微生物的分离与培养实验报告
——从酸奶中分离培养保加利亚乳杆菌
实验目的：
1.学习并掌握普通光学显微镜油镜的使用技术及微生物形态观察；
2.学习微生物制片、染色的基本技术，掌握乳酸菌的简单染色法及无菌操作接种技术；
3.通过对培养基的配制，了解配制培养基的一般步骤和方法，掌握微生物实验常用的器皿的清洗与包扎、培养基的制备、消毒灭菌。
4.了解各种灭菌的基本原理和应用范围，以及实验室中常用的灭菌方法。
5.了解酸奶中乳酸菌分离原理，观察乳酸菌的基本形态，掌握用显微镜测微尺测量微生物细胞大小、数目的测定的方法。
6.了解稀释平板计数的原理，熟练掌握混合平板培养法。明确显微镜计数的原理并学习使用血球计数板进行微生物计数的方法。
7．初步学会乳酸菌培养的基本技术，了解并掌握细菌鉴定中常用生理生化反应的原理和方法，掌握进行微生物大分子水解试验的原理和方法。
8.了解并掌握微生物菌种保藏的常用方法及其优缺点，并了解不同微生物对不同的生物大分子的分解利用情况，认识微生物代谢类型的多样性。
实验原理：
乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称，本实验中用革兰氏染色法进行染色，革兰氏染色法是根据细菌细胞壁成分不同，脱色效果不同从而可以将细菌区分为G+和G-菌。通过革兰氏染色以及形态学观察，乳酸菌呈紫色，为革兰氏阳性菌；乳酸菌应为乳杆菌和乳球菌的混合体。酸奶中含有乳酸菌，而且目前市场上销售的酸奶中通常含有双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌四种菌。细菌及其它一些微生物的大小，通常用测微计来测量，测微计分接目测微计与镜台测微计；培养基是按照微生物生长发育的需要，用不同组份的营养物质调制而成的营养基质；灭菌是用物理或化学的方法来杀死或除去物品上或环境中的所有微生物，包括芽孢；自然条件下，微生物常以群落状态存在，这种群落往往是不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物的特性或者要大量培养或者使用某种微生物，必须从这些混杂的微生物群落中获得纯培养，这些获得纯培养的方法称为微生物的分离和纯化。用生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌的生化反应。
实验器材：
样品：含乳酸菌的酸奶
①培养基：改良MRS固体培养基
蛋白胨5g 牛肉膏5g 酵母提取物 2.5g 柠檬酸二铵1g 水500mL
乙酸钠2.5g K2HPO4 1g MnSO4·4H2O 0.125 吐温80 0.5mL
琼脂12.5g MgSO4·7H2O 0.29g CaCO35g 葡萄糖10g
仪器用品：
500ml烧杯一个100ml量筒一个无菌培养皿12个250ml容量三角瓶2个
5ml无菌移液管1ml无菌移液管6只15ml试管7只高压灭菌锅
天平水浴锅一个玻棒一根旋涡均匀器一台镜台测微尺
电磁炉一个棉花纱布目镜测微尺牛皮纸
麻绳接种环一个盖玻片酒精灯一盏牛角匙
pH试纸血球计数板载玻片若干恒温培养箱酸度计
擦镜纸、吸水纸液体石蜡显微镜载玻片玻片架、洗瓶、酒精灯火柴、滴管
药品：结晶紫，乙醇，草酸铵，碘，碘化钾，番红，KOH，NaCl，10％NaOH，2%氯化铁。
药品配制
结晶紫：
结晶紫乙醇饱和液（结晶紫2g溶于20ml 95%乙醇中）20ml，1g草酸铵于蒸馏水100ml。将两液混匀即成。
卢戈氏碘液：
碘1g，碘化钾2g，蒸馏水300ml。先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，然后加入碘使之完全溶解，再加入蒸馏水300ml 即成。
蕃红溶液：
番红2.5g，95%乙醇100ml，溶解后存于密闭的棕色瓶中。用时取10ml与80ml蒸馏水混匀即可。
0.1%的吕氏美蓝染液：
A液：美蓝0.3g，95%乙醇300ml；B液：0.01% KOH 100ml。混合A和B液即成，按1：100稀释即可。
生理盐水：称取0.9克氯化钠，溶解在少量蒸馏水中，稀释到100毫升。
实验步骤：
一、培养基的培养
1．称量
用天平称取蛋白胨1g，牛肉膏1g，酵母提取物0.5g，柠檬酸二铵0.2g，乙酸钠0.5g，K2HPO40.2g，MnSO4·4H2O 0.025g，MgSO4·7H2O 0.06g，葡萄糖2g，吐温80 0.1mL，CaCO31g放入烧杯。2．溶解
向上述烧杯中加入蒸馏水50 mL无菌水，用玻璃棒搅匀后，放到酒精灯上加热，在石棉网上加热溶解后，加入2.5g琼脂，并继续用微火加热。在琼脂溶化的过程中，要控制火力的大小，并且不断搅拌，以免培养基溢出或烧焦。待琼脂完全溶化后，补加蒸馏水至100mL。
3．调节pH
用滴管逐滴滴入1mol/L的NaOH溶液，边滴边搅拌，并随时用精密的pH试纸测pH，直到pH到6.8左右。4．过滤
要趁热用四层纱布过滤
5．培养基的分装
将培养基趁热分装到2个三角瓶里(一半为宜)。注意：分装时不要将培养基沾在管口和试管上段，以免引起污染。6．加棉塞
培养基分装完毕以后，在管口上加一个棉塞。棉塞能防止杂菌污染，保证通气良好。加棉塞时，应使棉塞长度的2/3在试管口内。
7．包扎
在管口外面包上一层牛皮纸，然后，用线绳扎好。在每捆试管外挂上标签，注明培养基名称、配制日期和制作者姓名
二、灭菌
1．打开高压蒸汽灭菌锅，将里面的灭菌桶取出，向锅内加水(最好用开水)，水面与底架平齐为宜（直至高水位灯亮起）。
2．将扎好的试管管口向上竖放在灭菌桶内，再将灭菌桶放回灭菌锅。（注意：灭菌桶内的物品不能放得太挤，否则会影响灭菌效果）。
3．加盖，并将排气软管插入灭菌桶的排气槽内。（以两两对称的方式，同时旋紧相对的两个紧固螺栓，以防漏气）同时关闭灭菌锅上方的安全阀，打开排气阀，使水沸腾时得以排除锅内的冷空气。
4．设置灭菌温度和时间。温度为121℃，20分钟灭菌
5．排出锅内的冷空气，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升，当锅内的压力上升到98kPa时，控制火力大小，使压力维持在98kPa左右20min。
6．灭菌所需时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力将至0时，打开排气阀，旋开盖子，取出灭菌物品。
三、无菌检查
将取出的灭菌培养基放入37℃温箱保温培养24小时，经检查若无杂菌生长，即可待用。
四、菌悬液的配制
先将酸奶样品搅拌均匀，用无菌移液管吸取样品10ml加入盛有90ml无菌水的三角瓶中，在旋涡均匀器上充分振摇20分钟，使样品均匀分散。用一支1ml无菌吸管从中吸取1ml酸奶悬液注入9ml无菌水的试管中，吹息三次，使充分混匀。然后再用一支1ml无菌吸管从此试管中吸取1ml注入另一盛有9ml无菌水的试管中，以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7各种稀释度的菌悬液（要取7只15ml试管）。
五、倒平板
取无菌平板12个，编号标明10-1、10-5、10-6、10-7各三套；将经高温消毒的培养基冷却到50℃左右，按无菌操作法倒12只平板，每皿约15ml；平置使培养基均匀分布在皿底，待凝固。
六、分离方法
A．涂布平板法
用三支1ml无菌吸管分别吸取10-5、10-6和10-7的稀释菌悬液各1ml，对号接种于与之对应的3个无菌平板中，每个平皿放0.2ml；尽快用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂布均匀，平放与试验台上20 min；然后倒置于40℃恒温箱中培养48小时。
B．平板划线
1、划线在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，按无菌操作对标有‘10-1‘的3个平板进行划操作。
常用的划线方法有：
(a)用接种环以无菌操作挑取菌液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线3-4条，再转动培养皿约70°，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分做第二次平行划线，再用同法通过第二次平行划线部分做第三次平行划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线。划线完毕后，盖上皿盖，倒置于放在40℃恒温培养箱中培养48小时。
