质谱定量的原则系列讲座（转自分析测试百科叮当空间）
质谱定量的原则01--目录：
1．质谱定量的简介
a) 总离子流
b) 选择离子监测（SIM）
c) 选择反应监测（SRM/MRM）
2．开发一个SRM方法
3．内标
4．PK/LC/MS/MS 药物代谢动力学的LC/MS/MS的反相液相色谱的方法开发5．样品制备
6．标准和标准曲线的准备
a) 做标准曲线的步骤
b) 标准曲线的稀释方案Scheme的举例
c) 标准曲线的运行
d) 进行标准品和样品的随机化
e) 系统运行的实用性
f) “QCs”质量控制
7．相关的PK资源
8．定量的技巧Tips
质谱定量的原则02——质谱定量的简介和LC/MS监测的模式
简介
本教程主要用于：使用质谱作小分子药代动力学分析，即PK/MS。除此之外，这些同样的原则也可用于生物基质中肽和蛋白的定量。
传统上，在使用现代质谱定量之前，定量是用HPLC高效液相色谱和UV紫外检测器实现的。HPLC 药代动力学分析建立在保留时间、峰面积和紫外光谱性质的
基础上的。HPLC方法的缺点是灵敏度不够、缺乏特异性。我们已经看到一些实例，一个化合物的确已经代谢了，然而保留时间和紫外光谱上，母离子和代谢物无法区分。这种缺少特异性的分析时不时会误导研究者。所以在药代动力学分析中，基于质谱的表征现在是一种新型的重要的工具。
质谱定量中已经被广泛接受的方式是MS/MS定量。这种定量常通过三级四极杆或离子阱质谱实现。要求使用MS/MS的原因是：许多化合物有同样的质量。当使用第一个维度即单级质谱MS去定量时，也会缺乏特异性，尤其是对于像血液那样的复杂的基质。第二个维度的MS（即MS/MS）在大多数情况下，能够提供唯一的断裂。合并特异的母离子质量和唯一的碎片离子信息，可以选择性地监测被定量的化合物。下面我们将讨论获得和可视化LC/MS数据的方法。
获得和可视化LC/MS的数据，或称为：质谱数据如何在一个LC/MS实验中表达？
典型的方法，质谱被设置为扫描特定的质量范围。在全扫描分析中，质量扫描范围较宽；在选择离子监测SIM时，质量扫描范围较窄。依赖于扫描的类型，一个独立的质量扫描时间可以从10 ms到5秒。在一次LC/MS分析中可获得许多个扫描。LC/MS数据的表示方法为：把每个质量扫描的离子流信息叠加，画出随时间变化的总离子流，横轴是时间，纵轴是强度。总离子流图非常像HPLC的紫外图，见图1。。
下面我们将讨论各种扫描的模式，和这些模式同质谱定量的关系。
最常见的LC/MS数据模式为：
（1）总离子流图
（2）选择离子监测（SIM）
（3）选择反应监测（SRM）或多反应监测（MRM）：MRM和SRM本质上是同样的实验模式。
全扫描分析
图1
从药代分析中得到的全质量范围的总离子流图（TIC）非常像HPLC UV图，除了：质谱能检测到更多的化合物，尤其是没有紫外吸收的化合物。总离子流是一
个叠加图，叠加了每个质量扫描的离子流。当一个小分子或小肽流出HPLC色谱柱时，相对强度上升，在TIC图上出现了一个峰，横轴是时间。每个质量的化合物都被记录在TIC图上。找出感兴趣的化合物可能是困难的，因为许多化合物有相同的质量。化合物的天然质量不是鉴定的唯一性数据。设置一个确定的质量，可以画出一个提取离子流图，但这个图的强度会比下面介绍的SIM实验中的强度低。
（注意：TIC指的是在一段时间内采集的质量扫描数据，不特指扫描范围或质谱实验的类型。例如，我们可以在SIM或SRM实验中获得TIC图。然而，为简单起见，我们将把这些图称为SIM和SRM图，而不是SIM TIC图。）
Selected Ion Monitoring选择离子监测
在选择离子监测中，质谱被设置为扫描一个非常小的质量范围，典型的是一个质量数的宽度。选择的质量宽度越窄，SIM的确定度越高。SIM图就是从非常窄的质量范围中得到的离子流图。只有被该质量范围选择的化合物才会被画在SIM 图中。图1和图2是同一个样品的谱图，然而它们看起来很不相同。原因是在SIM图中，画的是TIC图中较少的组分。SIM图是比TIC图更确定的图。
图2
然而，SIM图仍显示了许多峰，不能唯一地确认我们感兴趣的化合物。一个复杂的样品（比如血清或血浆）中，这样的图是一个典型的SIM图。许多化合物有同样的质量，在ESI中还有多电荷峰也和我们感兴趣的化合物有同样的m/z值。SIM实验比全扫描实验更灵敏，因为质谱在一个更小的质量范围上驻留（dwell）更长的时间。
Selected Reaction Monitoring选择反应监测（SRM）
SRM被大多数科学家在质谱定量中使用，见图3。SRM中，可以监测一个特征的唯一的碎片离子，在很多非常复杂的基质中进行定量。SRM图非常简单，通常只包含一个峰。这种特征性使SRM图成为灵敏度高且特异性强的理想的定量工具。
图3
SRM的过程：选择一个特征的母离子做MS/MS，在其碎片中选择一个特征的子离子作为监测离子。可以把SRM理解为碎片离子的SIM。这种特征性的实验被成为“transition”（跃迁），可以表示为：母离子→ 子离子，举例：534 → 375质谱定量的原则03——建立一个SRM Transition 534 → 375
一个定量分析方法应该是特征性的、高准确度和高灵敏度的。在不牺牲上述特性的前提下，建立方法应该尽可能地快速，质谱定量可以很好地满足这些规则。
在建立一个感兴趣的化合物的MS/MS碎片transition的时候，一种优化transition 的方法是用注射泵进样（syringe pump）该化合物来优化。
先在全扫描方式中优化母离子信号。因为MS/MS的灵敏度将依赖于化合物在全扫描模式中是否响应得好，要尽可能地优化全扫描的、非CID响应的MS信号。
然后优化碰撞能CE和碰撞气体，给出丰度最高的碎片离子。不能使用太大的碰撞能CE，因为太大的CE会丢失稳定的、有价值的碎片峰。“我应如何优化碎片峰？”可以用注射泵进样化合物，进行MS/MS，挑出一个稳定的碎片峰，当改变碰撞能和碰撞气体参数时监测它的离子流。最后当获得最大的碎片离子峰响应时确定碰撞能和碰撞气体参数。现代的三重四极杆质谱都可以自动优化。
