遗传HEREDITAS(Beijing) 28(11): 1411~1420, 2006研究报告DOI: 10.1360/yc-006-1411
GmHSFA1基因克隆及其过量表达提高
转基因大豆的耐热性
陈晓军1,2, 叶春江1,3, 吕慧颖1, 徐民新1, 李葳1,
张利明1,王超1, 罗淑萍2, 朱保葛1
(1.中国科学院遗传与发育生物学研究所, 北京 100101; 2.新疆农业大学农学院, 乌鲁木齐 830052;
3.济南大学化工学院生物技术系, 济南 250022)
摘要: 热激转录因子在调节植物对逆境胁迫应答和热激蛋白基因表达方面起重要作用。采用生物信息学和比较基因组学方法结合RACE技术从大豆基因组中克隆到一个新的热激转录因子基因GmHsfA1, 其cDNA全长1 781 bp, 包含1个1 533 bp的开放阅读框, 编码含有510个氨基酸残基的蛋白质(GenBank登录号为AY458843)。与其他转录因子的分子结构相似,GmHSFA1也含有4个典型的结构功能域—DNA结合域、寡聚域、核定位信号和C端激活域。
BLAST分析表明, GmHSFA1与其同源性最高的番茄热激转录因子LpHSFA1之间的氨基酸序列相似性为52.46%。
RT-PCR、Northern和遗传转化结果显示: 1)GmHsfA1在大豆的不同组织中呈现组成型表达模式; 2)常温下转基因大豆植株的GmHsfA1表达水平明显高于非转基因对照; 3)GmHsfA1的过量表达激活了转基因大豆植株中热激蛋白基因GmHsp22在非诱导条件下的转录, 并加强了高温胁迫下另2个热激蛋白基因GmHsp23和GmHsp70的表达; 4)转GmHsfA1大豆植株的耐热温度(达52℃)明显高于非转基因植株。上述结果说明, GmHsfA1的过量表达激活或促进其下游3个热激蛋白基因的转录或表达, 明显提高了转基因大豆植株的耐热能力。
关键词: 大豆; 热激转录因子A1(HSFA1); 转基因; 热胁迫; 过量表达; 耐热性
中图分类号:Q943.2 文献标识码: A 文章编号: 0253-9772(2006)11-1411-10 Cloning of GmHSFA1 Gene and its Overexpression Leading to En-hancement of Heat Tolerance in Transgenic Soybean
CHEN Xiao-Jun1,2, YE Chun-Jiang1,3, Lü Hui-Ying1, XU Min-Xin1, LI Wei1
ZHANG Li-Ming1,WANG Chao1, LUO Shu-Ping2, ZHU Bao-Ge1
(1.Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China; 2. College of Agronomy, XinJi-
ang Agricultural University, Urmqi 830052, China; 3. BioTech Department, Chemistry-Engineering College, Jinan University, Jinan
250022, China)
Abstract: Heat shock transcription factors (HSFs) are important in regulating heat stress response by mediating expression of heat shock protein (HSP) genes in various plant species. In the present study, a novel GmHSFA1 with an ORF of 1 533 bp (full-length cDNA sequence of 1 781 bp) was cloned from soybean genome via comparative genomic
收稿日期: 2006-02-09; 修回日期: 2006-06-14
基金项目:国家自然科学基金项目、国家重点基础研究发展规划(973计划)项目(编号: 2002CB111304)和国家科技攻关项目(编号: 2004BA525B06)[Supported by the National Natural Science Foundation of China, the Key Project of Chinese National Programs for Funda-mental Research and Development (973 Program) (No.2002CB111304), the National Sci-Tech Project of China(No.2004BA525B06)]
作者简介:陈晓军(1977-), 男, 硕士, 研究方向: 植物基因工程
通讯作者:朱保葛(1960-), 男, 博士, 研究员, 博士生导师, 研究方向:植物遗传学与分子育种。E-mail: bgzhu@https://www.doczj.com/doc/d510946383.html,
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approach and RACE (rapid amplification of cDNA ends). This gene encodes 510 amino acids consisting of a protein of
56.2 kDa (GenBank accession number: AY458843). Similar to other HSFs, GmHSFA1 has the basic modular structure
including DBD, OD, NLS, and CTAD. BLAST analysis revealed the identity of 52.46% between amino acid sequences between GmHSFA1 and LpHSFA1 that has the highest similarity to GmHSFA1 in all HSFA1s in various plant species.
The results from RT-PCR, Northern blotting, and transformation showed: 1) GmHsfA1 exhibited the constitutive expression patterns in different tissues of soybean; 2) The expression level of GmHsfA1 in transgenic plants was notably higher than that in non-transgenic plants; 3) Overexpression of GmHsfA1 activated transcription of GmHSP22 in transgenic plants under normal conditions and enhanced obviously expressions of GmHSP23 and GmHSP70 in transgenic plants under heat stress conditions; 4) Heat tolerant temperature (as high as 52℃) of transgenic plants was remarkably higher than that of non-transgenic plants. These results preliminarily proved that the overexpression of GmHsfA1 possibly led to the notable enhancement of heat-tolerant level of transgenic plants by mediating the activation of transcription or improvement of expression of some GmHSPs in the GmHsfA1’s downstream in transgenic plants, suggesting GmHSFA1 is a novel and functional heat shock transcription factor of soybean.
Key words: Glycine max (L.) Merr; heat shock transcription factor (HSF); transgene; heat stress; overexpression; heat tolerance
热激转录因子(Heat stress transcription factor, HSF)是生物体在热激和其他胁迫条件下基因转录激活信号传导通路中的最后成员, 即直接启动下游热激蛋白基因的表达[1~5]。HSF在调节热激蛋白(Heat shock protein, HSP)基因表达和传递逆境胁迫尤其热胁迫信息以及提高植物耐逆性等方面起着重要作用。HSF是通过结合到热激元件(Heat stress elements, HSE)上激活热胁迫反应的基因, 从而诱导热激反应。
自20世纪80年代后期果蝇(Drosophila melanogaster)HSF基因被首先克隆以来, 粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、鸡、番茄、人、水稻、大豆、小鼠、黑猩猩(Pan troglodytes)、海藻(Guillardia theta)、非洲爪蟾(Xenopus Laevis)等物种的HSF基因被相继克隆。HSF蛋白的分子结构具有4个代表性的重要结构功能域: DNA结合域(DNA bind-ing Domain, DBD)、寡聚域(Oligmerization Domain, OD)、核定位信号(Nuclear Localization Signal, NLS)及C端激活域(C-terminal Activation Domain, CTAD), 其中DBD高度保守, 而CTAD的保守性最差[6]。
随着拟南芥基因组测序的完成, 我们能够通过序列比对的手段全面挖掘植物中的热激转录因子家族成员[3]。生物信息学的发展为我们发现和研究新的大豆热激转录因子提供了可能。据报道[6], 拟南芥中发现了21个HSFs; 番茄中发现16种以上的HSFs, 其中HsfA1的克隆和功能研究的比较深入, 认为它在番茄热激响应过程中起主要作用。大豆中也发现了15种以上HSFs的EST序列, 已经克隆了3个大豆HSF基因(GmHsfB4a、GmHsfA2和GmHsfB1)的全长cDNA序列, 但并不包含A1类的HSFs。本研究旨在克隆大豆的HSF A1基因—GmHsfA1, 并研究其表达模式以及对转基因大豆耐热性的作用, 为相关的基础研究和实际应用创造条件。
1 材料和方法
1.1材料
1.1.1 植物材料及菌株
实验所用的转化受体材料是本室培育的国审大豆品种科新3号。pBI121-GmHsfA1载体为本实验室构建, 大肠杆菌DH5α、根癌农杆菌LBA4404及植物表达双元载体pCAMBIA2300均由本实验室保存。
1.1.2 主要试剂
SMARTRACE TM cDNA 扩增试剂盒购于BD生物有限公司, TRIZOL试剂盒购于北京博大泰克生物有限公司, pGEM-T载体和RT-PCR试剂盒购于Promega公司。T4DNA连接酶和PCR试剂盒均购自大连宝生物公司, GA、6-BA、IBA、头孢霉素Cef、硫酸卡那霉素(Kana)和乙酰丁香酮(AS)等购于北京博晋生物技术公司。Asp和Glu购于经科宏达生物有限公司, DNA分子量Marker DL2000购于天为时代生物有限责任公司, M-GeneRuler TM 100 bp ladder plus购于上海生物工程有限责任公司。
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1.2 方法
1.2.1 GmHSFA1基因的克隆
采用生物信息学和比较基因组学的方法结合RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术克隆大豆热激转录因子基因GmHsfA1。
以LpHSFA1的蛋白序列为QUERY, 用tBLASTn 程序对大豆的EST 数据库进行搜索以获得可能的侯选序列。同时以GmHsfA1和HSF为关键词对大豆EST 数据库进行数据搜索, 以期获得尽可能多的侯选序列。搜索得到的每个EST序列都与LpHsfA1序列进行同源性比较分析, 选取高度同源的几个大豆EST序列进行拼接, 通过RACE得到GmHsfA1的3′和5′端产物经胶回收纯化克隆到T-easy 载体(购自Promega, USA)中, 由上海博亚公司测序并拼接得到该基因的全长cDNA序列。依据cDNA的两端序列设计特异引物, 从科丰1号大豆基因组中扩增全长cDNA并测序获得全长编码序列及其所编码的氨基酸序列。