（b）将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线。划线完毕后，盖上皿盖，倒置于放在40℃恒温培养箱中培养48小时。
C．稀释混合平板法
先分别吸取1ml的10-5、10-6、10-7稀释度的菌悬液对号放入平板中，然后再倒入经高温消毒的并冷却到50℃左右培养基中，边倒入边摇匀，使样品中的微生物与培养基混合均匀，到冷凝成平板后，倒置于40℃恒温箱中培养48小时。
七、菌落特征的观察
恒温培养48小时过后，取出培养平板；选择菌落分布较好的平板，先对其菌落形态（如菌落的大小、表面状况、透明度、色泽、边缘、隆起度、透光性、是否分泌色素等特点）进行观察，初步找出乳酸菌菌落。乳酸菌的菌落很小，大约1~3 mm，园形隆起，表面光滑或稍粗糙，呈乳白色、灰白色或暗黄色；在产酸菌落周围还能产生CaCO3的溶解圈。
八、乳酸菌的形态观察及保加利亚乳杆菌的形态观察
（一）普通光学显微镜的使用
1.取镜从显微镜箱中取出显微镜时，用一手握镜臂，一手托镜座，直立移动，轻放在平稳的实验台上，使用前首先要熟悉显微镜的结构和性能，检查各部零件是否齐全，镜头是否清洁，做好必要地清洁和调整工作。
2.调节光照
1) 用粗调节器提升镜筒，将低倍物镜旋到镜筒下方，使镜头和载物台距离约为5mm左右。
2) 上升聚光器，使之与载物台表面相距1毫米左右。
3) 插上电源，开开电源开关。左眼看目镜调节反光镜镜面角度（在天然的光线下观察，一般用平面反镜；若以
灯光为光源，则一般多用凹面反光镜）。
4) 开闭光圈，调节光线强弱，直至视野内得到最均匀最适宜的光度为止。
3.低倍镜观察
1) 将载片标本（涂面朝上）置于载物台的标本夹上，并将标本部位处于物镜的正下方，转动粗调节器，使镜头
下降至镜面距离检视物大约5mm处。
2) 然后以左眼看目镜，另一眼睁开，一边观察视野，一边扭动粗调节器使镜头缓慢地升高，至视野内出现物像
后，改用细调节器上下微微转动，仔细调节焦距和照明，直至视野内获得清晰的物像，选择适宜部位，移到视野中心。
3) 移动推动器，换高倍镜观察。
4.高倍镜观察将高倍物镜转至镜筒下方，调节光圈和聚光镜，使光线亮度适中，再仔细反复转动微调螺旋，调节焦距，获得清晰物象，再移动推动器选择最满意的镜检部位将染色标本移至视野中央，待油镜观察。
5.油镜观察
1) 先用粗调节旋钮将镜筒提升（或将载物台下降）约2cm，转动转换器将油镜转至镜筒正下方。在玻片标本
的镜检部位滴上一滴香柏油。从侧面注视，用粗调节旋钮将载物台缓缓地上升，使油浸物镜浸入香柏油中，使镜头几乎与标本接触。
2) 左眼看目镜，右手反时针方向微微转动粗调螺旋，下将载物台，当视野中有模糊地标本物象时，改用细调螺
旋，并移动标本直至标本物象清晰为止。
3) 观察完毕，下降载物台，将油镜头转出，先用擦镜纸擦去镜头上的油，再用擦擦镜纸蘸少许二甲苯或乙醚酒
精混合液（乙醚2份，纯酒精3份），擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜纸擦拭2~3下即可，（注意向一个方向擦拭）。
4) 将各部分还原：下降载物台最低处；转动物镜转换器，使物镜镜头转成八字形，再向下旋转至最低处；将调
节光源亮度的旋钮最小化；关掉电源；用柔软纱布清洁载物台等机械部分，放好显微镜，盖上罩。（如果是自然采光显微镜，降下聚光器，反光镜与聚光器垂直）。
6.换片另换新的标本片，必须从第三条开始操作。
7.用后必须清洁、复原观察完毕，上旋镜筒，先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少许二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去镜头上的残留油迹，最后再用擦镜纸擦去残留的二甲苯。机械部件用细软布擦去灰尘和冷凝水，下降镜筒，将接物镜转成八字形置于载物台上。下降聚光镜，（切勿使接物镜与聚光镜相碰受损），反光镜垂直于镜座。放进显微镜箱中锁好，并放入指定的面微镜柜中。
（二）镜检（革兰氏染色方法）
1.涂片取干净载玻片一块，在载玻片中央加一滴蒸馏水，将培养的乳酸菌作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。固定时通过火焰1~2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。
2.染色
(1) 初染加草酸铵结晶紫染色液一滴，约1~2分钟，倾去染色液，用自来水小心地冲洗。
(2) 媒染滴加卢哥氏碘液冲去残水，并覆盖约1~2分钟，水洗。
(3) 脱色将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20~30秒钟，立即用水冲净酒精，以终止脱色。
(4) 复染滴加番红液，染色2~3分钟，水洗。最后用吸水纸轻轻吸干。
(5) 镜检干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的乳酸菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。其中保加利亚乳杆菌呈杆状，成单杆、或双杆菌或长丝状；嗜热链球菌，呈球状，成对、或短链、或长链状。
十、保加利亚乳杆菌的细胞大小测定
1、目镜测微尺的校正把目镜的上透镜旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上，把镜台测微尺置于载物台上，刻度朝上。先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器，使两尺重叠，再使两尺的“0”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度，计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。因为镜台测微尺的刻度每格长l0μm，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度。
例如目镜测微尺5小格正好与镜台测微尺5小格重叠，已知镜台测微尺每小格为l0μm，则目镜测微尺上每小格长度为=5×10μm/5＝10μm
2、菌体大小的测定取下镜台测微尺，将保加利亚乳杆菌染色标本片置于载物台上，先在低倍镜和高倍镜下找到目的物。然后在高倍镜下转动目镜测微尺，测出保加利亚乳杆菌的长和宽各占几格（不足一格的部分估计到小数点后一位），测出的格数乘上目镜测微尺每格的长度，即等于该菌的大小。同法在油镜下转动目镜测微尺测出保加利亚乳杆菌的长和宽各占几格（不足一格的部分估计到小数点后一位），测出的格数乘上目镜测微尺每格的长度，即等于该菌的大小。
例如目镜测微尺在显微镜下经过校正，当使用油镜时，每格相当于1.3 μm。如果测量菌体的长度相当于目镜测微尺的两格，则菌体长度应为1.3 μm×2 = 2.6 μm。
一般测定微生物细胞大小时，通常测量10—20个菌体左右，求出平均值，才能代表该菌的大小。用最大和最小的数值来表示菌体大小的范围。例如长为3~5μm，宽为1~2μm，则其大小为l~2×3~5μm。
3、取出目镜测微尺，将接目镜放回镜筒，再将目镜测微尺和镜台测微尺分别再用擦镜纸擦拭后，放回盒内保存。
（二）血球计数板在显微镜下直接计数保加利亚乳杆菌的数量
如图--血球计数板构造
上：俯视图（中间平台分为两半，各刻有一个方格网）
下：侧面图（中间平台与盖玻片之间有高度为0.1mm的间隙）
血球计数板通常是一块特制的厚载玻片，载玻片上有四条槽而构成三个平台（图5-2）。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽而隔成两半，每个半边上面各刻有一个方格网。每个方格网共分9大格其中间的1大格又称为计数室，微生物的计数就在此大格中进行。常用的血球计数板的计数室有两种规格的刻度网格。一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格，即为16×25。另一种是一个大方格分成25个中方格
而每个中方格又分成16个小方格，即25×16。但是不管计数室是哪种规格，其计数室的小格数总是相同的，即16×25= 25×16= 400（小格），见下图。