从优化好的MS/MS谱中，选择一个合适的碎片峰用于定量监测。如图A所示，母离子质量为534，似乎从图B中可以很容易选择一个碎片峰做Transition。一个基本考虑是尽可能不要选择离母离子太近的质量。非常常见的，是化合物的失水峰或失氨（ammonia）峰，例如：534－517＝17。我们应尽可能不要选择失水峰或失氨（ammonia）峰做SRM，因为这会导致一个不是很特异的transition。这里，Transition 534 → 375是一个好的选择。另外要注意的是：要选择一个稳定的峰。当直接进样化合物时，被选择做Transition的峰必须每次扫描响应都一致。
提示：当优化MS条件时，最好能模拟实际做样的条件。例如：实际做样时色谱流速是400 ul/min，化合物在30%有机相时流出，用注射泵进样优化MS条件时最好模拟这个条件，即设置HPLC流速为400 ul/min，30%有机相；然后用三通注入化合物。
同时，第一次优化实验时，我们可以选择60/60的梯度，去表征化合物的疏水性，从而得知它在C18反相柱上的色谱行为。如果你对所有的化合物都按这样的方法实验，你就可以建立一个洗脱数据库，可以作为将来实验的参考。
注：60/60梯度的意思是：梯度从近100% 水相开始，在60分钟内到达60%有机相。
质谱定量的原则04——内标
在做MS定量时应该使用内标。选择一个合适的内标，将能减少因为样品提取、HPLC进样和离子化的多样性造成的差异。在复杂基质的分析中，在SRM积分图上，在标准曲线的低端，常会见到：两个不同的浓度水平，会给出近乎一致的响应。只有当使用一种内标时，这两个点才能被区分。一些研究者试图在实验中不用内标去做标准曲线，但成功率不高。我们在标准曲线上每个浓度水平都重复进样3次。没有内标的情况下，重现性％RSD常常会高于20%；而当使用内标时，%RSD能降低到近2%。
我要如何选择一个内标?
最好的内标是待定量的化合物的同位素内标。同位素标记的内标将和待测物有相似的回收率、ESI离子化响应，和相似的色谱保留时间。如果你运行的不是临床药代动力学定量，可能很难判断上述说法，因为特殊的合成一个同位素标记的内标，是非常昂贵和耗时的。
通常，如果你和一个医学的化学家工作，他们会有一个化合物相似物库，可以被用作内标。这些类似物，在化合物合成中被测试，和该化合物性质相似可以被用户定量内标，而且更重要的是，这些类似物和该化合物的母离子质量有微小的差异。
尽量不要使用去甲基化（－14）或者是氧化的（＋16）的类似物作内标，因为待
测化合物的母离子常会发生同样的代谢。
常见的做内标的类似物是氯代的化合物。氯代的化合物类似物会和待测化合物有相似的色谱保留时间，这是内标的一个重要特性。我们已经发现内标物的一个最重要的特性是它和待测化合物共流出。
我该如何使用内标？
首先，内标添加需在样品测试方法的开始阶段，典型的，应在血浆crash或固相萃取之前。内标应用同一浓度水平添加（包括标样）。内标应给出可靠的质谱响应。应该注意的是：内标的量应添加得合适，应高于定量限，但不能过高，因为过高的内标响应会抑制被分析物的离子化。“我应该添加多少量的内标？”这是一个重要的问题。通过做一些试分析：早、中、晚的时间点，也许一个或两个标准点，你应该知道你的样品中化合物的大概量。这些信息非常有价值，可以帮助建立一个合适的标准曲线，并知道应添加多少量的内标。举例来说：如果待定量的样品浓度范围是100 fg ～25 pg，检测限是100 fg，你应该添加5～10 pg的内标。一个好的经验法则是：内标物的量大概是标准工作曲线浓度最高点的1/3。这将给出一个比较不错的响应，并且不会抑制和干扰待测样品的离子化。见图1
图1 内标的量（内标.gif）
质谱定量的原则05——液相色谱串联质谱联用药代动力学方法开发
更快就是更好！在每一个药代动力学分析中更快就是更好！
样品组/系列包括：重复的标准品，QC质控样品，和样品，加起来大概要进行300次分析。如果每个样品实验耗时15分钟，整套分析要75个小时。高要求的实验（加上质谱）总计要超过3天时间。一些该领域的研究者可以只花1～2分钟分析一个样品；而大多数的PK/MS的实验室一般很容易做到花3～4分钟分析
一个样品。如果对上面同样的300个样，4分钟一个实验的话，总分析时间可减少到20个小时。所以，每分钟都是很重要的！在2mm×30～50mm反相短柱上可以获得快速的梯度和快速的平衡时间。LC/MS的非药动实验中，流速一般为200 μl/min.，而在LC/MS的药动实验中，流速一般设为400 ～1000 μl/min。更快的流速有助于加速洗脱和平衡。下面是典型的LC/MS药动实验条件：
LC/MS药动实验方法：
色谱柱：2.1 X 50 mm, 5 μm , 100 ? , C18
柱温：40℃
流动相：A 为水相（0.1% 甲酸），B为乙睛（0.1%甲酸）
流速：400μl/min
梯度：Time(min.)%B
025
280
2.125
425
Notes：
a ) 调节初始的％B使其适应该化合物
b ) 试着减少梯度时间到1分钟以缩短方法时间
优化梯度：
当然你要对每个化合物特别的进行方法优化。我们推荐创建一个色谱数据库，详细地记录实验室接手的各个化合物的疏水性（可以运行60/60方法完成）。当你需要挑选一个相似疏水性的内标时，这样的色谱数据库将非常有用。在长时间的梯度中，％B的起始值一旦明确，那么在缩短时间时，就把％B的值降10%。举例来说，如果％B初始值是40%，那么在运行液质药动方法时，起始值%B就是30%。这种方法将确保你的化合物可以留在你的柱子上。
优化柱子和流动相：
在上面举例的液相条件中，一些化合物有可能响应得不好。一些化合物可能要求不同的有机改性试剂或有机相。一般，磷酸盐不适用于质谱。有些人用10～20mM 低浓度的醋酸铵作A相缓冲盐。另一些人合并甲醇和乙睛在B相中。如果你的化合物峰形不好，需要改变几个或者所有的实验参数。必须选用合适的柱子去获得好的回收和好的峰形。