1.2.1.1 总RNA提取以0.1 g大豆叶片组织用TRIZOL试剂(BioDev)提取总RNA, 并用无 RNase的DNaseI (华美生物技术公司)在室温条件下消化15 min(反应介质: 20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.4), 2 mmol/L MgCl2 and 50 mmol/L KCl)。通过向反应液中加入终浓度为2.5 mmol/L 的EDTA并在65℃保温10 min灭活DNaseI。
1.2.1.2 cDNA的合成以Invitrogen 公司的反转录试剂盒SuperScript III Kit 进行反转录, 程序如下: 1) 在1个0.5 mL试管中加入如下成分: 1 μL olgo(dT)18;
10 μL RNA样品; 1 μL 10 mmol/L dNTP 混合物; 2) 将上述混合物于65℃加热 5 min, 并于冰上迅速冷却。短暂离心以收集内含物于管底, 并加入4 μL 5X 第一链Buffer 2 μL 0.1 mol/L DTT, 混合内含物并于42℃保温2 min; 3) 加入1 μL(200 U)的SuperScript TM II RT, 以加样器混合均匀, 于50℃保温90 min; 4) 70℃保温5 min, 以灭活反转录酶活性; 5) 加入适量TE稀释, 即可作为PCR反应的模板。
1.2.1.3 RACE 根据大豆EST数据库中不连续HsfA1 cDNA片段的EST序列设计上游和下游引物, 用SMARTRACE TM cDNA 扩增试剂盒扩增GmHsfA1的3′和5′末端。GSPs (基因特异性引物) 和 NGSPs (巢式基因特异性引物)的引物序列如下: 5′-RACE: GSP1, 5′-TGAACAGCCTTTGCAAGGAATGACAT- C-3′; NGSP1, 5′-CTCTGCAGCTGGTTATCAGTAG- CCTG-3′; 3′-RACE:GSP2, 5′-GCGCCTTCAAGGAA- TGGAGCAACGACAGC-3′; NGSP2, 5′-GATGTCAT- TCCTTGCAAAGGCTGTTCA-3′。引物由北京奥科生物公司合成, 反应程序按照试剂盒的说明进行。
1.2.2 GmHsfA1的表达模式分析
用定量RT-PCR方法分析GmHsfA1在大豆不同组织的表达。按照TRIZOL试剂盒操作说明分别从大豆根、茎、幼叶、花及花荚(含幼胚)等组织中提取总RNA, 以上述同样的方法逆转录合成各组织的cDNA作为PCR反应的模板。根据GmHsfA1的一段cDNA保守序列设计特异扩增的正、反向引物, 正向引物序列为5′-CAAATTGTTAAATATCAACC-3′, 反向引物序列为5′-TAATAATGTACACTTTC- ATA-3′。用GmActin(Accession No. V00450)定量模板cDNA的浓度, 正、反向引物序列分别为5′-GGTGA- TGGTGTGAGTCACACTGTACC-3′和5′-GTGGAC- AATGGATGGGCCAGACTC-3′。
PCR反应在Eppendorf型扩增仪上进行, 反应总体积为25 μL, 含有cDNA 200 ng, 正向引物10 pmol/L, 反向引物10 pmol/L, Taq DNA聚合酶(TaKaRa公司)1 U, 2.5 μL 10×缓冲液(200 mmol/L Tris-HCl, pH 8.8, 100 mmol/L KCl, 100 mmol/L (NH4)2SO4, 20 mmol/L MgSO4, 1% Triton × 100, 1 mg/mL nuclease-free BSA 和0.2 mmol/L dNTPs)。扩增程序为94℃预变性3 min, 然后进入循环: 94℃变性30 s, 60℃复性30 s, 72℃延伸90 s, 共30个循环, 最后72℃延伸5 min。PCR产物通过0.8%琼脂糖电泳分离。
1.2.3 植物表达载体的构建
用限制性内切酶SmaⅠ和SacⅠ酶切载体pBI121, 以引物P1:CCCGGGATGGACGGAAGAGC和P2:TTAAGAAAACCGTAGTCT(含有SmaⅠ识别位点CCCGGG和SacⅠ识别位点GAGCTC)进行PCR扩增得到GmHsfA1的全长ORF, 用T4DNA连接酶进行连接, 将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞, 在LB平板上筛选具有卡那霉素抗性的菌落, 小量提取质粒进行PCR和酶切鉴定, 得到含有植物表达载体pBI121-35S-GmHsfA1的阳性菌落。提取阳性菌落中的质粒, 电激转化农杆菌菌株LBA4404感受态细胞, 构建成pCAMBIA2300- GmHsfA1载体, 用于转化大豆材料。
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1.2.4 大豆遗传转化
用构建的植物表达载体转化农杆菌LBA4404, 在含有链霉素25 mg/L和卡那霉素50 mg/L的YEB培养基上进行筛选, 挑取单克隆提取质粒进行酶切鉴定, 得到阳性克隆, 4℃保存。从4℃保存的平板上挑取含有表达载体的农杆菌单菌落接入含有50 mg/L 卡那霉素、25 mg/L利福平、25 mg/L链霉素的YEB 培养基中, 28℃、200 r/min振荡培养12~14 h左右至对数期(OD600=0.8), 4℃下8 000 r/min离心10 min弃上清液, 用同体积的液体分化培养基(MS+1.6 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA pH5.4), 添加100 μmol/L AS重悬后备用。
参照文献[7]的转化方法并加以修改, 并按文献[8]的饱和次氯酸钠-浓盐酸熏蒸法进行种子表面消毒。消毒的科新3号大豆种子在发芽培养基B5(pH 5.8)上发芽5~6 d, 取无菌实生苗的子叶节为外植体, 用解剖刀在子叶节部位划网状裂纹, 将其浸没在农杆菌重悬液中侵染30 min后接种于固体培养基(B5+1.67 mg/L 6-BA+1 mg/mL GA+100 mmol/L pH5.4) 暗处共培养3d后, 转入诱导丛生芽培养基MS+1.6 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA; 长出丛生芽后, 将其接种于筛选培养基(B5+1.67 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA+50 mg/L kan+500 mg/L Cef); 筛选的不定芽长至0.5~1 cm时接于伸长培养基(B5 +50 mg/L Glu+50 mg/L Asp+0.5 mg/L GA+30 mg/L Kan+500 mg/L Cef); 约2 w后一些丛生芽抽出主茎并长成3~4 cm的小苗, 将其移入生根培养基(B5+ 50 mg/L Glu +0.5 mg/L Asp +1.5 mg/L IBA), 待长出健壮的根系后移栽到花盆中。
1.2.5 转化植株的分子检测
以CaMV35S启动子的一段保守序列设计特异引物或制备分子探针, 分别提取转基因大豆植株与非转基因的同品种对照植株的叶片基因组DNA[9], 先进行PCR初步检测, 表现阳性反应的转基因植株再进行Southern杂交检测, 采用限制性内切酶Eco R I对每株转基因植株的50 μg基因组DNA进行酶切, 再与标记探针杂交, 以检验外源的GmHsfA1在受体大豆基因组的整合情况。PCR分析和Southern杂交按照《分子克隆(第三版)》标准程序进行。
1.2.6 转基因植株中GmHsfA1和3个内源热激蛋白
基因表达的Northern blot或RT-PCR检测在人工气候箱(型号: NK system biotron LH-200- R)中将转基因大豆植株与非转基因对照植株(3周龄幼苗)分别在常温(28℃)下培养和高温(45℃)诱导处理各3 h, 分别提取转GmHsfA1的大豆植株与非转基因对照植株的叶片总RNA, 并将高温处理组和常温对照组的一部分转基因植株和非转基因植株的叶片总RNA逆转录合成cDNA供RT-PCR分析之用, 另一部分未进行逆转录的叶片总RNA用于Northern blot 分析。分别以GmHsfA1、GmHsp22、GmHsp23以及GmHsp70的一段cDNA保守序列制备探针或设计特异引物, 通过Northern blot或RT-PCR方法检测转基因大豆植株中GmHsfA1和3个内源热激蛋白基因GmHsp22、GmHsp23以及GmHsp70的表达情况。Northern blot分析参照《分子克隆(第三版)》的标准程序进行, RT-PCR方法同上。
1.2.7 热胁迫实验及转基因大豆的耐热性分析
为了验证转基因大豆株系中GmHsfA1的过量表达是否提高了耐热性, 将GmHsfA1过量表达的T0代转基因植株与非转基因对照植株放在人工气候箱中进行高温胁迫(热激)实验。设置4个高温点各持续处理40 min, 分别为38℃ 40 min、42℃ 40 min、48℃40 min和52℃ 40 min, 以28℃常温处理作对照, 并将热胁迫处理后的植株放回到28℃常温条件下恢复60 min, 以观察植株叶片热胁迫症状的复原情况。在处理过程中的不同时间点拍照, 以观察比较转基因株系和非转基因对照植株对不同高温胁迫的反应情况。此外, 还对2个T1代转基因株系的22株进行高温胁迫诱导实验, 以检验前一代(T0)材料的耐热性及其遗传性。
2 结果与分析
2.1 GmHsfA1的全长cDNA序列及其编码蛋白序列
应用巢式引物NGSPs和NUP所进行RACE的第二轮PCR反应对于目标基因的特异性扩增是十分必要的, 第二轮PCR反应所获得的3′和5′端产物, 并回收测序。根据3′和5′末端序列对与番茄HsfA1高度同源的4个大豆EST序列(CA938396、BI969567、AW569138和AW569256)进行拼接, 得到了该基因的全长cDNA序列; 依据cDNA的两端序列设计特异引物, 从大豆基因组中扩增了全长cDNA并测序获得了1781 bp的全长编码序列(GenBank登录号为
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AY458843), 该cDNA包括1 533 bp的开放阅读框、141 bp的5′非翻译区(5′UTR)以及107 bp的3′UTR。在5′UTR的+102位置有一个终止密码子TAG, 且与编码区的阅读框一致, 说明不存在其他更靠前的起始密码子, 表明所克隆的片段是全长cDNA, 它编码一段含有510个氨基酸残基的蛋白质。
2.2 GmHSFA1与LpHSFA1的同源性分析及其结
构功能域
BLAST结果显示, 在拟南芥、番茄和大豆等植物的HSFA1比对中(图1), 大豆HSFA1与番茄HSFA1之间的氨基酸同源性最高(52.46%), 二者的DBD同源性高达90.43%, 说明它们属于同一类热激转录因子。但二者之间存在多处差别,如在GmHSFA1 OD HR-A的N端前有19个氨基酸, 而LpHSFA1的相应区域有30个氨基酸。HR-B功能域的氨基酸个数在GmHSFA1和LpHSFA1之间完全保守, 只是在氨基酸组成上有4处不同(自GmHSFA1 的N端157位Arg→Ile、178位Ser→Ala、185位Gly→Ser和195位Leu→Gln)。GmHSFA1和LpHSFA1的CTAD结构域之间的保守性最差。说明GmHSFA1是一个新的热激转录因子。
2.3 GmHsfA1的表达模式
RT-PCR结果表明, 在正常温度条件下GmHsfA1在我们所检测的所有器官/组织如根、茎、幼叶、花、花荚离层以及幼荚等都有明显的表达(图2), 说明该热激转录因子基因在大豆多种器官/组织中都呈现组成型表达模式。
2.4遗传转化
采用前述的农杆菌介导的遗传转化方法将GmHsfA1转入科新3号大豆受体, 转化实验过程主要包括以下环节: 子叶节创伤处丛生芽的诱导与Kana筛选(图3:a)、Kana抗性芽主茎伸长(图3:b)、抗性植株生根(图3:c)以及转化植株移栽成活(图3:d)等, 共得到8株Kana抗性转化植株。
图1大豆A1热激转录因子(GmHSFA1)与番茄和拟南芥的A1热激转录因子(LpHSFA1和AtHSFA1)之
间的氨基酸序列比较
黑色区域表示氨基酸序列同源性达到100%; 蓝绿色区域表示同源性在50%以上。
Fig.1 Comparison of amino acid sequences between GmHSFA1 from soybean and LpHSFA1 from tomato (CAA47869),
AtHSFA1 from Arabidopsis (AAG60176)
Black regions denote the amino acid sequence similarity of 100%; Blue-green regions denote the similarity of over 50%.