图--计数网的区分与分格
每一个大方格边长为lmm、则每一大方格面积为lmm2。盖上盖玻片后，载玻片计数室与盖被片之间的高度为0.1mm，所以每个计数室（大方格）的体积为0.1mm3。在计数时，通常数5个中方格的总菌数，求得平均值。再乘上16或25就得一大方格中的总菌数。然后再换算成1mL菌液中的总菌数。（1mL = 1cm3 = 1 000mm3）
操作步骤如下：
1、取培养后的保加利亚乳杆菌液振荡混匀，加无菌水适当稀释（斜面一般稀释到10-2）。稀释度选择以小方格中的分布的菌体清晰可数为宜。一般以每小格内含4～5个菌体的稀释度为宜。
2. 取清洁无油的血球计数板，在计数室上面加盖玻片。
3.将保加利亚乳杆菌液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘滴入一小滴（不宜过多），使菌液沿两玻片间自行渗入计数室，勿使产生气泡，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌液。也可以将菌液直接滴加在计数室上，然后加盖盖玻片（勿使产生气泡）。
4. 静置5min后，将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数板的大方格网位置。寻找时光圈要缩小，光线要偏暗些，并将计数室移至视野中央。
5．计数时用由16中格的计数板，要按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个中格（即100小格）的保加利亚乳杆菌数。如果是25个大方格组成的计数区，除数上述四个格外，还需数中央l个中格的保加利亚乳杆菌菌数（即80个小格）。由于菌体在计数室中处于不同的空间位置，要在不同的焦距下才能看到，因而观察时必须不断调节微调如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。
6．在高倍镜下计数：随机地计数5个中格内的菌数，然后求得每个中格的平均值。乘上16（或25）就得出1大格中的总菌数，最后再换算到每1mL菌液中的含菌数量。由于菌体细胞在血球计数板上处于不同的空间位置，要在不同的焦距下才能看到，故观察时必须不断调节微调节器，方能数到全部菌体以免遗漏。
7. 计算方法
8. 血球计数板用后，在水龙头上用水柱冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后，并用吸水纸吸水，最后用擦镜纸擦干净，并放回盒内。
十二、保加利亚乳杆菌的生理生化试验
（1）乙酰甲基甲醇V-P实验
接种新鲜的实验菌种于培养基中，40℃恒温箱中培养48小时后，取培养液1mL在其中加入1ml 10％NaOH，混匀，再加入3－4滴2%氯化铁溶液。数小时后，培养基表面的下层出现红色者，为阳性
(2)糖发酵实验
将表下表所示培养基成分(指示剂除外)称取、溶解、摇匀，调整pH值为6.8—7.0，添加1．6％溴甲酚紫指示剂，按l％的浓度添加试验糖类并溶解，分装试管，每管5mL，121℃蒸汽灭菌20min。室温冷却待用。接种供试菌液0．025ml，置37℃恒温培养l、3、5天观察并记录结果。
结果判定：阳性结果为培养基的颜色变黄，表示产酸；阴性结果为颜色不变(与不含糖类的对照管相同)或变蓝(紫)。糖发酵试验基础培养基组成
培养基成分称取量
蛋白胨5g
牛肉膏5g
酵母膏5g
吐温80 0.5ml
1.6％溴甲酚紫溶液 1.4ml
蒸馏水1000ml
十三、菌种保藏（液体石蜡保藏法）
（1）液体石蜡灭菌在250ml三角烧瓶内装入100ml液体石蜡，塞上棉塞，并用牛皮纸包扎，121.3℃灭菌30分钟，然后置于105~110℃烘箱中1h，使水汽蒸发掉，备用。
（2）将需要保藏的菌种，在最适宜的斜面培养基中培养。
（3）用灭菌吸管吸取灭菌的液体石蜡，注入已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端1cm为准，使菌种与空气隔绝。
（4）保藏棉塞外包牛皮纸，将试管直立放置于4℃冰箱保藏。
微生物实验报告
实习报告 实习名称食品微生物检验实习 系别生物与化学工程系 年级专业12级食品科学与工程专业学生姓名某某某 指导老师王老师、黄老师、李老师 X X 学校
2015 年1 月13日
1、实习时间、地点和实习单位 2、实习目的 通过食品微生物检验实习，掌握培养基的配制、包扎及灭菌；正确采集样品并对样 品进行稀释、滴加、培养；菌落观察、鉴定与计数；数据处理、分析等方面内容，并结 合生产和科研技术的发展，开设较高的综合性实验为主，运用综合的实验方、实验手段 对我们的知识、能力、素质形成综合的培养。为我们今后从事各种与食品相关的工作打 下基础。 3、实习过程概述 3.1参加认识实习动员大会 2014年11月8日上午由黄大川、王瑶琼2位老师召开了微生物实习动员大会。会 上，老师们说明了实习目的、内容、时间、地点，着重强调了此次实习的自主性和和注 意事项，另外还应遵守实验室的规章制度，保持高度的安全意识。 3.2实习内容 一、腐乳中细菌含量的检测 1、实验材料和设备 1ml移液管 5支,1000ml、500ml、100ml的烧杯各1、1、2个,250ml锥形瓶 3个， 100ml量筒1个，研钵1个,滴定管1支,试管5支,试管架1个，玻璃棒1根,培养皿 12 个,涂布器1个,洗耳球1个,酒精灯1盏,电磁炉1个，天平1台,药匙1个，pH试纸， 标签纸1张，纱布、棉花、线、报纸若干，高压蒸汽灭菌锅，恒温培养箱，超净工作台。 2、牛肉膏蛋白胨培养基的配制 配方：牛肉膏3g 蛋白胨10g NaCl 5g 琼脂15—20g 水1000ml pH 7．4—7．6 步骤：称量→溶化→调pH→过滤→分装→加塞→包扎→灭菌→倒平皿→接种→培
2012级制药专业 工业微生物学实验报告 姓名: 刘甜甜学号: 2012304090 班级: 制药12-2班指导老师：王健 日期：2014.6.11
一、实验目的 1、抑制或杀死微生物的一些物理、化学及生物的因素抑菌、杀菌的原理。 2、掌握物理、化学及生物的因素抑菌、杀菌的试验方法。 3、了解细菌的形态特征、染色特点。 4、了解细菌在普通培养基、选择培养基、血平板上的菌落特征。 5、掌握细菌分离划线培养的方法。 6、掌握细菌的初步生化反应。 7、掌握细菌密集划线法，掌握细菌K-B药敏纸片法。 二、实验内容 1 细菌Gram’s stain染色，镜检，观察记录细菌形态和特色特征 1.1 实验原理：染色原理：G+菌与Gˉ菌细胞壁不同，G+菌比Gˉ菌细胞内核糖核酸镁盐含量高，G+菌比Gˉ等电点低。 1.2 实验步骤： 1.2.1.制片：○1涂片：取半滴生理盐水置一洁净玻片上，以无菌操作技术自平板上去菌落少许，与生理盐水混匀，均匀涂布约1cm2大小，自然干燥； ②固定：取含菌膜的玻片与酒精灯火焰上来回三次，使菌膜牢固附于玻片表面； 1.2.2染色：①初染：取结晶紫一到两滴覆盖于菌膜表面，轻微摇动，维持30〃~40〃,细流水冲洗，切勿直接冲洗涂片区域； ②媒染：取卢氏碘液1~2滴覆盖菌膜表面，轻微摇动，维持30〃~40〃,用上法细流水冲洗； ③脱色：取95%酒精2~3滴于菌膜表面，轻微摇动，局部接近无色即可, 用上法细流水冲洗； ④复染：取1：10稀释石炭酸复红覆盖涂片区域，轻微摇动，用上法细流水冲洗； ⑤吸水纸初步吸干玻片水分，然后自然干燥； 1.2.3 镜检：于涂片区域加半滴香波油，油镜（100倍目镜）下。 图1：Gram’s stain（1000×）图2：染色试验 三、分离培养 1实验原理：四区划线法是把混杂着在一起的微生物或同一微生物群体的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养繁殖后生成个菌落。有时这些单菌落并非由单个细胞繁殖而来，故必须反复分离多次才能得到纯种。其原理是微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离的目的。