帮助提示：
1）一个质谱实验室可能要整日忙着做色谱方法开发，尤其是如果这个实验室每周要接5～10个新化合物样品。在组合化合物和它们的内标，进行组合的色谱方法开发方面我们颇有心得。并不是所有的化合物适用于这种方式，但是这个方法为我们节省了大量的方法开发的时间。当我们发现做6个化合物混合样的方法开发时间，和一个化合物的几乎一样时，这个在新的组合给药（cassette dosing）方
法开发中，该方法就变得非常有用。
注：cassette dosing是一种新的给药方法，称为盒式给药法，又称为组合给药技术，由Ber- man等提出，即给动物同时服用几种药物，按常规取样时间取血，运用HPLC联用技术进行样品处理分析。
2）加速方法开发。许多常见化合物如布洛芬已经有人建立了方法，检索一下文献、互联网和USP的出版物，查到这些方法。不要浪费时间从头开始!
3）组合给药技术常常加速化合物筛选过程。许多研究者不愿做组合实验技术，是因为害怕药物-药物相互作用。一种可取的方式是给药后合并化合物。合并上述的方法开发方法，可以为任务重的实验室节省大量的时间。
4) HPLC自动进样器往往是出奇的慢，记得在平衡时间里考虑自动进样器，因为当自动进样器工作时，柱子是在初始化（initial）条件下被清洗的，必须在平衡时间里考虑这个时间。你可以从方法里砍掉30～60秒的平衡时间。要分秒必争嘛！从300个样品分析中，每个砍掉30～60秒，就是5个小时啊！
质谱定量的原则06—样品的制备（适用于液质药动分析的样品制备）
样品一般在血浆或血清中。离心去除血液里的血细胞获得血浆。血液凝固后去除固体得到血清样品。凝固血液清除血液细胞和凝血因子。血清比血浆易于处理，因为凝血因子已经被去除。当使用储存的血浆时，常会发现蓬蓬的凝块物，使样品很难进入吸液管pipette。不管是血清还是血浆，在进入反相柱分析前都要作进一步的处理。下面会讨论几种的方法用以制备可以用作液质药动分析的血浆和血清样品。
血浆破碎（crash）（有时称蛋白沉降）
血浆破碎/蛋白沉降是最常用的方法，因为它一般不要求特殊的仪器。用乙睛或甲醇沉淀去除丰度的白蛋白。
一个典型的方法描述如下：
前处理血浆蛋白沉淀.jpg (26.75 KB)
血浆破碎（crash）/蛋白沉降方法：
1）放50?l血浆或血清在0.5毫升管中
2）加10?l内标
3）添加140?l冷(冻)的有机溶剂（乙睛或甲醇）然后涡旋
4）冷冻样品2小时
5）稍稍离心样品，分离出沉淀的蛋白
6）取150?l上清液至一干净管，加150?l液相的A相(水相).
在这时，样品里含的有机相大概为38％。如果你的化合物要求更低的有机相，来保留在色谱柱上，应增加第6）步添加的水相的量。
7）把6）项的样品，进行HPLC进样做液质联用的药动分析。
固相萃取：
许多人首选固相萃取法SPE。在SPE中，血浆或血清被直接加入一个疏水的固相中，一般是C18小柱。加入后，用有机相淋洗小柱，则感兴趣的小分子会被洗脱下来。SPE可以是手动的，也可以是小批量的。手动的SPE制备方法限制了样品的通量。可以用96孔板做自动化。一些人认为96孔板非常贵，一个96孔板大约为100美元，但是痕量成本时应该考虑易用性和最终产品的贡献。一些人发现：用于液质联用药动分析的最终洗提液（eluant）质量更好，反相柱的附着物和质谱信号的滚动（roll-off）发生在较低的速率。
液液萃取：
必须承认我们在这方面没有很多经验。这里是我所知道的。液液萃取只工作在那些可以分隔进入有机相的化合物。它可能是一种样品净化的有效方法。然后，这种技术很难自动化。
药代的各种样品处理
这是一个补充的图，一种列表的方式，介绍各种前处理。
各课题组，都根据自己的需要选择方式。
梦想的方法是：简单的沉淀、离心蛋白法。这时候可能有堵的问题，因为处理非常简单，也许会堵。所以各个用户买液质的时候会问卖液质的销售一个silly question：你们的仪器是不是可以直接做沉淀蛋白的，而不堵啊？
问的可爱，答的“精彩”！
质谱定量的原则07——质谱药动定量分析的标准物和创建标准曲线
简介
完整的定量分析依赖于参考标准的质量。一种合格的参考标准，应能通过（pass）一系列定性参考标准的测试。参考标准的定性测试要设计为：充分地表征参考标准的质量和含量。如果参考标准的含量不对，那么建立在其上的定量分析一定是错的。然而，当进行“研究性药动”时，可能没有足够的时间去充分地表征化合物，因为很简单，在一周内，实验室要做三种新化合物。所以，当面临开发一种“研究型药动”方法时，实验室应努力建立一个假定的参考标准，在做整套化合物实验室保持不变，而且实验室能够永久地获得该假定参考标准，用于日后的参考。这个步骤能确保：每个相对于这个假定的参考标准的药动实验能够被测量。创建标准曲线的步骤在定量分析中也至关重要。
为了使分析可靠，这个参考标准必须可靠，在创建标准曲线上的每一点时，每一次称重和取液都必须准确无误。下面我们介绍，在液质药动定量分析中典型的创建标准曲线的方法。
创建标准曲线
汇集所有可能知道的关于未知样品浓度范围的信息，可以有计划地绘制标准曲线。以前曾介绍过一个快速的估算方法，早、中、晚的时间点伴随着低、中、高浓度的标准。鬼峰将允许创建一个更适当的标准曲线范围，并会告诉你应注入多少量的样品。这些步骤可以使你免于重复长时间的开发。有些时间点可能包含高浓度的目标化合物。这个初步的分析可以告诉你是否稀释，例如，最早的时间点乘以10倍，让你建立一个更合适的标准曲线。
标准曲线稀释方法举例（你用的实际步骤可能与此区别很大，只把这个例子作为参考）
在下表中的稀释步骤描述了一个3X, (3X50 μl)制备过程，以表达最能模拟未知样
品制备的实际情况。这个表包括了：加入有机溶剂做蛋白沉降。标准样品的制备和用于分析的注入的体积，应该反映未知样品的分析工作。
称出大约1毫克的参考标准,并重组为一个10 ug/毫升，称量不到1毫克可能增大称重误差的可能性并传递误差。一些疏水化合物可能要求两步的重组。例如，一种疏水化合物可能不能溶于含水量高的溶液。试着在少量的DMSO中溶解这种化合物，然后在含最低量有机溶剂的溶液（这时化合物是稳定和可溶的）中重组。供应这些化合物用以评估的药用化学家，常常给出你关于溶解度和稳定性的建议。