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图2 RT-PCR检测不同大豆组织中GmHsfA1的表达情况M: DNA 分子量marker(DL2000); 1: 花; 2: 花荚离层; 3: 幼荚; 4: 根;
5: 茎; 6: 幼叶; 7: 水(对照)。
Fig. 2 RT-PCR Examination of the expressions of GmHsfA1 in
different tissues of soybean plants
M: DL2000 DNA marker; 1: Flower; 2: Abscission zone of flower and pod; 3: Young pod; 4: Root; 5: Stem; 6: Young leaf; 7: Water(ck). 2.5转基因植株的分子检测
获得的8株转化植株经PCR检测发现2株呈阳性反应(图略),对这2株转基因植株进一步进行Southern检测。结果显示, 2株PCR-阳性的植株均能检测到特异杂交带(图4), 而2株非转基因对照植株未检测到特异带(图4)。说明外源的GmHsfA1已经整合到受体大豆品种的基因组中。2.6转基因大豆植株中GmHsfA1及3个内源热激蛋
白基因的表达分析
Northern blot分析表明, 常温条件下T0代转基因植株的GmHsfA1表达量显著高于非转基因对照植株(图5:A); 在高温胁迫下转基因植株的内源GmHsp70的表达量比非转基因植株高出10倍以上(图5: B), 常温条件下转基因植株中的GmHsp70有明显的表达(图5: C, b), 而它在非转基因植株中基本不表达(图5: C, a)。RT-PCR结果显示, 在常温条件下, 大豆内源GmHsp22在非转基因植株中不表达, 而在转基因植株中有明显的表达(图6: A); 但在热胁迫下该内源基因在转基因植株和非转基因植株中的表达量没有明显变化(图6: A)。非转基因植株中内源GmHsp23在常温和高温下的表达水平差异不明显(图6: B), 而转基因植株中的该基因在热胁迫下的表达量高于常温处理(图6: C)。上述结果说明, 转基因植株中外源GmHsfA1的过量表达很可能导致了常温下大豆内源GmHsp22和GmHsp70的激活和高温胁迫下内源GmHsp23和GmHsp70的过量表达, 暗示GmHsfA1对不同的热激蛋白基因具有不同的调控作用。
图3 农杆菌介导大豆遗传转化
a: 丛生芽的诱导与Kana筛选; b: Kana抗性芽主茎伸长; c: 转化植株生根; d: 转化植株移栽成活。
Fig.3 Soybean transformation mediated by Agrobacterium
a: Kana-screened and induced shoots; b: main stem elongating of Kana-resistant shoots; c: rooting of transgenic plants;
d: transplanted transgenic plants.
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图4 转基因植株的Southern blot检测
a和b为转基因植株; c和d为非转基因植株。
Fig. 4 Southern bloting analysis of transgenic plants and
non-transgenic plants
a, b: Transgenic plants; c, d: Non- transgenic plants.
2.7转基因大豆植株的耐热性检测
为了检验GmHsfA1过量表达的植株是否提高了耐热性, 将上述GmHsfA1过量表达的转基因植株(T0代)与非转基因对照植株进行4个高温点的热胁迫(热激)诱导实验。结果表明, 在28℃常温培养60 min, 所有供试植株的叶片都是平展的(图7: A); 当温度升至38℃持续40 min时, 仅发现非转基因植株的顶部嫩叶片开始内缩; 当温度升至42℃并持续40 min时, 非转基因植株的上部叶片内缩明显(图7: B, 左), 而转基因植株的叶片仍然平展(图7: B, 右); 当温度升至48℃并持续40 min时, 非转基因植株的上部叶片开始萎焉, 而转基因植株的叶片仍未观察到明显变化; 当温度升至52℃并持续40 min时, 非转基因植株的上部叶片严重萎焉并卷曲(图7: C, 左), 这时只发现转基因植株顶部复叶的一片叶下垂(图7: C, 右)。当温度升至55℃并持续30 min以后, 两类植株叶片症状与52℃的基本相似(图略)。将处理温度逐渐降至28℃常温并持续60 min后发现, 转基因植株顶部复叶的那片下垂叶片略有上升, 呈回复现象(图7: D, 左), 而非转基因植株上部叶片的萎焉程度并未减轻(图7: D, 右)。结果显示, GmHsfA1过量表达的转基因植株对高温的敏感性明显低于同品种的非转基因对照植株。
图5 转基因植株和非转基因植株中GmHsfA1和GmHsp70表达的Northern blotting分析
A:常温下(28℃/3小时)转基因植株(b)和非转基因植株(a)的GmHsfA1表达水平; B和C:分别为高温胁迫(45℃/3小时)和常温(28℃/3小时)条件下
转基因植株(b)和非转基因植株(a)中GmHsp70的表达水平。
Fig. 5 Northern blotting analysis of expressions of GmHsfA1 and GmHsp70 from transgenic and non-transgenic plants of soybean A: the expression levels of GmHsfA1 in transgenic plants (b) and non-transgenic plants (a) at normal temperature (28℃for 3 h); B, C: the expression levels of GmHsp70 in transgenic plants (b) and non-transgenic plants (a) at heat stress (45℃for 3 h) and normal temperature (28℃for 3 h), respec-
tively.
图6 转基因植株(2)和非转基因植株(1)中内源热激蛋白基因GmHsp22(A)和GmHsp23(B, C)的RT-PCR检测
HS: 热胁迫(45℃处理3小时); CK: 常温处理(28℃处理3小时)。
Fig.6 RT-PCR examination of expressions of endogenesis GmHsp22(A) and GmHsp23(B, C) from transgenic
(2) and non-transgenic (1) plants
HS: Heat stress induction (45℃ for 3 h); CK: Normal temperature treatment (28℃for 3 h).
1418 遗 传HEREDITAS (Beijing ) 2006 28卷
对T 1代3个转基因株系的36株(包括6号株系13株、11号株系14株和24号株系9株)在高温胁迫下(35~58℃/30~60 min)进行诱导实验。结果表明, 其中有13株表现高耐热性(可耐52℃以上高温), 另12株的耐热性较高(耐45℃以上高温), 其他11株与对照植株相似, 耐热能力没有提高。因此, 大多数T 1代转基因植株的耐热性明显高于非转基因对照植株。从3个转基因株系中选取耐热能力不同的8株(6
号株系的L6-2、L6-5、L6-7; 11号株系的L11-4、L11-5、L11-7和24号株系的L24-3、L24-6)利用RT-PCR 分析其GmHsfA1的表达水平与植株耐热性的关系。结果显示(图8), L6-5、L6-7、L11-4和L11-5表现高耐热性, 它们的GmHsfA1表达水平也高, 而耐热性较差的L6-2和L24-3, 其GmHsfA1的表达水平也较低, 只有L11-7
的情况略有出入。
图7 转基因植株(A 、B 、C 的右侧和D 的左侧)与非转基因对照植株(A 、B 、C 的左侧和D 的右侧)的热胁迫诱导实验
A: 常温(28℃) 处理60 min; B: 42℃热胁迫30 min; C: 52℃热胁迫30 min; D: 将热诱导处理后的植株放回28℃常温下恢复60 min 。
Fig. 7 Heat stress induction of transgenic plants (right in A, B, C and left in D) and non-transgenic plants
(left in A, B, C and right in D) A: Normal temperature (28℃) treatment for 60 min; B: 42℃ treatment for 30 min; C: 52℃ treatment for 30 min;
D: The heat stress-induced plants were placed back under normal condition (28℃) for 60 min.
图8 RT-PCR 检测热胁迫HS (35~58℃/30~60 min)下不同转基因大豆株系的GmHsfA1表达情况
1:非转基因植株(ck); 2~9:来自3个转基因株系(L6、L11、L24)的不同植株L6-2、L6-5、L6-7、L11-7、L11-4、L11-5、L24-3和L24-6;+: 仅耐
40-42℃(与对照相近); +++: 较耐热(45℃以上); ++++: 高耐热(52℃以上)。
Fig. 8 RT-PCR examination of GmHsfA1 expressions in different transgenic soybean lines under heat-stress
conditions (35-58℃/30-60 min)
1: Non-transgenic plant (CK); 2-9: Eight transgenic plants (2: L6-2, 3: L6-5, 4: L6-7, 5: L11-7, 6: L11-4, 7: L11-5, 8: L24-3, and 9: L24-6, from 3 dif-ferent T 1 transgenic lines L6, L11, L24);+: Only tolerant to mild high-temperature (40—42℃, similar to the control); +++: Tolerant to relative
high-temperature (over 45℃); ++++: Tolerant to severe high-temperature (over 52℃).