四、名词解释 1. 消毒（disinfection）：指杀死物体上病原微生物的方法，并不一定能杀死含芽胞的细菌或非病原微生物。 2. 灭菌（sterilization）：杀灭物体上所有微生物的方法，包括杀灭细菌芽胞在内的全部病原微生物和非病原微生物。 3. 无菌（asepsis）：指不存在活菌的意思。防止细菌进入人体或其他物品的操作技术，称为无菌操作。 4. 防腐（antisepsis）：防止或抑制体外细菌生长繁殖的方法。细菌一般不死亡。使用同一种化学药品在高浓度时为消毒剂，低浓度时常为防腐剂。 5. 抑菌（bacteriostasis）：抑制体内或体外细菌的生长繁殖。常用的抑菌剂为各种抗生素，可在体内抑制细菌的繁殖，或在体外用于抑菌试验以检测细菌对抗生素的敏感性。 8. 抗链球菌溶血素O试验（antistreptolysin O test, ASO test）：是用已知的链球菌“O”溶血毒素抗原检测患者血清中是否有相应链球菌溶血素O抗体的中和试验。它常用于辅助诊断急性风湿热的风湿活动期。其效价大于1：400以上有参考意义。 9. 肥达试验（Widal test）：利用已知的伤寒沙门菌菌体(O)抗原和鞭毛(H)抗原以及甲型、乙型、丙型副伤寒沙门菌鞭毛（H）抗原分别与不同稀释度的患者血清做定量凝集试验。根据抗体的动态变化，用于辅助诊断伤寒和副伤寒。 10. 外斐试验(Weil-Felix test)：是指某些普通变形杆菌X19、X2和Xk菌株含有的菌体(O)抗原，可与斑疹伤寒立克次体和恙虫病立克次体的部分抗原发生交叉反应，故可用以代替立克次体作为抗原与患者的血清进行凝集反应，此称为外斐试验，用以辅助诊断有关的立克次体病。 11. 锡克试验（Schick test）：用少量毒素测定机体内有无抗毒素免疫的一种方法。在一侧皮内注射白喉毒素0.1ml，若无任何反应，表示机体对白喉有免疫力；若24h－48h注射部位开始出现红肿，直径1cm-2cm，表示机体对白喉易感，无免疫力，血液中无抗毒素中和毒素。 12. 结核菌素试验（tuberculin test）：属于迟发型超敏反应，用结核菌素试剂做皮肤试验测定机体是否感染过结核分枝杆菌的一种迟发型超敏反应性试验。感染过结核分枝杆菌或接种过卡介苗者，一般都出现阳性反应。 13. 鲍－金培养基（B－G培养基）：含甘油、马铃薯和血液的营养培养基，用百日咳杆菌分离培养。 14. 卫星现象：流感嗜血杆菌生长时需V因子和X因子，将其流感杆菌分区划线在巧克力平板或血平板上，然后点种金黄色葡萄球菌。因金黄色葡萄球菌能合成V因子，置于37℃，培养18h－24h后观察菌落特点，凡是靠近金黄色葡萄球菌的流感杆菌生长得较好，形成菌落较大；而远离金黄色葡萄球菌越远的流感杆菌菌落越小，此现象称为卫星现象。这有助于对流感嗜血杆菌的鉴定。 15. 二相性真菌（dimorphic fungus）：有些真菌可因环境条件的改变，而使两种形态发生互变，称为二相性。如球孢子菌、组织胞浆菌等在含有动物蛋白的培养基上37℃培养时，呈酵母菌型；在普通培养基上25℃培养时，呈丝状菌 18. CPE（cytopathic effect,CPE）：病毒在细胞内增殖造成细胞破坏死亡的作用称其为杀细胞效应，这种效应在体外组织培养时可观察到细胞变园、聚集、脱落等，称为致细胞病变作用（CPE）。主要见于无包膜病毒，如肠道病毒等。 20. 血清学诊断：用已知抗原检测病人的血清中是否有相应抗体以及抗体效价的动态变化血清学诊断可作为某些传染性疾病的辅助诊断。此试验一般取病人血清进行试验，故通常称之为血清学诊断。 五、问答题 1. 革兰氏染色法的方法、步骤、结果和意义是什么? 2. 答：革兰染色法的操作与步骤如下： （1）标本片制作：取材涂片干燥固定 （2）染色步骤： 第一液碱性结晶紫，初染1min，水洗；
重庆大学研究生专业实验教学 实验报告书 实验课程名称： 实验指导教师： 学院： 专业及类别： 学号： 姓名： 实验日期： 成绩： 重庆大学研究生院制
一、实验目的 1、了解分离与纯化微生物的基本原理及方法； 2、了解倒平板配制土豆培养基的方法与平板划线分离的基本操作技术；； 3、学习平板菌落计数的基本原理和方法，并掌握其基本技能； 4、初步观察来自土壤中的几类微生物的菌落形态特征，并能判断菌的类型。 二、实验原理 1、培养基的种类 培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴别、保存各种微生物或积累代谢产物。一般的培养基应包含适合微生物生长的6大营养素即水分、碳源、氮源、能源、无机盐和生长因子。培养基的种类很多，根据培养成分的不同可分为天然培养基、合成培养基与半合成培养基；根据物理状态的不同又可分为液体培养基和固体培养基。微生物的分离、纯化、记数等方面的研究常常使用的就是固体培养基。本实验就是使用的固体培养基。 已配制好的培养基必须立即灭菌，如来不及灭菌，应暂存冰箱，以防止其中微生物生长繁殖而消耗养分和改变培养基酸碱度所带来不利影响。 培养基的原材料来源十分广泛，本实验采用的原材料为土豆。 2、接种方法与无菌接种 将微生物的培养物或含有微生物的样品移植到培养基上的操作技术称之为接种。接种是微生物实验及科学研究中的一项最基本的操作技术。接种的关键是要严格的进行无菌操作。微生物的接种方法很多，划线接种、三点接种、穿刺接种、混浇接种与涂布接种是几种常用的接种方法。 划线接种是最常用的接种方法，即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可以达到接种的目的。常用的接种工具为接种环、针等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。
山东大学实验报告2017年11月27日 ________________________________________ _________________________ 科目：微生物学实验题目：微生物大小与数量的测定姓名：丁志康 一、目的要求 1.学习并掌握用测微尺测定微生物大小的方法。 2.增强微生物细胞大小的感性认识。 3. 明确血细胞计数板计数的原理。 4. 掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。 二、基本原理 一）微生物大小的测定 1.微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。微生物 大小的测定，需要在显微镜下，借助于特殊的测量工具——测微尺，包括目镜测 微尺和镜台测微尺。 2.镜台测微尺是中央部分可有精确等分线的载玻片，一般是将1mm等分为100格每 格长0.01mm（即10μm）。镜台测微尺并不直接用来测量细胞的大小，而是用于 矫正目镜测微尺每格的相对长度。 3.目镜测微尺是一块可放入接目镜内的圆形小玻片，其中央有精确的等分刻度，有 等分为50小格和100小格两种。测量时，需将其放在接目镜中的隔板上，用以 测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同显微镜或不同的目镜和物镜组合放大 倍数不同，目镜测微尺每小格所代表的实际长度也不一样。因此，用目镜测微尺 测量微生物大小时，必须先用镜台测微尺进行校正，以求出该显微镜在一定大放 大倍数的目镜和物镜下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。然后根据微生物 细胞相当于目镜测微尺的格数，即可计算出细胞的实际大小。 4.球菌用直径来表示其大小；杆菌则用宽和长的范围来表示。如金黄色葡萄球菌直 径约为0.8μm，枯草芽孢杆菌大小为0.7~0.8×2~3μm。 二）微生物数量的测定 1.微生物数量的测定有多种方法，本次试验中使用显微镜直接计数法。显微镜直接 计数法是将少量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻 片上(又称计菌器)，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。目前 国内外常用的计菌器有：血细胞计数板、Peteroff-Hauser计菌器以及Hawksley 计菌器等，它们都可用于酵母、细菌、霉菌孢子等悬液的计数，基本原理相同。 后两种计菌器由于盖上盖玻片后，总容积为0.02mm3，而且盖玻片和载波片之间 的距离只有0.02mm，因此可用油浸物镜对细菌等较小的细胞进行观察和计数。（除 了用这些计菌器外，还有在显微镜下直接观察涂片面积与视野面积之比的估算法， 此法一般用于牛乳的细菌学检查。)显微镜直接计数法的优点是直观、快速、操
