光假单胞菌复配的可湿性粉剂,通过灌根处理防治三七根腐病。武汉天惠生物工程有限公司完成登记并投产的枯草芽孢杆菌B S2208可湿性粉剂抗灰霉、白粉2种病害,为细菌性植物保护剂,是多种植物病原菌的竞争性抑制剂。它通过竞争性生长繁殖占据生存空间的方式来阻止植物病原菌的生长,能在植物表面迅速形成一层保护膜,使农作物免受病原菌为害。枯草芽孢杆菌还能分泌抑菌物质,抑制病菌孢子发芽和菌丝生长。江苏省农业科学院陈志谊等经过多年生物防治水稻病害的研究获得了防治水稻纹枯病的效果达50.0%~81.0%的枯草芽孢杆菌B2916菌株,现已在江苏等地得到广泛推广。黑龙江省科学院应用微生物研究所研发的枯草芽孢杆菌水剂主要防治瓜类及保护地蔬菜枯萎病、立枯病和豆类根腐病,已在黑龙江等地进行推广应用。
2枯草芽孢杆菌的生防作用机制
2.1营养和空间位点的竞争竞争作用是生防微生物发挥作用的重要机制之一。微生物竞争作用主要包括营养竞争和位点竞争。营养和空间位点的竞争是指存在于同一微小生物环境中的2种或2种以上微生物之间争夺这一环境内的空间、营养、氧气等现象。营养竞争只在少数菌株中发现。研究表明,某些菌株通过产生一种嗜铁素(Sider ophores)与环境中的铁离子高度结合,使植物病原菌缺乏铁营养而不能生长繁殖,从而占据一定的生态位[29]。位点竞争指微生物在植物根际、体表或体内及土壤中定殖,大多数枯草芽孢杆菌菌株以位点竞争占优势。Ba con分离的玉米内生枯草芽孢杆
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36卷1期李晶等生防枯草芽孢杆菌的研究进展
菌与玉米病原真菌串珠镰孢菌(Fusariu m m onili fo rme S heldo n)有相同的生态位[30]。枯草芽孢杆菌能在玉米体内迅速定殖和繁殖,可有效降低串珠镰孢菌及其毒素(M ycoto xin)的积累。Asaka等研究表明,Bac illus subtilis RB14和NB22在土壤中以细胞存活一段时间后(大约14d)主要以芽孢形式在土壤中长期存活[31]。杜立新等通过扫描电镜观察发现,Bac illus sub2 tilis B S2208菌株在番茄叶面分布不均,大多定殖于伤口周围、叶面凹陷处和绒毛根部,且能够在自然土壤和灭菌土中成功定殖,自然土中菌量低于在灭菌土中的菌量[32]。何红等研究表明,辣椒内生枯草芽孢杆菌B S21和B S22菌株通过浸种、灌根和涂叶处理,不仅可在辣椒体内定殖,而且可在番茄、茄子、黄瓜等多种非自然宿主植物体内定殖[33]。
生物都具有一定的生态适应性。在一定的生态系统中引入生防菌后,它能否适应被引入的生态环境,能否在病菌的寄主植物上定殖、增殖以及与相应病原物竞争决定着生物防治的成败。这些都与生防菌的定殖和生物学特性紧密相关。理想的生防菌应具有营养竞争能力强、抗菌物质产生量高、生长速度快及适应性强等特点。对根际定殖微生物的检测是根际微生物复合系统应用中重要的一步。目前对外源微生物多采用在定殖前进行标记,而常用的标记方法是天然抗生素标记和外来基因标记。而近年来随着分子生物学和生化分析技术的发展,一些新技术、仪器被用于生防菌定殖和种群建立等竞争作用的研究。如,扫描电镜观察[34-35]、荧光标记[36]、ELIS A[37]、P C R[38]等技术,都被应用于枯草芽孢杆菌竞争作用的研究。