11期 陈晓军等: GmHSFA1基因克隆及其过量表达提高转基因大豆的耐热性 1419
上述结果说明, 转GmHsfA1大豆的植株能够表现出较强的耐热能力, 其耐热温度比非转基因对照植株高出10℃左右, 暗示GmHsfA1具有提高大豆耐热性的功能。
3 讨论
植物热激蛋白基因的表达受到一个很大的热激转录因子家族的调控, 尽管对其中的层次关系不甚了解, 但越来越多的研究表明各种热激转录因子之间及其与所调控的靶基因之间确实存在着复杂的互作关系。近年来有报道证明, 番茄的LpHsfA1对该植物的耐热性有着至关重要的作用, 它负责热激情况下调控热激蛋白和其他热激转录因子的生物合成[6], 说明在植物的热激响应过程中各种不同的热激转录因子之间存在着等级控制。
据文献[6]报道, LpHSFA1在番茄的热激反应中起着“管家”的作用。通过反义沉默实现的LpHsfA1共抑制植株对温度是高度敏感的, 另一方面, LpHsfA1的过量表达能够显著提高了转基因番茄植株的耐热性, 因为其过量表达导致了下游HsfA2、HsfB1和Hsp17-CI等含量的增加。因此, HSFA1应该是植物适应胁迫环境的最重要的热激转录因子。我们的转基因实验、热胁迫诱导和Northern和RT-PCR 分析等结果表明, 新克隆的GmHsfA1通过上调其下游与耐热相关的热激蛋白基因的表达提高了转基因大豆植株的耐热能力。根据序列同源性、结构功能域、表达模式以及转基因功能实验等研究可以看出, GmHSFA1是大豆热激响应中起重要作用的热激转录因子之一。
已有的研究表明, 受诱导表达的HSFs和组成型表达的LpHsfA1对热激反应是不同的[10]。番茄中热诱导型的HSFs对高温的响应与热激蛋白基因相似, 即受到热激会导致其mRNA水平的迅速积累。与之相反, 常温条件和热诱导条件下LpHsfA1的mRNA丰度没有明显的变化[10]。人们普遍接受的观点是: 由热激转录因子介导的植物热激反应中热激转录因子的mRNA水平没有明显的变化, 其调控功能的实现是由从已存在的无活性的单体状态转变为有活性的三聚体状态, 而不是mRNA丰度的改变。研究发现, HSFs通过与热激蛋白基因启动子的DNA热激元件(heat shock element, HSE)结合而促使热激蛋白基因的转录, 并发现把多个HSF基因串在一起转入植物, 能促进热激蛋白靶基因的高效表达[11~13]。
文献[14]报道了6个大豆热激转录因子的cDNA 克隆研究, 其中3个分别为GmHsfB1、GmHsfB4a和GmHsfB2c, 其共同特点是在它们的DNA结合区C末端存在一个较长的联结区(linker region)以及在HR-A 和HR-B的核心区缺少插入区(insertion region)。另外2个GmHSFs分别为GmHsfA4b and GmHsfA2[3]。本研究中, 将其中的4个大豆EST序列(CA938396、BI969567、AW569138和AW569256, 均与LpHsfA1高度同源) 通过采用RACE方法获得cDNA两端序列并从大豆基因组中扩增了GmHsfA1的全长cDNA。
克隆具有耐热功能的热激转录因子基因对于通过基因工程途径提高大豆的耐逆性, 从而增加其籽粒产量是非常重要的, 因为在干旱、高温等逆境条件下由大豆花荚的过量脱落所造成的减产十分严重[15]。为了检验新克隆的GmHsfA1的应用价值, 我们通过农杆菌介导的转化方法获得了该基因过量表达的转基因大豆株系。实验发现, 转基因株系中GmHsfA1在常温下的表达水平显著高于非转基因植株(图5: A), 其过量表达激活了小分子量热激蛋白GmHsp22在非热激诱导情况下的转录(图6: A), 并且促进了高温诱导下另2个内源热激蛋白基因GmHsp23和GmHsp70的表达(图6:C和图5:B), 从而导致转基因大豆材料耐热性的显著提高(图7: C, D), 因为有报道认为植物HSP70基因和一些小分子量(60 kDa以下)热激蛋白基因的表达可使植物具有耐热能力[16]。结果说明, 本研究所分离到的新的GmHsfA1编码了具有耐热功能的热激转录因子, 其过量表达能够激活其下游的热激蛋白基因GmHsp22在常温下的转录, 并加强GmHsp23和GmHsp70等基因在高温胁迫下的表达, 从而显著提高转基因大豆的耐热性。对转GmHsfA1大豆材料的深入研究将有助于了解该热激转录因子所调控的全部下游相关基因的表达谱(借助于Microarray和RT-PCR等技术)以及大豆抗逆性的分子机制, 并创造出抗逆和高产的基因工程大豆新材料。
参考文献 (References):
[1] Morimoto R I. Regulation of the heat stress transcriptional re-
sponse: cross talk between family of heat stress factors, molecu-
lar chaperones, and negative regulators. Genes Dev, 1998, 12(24): 3788~3796.
1420 遗传HEREDITAS(Beijing) 2006 28卷
[2] Nakai A. New aspects in the vertebrate heat stress factor system:
HsfA3 and HsfA4. Cell Stress Chap, 1999, 4(2): 86~93.[DOI] [3] Nover L, Bharti K, D?ring P, Mishra S K, Ganguli A, Scharf K D.
Arabidopsis and the heat stress transcription factor world: how many heat stress transcription factors do we need? Cell Stress Chap, 2001, 6(3): 177~189. [DOI]
[4] Sch?ffl F, Pr?ndl R, Reindl A. Regulation of the Heat-Shock
Response. Plant Physiol, 1998, 117(4): 1135~1141. [DOI]
[5] Wu C. Heat shock transcription factors: structure and regulation.
Annu Rev Cell Dev Biol, 1995, 11: 441~469. [DOI]
[6] Mishra S K, Tripp J, Winkelhaus S, Tschiersch B, Theres K,
Nover L, Scharf K D. In the complex family of heat stress tran-scription factors, HSFA1 has a unique role as master regulator of thermotolerance in tomato. Genes Dev, 2002, 16(12): 1555~ 1567. [DOI]
[7] YIN Qing-Nü, Lü Hui-Ying, ZHU Bao-Ge, ZHANG Jing. Study
on hsf8 gene transferred into soybean cultivar through Agrobac-terium-mediated method. Molecular Plant Breeding, 2004, 2(6): 783~787.
[8] Zhang Z, Xing A, Staswick P E, Clemente T E. The use of glu-
fosinate as a selective agent in Agrobacterium-mediated trans-formation of soybean. Plant Cell Tiss Organ Cult, 1999, 56: 37~46. [DOI]
[9] Edwards K, Johnstone C, Thompson C. Simple and rapid method
for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nu-
cleic Acids Res, 1991, 19(6): 1349.
[10] Scharf K D, Maternal T, Treuter E, Nover L. Heat stress promot-
ers and transcription factors. Springer-Verlag, Berlin/Heidelber, 1994, 121~158.
[11] Dix D J, Allen J W. Targeted gene disruption of HSP70-2 results
in failed meiosis, germ cell apoptosis and male inferfility. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93(8): 3264~3268. [DOI]
[12] Prandl R K, Hinderhofer G, Eggers S. HSF3, a new heat shock
factor from Arabidosis thalinana, expresses the heat shock re-
sponse and confers Thermotolerance when overexpressed in transgenic plants. Mol Gen Genet, 1998, 258(3): 269~278. [DOI] [13] Lee J H, Schoffl F. An HSP70 antisense gene affects the expres-
sion of HSP70 the regulation of HSF, and the acquisition of thermotolerance in transgenic Arabidosis thalinana. Mol Gen Genet, 1996, 252(1-2): 11~19. [DOI]
[14] Czarnecka-Verner E, Yuan C X, Fox P C, Gurley W B. Isolation
and characterization of six heat stress transcription factor cDNA clones from soybean. Plant Mol Biol, 1995, 29(1): 37~51. [DOI] [15] Nagel L, Brewster R, Riedell W E, Reese R N. Cytokinin regula-
tion of flower and pod set in soybeans (Glycine max (L.) Merr.).