微生物检验实验室操作技术要求 第一节实验室管理制度 一、实验室管理制度 1．实验室应制定仪器配备管理、使用制度，药品管理、使用制度，玻璃器皿管理，使用制度，并根据安全制度和环境条件的要求，本室工作人员应严格掌握，认真执行。 2．进入实验室必须穿工作服，进入无菌室换无菌衣、帽、鞋，戴好口罩，非实验室人员不得进入实验室，严格执行安全操作规程。 3．实验室内物品摆放整齐，试剂定期检查并有明晰标签，仪器定期检查、保养、检修, 严禁在冰箱内存放和加工私人食品。 4．各种器材应建立请领消耗记录，贵重仪器有使用记录，破损遗失应填写报告；药品、器材、菌种不经批准不得擅自外借和转让，更不得私自拿出，应严格执行《菌种保管制度》。 5．禁止在实验室内吸烟、进餐、会客、喧哗，实验室内不得带入私人物品，离开实验室前认真检查水、电、暖气、门窗，对于有毒、有害、易燃、污染、腐蚀的物品和废弃物品应按有关要求执行。 6．科、室负责人督促本制度严格执行，根据情况给于奖惩，出现问题立即报告，造成病原扩散等责任事故者，应视情节直至追究法律责任。 二、仪器配备、管理使用制度 1．食品微生物实验室应具备下列仪器：培养箱、高压锅、普通冰箱、低温冰箱、厌氧培养设备、显微镜、离心机、超净台、振荡器、
普通天平、千分之一天平、烤箱、冷冻干燥设备、匀质器、恒温水浴箱、菌落计数器、生化培养箱，电位pH计、高速离心机。 2．实验室所使用的仪器、容器应符合标准要求，保证准确可靠，凡计量器具须经计量部门检定合格方能使用。 3．实验室仪器安放合理，贵重仪器有专人保管，建立仪器档案，并备有操作方法，保养、维修、说明书及使用登记本，做到经常维护、保养和检查，精密仪器不得随意移动，若有损坏需要修理时，不得私自拆动、应写出报告、通知管理人员，经科室负责人同意填报修理申请、送仪器维修部门。 4．各种仪器（冰箱、温箱除外），使用完毕后要立即切断电源，旋钮复原归位，待仔细检查后，方可离去。 5．一切仪器设备未经设备管理人员同意，不得外借，使用后按登记本的内容进行登记。 6．仪器设备应保持清洁，一般应有仪器套罩。 7．使用仪器时，应严格按操作规程进行，对违反操作规程的因管理不善致使仪器械损坏，要追究当事者责任。 三、药品管理、使用制度 1．依据本室检测任务，制定各种药品试剂采购计划，写清品名、单位、数量、纯度、包装规格，出厂日期等，领回后建立帐目，专人管理，每半年做出消耗表，并清点剩余药品。 2．药品试剂陈列整齐，放置有序、避光、防潮、通风干燥，瓶签完整，剧毒药品加锁存放、易燃、挥发、腐蚀品种单独贮存。
山东大学实验报告2012年 12 月 4日 姓名系年级 2011级生科2班组别四 科目微生物学实验题目微生物的生理生化反应 微生物的生理生化反应 一、【实验目的】 1. 证明不同微生物对各种有机大分子物质的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统。 2.掌握进行微生物大分子物质水解试验的原理和方法。 3.了解糖发酵的原理和在肠细菌坚定中的重要作用。 4.掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。 5. 了解吲哚和甲基红试验的原理以及其在肠道细菌鉴定中的意义和方法。 二、【实验仪器与试剂】 菌种：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、普通变形杆菌、产气肠杆菌培养基：培养基：固体淀粉培养基、固体油脂培养基（大分子水解试验）；葡萄糖发酵培养基、乳糖发酵培养基（内装有倒置的德汉氏小管）（糖发酵试验）；蛋白胨水培养基（吲哚试验）；葡萄 糖蛋白胨水培养基； 试剂：卢戈氏碘液、乙醚、吲哚试剂、甲基红试剂、蒸馏水、 仪器：酒精灯、接种针、培养皿、试管、试管架、烧杯、量筒、德汉氏小管 三、【实验原理】 1.在所有生活细胞中存在的全部生物化学反应称之为代谢，代谢过程主要是酶促反应过程，由于各种 微生物具有不同的酶系统，所以他们能利用的底物不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌，尤其是在肠杆菌科细菌的鉴定中，生理生化试验占有重要的地位。 2.淀粉的水解：由于微生物对淀粉这种大分子物质不能直接利用，必须靠产生的胞外酶将大分子物质 分解才能被微生物吸收利用.胞外酶主要为水解酶,通过加水裂解大的物质为较小的化合物,使其能被运输至细胞内.如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精,双糖和单糖；而淀粉遇碘液会产生蓝色，因此能分泌胞外淀粉酶的微生物，则能利用其周围的淀粉，在淀粉培养基上培养用碘处理其菌落周围不呈蓝色，而是无色透明圈，据此可分辨微生物能否产生淀粉酶。 3.油脂的水解：在油脂培养基上接种细菌，培养一段时间后观察菌苔的颜色，若出现红色斑点，则说 明此中菌可产生分解油脂的酶。 4.糖发酵试验：糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应,在肠道细菌的鉴定上尤为重要.绝大多数 细菌都能利用糖类作为碳源和能源,但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异.有些细菌能分解某种糖产生有机酸(如乳酸,醋酸,丙酸等)和气体(如氢气,甲烷,二氧化碳等);有些细菌只产酸不产气. 例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气。产酸后再加入溴甲酚指示剂后会使溶液呈黄色，且德汉氏小管中会收集到一部分气体。若细菌不能使糖产酸产气，则最后溶液为指示剂的紫色，且德汉氏小管中无气体。 5.IMVC实验主要用于快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌。 （1）吲哚试验：是用来检测吲哚的产生，在蛋白胨培养基中，若细菌能产生色氨酸酶，则可将蛋白胨中的色氨酸分解为丙酮酸和吲哚，吲哚与对二甲基苯甲醛反应生成玫瑰色的玫瑰吲哚。但并 非所有的微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，所以吲哚实验可以作为一个生物化学检测
微生物实验室的基本要求 实验室总体面积应在70平米以上，要求水、电供应充足，畅通，排污设施与安全措施齐备。 一、选址： 1. 实验室应选择在清洁安静的场所，远离生活区，锅炉房与交通要道； 2. 实验室应选择在光线充足，通风良好的场所，要与生产加工车间有一定距离； 3. 实验室应选择在方便取样与检验，距离车间较近的工作场所。 二、结构和布局： 应设置细菌与理化检验兼有的综合实验室，主要包括以下三大部分：细菌实验室、理化实验室、办公室。 1. 办公室 2. 理化分析实验室：（或者和细菌检验操作室合并） ①理化分析室（兼作感观检验室） ②仪器室（兼放细菌室显微镜等少量仪器） 3．细菌实验室： ①细菌检验操作室； ②无菌室； ③培养基制作室； ④洗涮消毒室； 一般布局要求如下： 1. 办公室：办公室是化验人员进行原始记录等各项工作的场所，是与非化验室人员交往较多的场所，因此，应设在整体综合化验室的最外层，只需有桌、椅等简单设施即可。 2. 细菌检验操作室（常规操作）细菌检验操作室是细菌培养与检验主要操作室，主要设施是实验台。 对实验台的要求： a.实验台面积一般不小于2.4×1.3m； b.实验台位置应在实验室中心位置，要有充足光线；也可以做边台。
c.实验台两侧安装小盆与水龙头； d.实验台中间设置试剂架，架上装有日光灯与插座； e.实验台材料要以耐热、耐酸碱为宜； f. 实验室围护结构采用彩钢板材料，表面光滑、耐腐蚀、防水，所有缝隙可靠密封，便于清洁消毒，且防震、防火； g. 墙面、吊顶：彩钢板：钢板厚度0.426，15克覆膜。 3. 无菌室：无菌室是处理样品和接种培养的主要工作间，应与细菌检验操作室紧密相连。为满足无菌室无菌要求，无菌间应满足以下布局： a.入口避开走廊，设在细菌检验操作室内； b.与操作室用两道缓冲间隔开； c.无菌室与缓冲间均装有紫外灯，要求每3平米安装30ｗ紫外灯一盏； d.无菌室内设有工作台（中心与边台皆可），紫外灯距工作台面要小于1.5m； e. 微生物室结构应坚固、严密、防尘、光线明亮，地面应光滑，并应有缓冲间，设双层传递窗传递物件； f.门窗应是不锈钢的； g．室内温度18～26℃，相对湿度为45～65%，室内必须保持整洁； h．墙面、吊顶：彩钢板：钢板厚度0.426，15克覆膜； i. 地面采用PVC材料，防渗漏、无接缝、光洁、防滑。 4. 培养基制作室：培养基室是制作、配制微生物培养所需培养基及检验用试剂的场所，其主要设备应为边台与药品橱。 a.边台上要放置电炉，以满足熔化煮沸培养基时用； b.边台材料要耐高热、耐酸碱； c.药橱分门别类存放一些一般药品及试剂； d.危险、易腐易燃有毒有害药品单独设保险柜存放； e.边台上要放天平，以称取药品用。 5. 洗涮消毒室：洗涮消毒室用以消毒洗涮待用与已用之玻璃器皿，培养基及污物，其面积应大于10平米。 为满足洗涮消毒的功能，洗涮消毒室应设有： a.1-2个洗涮池，洗涮池上下水网要畅通；