2.1.1抗生素标记。抗生素标记简单易行,主要有抗利福平、氨苄青霉素、卡那霉素等抗生素标记法。1994年张学君报道了抗利福平枯草芽孢杆菌B3菌株对小麦根系和茎基部的定殖作用[21]。张玉勋等研究了Pse udom onas fluo re sc e nc e5号、15号菌株和B.subtilis M9、M11菌株在大棚温室番茄上定殖及其对灰霉病的控制效果,指出Ps eu do mo nas fluo re sc e nc e和B.sub tilis在大棚番茄叶片上的定殖能力决定对灰霉病的生防作用[39]。余桂容等研究发现对小麦赤霉病有良好防效的枯草芽孢杆菌B4和B6菌株能定殖和生长在麦穗上,并维持较高的种群量达10余d[40]。2001年蔡学清等采用抗菌素和抗病原真菌双重标记的方法研究B S22和B S21菌株的定殖动态[41]。2004年杜立新等将拮抗番茄灰霉病的枯草芽孢杆菌B S2208和B S2209菌株进行利福平抗性诱导,研究枯草芽孢杆菌在番茄叶面和土壤中的定殖和种群分布[32]。B S2208菌株因具有较强的拮抗作用、耐不良环境、繁殖速度快等特点而具有较强的竞争能力,抢先占领伤口和叶面凹陷处等一些有利位点,成功定殖叶面,起到抑菌防病作用。马艳等利用B S21l菌携带的利福平抗性标记对其宿主范围进行了测定,结果表明B S211菌能在辣椒、番茄、甜瓜、黄瓜、棉花和西瓜植株体内定殖[42]。由此可见,将生防枯草芽孢杆菌野生菌株进行抗生素诱导后,产生的抗生素抗性生防菌可以很好地用于生防菌的定殖研究,以揭示生防菌的作用机理。
2.1.2荧光标记。随着分子生物学技术的发展,分子标记技术日益成熟并用于根围生态学研究。现有的报告基因主要有B2半乳糖苷酶(Lac Z)、B2葡糖苷酸酶(GUS)、分泌型胎盘磷酸酯酶(S EAP)、萤火虫荧光素酶(L UC)等。但这些基因的检测都需要底物和辅助因子,因而在活体中的应用受到限制。绿色荧光蛋白(Gree n Fluoresce nt P rote in,GF P)是近年新兴的一种报告分子。该蛋白能够自身催化形成发色结构,并在紫外或蓝光激发下发出绿色荧光,具有荧光强度高、不需要底物(或辅助因子)、无种属特异性、相对分子量小、易与其他蛋白融合、对细胞无伤害、检测方便、可在活细胞内实时观察等特点,而优于传统的报告分子,如B2半乳糖苷酶(LacZ)、B2葡糖苷酸酶(GUS)和荧光素酶(L UC)等。作为报告基因,G FP 是目前能在活细胞中表达的发光蛋白之一,易于构建载体,且对活细胞无毒害,对目的基因的功能也没有影响,转化后细胞可以继续传代,因而成为重要的报告因子,在动物、植物和微生物学中广泛应用[43]。2000年Ram os用G FP标记Pse ndo m onas putida,研究该菌在大麦苗根围的定殖情况[44]。2005年Ete ba ria n H R用G FP基因标记Psen do mo nas fluorse ns,研究了它对苹果Pe nic iuium e xpansum的生防机制[45]。
近年来,我国科研人员也成功开展了GF P基因标记菌株的定殖研究。2003年姚震声等用GF P基因标记了对水稻纹枯病具有生防作用的枯草芽孢杆菌B916,研究了标记菌株的质粒稳定性和抑菌活性[46]。2004年田涛等用GFP基因标记了生防芽孢菌株A47,研究了该菌在小麦根际和体表的定殖规律[36]。借助荧光显微镜,发现GF P标记的菌株A2472gf p能够在小麦根际及小麦体表定殖(包括根表和茎叶表面);相对于在茎叶表面定殖的A2472gf p,在根表定殖的菌体与根的结合更为牢固;从根基到根尖A2472gf p的定殖量有明显的减少趋势。张淑梅等用黄绿荧光蛋白基因标记生防枯草芽孢杆菌B S68菌株,研究了该菌在黄瓜根茎部的定殖规律,浸种和浇穴处理后该菌能在黄瓜根部和茎基部定殖,而且菌株向茎部和叶部传导[47]。
2.2分泌抗菌物质生防细菌防治植物病害发生发展的一个重要机制是产生拮抗物质。生防细菌的拮抗物质种类多,作用范围广谱。同一种拮抗物质可以由多种细菌菌株产生,而同一细菌也可以产生多种不同结构的拮抗物质。