（警告：这种稀释方法可能会出错，你必须验证它。）
参考标准浓度=10 μg/毫升（在不含血清的溶液中制备）
溶液A = 1 μg/ml (100 μl 参考标准+ 900 μl血清)
溶液B = 100 pg/ml (10 μl参考标准+ 990 μl 血清)
溶液C = 10 pg/ml (10 μl参考标准+ 9990 μl 血清)
溶液D = 1 pg/ml (10 μl 溶液 B + 990 μl 血清)
下载标准曲线法standardcurve.rar (4.23 KB)
（注意这个稀释程序可能有错，你必须验证它）
方法注意：
1．在加入有机物沉淀蛋白前，内标应与样品充分混合。尽可能地加入低浓度有机相的内标，这样不会引起永久的沉淀。如果可能的话，用在血清中制备的内标储液最好。
2．溶液A，B，C和D应该在血清中制备，这样标准曲线的样品更接近未知
的、在基质中的实际样品。
3．当创建标准曲线时，应避免系列的稀释。因为如果在第一次稀释时，如果犯了一个错误，那么系列的稀释将造成错误漫步在整个标准曲线上。
4．在配置溶液时，不要吸取< L的液体，更小的体积将导致更大的误差。并且，确保你的移液管是校正过的。 10
5．用于这个步骤的血清总量是12.7 mL。
运行标准曲线：
由于标准曲线常常跨越三个（浓度）数量级，通常，标准样品从低浓度～高浓度依次做样。这个步骤保证不受高浓度标样的色谱交叉污染。在标准曲线运行完后，要进几针空白，直到看不到明显的色谱的记忆效应。同样的，样品组经常运行在相反的顺序，即：先运行最后的时间点，最后运行最早的时间点。因为，最早的时间点样品浓度最高，所以交叉污染的可能性最大。药动时间段之间，应该进几针空白的含水溶剂分隔开来，以避免交叉污染。
标准和样品的随机化：
有些实验室在实验前，有样品随机化的方法。这个步骤确保不歧视任何样品。随机化的程序经常使用完全被表征和认证过的色谱方法。如果你遵循随机化的程序，最后你一定确信有有一个稳健的（robust）色谱方法，而不会产生显著的交叉污染。如果要使用随机化方法，认证方法中应包含随机化方法的适应性。
运行系统的适用性（system suitability）:
系统适应性是任何分析中一个最重要的组成部分。在运行样品前，先要通过（pass）系统适应性。系统适应性提供了在正式做大量样品前，HPLC，柱子，质谱充分运行的合理保证。然而真实情况是，即使你通过了初始化的指标测试，你的系统也可能在分析的任何点死机。所以，在没通过系统适应性以前永远不能开始做样！
系统适应性的测试回答了这个问题：“我这样做分析对么？我应该继续做样品分析么？” 不同的实验室、不同的分析，系统适应性都不同。在我们的实验室，用于定量分析的系统适应性包括：色谱峰形计量；达到一个定义好的允许的检出限；运行全部的标准曲线；在进实际样品前通过一定的计量要求的％RSD，和最终通过空白样品测试。由于色谱柱可能会在大量样品组运行的中间失效，我们制订了一条规则：一旦运行了500次血浆沉淀进样的样品，就更换色谱柱。大量的实验花费大量的时间和金钱，及时更换柱子确保了省时省钱。我知道，很难丢掉一个好的HPLC色谱柱，但是最终，实验室将会花费较少的时间去做那些导致停止工作的故障诊断。
“质控”“QCs”
质控是指使用一系列标准品，去检查上面描述的标准曲线的准确度。质控通常设置在标准曲线的低、中、高三个区域，和未知样穿插进行。可以把质控看成是独立的衡量参考标准。在最严格的意义上，质控应由第二个独立的分析人员衡量参考标准。这个独立的标准，即质控样，对操作者进行控制并消除歧视，提供必要的、官方标准曲线的有效性的双检测。质控样本的评估，对判断某个特定的分析是否有效有着重要的影响。把质控样本放入初始的系统实用性的评估中，同时将它们穿插入未知样本分析中是明智的。
结束
福建省地方计量技术规范 JJF（闽）1032－2010 液相色谱-质谱联用仪校准规范 Calibration Specification for Liquid Chromatography —Mass Spectrometers 2010－03－01发布2010－03－10实施 福建省质量技术监督局发布
JJF （闽）1032－2010 1 液相色谱-质谱联用 仪校准规范 Calibration Specification for Liquid Chromatography — Mass spectrometers 本规范经福建省质量技术监督局于2010年03月01日批准，并自2010年03月10日起施行。 归 口 单 位：福建省质量技术监督局 起 草 单 位：福建省计量科学技术研究所 本规范由起草单位负责解释 JJF （闽）1032－2010
JJF（闽）1032－2010 本规范主要起草人： 许航（福建省计量科学技术研究所）参加起草人： 杨乙强（泉州市产品质量检验所） 林峰（福建省计量科学技术研究所） 陈小燕（福建省计量科学技术研究所） 蔡泽兵（漳州市计量所） 罗峰（福建省计量科学技术研究所） 2
JJF（闽）1032－2010 目录 1 范围 (1) 2 引用文献 (1) 3 术语和计量单位 (1) 3.1大气压离子化（atmospheric pressure ionization, API） (1) 3.2质荷比；m/z (1) 3.3质量范围（mass range） (1) 3.4原子质量单位u（atomic mass unit） (1) 3.5 分辨力（resolution） (1) 3.6 信噪比（signal-to-noise ratio, S/N） (1) 4 概述 (2) 5 计量性能要求 (2) 6 校准条件 (3) 6.1实验室环境要求 (3) 6.2校准设备及标准物质 (3) 7 校准项目和校准方法 (3) 7.1分辨力 (3) 7.2质量准确性 (3) 7.3质量范围 (3) 7.4信噪比 (3) 7.4.1 ESI正离子 (4) 7.4.2 ESI负离子 (4) 7.4.3 APCI正离子 (4) 7.5整机定量及定性重复性 (4) 8 校准结果的处理 (4) 9 复校时间间隔 (5) I