Ann Bot, 2001, 88: 27~31. [DOI]
[16] Hendrick J P, Hartl F. Molecular chaperone function of heat
shock proteins. Ann Rev Biochem, 1993, 62: 349~382. [DOI]
转基因安全性评价 对转基因植物食品未知物质风险的主要担忧有：①致病性物质的出现，即转基因生物产品食用后是否会致病；②营养成分的 变化及抗营养因子的出现，如蛋白酶抑制剂、脂肪氧化酶 的产生或含量的变化；③新的过敏原的出现，如大豆中的 致敏性蛋白和巴西坚果中的2s清蛋白¨u；④天然有毒物的产生，如茄碱、葫芦素、Ot一番茄素等u2棚1。其中，最令人关注的是有可能会产生毒素、抗营养物质、过敏原以及致癌物质或联合致癌物质。转基因奶牛生产的激素(rbGH)在美国投入商业化使用后，使用者很快发现这类药物导致了奶牛乳房炎发病率加繁殖率低。由于药物的作用，奶牛新陈代谢加快，导致能耗增加而引起死亡，牛奶的营养价值也降低了。对获准在西班牙和美国商业化种植的转基因玉米和棉花进行针对性研究后认为，转基因作物可能引起脑膜炎和其它新病种。也有资料证实，转基因食品可能诱发癌症并传递给下一代以及导致失调，可能需要30年或更长的时间。转基因治疗性药物、人体组织器官等是否对人体健康造成影响，尚无法检测证实¨转基因的管理 我国对转基因产品的管理主要是针对农业转基因生物的管理。全国农业转基因生物安全的监督管理工作由农业部负责；卫生部依照《食品卫生法》的有关规定，负责转基因食品卫生安全的监督管理工作；此外，国务院还建立了由多个有关部门组成的农业转基因生物安全管理际联席会议制度，负责研究和协调农业转基因生物安全管理工作中的
重大问题。为了促进我国生物技术的发展，对作为其核心技术的重组DNA技术的研究和开发，必须加强安全性管理。早在1990年，中国政府就制定了《基因工程产品质量控 制标准》，成为我国第一个有关生物安全的标准和办法。1993年，原国家科学技术委员会发布了《基因工程安全管理办法》，对基因工程的定义、安全等级及安全性评价的划定、申报及审批程序等作了规定。在这一技术在国际上开始进入商品化的1996年，农业部又相应制定《农业生物基因工程安全管理实施办法》，具体规定农业生物基因工程安全等级的划分标准，明确各阶段的审批权限，以及相应的安全性控制措施；对农业生物技术的全过程，从实验研究，到中间试验，遗传工程体及其产品的环境释放，到遗传工程体及其产品的商品化生产实施管理，其适用范围涵盖我国自己研发的工作，也包括国外研制的相应产品在我国境内的各个阶段的试验、研究、应用。在联合国环境规划署(UNEP)和全球环境基金(GEF)的支持和资助下，2000年国家环保总局牵头编制了《中国国家生物安全框架》ⅢJ，提出了我国生物安全管理体制、法规建设和能力建设方案。2000年通过的《种子法》，要求转基因植物品种的选育、试验、审定和推广必须进行安全性评价，并采取严格的安全控制措施。销售转基因植物品种种子的，必须用明显的文字标注，并提示使用时的安全控制措施。这是我国第一次要求对转基因产品进行标识。2001年国务院颁布实施《农业转基因生物安全管理条例》。2002年，农业部发布施行《农业转基因生物安全评价管理办法》、
基因克隆及转基因 一、基因克隆及转基因过程 1、设计引物 软件是https://www.doczj.com/doc/d510946383.html,sergene.v7.1，用到里面的PrimerSelect和EditSeq。 一般原则：1、长度：18-25； 2、GC含量：40-60％，正反向引物相差不要大于5%； 3、Tm值：55以上（到65），实在不行50以上也可以，正反向引物相差不要大 于5； 4、3’端结尾最好是GC，其次是T，不要A； 5、正反向引物连续配对数小于4； 6、在NCBI上的Primer Blast上看引物特异性如何； （如果克隆的话不能满足条件也没办法。） 不是必须条件，但可以考虑：多个基因设计引物时，可尽量使Tm值相似，方便PCR。 步骤： 一、打开PrimerSelect和EditSeq。 二、在EditSeq中输入你的序列。 引物有一对F和R 1、对于F是从5’到3’，在序列的前部分选择长度为18-25bp的碱基，如果你是要验证就随便选，如果你是要克隆就在最开始选，不符合原则就只能在你选的后边增或减碱基。 2、将选择的F引物输入到PrimerSelect中，在File中选择Enter New Primer，复制，OK，然后可以看到引物的情况，看看长度、Tm、GC含量是不是符合标准，不符合就继续选。 3、对于R是从3’到5’，选中序列，在EditSeq的Goodies中选择第一个“反向互补”，此时序列已反向互补，按照前面F的方法搜索R的引物。、 4、注意你想要的目的带的大小，比如序列是1000bp，你想PCR出来800大小的目的带，那就要看看F和R之间的长度在你想要的范围内。可以将R反向互补，在正向的序列中搜索R在的位置，就是在EditSeq中选择Search，点击第一个Find，开始搜寻。 5、搜索完引物在PrimerSelec中的Report中选择前两个查看二聚体情况。 6、在NCBI上的Primer Blast上看引物特异性如何。 7、因为是克隆，所以引物要有酶切位点，酶切位点的加入主要考虑所用到的表达载体，在NEBcutter网站中输入总序列查看可用的酶切位点。在引物上游加入酶切位点，注意加入时载体的表达的方向，前面的酶切位点在引物F上，后面的酶切位点在引物R上。一般在引物上游还要加上两个保护碱基。 2、提取醋栗DNA 3、PCR扩增与目的基因回收 PCR先找合适的退火温度，找到后回收时就可以多PCR几管，一般我们用20ul的体系，PCR5管就可以回收，就是琼脂糖凝胶回收，将目的基因用刀片切下来，用试剂盒回收。回收完可以再跑电泳检测一遍。 PCR： 20ul体系：灭菌水13.8ul，若模板为质粒灭菌水14.3ul； 2.5mMdNTP2.0ul；
绿色荧光蛋白G F基因 的克隆表达和粗提取 SANY标准化小组 #QS8QHH-HHGX8Q8-GNHHJ8-HHMHGN#
绿色荧光蛋白(G F P)基因的克隆、表达和粗提取 南方医科大学 2011预防医学（卫生检验检疫） 摘要 目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。方法：从 DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。再用限制性内切酶BamHI和NotI对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞 BL-21中，用LB培养基对转化后的进行扩大培养。用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。 关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取 目录
1 前言 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿
色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。1962 年，下村修等分离纯化了水母中发光蛋白水母素，并发现一种绿色的荧光蛋白。1974 年，他们分离得到了这个蛋白，当时称绿色蛋白，以后称绿色荧光蛋白(GFP)[1] GFP 作为一种新的报告基因，其优点在于①荧光强度高，稳定性高；②GFP 分子量小，易于融合，适用于多种转化方式，对受体无毒害，安全可靠；③不需要反应底物与其他辅助因子，受蓝光激发产生绿色荧光，尤其适用于体内的即时检测； ④GFP 不具有种属依赖性，在多种原核和真核生物细胞中都表达；⑤通过替换一些特殊氨基酸，可以使之产生不同颜色的光，从而适应不同的研究需要。近年来广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移以及相互作用、信号传递、转染与转化，以及细胞的分离与纯化等研究领域[ 2～3]。采用GFP 作为标记基因，可直接收集转化细胞供实验，缩短了筛选时间、减少对细胞活性的影响并可作为活体标记，为研究发育的基因调控和分子机制提供了一种简洁有效的手段[ 4、5 ]。采用基因工程手段生产GFP标记的方法，可建立一种简便、快速的免疫诊断技术[6]。 质粒转化进入大肠杆菌（Escherichia coli）感受态细胞是分子克隆的关键步骤[7]，是基因克隆以及DNA文库构建等研究中一项重要的常规操作。目前，感受态 法，该方法操作简单、容易掌握、重复性好、转化率 细胞的制备主要采用CaCl 2 高，可广泛应用于一般的实验室。其原理是Ca2+ 破坏细胞膜上的脂质阵列，并与膜上多聚羟基丁酸化合物、多聚无机磷酸形成复合物以利于外源DNA的渗入[8]。 大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉、可以快速大规模地生产
4植物基因克隆的策略与方法 基因的克隆确实是利用体外重组技术,将特定的基因和其它DNA顺序插入到载体分子中。基因克隆的要紧目标是识不、分离特异基因并获得基因的完整的全序列,确定染色体定位,阐明基因的生化功能,明确其对特定性状的遗传操纵关系。通过几十年的努力由于植物发育,生理生化,分子遗传等学科的迅速进展,使人们把握了大量有关植物优良性状基因的生物学和遗传学知识,再运用先进的酶学和生物学技术差不多克隆出了与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆,育性、高蛋白质及与植物发育有关的许多基因。我们实验室对天麻抗真菌蛋白基因作了功能克隆的研究(舒群芳等,1995;舒群芳等,19 97),为了克隆植物基因也探讨了其它克隆方法,本文论述基因克隆的策略、方法及取得的一些进展。 1功能克隆(functional Cloning) 功能克隆确实是按照性状的差不多生化特性这一功能信息,在鉴定和已知基因的功能后克隆(Collis,1995)。其具体作法是:在纯化相应的编码蛋白后构建cDNA文库或基因组文库,DNA文库中基因的选择按照情形要紧可用二种方法进行,(1)将纯化的蛋白质进行氨基酸测序,据此合成寡核苷酸探针 从cDNA库或基因组文库中选择编码基因,(2)将相应的编码蛋白制成相应抗体探针,从cDNA入载体表达库中选择相应克隆。功能克隆是一种经典的基因克隆策略,专门多基因的分离利用这种策略。 Hain等从葡萄中克隆了两个编码白藜芦醇合成的二苯乙烯合成酶基因(Vst1和Vst2),葡萄中抗菌化合物白藜芦醇的存在,能够提升对灰质葡萄孢(B otrytis cinerce)的抗性,在烟草和其它一些植物中无二苯乙烯合成酶,因此克隆该基因通过转基因后,对有些植物产生对灰质葡萄孢的抗性专门有意义(H ain等,1985)。Kondo等1989年对编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的基因组DN A做了克隆和序列分析(Kondo等,1989)。周兆斓等构建了水稻cDNA文库,分离了编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的cDNA(周兆斓等,1996)。植物蛋白酶抑制剂是一类天然的抗虫物质,它可抑制摄食害虫对蛋白质的消化,使害虫因 缺乏所需氨基酸而导致非正常发育或死亡。胡天华等人从烟草中分离出流行于我国的黄瓜花叶病毒(Cucumber Mosaic virus)(CMV),并克隆了编码该
毕业设计/论文 开题报告 课题名称红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析类别毕业论文 系别城市建设学院 专业班生物工程0701班 姓名于凯 评分 指导教师 华中科技大学武昌分校
华中科技大学武昌分校学生毕业论文开题报告