自1945年Jo hnson等报道枯草芽孢杆菌产生抗菌物质[48]后,半个多世纪以来人们从枯草芽孢杆菌的不同菌株中发现了60多种抗生素。枯草芽孢杆菌产生的抗菌物质大多为低分子抗菌肽,有环状肽或环状脂肽,也有线状肽,分子量约1000Da(介于300~3000Da),但也有一些为蛋白类拮抗物。
2.2.1脂肽类抗生素。非核糖体途径合成的脂肽类抗生素(Lipo pe ptide Antibio tic)根据其结构上的差异分为伊枯草菌素(I turin)家族、表面活性素(Surf ac tin)和Feng ycin A、B,加上一些结构未知的环肽抗生素如Bac illus subtilis TG226产生的一种新的抗真菌小肽LP21[49]。
2.2.1.1伊枯草菌素。伊枯草菌素是由枯草杆菌产生的一大类脂肽类化合物,家族成员包括Iturin A、B、C、D、E,芽孢菌素(B ac illom ycin)D、F、L以及抗霉枯草菌素(M yc osubtilin)等[50-51]。它们都是由7个氨基酸残基组成的一个肽环,其中包括一个不变的D T yr2以及一个稳定的手性顺序LD2 D LLD L,最后连接一个C142C17的B2氨基脂肪酸(B AA,B2a mino
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Fatty Ac ide s)。它们对大多数的致病酵母和霉菌具有强烈的抗菌能力。C ho S oo2Jin等报道,抑制炭疽病害的B.subtilis KS03产生的主要抗菌化合物是分子量为1042Da的伊枯草菌素A2[15]。Nakaya m a等研究表明,某些枯草芽孢杆菌能产生抗菌物质伊枯草素(Iturin)[52]。除了枯草芽孢杆菌,已有人从性质与枯草芽孢杆菌比较接近的解淀粉芽孢杆菌(B. am ylo lique fac ie ns)中分离到伊枯草菌素。张桂英等选择对甘蔗黑穗病菌有拮抗作用的5个革兰氏阳性芽孢杆菌拮抗菌株和3个革兰氏阴性拮抗细菌菌株,用PC R技术扩增抗霉菌枯草杆菌素操纵元中m yc B基因[53]。结果是5个革兰氏阳性芽孢杆菌拮抗菌株均扩增出一条大小为2.0kb左右的特异带,革兰氏阳性芽孢杆菌基因组的PC R产物和伊枯草菌素A合成酶操纵元中的ItuB基因的同源性为97%~98%,说明抗菌作用机制和Iturin类群脂肽抗生素的产生有关。
芽孢霉素D也属于伊枯草菌素家族。它的氨基酸顺序是L2Asn2D2T yr2D2Asn2D2Pro2L2Glu2D2S er2L2Thr。与I turin家族其他成员有同样的Asx2T yr2Asx顺序。Anne2Laure M oyne等报道,枯草芽孢杆菌A U195可以产生芽孢霉素D,抑制黄曲霉毒素产生菌黄曲霉(A s pe r gillus flavus)[15]。
2.2.1.2生物表面活性素。1968年,Arim a等首次发现枯草芽孢杆菌株(Bac illus subtilis)产生的脂肽类表面活性剂,呈晶状,商品名为表面活性素(S urfa ctin)[54]。生物表面活性素(S urfa ctin)为分子量约1000Da的环脂肽类物质,具有抗菌、抗病毒和生物表面活性剂作用。一般认为,由枯草芽孢杆菌产生的生物表面活性素无直接抗真菌能力,但是可以加强伊枯草菌素的抗真菌能力。S urf actin还能在植物的根部形成一层生物膜(B iofilm)。该膜能保护植物根部免受病原菌的入侵[55]。枯草芽孢杆菌的S499菌株能同时产生表面活性素、伊枯草菌素和Feng ycin三大类脂肽类抗生素。S urfa ctin是已发现的最强的一类生物表面活性剂,在医药、化妆品、微生物采油、环境治理等领域都有较好的应用前景。2003年高学文等研究发现,枯草芽孢杆菌B2菌株产生的胞外物质经盐酸沉淀、甲醇抽提,获得粗制备物[56]。