微生物实验报告 一环境中的微生物的检测和分离纯化 实验目的： 1 学习并掌握无菌操作技术原理和方法 2 学习用稀释涂布法分离微生物 3 认识微生物存在的普遍性，体会无菌操作的原理 实验材料： 1 土样溶液，无菌生理盐水 2 取液器(1000μL一支，100μL一支)，培养箱，培养皿(12个)，无菌有帽试管，三角瓶，无菌涂棒，接种环，1000μL无菌吸头若干，记号笔，酒精灯，火柴，试管架 实验步骤： A 培养基的制备(已提前制备好) B 周围环境中的微生物的检测，在牛肉膏蛋白胨培养基平板上作如下实验 1 取三个平板，用100μL的取液器分别吸取100μL的河水、豆浆、豆奶，均匀加在三个培养基上，并用无菌玻璃涂棒涂布均匀(要多涂几次，时间约1-2分钟，使细菌均匀分布)。 2 再取三个平板，三个同学分别用手指(未洗过)在培养基上涂抹几秒钟，一个同学对应一个平板。 3 再取一个平板，其中一个同学将手用肥皂洗过后，再在培养基上涂抹。 4 再取一个平板，打开皿盖，一个同学对着培养基咳嗽，使口腔中的气流和飞沫落到培养基上。 5 再取一个平板，打开皿盖，在空气中放置10min左右，关上皿盖。 6 将上述9个平板放置在35℃的培养箱中培养24h。 C 土壤中分离微生物 1 采土样，制备土壤稀释液(已准备好) 2 取三个平板，每个培养基上用取液器添加100μL的土壤稀释液，并用无菌玻璃涂棒涂布均匀(要多涂几次，时间约1-2分钟，使细菌均匀分布)。 3 将平板依旧放在35℃的培养箱中培养24h。 D 菌落计数 培养24h后，取出培养平板，算出每个平板上的菌落数量。其中，土样中的微生物含量可用以下式子计算 土壤中的细菌含量(个/g土壤)=菌落平均数×10×稀释倍数 实验结果及数据： 实验结果如附图。
实验一微生物形态观察 一、实验目的 1．巩固显微镜的使用方法，重点练习油镜的使用； 2．认识细菌、放线菌和霉菌的基本形态特征和特殊结构； 3．练习手绘微生物图片。 二、实验原理 1．细菌基本形态 细菌是单细胞生物，一个细胞就是一个个体。细菌的基本形态有 3 种：球状，杆 状和螺旋状，分别称为球菌、杆菌、螺旋菌。球菌根据细胞分裂后排列方式的不同分为 单球菌、双球菌、四联球菌、八叠球菌、链球菌、葡萄球菌等。杆菌分为单杆菌、双杆 菌、链杆菌等，是细菌中种类最多的。螺旋菌分为弧菌和螺菌。 除此之外，还有一些特殊形态的细菌。 2．细菌特殊结构 细菌的特殊结构包括荚膜、鞭毛、菌毛、芽孢等。荚膜是某些细菌向细胞壁表面分泌的一层厚度不定的胶状物质，具有抗干燥、抗吞噬和附着作用。鞭毛是某些细菌表面着生的 1 至数根由细胞内伸出的细长、波曲的丝状体，具有运动功能，在菌体上的着生 位置、数目因菌种而异。菌毛（又称纤毛）是在细菌体表的比鞭毛更细、更短、直硬， 且数量较多的丝状体，与细菌吸附或性结合有关。芽孢又称内生孢子，是某些细菌生长到一定阶段，在菌体内部产生的圆形、椭圆形或圆柱形休眠体，具有极强的抗热、抗辐射、抗化学药物和抗静水压等特性。 3．真菌的结构特征 菌丝是构成真菌营养体的基本单位，是一种管状细丝。可伸长并产生许多分枝，许多分枝的菌丝相互交织在一起，就叫菌丝体。根据菌丝中是否存在隔膜可分为无隔膜菌 丝和有隔膜菌丝。为适应不同的环境条件和更有效地摄取营养满足生长发育地需要，许 多真菌的菌丝可以分化成一些特殊的形态，这些特化的形态称为菌丝变态。比如吸器、 假根、子实体。 4．放线菌的结构特征 放线菌的形态比细菌复杂些，但仍属于单细胞生物。链霉菌是典型的放线菌，其细胞呈丝状分枝，菌丝直径很小，在营养生长阶段，菌丝内无隔，故一般呈多核的细胞状 态。当其孢子落在固体基质表面并发芽后，就不断伸长、分支并以放射状向基质表面和 内层扩展，形成大量色浅、较细的具有吸收营养和排泄代谢废物功能的基内菌丝，同时在其上又不断向空间方向分化出颜色较深、直径较粗的分枝菌丝，这就是气生菌丝。不久，大部分气生菌丝成熟，分化成孢子丝，并通过横隔分裂方式，产生成串的分生孢子。 5．微生物菌落 菌落是在固体培养基上（内）以母细胞为中心的一堆肉眼可见的、有一定形态和构造等特征的子细胞集团。细菌的菌落有其自己的特征，一般呈现湿润、较光滑、较透明、较粘稠、易调取、质地均匀以及菌落正反面或边缘与中央部位的颜色一致等。不同形态、生理类型的细菌，在其菌落形态、构造等特征上也有许多明显的反映。 三、实验器材 普通光学显微镜（Nikon YS-100 ），镜油，镜头纸，擦镜液；
年级：2009 专业：医学检验班级：一班姓名：赵富海学号：2009221792 实验八、细菌的药物敏感试验 【K-B法】 菌种（均为幼龄菌）：金黄色葡萄球菌1.5×108/ml、大肠埃希菌1.5×108/ml 药物纸片：青霉素、庆大霉素、新诺明、环丙沙星 方法： 1.涂菌（棋盘划线法），室温放10min； 2.贴药敏纸片，注意间距（大于24mm）和边距（大于15mm）； 3.置35℃24h判读结果。 结果如图所示： 金黄色葡萄球菌 金黄色葡萄球菌抗菌药物敏感性试验评价结果 实验结论：金黄色葡萄球菌对青霉素耐药，对庆大霉素、新诺明、环丙沙星敏感。 【试管稀释法】 菌种：金黄色葡萄球菌1.5×108/ml、大肠b1.5×108/ml 抗生素：庆大霉素32u/ml 方法： 1.对倍稀释抗生素
2.加菌液0.1ml/管，摇均35℃16—18h 3.判读MIC 试验操作如下图所示： 注意:设立对照管(肉汤对照管,待测菌生长对照管和质控菌生长对照管) 结果判断: 不出现肉眼可见生长的最低药物浓度为该药对该细菌的MIC. 如图： 实验结论：MIC=原药物浓度(32u/ml) ×稀释倍数(1:24)=2u/ml 【联合药敏试验】（示教） 金黄色葡萄球菌大肠b 结果判断： 金黄色葡萄球菌联合药敏试验结果判读：
①青+链=青单+链单→相加作用 ②青+红=青单+红单→相加作用 ③青+万=青单+万单→相加作用 ④青+林＞青单+林单→协同作用 大肠b联合药敏试验结果判读： ①青+红=青单+红单→相加作用 ②青+链=青单+链单→相加作用 ③青+林=青单或林单→无关作用 ④青+南＞青单+南单→协同作用 【实验讨论】 1．K-B法原理 将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上。纸片中所含有的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断地向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度。并与该药对测试菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关关系，即抑菌圈愈大，MIC 愈小。 2. K-B法影响因素 ①培养基的质量，如PH、深度、硬度和表面湿度等； ②药敏纸片的质量，含药量和保存方式； ③接种菌量正确与否是影响结果的重要因素之一，取决于比浊标准的配制，正确使用和保存； ④试验操作质量：接种细菌后贴片时5~15分钟； ⑤孵育条件，温度和时间：培养时间16~18h,不要超过24h。 3．稀释法原理： 以水解酪蛋白（MH）液体培养基将抗生素作不同浓度的稀释，然后种入待测细菌，定量测定抗菌药物对被测菌的最低抑菌浓度(MIC)或最低杀菌浓度（MBC）。 4. 稀释法影响因素：培养基、接种菌量、蛋白质结合率、抗菌药物的配制、结果观察的时间等因素均能影响本试验的结果。 5．抗生素药物敏感性试验（AST）的意义 ①可预测抗生素治疗的效果，既AST试验结果为“敏感”时，治疗可能有效；试验结果为“耐药”时，使用该药物治疗肯定失败； ②指导临床医生选择使用抗生素，AST的结果往往在给予病人经验性治疗24~48h之后，若AST结果为“敏感”，该治疗为有效，若结果为“耐药”，即应更换药物； ③提供所选择药物的依据； ④监测耐药性，分析耐药菌的变迁，掌握耐药菌感染病的流行病学，控制和预防耐药菌感染的发生和流行。 6．通过此次实验掌握纸片扩散法（K-B法）、试管稀释法的原理、操作方法、结果的判读及其临床意义，并掌握联合药敏试验结果的观察、判断。