癌活性，对于治疗卵巢癌、乳腺癌等疗效突出。但是由于含量少、提取困难等诸多因素，高纯度紫杉醇价格昂贵，每公斤200万元人民币左右。因此，近年来国内外许研究人员、实验室和公司一直试图通过生物合成、化学合成、微生物提取、组织和细胞培养、寻找类似物等途径来解决紫杉醇的药源短缺问题。 研究紫杉醇的生物合成，尤其一些限速反应步骤机理的阐明对于人为定向的提高合成效率，克隆重组形成关键酶基因从而提高紫杉醇的产量意义重大。从理论上来说这是一个好方法，但是紫杉醇的合成途径非常复杂，涉及到多种酶以及很多分支途径，单纯依靠转化一、两种限速酶基因，只能保证转入的限速酶表达量提高，使之不再是限速因素，但其它阶段对于最终产量的限制依然存在，而且同时转入多种基因的可行性非常低，这种方法的缺陷很明显。 若采用化学合成，如从红豆杉植物中分离得到的巴卡亭Ⅲ经过四步化学过程可合成紫杉醇，为合成紫杉醇提供了新途径[5]。但化学合成从实质意义上说还没有取得彻底的突破，目前还不具备应用价值。 如果从共生真菌中直接提取紫杉醇，能够利用真菌生长速度快的优势，但目前分离的菌株无论从种类还是数量上都远不够工业化的要求，而且还存在很多不确定因素[1]。生产紫杉醇的微生物大多是与红豆杉共生的真菌，其紫杉醇含量极微，并且这些真菌的培养和大规模发酵困难，菌株衰退也是一个难题。 另外，红豆杉愈伤组织和细胞培养生产紫杉醇是研究的热点之一，是工厂化大规模生产紫杉醇的重要手段之一。但运用植物组织、细胞培养技术生产紫杉醇仍处在实验室阶段，如何获得高含量、产紫杉醇稳定的愈伤组织一直都是组织培养、细胞培养生产紫杉醇的关键。 1.1.3关于MYB基因 ①MYB基因 目前，在几乎所有的真核生物中都发现了与禽类逆转录病毒癌基因和细胞原癌基因c-MYB相似的基因，它们的编码产物在结构和功能上具有高度保守的DNA结合域，是一类转录因子[6]。在植物中首先从玉米中克隆了含有MYB结构域的转录因子C1基因，之后在植物中发现的MYB相关基因的数量迅速增加[7]。
转基因大豆进口对我国生物安全的影响及对策研究 一、目前已经商业化或正在研发阶段的转基因大豆 （一）耐除草剂基因的大豆 孟山都公司的耐草苷膦大豆是在1994年5月19日得到商品批准的。这是最早获准推广的转基因大豆品种（Roundup Ready Soybean，简称 RR大豆）。RR大豆对非选择性除草剂农达（Roundup）有高度耐受性。目前世界上种植最多的是RR大豆。Aventis公司耐膦丝菌素大豆是在 1996年7月31日得到商品批准的。种植抗草苷膦大豆可节约劳力、降低成本，在杀灭杂草后可使大豆增产，因此，在劳力昂贵的美国对RR大豆进行了大面积推广。 （二）豆油脂肪酸改变的大豆 杜邦公司的豆油脂肪酸改变大豆是1998年4月30日获美国食品药物管理局批准，目前杜邦公司利用基因工程方法用反义的油酸脱饱和酶基因转入大豆，已培育出了油酸含量达70%以上的大豆品种。此外，在美国低亚麻酸大豆、低棕榈酸大豆、高硬脂酸大豆、高棕榈酸大豆等转基因品种也已培育成功。 在大豆油脂中，单不饱和脂肪酸是对人体最为有益的营养成份。利用基因工程方法培养出了高油酸含量，提高了对人体最佳的营养成份，同时也降低了多不饱和脂肪酸含量，而且也不存在反式双键的脂肪酸，因此是一种理想的植物油。 （三）转抗虫基因大豆 由于大豆食心虫的危害，抗虫转基因大豆的研究在国内外广泛开展，研究者多采用苏云金芽孢干菌(Bt)伴孢晶体蛋白基因提高大豆抗虫性。目前，在国际上还未见有抗虫转基因大豆被批准商品化的报道。抗虫大豆可以有效地控制大豆食心虫的发生，从而提高大豆产量，显著提高豆粒品质。 二、转基因大豆的发展及其在全球转基因作物中的地位 （一）转基因大豆在全球转基因作物种植面积中占据主要地位 目前世界上种植最多的转基因作物是玉米、大豆、棉花和油菜籽。转基因作物种植面积由1996年的170万公顷猛增到2001年的5260万公顷，其中转基因大豆由50万公顷猛增到3330万公顷，在全球转基因作物种植面积中占63%，比2000年增加750万公顷，增长29%（见表1）。
一、组织总RNA的提取 相关试剂：T rizol；氯仿；苯酚；异丙醇；75%乙醇；RNase-free水 相关仪器：制冰机；液氮&研钵/生物样品研磨仪；高速离心机；移液器（1ml、200μl、100μl/50μl）；涡旋振荡仪；恒温金属浴。 相关耗材：解剖工具，冰盒，离心管，离心管架，吸头（1ml，200μl/300μl），一次性手套，实验手套。 实验步骤 1.取暂养草鱼，冰上放置一段时间，然后解剖，剪取肠道50~100mg，放入研钵中，加入液 氮迅速研磨，然后加入1ml 预冷TRIzol试剂，充分研磨至无颗粒物存在。 2.转移到离心管中，室温放置5min，使细胞充分裂解； 3.按1ml Trizol加入200μl氯仿，盖上盖子，迅速充分摇匀15s，然后室温放置3min； 4.4℃，,12000g 离心15min； 此时混合物分为三层，下层红色的苯酚氯仿层，中间层和上层无色水相；RNA存在于无色水相中； 5.小心吸取上清液，千万不要吸取中间界面，否则有DNA污染；转移至一个新的离心管， 加入等体积的异丙醇，轻轻混匀； 6.室温放置10min；4℃，,12000g 离心10min； 7.弃上清，加入1ml 75%乙醇洗涤；涡旋，悬浮沉淀；4℃，,12000g 离心5min； 8.弃上清；可以再次用75%乙醇洗涤沉淀； 9.弃上清；用移液器轻轻吸取管壁或管底的残余乙醇，注意不要吸取沉淀；室温放置5min 晾干沉淀；（RNA样品不要过于干燥，否则极难溶解） 10.沉淀中加入30μl RNase-free水，轻弹管壁，使RNA溶解。 RNA质量检测 相关试剂：溴酚蓝， TEB/TAE电泳缓冲液，溴乙锭（EB） 相关仪器：（超微量分光光度计，移液器（2.5μl 或2μl 规格，10μl规格），电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，制冰机） 相关耗材：（无菌无绒纸，吸头，离心管架，PCR管，PCR管架，锥形瓶，烧杯，一次性手套，实验手套，冰盒） （1）RNA纯度的检测：测定其OD260和OD280的值，根据其OD260/ OD280的比值，当其比值在1.9~2.1之间，说明提取的总RNA纯度比较高，没有蛋白质和基因组的污染。 （2）RNA完整性的检测：取2μlRNA，与2μl溴酚蓝混匀，用1%的琼脂糖进行凝胶电泳，20min后，在凝胶成像系统中观察效果。当28S与18S条带清晰，且亮度比大约是2:1时，5S条带若隐若现，而且没有其它条带时，说明完整性不错，可以用于下游逆转录实验。
基因克隆载体上的各种常用蛋白标签 蛋白标签(proteintag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。随着技术的不断发展，研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。目前，这些蛋白标签已在基础研究和商业化产品生产等方面得到了广泛的应用。 美国GeneCopoeia(复能基因)为客户提供50多种蛋白标签，可以满足客户的不同需求，包括各种最新型的标签，如：SNAP-Tag?、Halo Tag?、AviTag?、Sumo等;也提供齐全的各种常用标签，如eGFP、His、Flag等等标签。 以下是部分蛋白标签的特性介绍，更加详细的介绍可在查询产品的结果列表里面看到各种推荐的蛋白标签和载体。 TrxHIS His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测;二是构成独特的结构特征(结合配体)利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。使用His-tag有下面优点： 标签的量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD，一般不影响目标蛋白的功能; His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性; His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究; His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。 可应用于多种表达系统，纯化的条件温和; 可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。 Flag标签蛋白 Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽(DYKDDDDK)，同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。FLAG作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点： FLAG作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。 融合FLAG的目的蛋白，可以直接通过FLAG进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高。 FLAG作为标签蛋白，其可以被抗FLAG的抗体识别，这样就方便通过Western Blot、ELISA等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测、鉴定。
转基因大豆安全性研究 【摘要】 转基因大豆是世界上最早商品化、推广应用速度最快的转基因作物,但其遗传转化仍然是基因工程领域的难点之一,如何建立高效稳定的遗传转化体系是转基因大豆的研究重点,同时随着转基因大豆走上人们的餐桌,关于其安全性也引起了人们的质疑。本文将从目前研究的各个方向来阐述转基因大豆的发展现状、转基因大豆的优势、转化技术、安全性评价以及对未来转基因生物的展望。【关键字】转基因大豆、环境安全、生物多样性、基因漂移
【正文】 一、转基因大豆生产的现状 近年来,美国的转基因大豆商业化速度进展很快,1994年美国Monsanto公司研制的抗草甘膦转基因大豆被批准进行商业化生产,1997年DuPont公司研制的高十八烯酸(油酸)大豆被批准进行商业化生产,1998年AgrEvo公司研制的抗草丁膦大豆被批准进行商业化生产。2001年,世界种植大豆总面积7 200万公顷,而转基因大豆有3330万公顷占据全球转基因作物的63%,且均为抗除草剂大豆。目前种植转基因大豆的国家主要是美国(转基因大豆约占97%)、阿根廷(转基因大豆约占90%)和巴西(转基因大豆约占25%)等,我国还没有转基因大豆生产。 二、转基因大豆的优势 1、转基因大豆的主要特性 大豆是植物蛋白、油脂、食品、饲料及工业原料的重要来源作物。仅排在水稻，小麦和玉米之后，是世界四大粮食作物之一。当前，转基因大豆商业化种植的主要品种美国抗除草剂草甘膦转基因大豆是通过农杆菌介导方法，将矮牵牛Ti质粒（GaMy）中35s启动子控制EPSPE基因导入到大豆植株，进而培育成的新品种[1]。其含有的4个来源于土壤细菌的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-膦酸合成酶（epsps）基因，是草甘膦抗性的主要来源[2]。此基因与大豆酚类、生物碱和芳香族氨基酸等代谢相关。抗草甘膦转基因大豆的特性主要表现为：较好控制草害、大豆产量高、抗虫性较强、护土壤、降低污染、改善环境、防止土壤养分及水土的流失、减少除草剂活性成分及能有效地控制杂草的生长与繁育，转基因大豆食品使大豆油的产量与品质得到改良、延长食品贮藏时间。 2、转基因大豆的营养价值 金红等对非转基因大豆W28544与美国转基因大豆GTS40-3-2种子中的部分营养指标进行差异检测,结果表明,转基因大豆中的粗脂肪、粗蛋白、脂肪酸、黄酮和酚酸的含量都明显高于非转基因大豆。并且，这些物质均具有提高植物对物理环境的适应性，增强植物抵御天敌侵袭及抵抗病害的能力，monsanto公司对培育转基因大豆品种GTS40-3-2进行食品安全评价的结果表明：转基因大豆中所有氨基酸的含量与非转基因大品种之间不存在显著性差异，内源蛋白过敏源及含量与非转基因大豆之间也不存在差异性，相同品质改良的转基因大豆也取得重