利用HP LC系统将粗制备物过Xte rra R P18层析柱分离,获得的收集液抑制小麦赤霉病菌分生孢子萌发。通过LC2M S分析,发现B2菌株胞外存在3种抑菌物质,即脂肽类抗生素表面活性素、多烯类和一种分子量为564的结构未知的新物质。同年,他们利用M AL2 DI2TOF2M S技术,鉴定了将lpaB3基因[57]转入枯草芽孢杆菌Bac illus subtilis168菌株所构建的工程菌GEB3产生的脂肽类抗生素种类。结果表明,G EB3仅产生表面活性素(Surf ac tin)一种脂肽类抗生素。经LC2MS分析,GEB3产生由13、14和15个碳原子的脂肪酸链构成的标准表面活性素变异体(S ta n2 dard S urfac tin I sof orm s)。生物活性检测表明,该工程菌产生的脂肽类抗生素表面活性素具有抑制小麦纹枯病菌和稻瘟病菌菌丝生长的作用。2006年别小妹等报道,B ac illus subtilis fm bR菌株的抗菌物质由C13~C15的3种S urfac tin A同系物和一种羊毛硫抗生素S ubti1osin组成[58]。
2.2.1.3Fengy cin。1978年台湾植物病理学家陈升明教授在丰原市郊马铃薯田中分离出Bac illus subtilis F2923[59]。该菌株在田间试验中可有效抑制并预防由Pyric ularia o r yzae、A l2te rnaria kikuchiana所造成的植物病害。Va nitta na kom等经纯化和化学分析发现,Bac illus sub tilis F2923能产生一种抑制许多丝状真菌生长的脂肽类抗生素,命名为丰原素(Fengyc in)[60-61]。丰原素在分子结构上含有一个由10个氨基酸所组成的环状部分及1个长链的脂肪酸支链。它是一种利用非核糖体合成机制所合成的抗生素,其合成基因由fe nC、fe nD、f enE、f enA、fe nB所组成。丰原素合成酶共包含10个间隔区(M odule),每个间隔区均能活化一种氨基酸。这些被活化的氨基酸再依次连接,形成脂肽链。
S urfa ctin表现出抗病毒、抗肿瘤和抗支原体活性,作用机理是破坏病毒的脂膜。Iturin和Fen gycin具有强抗真菌活性,机理是影响真菌细胞膜的表面张力,导致微孔的形成、K+及其他重要离子的渗漏,最后引起细胞死亡。脂肽类化合物可用于防治水稻稻瘟病、水稻纹枯病、小麦白粉病、小麦赤霉病、辣椒炭疽病、辣椒病毒病、番茄早疫病、番茄青枯病、黄瓜灰霉病、黄瓜霜霉病等植物病害以及蚜虫等虫害。
生防菌分泌的抗菌物质稳定性决定它对植物病原菌拮抗能力的持续性。有研究报道,枯草芽孢杆菌分泌的表面活性素(S urfa ctin)在土壤中的稳定性强于伊枯草菌素(I turin)。土壤灌溉、土壤微生物的降解作用及抗生素与土壤中某些物质的结合都可能造成抗生素在土壤中含量的降低[10]。
2.2.2蛋白类抗菌物质。人们从部分拮抗细菌菌株中分离检测到蛋白类拮抗物质。这类物质包括一些酶类、抗菌蛋白和多肽类。目前已报道的枯草芽孢杆菌分泌的酶类有几丁质酶、B acillom ycin D syntheta se C(309.04kDa)、Putative sensor kinase(5
3.38kDa)、Endo21242b2gluc anase(46.60kDa)、B acil2 lom ycin D synthe ta se B(607.23kDa)、Endo21242b2xylanase(5
4.26 kDa)和Ba cillo mycin D synthe ta se A(448.21kD a)等[62-63]。几丁质酶是一种分解聚N2乙酰氨基葡萄糖分子的糖苷酶。