微生物学实验报告格式 专业学号 姓名 实验一、???培养基的配制和高压蒸汽灭菌 一、实验目的 二、实验原理 三、实验材料（实际用到哪些试剂、材料、玻璃器皿等都要写出，包括数量） 四、实验步骤（按照实际步骤填写,切忌抄袭） 五、注意事项（自己总结实验过程中的注意点） 六、思考题 1、简述培养基的配制原则？ 2.为什么湿热灭菌比干热灭菌法更有效？ 3.高压蒸汽灭菌时，为什么要先将灭菌锅锅内的冷空气完全排尽？ 实验二自生固氮菌的分离纯化 （这是个综合实验，请大家回顾三周来的所有操作步骤，将其整理成连贯完整的一份报告，注意每次实验的衔接，不要把其他的实验项目写进来，但也不要漏写该实验的相关步骤。） 一、实验目的
二、实验原理 三、实验材料（整个综合实验有涉及到的材料都要列出） 四、实验步骤（详叙每周所做的相关步骤） 五、注意事项（自己总结实验过程中的注意点） 六、思考题 1、划线分离时，为什么每次都要将接种环上多余的菌体烧掉？划线为何不能重叠？ 2、如何从自然界中分离自己所需要的纯培养？ 实验三平板培养测数法 一、实验目的 二、实验原理 三、实验材料（实际操作有涉及到的材料都要列出） 四、实验步骤（详叙相关步骤） 五、实验结果 六、注意事项（自己总结实验过程中的注意点） 七、思考题 1、平板菌落计数法中，为什么溶化后的培养基再冷却至45℃左右才能倒平板？
2、本次实验是否成功？如果失败，试分析原因。 实验四简单染色 一、实验目的 二、实验原理 三、实验材料（包括菌种、染料、玻璃器皿） 四、实验步骤 五、实验结果（黏贴染色结果图片并描述所观察到的细菌的显微形态） 六、思考题 1、简单染色要获得成功，有哪些问题需要注意，为什么？ 实验五革兰氏染色 一、实验目的 二、实验原理 三、实验材料（包括菌种、染料、玻璃器皿） 四、实验步骤 五、实验结果（黏贴染色结果图片并判断自己分离到的菌种是G还是G+-？） 六、思考题 1、革兰氏染色要获得成功，有哪些问题需要注意，为什么？
实验四 微生物大小的测定 一、实验目的 1．熟悉目测微尺和物测微尺的使用方法，掌握测定微生物大小的技能。 3．巩固光学显微镜的使用方法 二、实验要求 1．预习有关微生物大小测定等方面的知识； 2．遵守实验室安全制度，听从指导教师安排； 3．认真听讲，不懂就问； 4．完成实验报告 三、实验仪器和材料 目测微尺、物测微尺、光学显微镜、微生物标本片 四、实验原理及方法 1. 目测微尺： 目镜测微尺是一块圆形玻片，在玻片中央把5mm 长度刻成50等分，或把10 mm 长度刻成100等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上(此处正好与物镜放大的中间像重叠)来测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测微尺校正，以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。 2. 物测微尺 中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般将1mm 等分成100格，每格长0.01mm （即10μm ）。它并不直接测细胞的大小，而是用于校正目镜测微尺每格的相对长度。 五、实验步骤及内容 1．目测微尺的标定 两对重合线间镜台测微尺格数10 目镜测微尺每小格长度＝两对重合线间目镜测微尺格数
把物测微尺放在载物台上使刻度朝上。用低倍镜找到物测微尺的刻度，移动物测微尺和目测微尺使两者的第一条线重合，顺着刻度找出另一条重合线。再分别求出高倍镜和油镜下目测微尺每格的长度。 2．菌体大小的测量 将物测微尺取下，换上标本片，选择适当的物镜测量目的物的大小，分别找出菌体的长和宽占目测微尺的格数，再按目测微尺1格的长度算出菌体的长度和宽度。 六、实验结果 1.将目镜测微尺校正结果填入表1 表1 目镜测微尺校正结果 2. 在高倍镜下测量枯草芽孢杆菌大小，将结果填入表2
微生物实验报告模板 淀粉与微生物篇一：实验十分离产淀粉酶的微生物 第十次实验分离产淀粉酶微生物 学院：生命科学学院 专业：生物科学类 年级：20XX级 姓名： 学号：1007040085 20XX年XX月XX日 实验十分离产淀粉酶的微生物 一、实验目的 1、熟悉常用微生物培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）的配制方法。 2、学习各种无菌操作技术，并用此技术进行为微生物稀释分离、划线分离接种。 3、用平板划线法和稀释涂布平板发分离微生物。 4、认识为微生物存在的普遍性，体会无菌操作的重要性。 5、掌握分离产淀粉酶微生物的试验方法和步骤，了解产淀粉酶的微生物种类及形态。 二、实验原理 土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发现有重要应用潜力的微生物的主要菌源。不同土样中各类微生物数量不同，一般土壤中细菌数量最多，其次为放线菌和霉菌。一般
在较干燥，偏碱性、有机质丰富的土壤中放线苗数量较多；酵母菌在一般土壤中的数量较少，而在水果表皮、葡萄园、果园土中数量多些。本次实验从土壤中分离产淀粉酶的微生物，应该取那些富含产淀粉酶的微生物的土样。从复杂的微生物群体中获得只含有一种或某一类型微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常用的方法有 1、简单单细胞挑取法 2、平板分离法和稀释涂布平板法 此次实验采取的是平板分离法和稀释涂布平板法结合，该方法操作简单，普遍用于微生物的分离与纯化。其原理包括： 1)稀释后的细胞悬液图不在平板上可以分离得单个菌株 2)在适合于待分离微生物的生长条件（如营养、酸碱度、温度与氧等）下培养微生物，或加入某种抑制剂造成只利于待分离微生物的生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。 3)微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得纯培养。获得单菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等方法完成。 以淀粉作为惟一碳源的培养基培养未分离细菌，能产淀粉酶的细菌能生长，且菌落周围出现透明圈（淀粉不透明，被消化后变透明），则产淀粉酶微生物被分离出来。本实验
微生物实验注意事项 一、无菌操作要求 1.接种细菌时必须穿工作服、戴工作帽。 2.进行接种食品样品时，必须穿专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用。 应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75％酒精棉球将手擦干净。 3.接种食品样品时， 4.进行接种所用的吸管，平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼三次后使用。 5.从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不得触及试管或平皿边。 6.接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒。 7.接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到环和针与杆的连接处，接种结核菌和烈性菌的接种环应在沸水中煮沸5min，再经火焰烧灼。 8.吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。 二、无菌间使用要求 1.无菌间通向外面的窗户应为双层玻璃，并要密封，不得随意打开，并设有与无菌间大小相应的缓冲间及推拉门，另设有 0.5- 0.7m2的小窗，以备进入无菌间后传递物品。