拟南芥基因克隆的策略与途径 拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种模式植物，具有基因组小（125 Mbp）、生长周期短等特点，而且基因组测序 已经完成（The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000）。同时，拟南芥属十字花科（Cruciferae），具有高等植物 的一般特点，拟南芥研究中所取得成果很容易用于其它高等植物包括农作物的研究，产生重大的经济效益，特别是十字 花科中还有许多重要的经济作物，与人类的生产生活密切相关，因此目前拟南芥的研究越来越多地受到国际植物学及各 国政府的重视。 基因(gene)是遗传物质的最基本单位,也是所有生命活动的基础。不论要揭示某个基因的功能,还是要改变某个基因的功 能,都必须首先将所要研究的基因克隆出来。特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。本文就基因克隆的 几种常用方法介绍如下。 1、图位克隆 Map-based cloning, also known as positional cloning, first proposed by Alan Coulson of the University of Cambridge in 1986, Gene isolated by this method is based on functional genes in the genome has a relatively stable loci, in the use of genetic linkage analysis or chromosomal abnormalities of separate groups will queue into the chromosome of a specific location, By constructing high-density molecular linkage map, to find molecular markers tightly linked with the aimed gene, continued to narrow the candidate region and then clone the gene and to clarify its function and biochemical mechanisms. 图位克隆（map-based clonig）又称定位克隆（positoinal cloning），1986年首先由剑桥大学的Alan Coulson提出。用该方法分离基因是根据功能基因在基因组中都有相对较稳定的基因座，在利用分离群体的遗传连锁分析或染色体异常将基因伫到染色体的1个具体位置的基础上，通过构建高密度的分子连锁图，找到与目的基因紧密连锁的分子标记，不断缩小候选区域进而克隆该基因，并阐明其功能和生化机制。 用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的DNA序列，也无需预先知道其表达产物的有关信息。它是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。近几年来随着拟南芥基因组测序工作的完成，各种分子标记的日趋丰富和各种数据库的完善，在拟南芥中克隆一个基因所需要的努力已经大大减少了（图1）。
3 结果与分析 3.1质粒提取 用醋酸铵法提取pET-28a 和pEGFP-N3质粒后，进行琼脂糖电泳检测质粒是否提取成功。得到电泳结果，如图一所示，3、4号泳道有明显清晰的条带说明pEGFP-N3提取成功。1、2泳道同样有明显清晰的条带，说明pET-28a 提取成功。 3.2 双酶切 用BamH1和Not1分别对pEGFP-N3和pET-28a 双酶切。1、2号泳道为pEGFP-N3的酶切结果，如图二所示，电泳会得到两条带，说明pEGFP-N3酶切成功。4号泳道为pET-28a 的酶切产物的电泳有明显条带，证明酶切成功。 3.3 抗性筛选 通过氯化钙法制备DH5α感受态细胞，用热激发将pET-28a-GFP 转入DH5α感 图 1 pET-28a 和pEGFP-N3质粒提取电泳图 1、2泳道为pET-28a 电泳结果 3、4号泳道为pEGFP-N3电泳结果 图 2 BamH1、Not1双酶切 pEGFP-N3和pET-28a 1、2号泳道为pEGFP-N3酶切产物 3号泳道为pEGFP-N3原始质粒 4号泳道为pET-28a 酶切产物 5号用泳道为pET-28a 原使质粒
受态细胞。转化重组质粒后涂平板，进行重组质粒的抗性筛选。因为28a中含有 抗卡那基因，所以筛选后可以得到含28a的重组质粒。从图中可以看出1号平板 长出较多菌落，说明DH5α感受态细胞存活。2号平板无菌落生长，说明DH5α中 不含抗卡那基因。3号板生长出较少菌落，证明卡那有活性。4号板无菌落生长。 失败原因其一可能是在倒了第一个平板加入卡那后，由于倒平板速度太慢，导致 培养基凝固，影响了卡那的浓度和活性。其二可能是在转化过程中，离心后，弃 上清的过程中，将沉淀和上清混在了一起，影响了溶液的浓度。 图3重组质粒转化DH5α感受态细胞 1号图为不含卡那的阴性对照 2号图为含卡那的阴性对照 3号图为含卡那的自提pET-28a的阳性对照 4号图为含卡那的连接产物结果 3.4PCR鉴定 经PCR扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳检测是否扩增成功，得到电泳结果如图 四所示，结果表明，1、2泳道的条带约为700bp，说明成功扩增出含有GFP的基 因。DNA电泳检验扩增片段,选出能够得到700bp左右片段的阳性克隆。 图4阳性重组菌的PCR鉴定 1、2号泳道为重组质粒转化结果
题目：绿色荧光蛋白（GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达 李宏远 2014236053 立题依据： 随着分子生物学和基因工程技术的迅速发展和广泛应用, 人们根据自己的意愿有目的、有计划、有根据、有预见地将外源基因导入动物细胞内, 使外源基因进行表达、阐明基因表达的调控机理或者通过与染色体基因组进行稳定整合，将生物性状传递给子代动物的研究方兴未艾[1]。 1.选材：大肠杆菌 大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉、可以快速大规模地生产目的蛋白等优点。而且其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌中蛋白量的30 %，因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。 2.基因标记技术 基因标记技术是近年来发展起来的分子生物学技术。荧光蛋白基因在标记基因方面由于具有独特的优点而引起了科学家的广泛关注，现已被普遍应用到分子生物学研究的各个方面。荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白，分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白[2]。
3.绿色荧光蛋白 从水母(Aequorea victoria)体内发现的发光蛋白。分子质量为 26kDa，由238个氨基酸构成，第65～67位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成发光团，是主要发光的位置。其发光团的形成不具物种专一性，发出荧光稳定，且不需依赖任何辅因子或其他基质而发光。绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因。 【实验目的】 研究绿色荧光蛋白（Greed Fluorescent Protein，GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达。 【研究意义】 研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达。通过质粒重组形成所需要的重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入大肠杆菌体内，通过酶切、PCR及用IPTG诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导表达成功。根据电泳结果及荧光现象得出结论，重组质粒在大肠杆菌体内成功诱导表达。 GFP的应用特点 检测方便：不需要外加底物和辅助因子，用内眼就可以观察到，在长紫外光照射下特别漂亮，以此作为标记，观察表达产物。
第一章总则 第一条为规范农业转基因生物加工活动，确保转基因生物在装卸、运输、储存以及加工过程中的封闭式管理，防范转基因生物对人类、动物、微生物和生态环境构成危险或潜在风险，根据农业部《转基因生物安全条例》、《农业转基因生物安全管理办法》、《农业转基因生物进口安全管理办法》，结合本公司实际情况，制定本制度。 第二条本办法所称农业转基因生物，是指用于农产品加工的转基因动植物、微生物及其产品，具体指进口转基因大豆及其加工的产品（包括豆油、豆粕）。 第三条本办法所称农业转基因生物加工是指以具有活性的农业转基因生物为原料生产农业转基因产品的活动。具体指以进口转基因原料，生产豆油、豆粕等活动。 第二章组织保障 第四条成立进口转基因大豆安全管理小组。 为确保进口转基因大豆在原料采购、运输、贮藏、加工及产品销售等环节的安全性，明确相关部门及人员的职责，将各项工作落实到实处，公司特成立进口转基因大豆安全管理小组（以下简称“安全管理小组”），主要负责进口转基因大豆加工过程中的安全管理、日常监督及
突发事件的应急指挥等工作。 第五条职责分工 （一）组长 1、职责 （1）负责公司进口转基因大豆各环节安全工作的总体策划。 （2）负责进口转基因大豆加工过程中及突发事件处理过程中相关资源（人力、物力，必要时财力等）的配备工作。 （3）负责转基因生物扩散突发事件的总指挥及突发事件后与上级主管部门之间的协调沟通工作。 （4）对本公司采购加工的进口转基因大豆安全性负整体责任。 2、权限 （1）有权调动公司内一切资源。 （2）有权组织各部门定期或不定期召开进口转基因大豆相关安全工作会议。 （3）有权变更安全管理小组中所有人员及其职责和权限。 （4）有权以进口转基因大豆安全工作进行直接安排。 （5）有权对出现问题的部门和人员进行直接处理。 (二)副组长
基因克隆得几种常见方法 基因（gｅｎe)就是遗传物质得最基本单位,也就是所有生命活动得基础。不论要揭示某个基因得功能,还就是要改变某个基因得功能,都必须首先将所要研究得基因克隆出来。特定基因得克隆就是整个基因工程或分子生物学得起点。本文就基因克隆得几种常用方法介绍如下。 1 根据已知序列克隆基因 对已知序列得基因克隆就是基因克隆方法中最为简便得一种。获取基因序列多从文献中查取，即将别人报道得基因序列直接作为自己克隆得依据。现在国际上公开发行得杂志一般都不登载整个基因序列,而要求作者在投稿之前将文章中所涉及得基因序列在基因库中注册，拟发表得文章中仅提供该基因在基因库中得注册号(acｃｅssion numｂer）,以便别人参考与查询。目前，世界上主要得基因库有１）EMBL,为设在欧洲分子生物学实验室得基因库，其网上地址为; （2)Genbank，为设在美国国家卫生研究院(ＮIＨ）得基因库，其网上地址为;（3)Swｉssport与TＲEMBＬ,Swissport就是一蛋白质序列库,其所含序列得准确度比较高,而TREMBＬ只含有从EＭBＬ库中翻译过来得序列。目前,以Geｎbａnk得应用最频繁。这些基因库就是相互联系得,在Genbank注册得基因序列,也可能在Swisspoｒt注册。要克隆某个基因可首先通过Inｔeｒnet查询一下该基因或相关基因就是否已经在基因库中注存。查询所有基因文库都就是免费得,因而极易将所感兴趣得基因从库中拿出来,根据整个基因序列设计特异得引物，通过PＣＲ从基因组中克隆该基因,也可以通过RＴ-PCＲ克隆cＤNA。值得注意得就是,由于物种与分离株之间得差异,为了保证PＣR扩增得准确性,有必要采用两步扩增法,即neｓted PCR。 根据蛋白质序列也可以将编码该蛋白质得基因扩增出来。在基因文库中注册得蛋白质序列都可以找到相应得ＤNA或cDNＡ序列。如蛋白质序列就是自己测定得，那么需要设计至少１对简并引物(dｅgｅneｒated ｐrimeｒ),从cDNA文库中克隆该基因。以这种方法克隆得基因必须做序列测定才能鉴别所扩增产物得特异性。 另外,在基因克隆之后，如还要进一步做表达研究，所使用得PCR酶最好不用Taq DNA聚合酶，而采用其她有自我检测（reading proｏf)功能得酶,如pfｕ。这样可以避免由于扩增过程中出现得点突变或终止密码子而导致整个研究结论得错误。 ２根据已知探针克隆基因 这也就是基因克隆得一种较直接得方法。首先将探针作放射性或非放射性标记,再将其与用不同内切酶处理得基因组DNＡ杂交,最后将所识别得片段从胶中切下来，克隆到特定得载体（质粒、噬菌体或病毒)中作序列测定或功能分析。这种方法不但可以将基因克隆出来,还能同时观察该基因在基因组中得拷贝数。