串联质谱如何定量？ 串联质谱定量时,是以后面产生的碎片峰（子离子）定量,但是这一子离子是由母离子在碰撞室产生的特征性碎片，所以用MRM定量灵敏度会比用SIM定量好很多。 建立方法的步骤是：用一定溶度的标准品溶液（1-10 ug/mL）Tune化合物的一级质谱条件，找到母离子的最佳质谱条件，然后对母离子进行打碎，优化碰撞能量，得到其特征性的子离子。最后利用该质谱条件和该母离子->子离子对进行定量。 API和ABI如何区别？ 但API也是Atmosphere Pressure Ionization （大气压电离，包括ESI、APCI和最新的大气压光电离APPI）的简称，API是LCMS的关键，因为这一技术最开始是ABI公司发明的，所以ABI的LCMS和LCMSMS都以API命名，常见的型号有API2000，API3000，API4 000。您问的API也可能是指这个。 Q-Tof中的Q是什么意思？？ Q就是指的四极杆，TOF是指的飞行时间。QQQ是三重四极杆。两者是四极杆－飞行时间的串联一般的四极杆串联都是三重四极杆的空间串联，至于纯粹的二重四极杆没有听说过，但是QQ-TOF有没有就不是很清楚 质量偏差怎么办？ 不知道你用的是哪个厂家的仪器，应该每个厂家都会随机带有校正液。 质谱的质量数偏了，说明你的仪器该校正了，一般3个月就要校一次机。 做样前－检查氮气，流动相，质谱仪的真空度，毛细管温度，… 1 最好不用直接进样（容易污染离子源）！ 2 做联用时最好分流（a可以使用常规柱，b缩短分析时间，c 延长质量分析器寿命） 3 最好使用在线切换阀，降前每个样品的前后1－2分钟的流动相切入废液（避免样品中的盐进入质谱，做Sequence时可以把平衡柱子的流动相切入废液） 4 开始联用前，直接运行质谱数分钟，可以先将温度（毛细管温度和离子源温度（APCI））加热到预设定值（如果是APCI源还可以避免将烧掉heater，很贵的，我烧掉过一个） 5 待机时将切换阀置于waste，避免刚开液相时将流动相打入离子源， 6 关机前毛细管的温度先降下来，稳定一段时间后再关闭电源，避免风扇停止转动后毛细管外围的热量向里扩散，容易引起内部线路及电子元器件老化加速， 7 每天清理毛细管口外部，擦洗干净，每次停机时注意清洗Skimmer，用无尘擦拭纸，kimberly 那种， 8 如果用的是钢瓶而且天天做样的话，将两个钢瓶并联，当然，一月不做一次的话就算了， 9 做定量时注意离子源喷针的具体位置，否则标准曲线就不能用了， 10 不要不经过柱子分离进行定量分析，结果不可靠（竞争性抑制目标分子离子化） 11 如果是负离子检测的话，可以相流动相中加入少量异丙醇， 12 不好使用不挥发性盐，可以使用挥发性盐，但浓度不要超过20mmol/l 13 需要使用酸的情况下可以用甲酸，乙酸，三氟乙酸可以用，但能用甲酸或乙酸时就别用TFA
有机质谱解析 第一章导论 第一节引言 质谱，即质量的谱图，物质的分子在高真空下，经物理作用或化学反应等途径形成带电粒子，某些带电粒了可进一步断裂。如用电子轰击有机化合物（M），使其产生离 子的过程如下： 每一离子的质量与所带电荷的比称为质荷比(m/z ,曾用m/e)。不同质荷比的离子经质量分离器一一分离后，由检测器测定每一离子的质荷比及相对强度，由此得出的谱图称为质谱 质谱分析中常用术语和缩写式如下： 游离基阳离子，奇电子离子（例如CH4） (全箭头) 电子对转移 钩）单个电子转移 α断裂αY ；与奇电子原子邻接原子的键断裂（不是它们间 的键断裂） “A”元素只有一种同位素的元素（氢也归入“A”元素）。 “A+1”元素某种元素，它只含有比最高丰度同位素高1amu 的同位素。 “A+2”元素某种元素，它含有比最高丰度同位素高2 amu的同位素。 A峰元素组成只含有最高丰度同位素的质谱峰。 A+1峰比A峰高一个质量单位的峰。 分子离子（M）失去一个电荷形成的离子，其质荷比相当于该分子的分子量。 碎片离子：分子或分子离子裂解产生的离子。包括正离子（A+）及游离基离子（A+.）。 同位素离子：元素组成中含有非最高天然丰度同位素的离子。 亚稳离子（m*）离子在质谱仪的无场漂移区中分解而形成的较低质量的离子。 质谱图上反应各离子的质荷比及丰度的峰被称为某离子峰。 基峰：谱图中丰度最高离子的峰 绝对丰度：每一离子的丰度占所有离子丰度总和的百分比，记作%∑。 相对丰度：每一离子与丰度最高离子的丰度百分比。
第二章谱图中的离子 第一节分子离子 分子离子（M+）是质谱图中最有价值的信息，它不但是测定化合物分子量的依据，而且可以推测化合物的分子式，用高分辨质谱可以直接测定化合物的分子式。 一、分子离子的形成 分子失去一个电子后形成分子离子。一般来讲，从分子中失去的电子应该是分子中束缚最弱的电子，如双键或叁键的π电子，杂原子上的非键电子。失去电子的难易顺序为： 杂原子> C = C > C —C > C —H 易难 分子离子的丰度主要取决于其稳定性和分子电离所需要的能量。易失去电子的化合物，如环状化合物，双键化合物等，其分子离子稳定，分子离子峰较强；而长碳链烷烃，支链烷烃等正与此相反。有机化合物在质谱中的分子离子稳定度有如下次序：芳香环> 共轭烯> 烯>环状化合物> 羰基化合物> 醚>酯> 胺> 酸> 醇>高度分支的烃类。