B acillus subtilis G3、地衣芽孢杆菌、短芽孢杆菌都可分泌产生几丁质酶[64]。
国内研究者对枯草芽孢杆菌抗菌蛋白的研究主要集中在抗菌蛋白的产生条件及抗菌蛋白的分离提取上。关于抗菌蛋白的分离纯化,目前普遍采用硫酸铵盐析后分步柱层析等程序逐步纯化。1993年王雅平等从丝瓜根部分离到一株强烈抑制玉蜀黍赤霉病菌的拮抗菌B ac illus sub tilis TG26,并且从中分离到2种分子量为14和14.5kD a的拮抗蛋白[65-66]。这2种蛋白除对玉蜀黍赤霉病菌多个生理小种表现出强烈抑制作用外,对水稻稻梨孢、长柄链格孢、玉米小斑病菌及绿色木霉也有强烈的抑制作用。1998年谢栋等从对苹果轮纹病菌具强拮抗作用的B.subtilis B S298菌株中纯化出抗菌蛋白X98ó,分子量为59kD,等电点为4.5[67]。糖、脂特异染色证明,X98ó为一种含糖和脂的蛋白,对苹果轮纹病、芦笋茎枯病都有很强的抑制作用。抑菌机理主要是溶解细胞壁,造成菌丝畸形、孢子不发芽或发芽异常。童有仁等研究了对水稻白叶枯病菌具拮抗能力的枯草芽孢杆菌B2034的抗菌物质,其作用活性的p H范围为4~12,对热稳定[68]。粗提液经Phenyl S ephar ose C L24B柱层析、D EAE2S e phac el柱层析和HP LC的Superde x75HR10/30柱层析,得到2个拮抗活性峰)))P1和P2。蛋白电泳和等电点电泳显示,P2为单一蛋
109
36卷1期李晶等生防枯草芽孢杆菌的研究进展
白带,分子量为50.3kD,等电点为6.25。经自动Edm an降解法检测和计算机检索,发现P2是一种新的功能蛋白。2005年刘永峰等用硫酸铵分级沉淀枯草芽孢杆菌B2916胞外抗菌蛋白质,共获得8个蛋白质粗提物,其中硫酸铵饱和度为40%~50%和50%~60%提取的粗蛋白质对水稻纹枯病菌和水稻恶苗病菌有较强的抑菌活性,对马铃薯晚疫病菌则没有抑菌活性,经S ephadex G2100层析后检测到4个蛋白质吸收峰[69]。2007年报道从B.subtilis B2916中分离到一种新蛋白B acisubin[63],分子量为41.9kD。该蛋白具有核糖核酸酶活性和使红血球凝聚的活性,不具蛋白酶活性和蛋白酶抑制剂活性。B acisubin对稻瘟病菌(M agna po rthe grise ase)、菌核菌(Sc le ro tinia sc le ro tiorum)、立枯丝核病菌(Rhizo c tonia so lani)、甘蓝和花椰菜、白菜黑斑病菌(A lte rna ria ole race a A lte rna ria b ras si2 cae)、灰霉病菌(B otrytis c ine re a)具有抑制作用。Ba cisubin使得Rhiz oc tonia so lani菌丝顶端分枝、扭曲、肿大、破裂。笔者从枯草芽孢杆菌B29菌株的发酵上清液中经DEAE252离子交换层析和B io2Gel o R P2100凝胶层析分离纯化到抗菌蛋白B29I,分子量约为42.3kD,等电点为5.69。抗菌蛋白B29I可推迟黄瓜枯萎病菌孢子的萌发时间,并可强烈抑制芽管伸长。分泌抗菌蛋白的枯草芽孢杆菌还有B.s ub tilis B3、H110、B9601菌株。另外,枯草芽孢杆菌A30及内生枯草芽孢杆菌B S22菌株也分泌抗菌多肽[70-71]。
由此可见,不同拮抗枯草芽孢杆菌分泌产生的抗菌蛋白对多种植物病原菌具有强烈抑制作用。其抗病机制包括抑制病原菌孢子产生和萌发,使得菌丝畸形,细胞壁溶解,原生质泄露。新抗菌蛋白的获得将为抗菌基因的克隆和转抗菌蛋白基因植物的研究奠定理论和试验基础。