题目：《转基因大豆发展状况及其安全性》 201230440316 12家具1班莫智辉101号摘要：世界转基因作物发展迅猛, 其中转基因大豆无论种植面积还是作物产量方面均占 有较大比例，但其安全性受到人们极大关注。本文将从转基因大豆发展现状、转基因方法、转基因大豆种类及其安全性等方面对其做一简单蛛述，并对转基因大豆前景进行展望。 关键词:转基因大豆；安全性；展望； 1 转基因大豆概述及现状 转基因大豆可以抵抗杀草剂——草甘膦（毒滴混剂）。草甘膦会把普通大豆植株与杂草一起杀死。这种大豆被称为转基因大豆。而这种转基因技术终于走出实验室和试验田，进入像玉米、大豆和棉花作物的日常耕作。 转基因大豆的研制是为了配合草甘膦除草剂的使用。除草剂有选择性的和非选择性的，草甘膦是一种非选择性的除草剂，抗草甘膦转基因作物是目前全球播种面积最大的转基因作物。草甘膦杀死植物的原理在于破坏植物叶绿体或者质体中的EPSPS(5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶)。通过转基因的方法，让植物产生更多的EPSPS酶，就能抵抗甘草膦，从而让作物不被草甘膦除草剂杀死。有了这样的转基因大豆，农民就不必像过去那样使用多种除草剂，而可以只需要草甘膦一种除草剂就能杀死各种杂草。当前除了大豆之外，还有很多其他抗甘草膦的转基因作物，包括油菜、棉花、玉米等。除了抗草甘膦作物之外，还有抗草丁膦除草剂的作物，不过草丁膦与草甘膦杀灭植物的原理并不相同，而培养这两类作物所转的基因也不同。而当前转基因大豆主要用来提炼大豆油。 在农业生物技术领域, 转基因作物研究与开发在全球范围内取得举世瞩目进展。目前种植转基因作物的主要国家有美国、阿根廷、加拿大、中国、巴西和南非。2003年, 美国转基因作物种植面积为4280万公顷, 比上一年增加10%, 占全球转基因作物总种植面积的63%；阿根廷居第二, 占21%；加拿大占6%；巴西和中国各占4%；南非占1%。这六个国家占全球种植总面积的99%。其中转基因大豆无论种植面积还是作物产量方面均占有较大比例, 而且一直保持着增长趋势[1]。营养学家称21世纪是“大豆的世纪”, 可见转基因大豆在转基因物及未来食品中占有重要地位。 2 转基因大豆研究概况 大豆高效遗传转化一直是植物基因工程领域的难点之一。其主要原因是转化以后从转化组织的细胞上再生植株比较困难。虽然已经有了再生频率相对较高的再生系统包括体细胞胚胎发生和器官发生再生系统, 然而, 这些再生系统尚不能与现有的植物转化方法很好地结合, 转化效率依然没有显著提高。
基因克隆的几种常见方法 基因(gene)是遗传物质的最基本单位,也是所有生命活动的基础。不论要揭示某个基因的功能,还是要改变某个基因的功能,都必须首先将所要研究的基因克隆出来。特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。本文就基因克隆的几种常用方法介绍如下。 1 根据已知序列克隆基因 对已知序列的基因克隆是基因克隆方法中最为简便的一种。获取基因序列多从文献中查取,即将别人报道的基因序列直接作为自己克隆的依据。现在国际上公开发行的杂志一般都不登载整个基因序列,而要求作者在投稿之前将文章中所涉及的基因序列在基因库中注册,拟发表的文章中仅提供该基因在基因库中的注册号(accession number),以便别人参考和查询。目前,世界上主要的基因库有1)EMBL,为设在欧洲分子生物学实验室的基因库,其网上地址为 https://www.doczj.com/doc/d510946383.html,/ebi-home.html;(2)Genbank,为设在美国国家卫生研究院(NIH)的基因库,其网上地址为 https://www.doczj.com/doc/d510946383.html,/web/search/index.html;(3)Swissport和TREMBL,Swissport是一蛋白质序列库,其所含序列的准确度比较高,而TREMBL只含有从EMBL库中翻译过来的序列。目前,以Genbank的应用最频繁。这些基因库是相互联系的,在Genbank注册的基因序列,也可能在Swissport注册。要克隆某个基因可首先通过Internet查询一下该基因或相关基因是否已经在基因库中注存。查询所有基因文库都是免费的,因而极易将所感兴趣的基因从库中拿出来,根据整个基因序列设计特异的引物,通过PCR从基因组中克隆该基因，也可以通过RT-PCR克隆cDNA。值得注意的是,由于物种和分离株之间的差异,为了保证PCR 扩增的准确性,有必要采用两步扩增法,即nested PCR。 根据蛋白质序列也可以将编码该蛋白质的基因扩增出来。在基因文库中注册的蛋白质序列都可以找到相应的DNA或cDNA序列。如蛋白质序列是自己测定的,那么需要设计至少1对简并引物(degenerated primer),从cDNA文库中克隆该基因。以这种方法克隆的基因必须做序列测定才能鉴别所扩增产物的特异性。 另外,在基因克隆之后,如还要进一步做表达研究,所使用的PCR酶最好不用Taq DNA聚合酶,而采用其他有自我检测(reading proof)功能的酶,如pfu。这样可以避免由于扩增过程中出现的点突变或终止密码子而导致整个研究结论的错误。 2 根据已知探针克隆基因 这也是基因克隆的一种较直接的方法。首先将探针作放射性或非放射性标记,再将其与用不同内切酶处理的基因组DNA杂交,最后将所识别的片段从胶中切下来，克隆到特定的载体(质粒、噬菌体或病毒)中作序列测定或功能分析。这种方法不但可以将基因克隆出来,还能同时观察该基因在基因组中的拷贝数。但在探
Cloning and expression of peroxisomal Ascorbate Peroxidase gene from wheat Yaping Chen,Huazhong Wang,Xiue Wang,Aizhong Cao&Peidu Chen* State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement,Nanjing Agricultural University, Nanjing210095,People’s Republic of China;*Author for correspondence(Phone:+86-25-84396026;E-mail: pdchen@https://www.doczj.com/doc/d510946383.html,) Accepted24October2005 Key words:peroxisomal ascorbate peroxidase,powdery mildew,SSH,wheat Abstract A full-length cDNA encoding wheat peroxisomal ascorbate peroxidase(pAPX)was cloned by Suppression Subtractive Hybridization(SSH)and in silico approach.The cDNA was1027bp in length and contained a complete ORF of876bp,which encodes a protein of292amino acid residues.Its deduced amino acids sequence had84%identity with that of pAPX from barley.The gene was designated as Ta-pAPX.The Ta-pAPX homologous genes were mapped on wheat chromosome7A and7D using Chinese Spring nulli-tetrasomic lines analysis.Northern analysis indicated that,after inoculation by Erysiphe graminis Dc.f.sp. tritici,the expression of Ta-pAPX gene in Yangmai5was enhanced,but its expression in wheat-Haynaldia villosa6VS/6AL translocation lines changed a little.The results implied that Ta-pAPX may be related to susceptibility of wheat to powdery mildew.The complete coding sequence of Ta-pAPX was cloned into an expression vector pET32(a+)and a protein with the same deduced molecular weight(MW)was expressed in E.coli BL21(DE3),which showed ascorbate peroxidase activity. Abbreviations:APX–ascorbate peroxidase;ESTs–expressed sequence tags;IPTG–isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside;MW–molecular weight;ORF–open reading frame;pAPX–peroxisomal ascorbate peroxidase;SSH–Suppression Subtractive Hybridization. Introduction Ascorbate peroxidase(APX),found in higher plants,cyanobacteria,and algae[1],is the key enzyme in degradation hydrogen peroxide.So far, at least?ve APX isoforms have been identi?ed in plants:cytosolic isoforms,mitochondria isoforms, peroxisomal/glyoxysomal isoform and two chlo-roplastie isoforms,one in stroma and the other associated with the thylakoid membranes,all of which catalyze the reaction: 2ascorbate peroxidasetH2O2! 2monodehydroascorbatet2H2O APXs activity increased in response to a num-ber of stress conditions,such as drought[2],salt [3],high temperature[4]and pathogen infection [5].Relationship between di?erent stress condi-tions and changes of APX activity were observed. Powdery mildew caused by E.graminis DC.f.sp.tritici is one of the most serious diseases of common wheat in China and many other countries.The Triticum aestivum(‘‘Yangmai5’’)–Haynaldia villosa6VS/6AL translocation line carrying powdery mildew resistance gene Pm:21 confers e?ective resistance to all current powdery mildew races.To investigate the mechanism of Molecular Biology Reports(2006)33:207–213 DOI10.1007/s11033-005-4536-1óSpringer2006