质谱法基本知识（22）—质谱定量分析 1.同位素测量 同位素离子的鉴定和定量分析是质谱发展起来的原始动力，至今稳定同位素测定依然十分重要，只不过不再是单纯的元素分析而已。分子的同位素标记对有机化学和生命化学领域中化学机理和动力学研究十分重要，而进行这一研究前必须测定标记同位素的量，质谱法是常用的方法之一。如确定氘代苯C6D6。的纯度，通常可用C6D6+与C6D5H+、C6D6H2+等分子离子峰的相对强度来进行。对其他涉及标记同位素探针、同位素稀释及同位素年代测定工作都可以用同位素离子峰来进行。后者是地质、考古等工作中经常进行的质谱分析，一般通过测定36Ar／40Ar（由半衰期为 1.3×109α的40K之K俘获产生）的离子峰相对强度之比求出4OAr,从而推算出年代。 2.无机痕量分析 花源的发展使质谱法可应用于无机固体分析，成为金属合金、矿物等分析的重要方法，它能分析周期表中几乎所有元素，、灵敏度极高，可检出或半定量测定10-9范围内浓度。由于其谱图简单且各元素谱线强度大致相当，应用十分方便。 电感耦合等离子光源引入质谱后（ICP－MS），有效地克服了火花源的不稳定、重现性差、离子流随时间变化等缺点，使其在无机痕量分析中得到了广泛的应用。
3．混合物的定量分析 利用质谱峰可进行各种混合物组分分析，早期质谱的应用很多是对石油工业中挥发性烷烃的分析。 在进行分析的过程中，保持通过质谱仪的总离子流恒定，以使用于得到每张质谱或标样的量为固定值，记录样品和样品中所有组分的标样的质谱图，选择混合物中每个组分的一个共有的峰，样品的峰高假设为各组分这个特定m／z峰峰高之和，从各组分标样中测得这个组分的峰高，解数个联立方程，似求得各组分浓度。 用上述方法进行多组分分析时费时费力且易引入计算及测量误差，故现在一般采用将复杂组分分离后再引入质谱仪中进行分析，常用的分离方法是色谱法。
Introduction to MS Quantitation and Modes of LC/MS Monitoring Introduction This tutorial applies to the quantitation of small molecules using mass spectrometry in pharmacokinetic analysis, also known as PK/MS. In addition these very same principles can be applied to the quantitation of peptides and proteins in biological matrices. Traditionally before the advent of modern-day mass spectrometry quantitation was accomplished using HPLC and UV detection. HPLC PK analysis relied on; retention time, peak area and UV spectral character. Unfortunately the HPLC assay suffered from lack of sensitivity and specificity. We have seen examples where a molecule was extensively metabolized and yet the retention time and UV spectral character remained the same as the parent compound. This lack of specificity will from time to time mislead the investigator. MS characterization is now a vital new tool in pharmacokinetic analysis. The accepted way of performing mass spec quantitation is by using a mass spectrometer capable of MS/MS fragmentation. MS/MS used in conjunction with quantitation is commonly accomplished with a triple quadrupole or ion trap mass spectrometer. The reason MS/MS is required is because many compounds have the same intact mass. While many researchers use the first dimension of MS to perform quantitation, that technique again suffers from lack of specificity especially in very complex matrices like blood. The second dimension of MS fragmentation in the majority of cases provides a unique fragment. The combination of the specific parent mass and the unique fragment ion is used to selectively monitor for the compound to be quantified. Below we will discuss the method for acquiring and visualizing LC/MS data. Modes of acquiring and visualizing LC/MS data, or how MS data is represented in an LC/MS run. Typically the mass spectrometer is set to scan a specific mass range. This mass scan can be wide as in the full scan analysis or can be very narrow as in