2.3溶菌作用溶菌作用是拮抗微生物通过吸附在病原真菌的菌丝上,并随着菌丝生长而生长,产生溶菌物质消解菌丝体,使菌丝发生断裂、解体、细胞质消解,有的菌丝原生质凝结;或者是次生代谢产物对病原菌孢子的细胞壁产生溶解作用,致使细胞壁产生穿孔、畸形等现象。林福呈等在分离了976株细菌分离物后,发现来自甘蔗根围的一株枯草芽孢杆菌S9对立枯丝核菌(Rhiz oc tonia solani)、终极腐霉(Pythium ultim um)和西瓜枯萎病菌(Fusarium o xyspo rm f.sp.nive um)在PD A平板上的对峙培养过程中不形成抑菌圈,但4d后使上述植物病原真菌的菌丝溶解[72]。扫描电镜观察发现,S9菌株在待测的立枯丝核菌表面形成了溶菌斑。S9菌株对立枯丝核菌的作用过程是通过吸附在病原真菌的菌丝上,并随着菌丝生长而生长,而后产生溶菌物质消解菌丝体。许多B. subtilis类拮抗体产生的次生性代谢物质对病原菌的菌丝或孢子的细胞壁产生溶解作用,致病菌细胞壁穿孔、畸形、菌丝断裂、原生质消解、外溢而丧失活力。例如,B.s ub tilis PRS5菌株的代谢产物可使R.so lani菌丝分隔增多、隔间变短、胞内原生质消解、胞壁大量穿孔或不规则消解、菌丝缩短、断裂、原生质外溢解体而失活。B.sub tilis B2916产生的抗菌物质B acisubin能使R hi zoc tonia so lani菌丝顶端肿大、破裂[63]。
2.4诱导抗性植物的诱导抗病性即各种胁迫、刺激引发的植物对病原物致病性的抵抗作用。这些诱导因子通过激活植物的天然防御机制,使植物免受病原物危害或减轻危害。近年一些研究表明,一些病原菌进入免疫植株的穿入能力因免疫植株抑制其发育、侵入和增殖而明显降低。经诱导处理的植株有些明显降低了菌分生孢子萌发和吸器的穿入程度,有的则是菌穿入后植株迅速木质化,并伴随过氧化物酶活性的增强,因此诱导抗病性机制是复杂的。目前揭示的抗病机制表现在:1诱导木质素形成和伸展蛋白(HRGP)的积累;o诱导植保素(Phy toa le xins)的沉淀;?诱导病程相关蛋白PR P的产生;?诱导酚物质的积累;?诱导寄主防御酶活力。
寄主防御酶系主要包括苯丙氨酸解氨酶(P AL)、过氧化物酶(P O)、多酚氧化酶(PP O)、超氧化物歧化酶(S OD)、B21,32葡聚糖酶、几丁质酶等。许多研究表明,植物抗病品种或诱导产生的抗性植株体内酶活性增强,并有PO特异同工酶的出现。PA L是莽草酸代谢途径的定速酶,是酚、植保素、木质素等抗菌物质合成过程中的关键酶。PO及同工酶在上述抗菌物质合成过程中起重要作用。在酶谱上,抗病强的谱带表现增强,P O与乙烯的合成和吲哚乙酸的作用有关,2种激素会影响代谢的巨变,并与PO一起影响酚的代谢。PP O的主要功能是将酚氧化成毒性更强的醌,PPO的升高有利于酚类物质积累和醌的大量形成。酚为木质素的前体。醌能引起植株过敏抗性反应,甚至P PO本身对植物病害也有抑制作用。植物诱导抗性的产生是通过防御酶系活动而实现的,这些酶活性与抗病性呈正相关[73]。
近年研究发现,诱导植物抗性也是枯草芽孢杆菌生防作用的重要机制之一[34]。Bac illus s ub tilis FZB24(r)产生与植物抗性蛋白合成基因表达相关的信号蛋白,诱导植物抗性,也通过分泌相关蛋白如丝氨酸专性肽链内切酶(S erine spe cific endopeptidases)直接诱导植物抗性。B ac illus s ub tilis AF1处理木豆种子能诱导木豆苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性增加。