2.无菌间内应保持清洁，工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒，擦拭工作台面，不得存放与实验无关的物品。 打开紫外灯，如采用室内悬吊紫外灯消毒时，需30W 3.无菌间使用前后应将门关紧，紫外灯，距离在 1.0m处，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻擦拭，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响。 4.处理和接种食品标本时，进入无菌间操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。 5.在无菌间内如需要安装空调时，则应有过滤装置 三、消毒灭菌要求微生物检测用的玻璃器皿、金属用具及培养基、被污染和接种的培养物等，必须经灭菌后方能使用。 （一）干热和湿热高压蒸气锅灭菌方法 1．灭菌前准备（1）所有需要灭菌的物品首先应清洗晾干，玻璃器皿如吸管、平皿用纸包装严密，如用金属筒应将上面通气孔打开。 （2）装培养基的三角瓶塞，用纸包好，试管盖好盖，注射器须将管芯抽出，用纱布包好。 2．装放（1）干热灭菌器： 装放物品不可过挤，且不能接触箱的四壁。 （2）大型高压蒸气锅： 放置灭菌物品分别包扎好，直接放入消毒筒内，物品之间不能过挤。 3．设备检查（1）检查门的开关是否灵活，橡皮圈有无损坏，是否平整。
实验一、微生物得简单染色思考题 1油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应特别注意些什么? 答:油镜在使用时必须在载玻片与物镜之间滴加镜头油。油镜使用过程中要注意两点：(１）、使用后镜头得清洁：镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度，用完油镜必须进行“三擦”(观察完毕,上悬镜筒,先用擦镜纸擦去镜头上得油,然后再用擦镜纸沾取少量二甲苯（或者乙醇乙醚溶液)擦去残留得油,最后用擦镜纸擦去残留得二甲苯，后将镜体全部复原）。 (2)、、观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜,最后用油镜。当目视接目镜时,特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器,以免压碎玻片或损伤镜面. 2、使用油镜时,为什么必须用镜头油？ 答：在使用普通显微镜时，当光线由反光镜通过玻片与镜头之间得空气时，由于空气与玻片得密度不同,使光线受到曲折,发生散射，降低了视野得照明度。若中间得介质就是一层油（其折射率与玻片得相近）,则几乎不发生折射,增加了视野得进光量，从而使物象更加清晰。3、镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不就是直接用高倍镜或油镜观察？ 答：低倍镜视野比较大，能瞧到得范围大，容易找到观察得目标,然后在用放大倍数高得高倍镜或油镜有目得得观察。 实验二、革兰氏染色 (１）为什么必须用培养2４ｈ以内得菌体进行革兰氏染色？ 答：24h以内得菌体处于活跃生长期，菌体细胞壁具有典型特征，而处于老龄得革兰氏阳性细菌壁结构开始发生变化，染色时会被染成红色而造成假阴性 （2）要得到正确得革兰氏染色结果，必须注意哪些操作？哪一步就是关键步骤?为什么? 答：应注意如下几点： 其一,选用活跃生长期菌种染色,老龄得革兰氏阳性细菌会被染成红色而造成假阴性； 其二，涂片不宜过厚,以免脱色不完全造成假阳性; 其三,脱色就是革兰氏染色就是否成功得关键，脱色不够造成假阳性,脱色过度造成假阴性（3）当您对未知菌进行革兰氏染色时，怎样保证操作正确，结果可靠？ 答：当要确证未知菌得革兰氏反应时,可用已知菌进行混合涂片,使二者染色条件保持一致,如果已知菌得结果与预期相符，则证明操作操作正确，结果可靠。 实验三、微生物得显微镜直接计数法 1、在显微镜下直接测定微生物数量有什么优缺点? 答:1）优点:直观、快速、操作简单。 2）缺点: 不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌得计数; 需要相对高得细菌浓度； 个体小得细菌在显微镜下难以观察； 实验四、微生物大小得测定 1、在不改变目镜与目镜测微尺，而改用不同放大倍数得物镜来测定同一细菌得大小时,其测定结果就是否相同?为什么？ 答:相同；目镜测微尺就是一块圆形玻片,其中央刻有精确等分得刻度，有把５毫米刻成为50等分或把10毫米长度刻成100等分.测量时,将其放在接目镜中得隔板上来测量经显微镜放大后得细胞物象。由于在不改变目镜与目镜测微尺，而改用不同放大倍数得物镜来测定同一细菌得大小时，物象得放大倍数与每小格目镜测微尺所代表得长度在变化比例上就是同步得，
微生物学实验报告 实验一普通光学显微镜的使用及细菌染色与形态观察 第一部分：显微镜的使用 一、目的要求 1．熟悉普通光学显微镜的构造、油镜的使用原理和显微镜的维护方法。 2．学会正确使用油镜观察细菌的基本形态和特殊构造。 3．了解各种显微镜的主要特征。 二、实验原理 （一）光学显微镜的构造 微生物实验室中最常用的是普通光学显微镜，它的构造可分为机械部分和光学部分。 1、机械部分 普通复式光学显微镜的机械部分通常包括以下几个部分：目镜、镜筒、基座回转器、物镜、载物台、光圈、聚光器、光源、镜臂、细调节器、粗调节器等。 2、光学部分：目镜、物镜、聚光器、光圈、光源。 （二）放大倍数 标本首先经物镜放大，在目镜的焦距平面上形成一个实像，再经过目镜放大成最终的虚像。总的放大倍数是物镜放大倍数与目镜放大倍数的乘积。 物镜的放大倍数愈大，其工作距离（物镜镜头到标本片之间的距离）愈短，这时光圈就要打开得愈大。 显微镜的性能受物镜的分辨距离或分辨力所限制。分辨距离即透镜所能分辨的两个物点之间的最小距离，分辨距离愈小，透镜的分辨力愈高，物像也就愈清晰。因此常以分辨距离来衡量显微镜的分辨力。 R=0.61λ/N.A 式中：R-----分辨距离； λ------作用光的波长； N.A------数值口径。 一些介质的折射率
介质折射率 空气 水玻璃香柏油 1 13 55 1.56 三、实验内容 （一）材料：显微镜，香柏油，擦镜纸。 （二）方法： 细菌很小，须使用油镜方可观察到。油镜是显微镜上最重要的部件之一，观察时与玻片非常接近，稍不小心即可压碎玻片，更严重的是损坏镜头，故必须极其仔细地学习油镜的使用方法： 1、为使低倍镜取得最适之光源，可将低倍镜头调节到离载物台约1cm的高度，将聚光器提高，光圈完全打开，然后调节电压旋钮至视野最合适。 2、滴一滴香柏油，固定于载物台上，用推动器调节到载物台正中。在双目侧视下，下旋粗调节器，使油镜头浸入油中几乎与标本片相接触。然后眼睛从目镜观察（如光线不足，可适当增大电源电压），徐徐上旋粗调节器至看到模糊物像之后，再用细调节器调节以使物像清晰。如镜头已离开油面还未看到物像，则再重新操作。 3、更换标本时应先提高油镜头，再更换玻片，切勿随意移动显微镜的位置。 4、油镜观察完毕后，按“显微镜保护”中（6）项处理。 5、最后将油镜各部分还原，聚光器下降，反光镜垂直于镜座，镜头转成八字形， 以免与聚光器发生碰撞。 四、思考题 1、使用显微镜时为何调节下列构造？反光镜，光圈，聚光器，粗调节器，细调节器，镜头回转器。 答：聚光器的位置之升降可影响视野的明亮度，上升则视野明亮，下降则光线减弱。光圈的放大或缩小也可控制视野明亮程度。粗调节器和细调节器均是调节焦距的装置。镜头回转器为装置物镜和转换物镜之用。 2、使用不同放大倍数的物镜时，工作距离与光圈的关系。如何利用这一原理用好显微镜？ 答：物镜的放大倍数愈大，其工作距离（物镜镜头到标本片之间的距离）愈短。标本首先经物镜放大，在目镜的焦距平面上形成一个实像，再经过目镜放大成最终的虚像。总的放大倍数是物镜放大倍数与目镜放大倍数的乘积。 3、为何要选用与玻璃折射率相似的香柏油作为油镜的介质？油镜的原理是什么？ 答：香柏油只在使用油镜头时（100倍物镜）使用，因为当镜与装片之间的介质为空气时，由于空气（n= 1.52）的折射率不同，光线会发生折射，不仅使进入物镜的光线减少，降低了视野的照明度，而且会减少镜口角。当以香柏油（n=1.515）为介质时，由于它的折射率与玻璃相近，光线经过载玻片后可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射，不仅增加了视野的照明度，更重要的是通过增加数值孔径达到提高分辨率的目的。可见光的波长平均为0.55μm。当使用数值孔径为0.65的高倍镜时，它能辨别两点之间的距离为0.42μm；而使用数值孔径为1.25的