selected ion monitoring. A single mass scan can take anywhere from 10 ms to 5 s depending on the type of scan. Many scans are acquired during an LC/MS analysis. LC/MS data is represented by adding up the ion current in the individual mass scans and plotting that "totaled" ion current as an intensity point against time. The resulting plot is a plot that looks very much like an HPLC UV trace, see Figure 1 below. Below we will discuss the modes of scanning and acquiring MS data and their relevance to MS quantitation. The most common modes of acquiring LC/MS data are : (1) Full scan acquisition resulting in the typical total ion current plot (TIC) (2) Selected Ion Monitoring (SIM)
质谱分析方法 质谱仪种类很多，不同类型的质谱仪的主要差别在于离子源。离子源的不同决定了对被测样品的不同要求，同时所得到信息也不同。质谱仪的分辨率也非常重要，高分辨质谱仪可以给出化合物的组成式，这对于未知物定性是至关重要的。因此，在进行质谱分析前，要根据样品状况和分析要求选择合适的质谱仪。目前，有机质谱仪主要有两大类：气相色谱-质谱联用仪和液相色谱-质谱联用仪，现就这两类仪器的分析方法叙述如下： GC-MS分析方法 GC-MS分析条件的选择 在GC-MS分析中，色谱的分离和质谱数据的采集是同时进行的。为了使每个组分都得到分离和鉴定，必须设备合适的色谱和质谱分析条件。 色谱条件包括色谱柱类型（填充柱或毛细管柱），固定液种类，汽化温度，载气流量，分流比，温升程序等。设置的原则是：一般情况下均使用毛细管柱，极性样品使用极性毛细管柱，非极性样品采用非极性毛细管柱，未知样品可先用中等极性的毛细管柱，试用后再调整。当然，如果有文献可以参考，就采用文献所用条件。 质谱条件包括电离电压，电子电流，扫描速度，质量范围，这些都要根据样品情况进行设定。为了保护灯绿和倍增器，在设定质谱条件时，还要设置溶剂去除时间，使溶剂峰通过离子源之后再打开灯绿和倍增器。 在所有的条件确定之后，将样品用微量注射器注入进样口，同时启动色谱和质谱，进行GC-MS分析。 GC-MS数据的采集 有机混合物样品用微量注射器由色谱仪进样口注入，经色谱柱分离后进入质谱仪离子原在离子源被电离成离子。离子经质量分析器，检测器之后即成为质谱仪号并输入计算机。样品由色谱柱不断地流入离子源，离子由离子源不断的进入分析器并不断的得到质谱，只要没定好分析器扫描的质量范围和扫描时间，计算机就可以采集到一个个的质谱。如果没有样品进入离子源，计算机采集到的质谱各离子强度均为0。当有样品过入离子源时，计算机就采集到具有一定离子强度的质谱。并且计算机可以自动将每个质谱的所有离子强度相加。显示出总离子强度，总离子强度随时间变化的曲线就是总离子色谱图，总离子色谱图的形状和普通的色谱图是相一致的。它可以认为是是用质谱作为检测器得到的色谱图。 质谱仪扫描方式有两种：全扫描和选择离子扫描。全扫描是对指定质量范围内的离子全部扫描并记录,得到的是正常的质谱图,这种质谱图可以提供未知物的分子量和结构信息。可以进行库检索。质谱仪还有另外一种扫描方式叫选择离子监测(select ion Moniring SIM)。这种扫描方式是只对选定的离子进行检测,而其它离子不被记录。它的最大优点一是对离子进行选择性检测，只记录特征的、感兴趣的离子，不相关的，干扰离子统统被排除，二是选定离子的检测灵敏度大大提高。在正常扫描情况下，假定一秒钟扫描2-500个质量单位，那么，扫过每个质量所花的时间大约是1/500秒,也就是说，在每次扫描中，有1/500秒的时间是在接收某一质量的离子。在选择离子扫描的情况下，假定只检测5个质量的离子，同样也用一秒，那么，扫过一个质量所花的时间大约是1/5秒。也就是说，
比较常见质谱性能和特点 液相色谱:动情品人间冷暖,静心观乾坤西东 查看原文 浏览全文 2009-03-25 比较常见的质谱性能和特点 比较一下常见的质谱性能和特点比较一下常见 的质谱性能和特点 编辑 ?结构简单、成本低 ?维护简单 ?定量能力强 ?是多数检测标准中采用的仪器设备。 缺点： o无串极能力，定性能力不足 o分辨力较低（单位分辨），存在同位素 和其他m/z近似的离子干扰 o速度慢 o质量上限低（小于1200u） 厂家： o安捷伦597x系列 o PE/Sciex Clarus系列
o Finnigan DSQ系列 o瓦里安320系列 o岛津2010系列 四极杆质谱原理 编辑 ?分辨能力好，有助于定性和m/z近似离子的区别，能够很好的检测ESI电喷雾离子源产 生多电荷离子。 ?速度快，每秒2～100张高分辨全扫描（如50～2000u）谱图，适合于快速LC系统（如 UPLC） ?质量上限高（6000～10000u） 缺点： o无串极功能，限制了进一步的定性能力 o售价高于QMS o较精密，需要认真维护 编辑
?有串极功能，定性能力强 ?定量能力非常好，信噪比高于QMS ?是常用的QMS结果确认仪器 ?除一般子离子扫描功能外，QQQ还具有SRM、MRM、母离子扫描、中性丢失（Neutral loss） 等功能（离子阱不行）对特征基团的结构研 究有很大帮助 缺点： o分辨力不足，容易受m/z近似的离子干 扰 o售价较高 o需要认真维护 o同时具备MRM、SRM、中性丢失和多级串级功能，非常适合于未知样品的结构解 析