B acillus subtilis I N937也能诱导黄瓜对Erw inia trac hei phila的抗性。水稻纹枯病生防菌B2916能诱导水稻叶鞘细胞PA L、PO、PP O和S OD活性增强,且分别在24、48、72和24h达到最高。T ang等研究也发现,B ac illus subtilis B3能诱导小麦P O活性的增加并产生新的PO[74]。徐韶等在对甜瓜枯萎病温室防效试验的研究中发现,内生枯草芽孢杆菌B6菌株与绿色木霉T23菌株复合处理的相对防效达82.22%,比B6和T23的单独处理分别提高32.8%和146.7%[75]。研究表明,内生细菌B6和木霉T23复合接种,其苯丙氨酸解氨酶、过氧化物酶、多酚氧化酶和B21,32葡聚糖酶比活性比单独接种有不同程度的增强。这种变化在挑战接种甜瓜枯萎病菌之后更加明显。拮抗菌处理后诱导植物体内产生一些有益于植物抗病性增强的生理生化反应,是拮抗菌制剂防病的重要机理。枯草芽孢杆菌不但能抑制植物病原菌,而且能通过诱发植物自身抗病机制增强植物的抗病性能,即诱导植物抗病性作用,是生防菌发挥生防作用的一个重要方面。
3结语
目前植物病害生防枯草芽孢杆菌的研究开发及应用已取得令人瞩目的成就。尽管当前化学杀菌剂在农药产业中仍占主导地位,但枯草芽孢杆菌微生物杀菌剂具有对人畜安全、对环境无污染、不易产生抗药性、高效广谱、促进作物生
110安徽农业科学2008年
长等优点,因而更符合现代社会对农业生产及有害生物综合防治的要求和农业的可持续发展战略目标。枯草芽孢杆菌抗菌物质的分离纯化及抗菌作用的分子机制、拮抗基因的克隆及其表达调控等研究已经积累了丰富的研究资料,具有重要的理论意义和指导生产价值。现代生物技术的广泛应用、基因组学和蛋白组学的发展以及先进的仪器设备的应用必将为枯草芽孢杆菌植物病害生防研究开发带来新的发展机遇。
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36卷1期李晶等生防枯草芽孢杆菌的研究进展
图7盐胁迫对水稻叶绿体A TP含量的影响Fig.7Effects o f salt s tress o n the co ntent o f A TP in ch lo ro phyp hll o f rice
量和结构的变化有关;叶绿体偶联因子A TP ase是分布在叶绿体类囊体膜表面的一种复合蛋白,在光合作用能量转换反应中起重要作用,Ma nsour等[14]认为,C a2+,M g2+对于A TP酶活力是必须的,同时K+还能刺激A TP酶活力,高盐浓度下, A TP酶活力的降低可能和叶绿体内Ca2+,Mg2+,K+含量的降低有关;NaC l对叶绿体光合磷酸化和A TP酶活力的影响趋势基本保持一致,大量研究也已经表明,光合磷酸化与电子传递是通过A TP酶偶联在一起的,有报道指出,光合磷酸化活力还可能与叶绿体偶联因子的活性和结构发生变化有关[15]。同时,在不同浓度盐胁迫下Pokkali叶绿体A TP酶和光合磷酸化活力上升程度比Pe ta高,下降的程度比Peta低, Pokkali在叶绿体光合磷酸化和A TP酶活力方面表现出一定的耐盐性;A TP作为植物维持生命活动最重要的能量库,其含量在一定程度上也能够反映植物本身的能量状况。盐分胁迫下叶绿体A TP含量下降,可能与光合作用降低,渗透调节物质合成和积累的耗能以及维持渗透势的耗能有关;同时,叶绿体放氧活性、A TP酶以及光合磷酸化活性对叶绿体A TP的形成起着决定性的作用,它们活性的变化时刻影响着叶绿体A TP的形成。
(3)试验表明,盐胁迫下,叶绿体放氧活性、A TP酶和光合磷酸化活力及A TP含量都受到了不同程度的影响,但在这些光能转化指标中Pokkali上升的幅度比Pe ta高,下降的幅度比Pe ta低,可见,Pokkali耐盐能力强于Pe ta。
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