缺点 ?分辨力还是低了点 厂家： ?ABI/Sciex， QTrap系列质谱 编辑 ?成本比QQQ低廉，体积小巧 ?具备多级串级能力，适合于分子结构方面的定性研究，能够给出分子局部的结构信息，比QQQ好 ?有局部高分辨模式（Zoom Scan），分辨力比四极杆质谱高数倍，达到6000～9000，适合于确定离子质量数 缺点： o定量能力不如QMS和QQQ，所以大多数GCMS不采用离 子阱质谱 o不能够像QQQ一样做母离子扫描和中性丢失，在筛选
质谱介绍及质谱图的解析（来源：小木虫）质谱法是将被测物质离子化，按离子的质荷比分离，测量各种离子谱峰的强度而实现分析目的的一种分析方法。质量是物质的固有特征之一，不同的物质有不同的质量谱——质谱，利用这一性质，可以进行定性分析（包括分子质量和相关结构信息）；谱峰强度也与它代表的化合物含量有关，可以用于定量分析。 质谱仪一般由四部分组成：进样系统——按电离方式的需要，将样品送入离子源的适当部位；离子源——用来使样品分子电离生成离子，并使生成的离子会聚成有一定能量和几何形状的离子束；质量分析器——利用电磁场（包括磁场、磁场和电场的组合、高频电场、和高频脉冲电场等）的作用将来自离子源的离子束中不同质荷比的离子按空间位置，时间先后或运动轨道稳定与否等形式进行分离；检测器——用来接受、检测和记录被分离后的离子信号。一般情况下，进样系统将待测物在不破坏系统真空的情况下导入离子源（10-6～10-8mmHg），离子化后由质量分析器分离再检测；计算机系统对仪器进行控制、采集和处理数据，并可将质谱图与数据库中的谱图进行比较。 一、进样系统和接口技术 将样品导入质谱仪可分为直接进样和通过接口两种方式实现。 1. 直接进样 在室温和常压下，气态或液态样品可通过一个可调喷口装置以中性流的形式导入离子源。吸附在固体上或溶解在液体中的挥发性物质可通过顶空分析器进行富集，利用吸附柱捕集，再采用程序升温的方式使之解吸，经毛细管导入质谱仪。 对于固体样品，常用进样杆直接导入。将样品置于进样杆顶部的小坩埚中，通过在离子源附近的真空环境中加热的方式导入样品，或者可通过在离子化室中将样品从一可迅速加热的金属丝上解吸或者使用激光辅助解吸的方式进行。这种方法可与电子轰击电离、化学电离以及场电离结合，适用于热稳定性差或者难挥发物的分析。 目前质谱进样系统发展较快的是多种液相色谱/质谱联用的接口技术，用以将色谱流出物导入质谱，经离子化后供质谱分析。主要技术包括各种喷雾技术（电喷雾，热喷雾和离子喷雾）；传送装置（粒子束）和粒子诱导解吸（快原子轰击）等。
实验室练习6：数据定量分析 积分 实验室练习6：数据定量分析 在这个实验中,您将建立具有三个浓度级别的校正数据库,并将其保存为方法的一部分。该方法用于未知物的定量计算。 在这个实验中： ?获取所需信息以设置校正方法 ?建立一个5 个浓度级别的含内标的校正数据库 ?定量一个未知化合物 对以下化合物进行定量：
实验室练习6：数据定量分析积分
实验室练习6：数据定量分析 积分积分 精确定量的重要因素之一是正确积分。 1)通过选择File/LoadDataF ile…调用 C:\MSDCHEM\1\DATA\VOADATA\ CLWV020.D 文件，选择 Method / Load Method…调用DEFAULT.M 方法。 2)选择Chromatogram / Select Integrator及RTE Integrator单击 OK。OK 对积分来说只是临时选择。 现在让我们对 caffein设定积分参数。 3)选择Chromatogram / Extract Ion Chromatograms…完成图1 所示 的需要输入的项目（注意时间范围）单击OK。 NOTICE 图 1 4)现在编辑RTE的缺省积分参数。选择Chromatogram / MS Signal Integration Parameters…完成图 2 所示的要输入的项目。 须知当欲在最小峰面积 (minimum peak area) 中添入大于100 的数之前必须选中Area Counts 选项框。
实验室练习6：数据定量分析 积分 NOTICE 图 2 5)单击OK接受所做的改变。现在通过选择Chromatogram / Integrate 用这些参数做积分。注意离子 194被积分，而离子67没有被积分。让我们降低最小面积来解决这一问题。 6)选择Chromatogram / MS Signal Integration Parameters…完成图 3 中所示的各项内容。 NOTICE 图 3 7)单击Save…和OK输入积分文件名字VOLATILE.P，单击OK。
本细则根据高效液相色谱仪方法通则（JY∕T 024－1996）、有机质谱分析方法通则（JY∕T 003－1996）和美国Agilent 公司液相色谱质谱联用仪操作说明书制定。 1．适用范围 本方法适用于有机样品定性及定量分析。 样品要求：待测样品必须能溶解于水或其它有机溶剂中。若样品或配制的样品溶液发生沉淀，挥发，变质等异常现象时，应重新取样或重新配制溶液。 分子量范围：（100 ～2300）amu（单电荷） 分析前要求：在液相色谱仪上确定分离条件，使待测组分能完全分离，且该色谱条件中流动相不应含有不挥发性盐。 2．引用标准 有机质谱分析方法通则（JJG003－1996） 3．术语、符号、代号 详见《有机质谱分析方法通则》（JJG003－1996） 4．方法、原理 详见《有机质谱分析方法通则》（JJG003－1996） 5．试剂和材料 所有的溶剂均选用色谱级试剂，所用水的电导率应大于18KΩ，其余试剂为分析纯。 6．仪器设备 仪器：Agilent 1100 LC/MSD SL（液相色谱-质联用仪），配有ESI及APCI离子源 分子量范围：（100 ～2300）amu（单电荷） 扫描分辨率：半峰宽小于1； 检测灵敏度：SIM S∕N ≥10∶1；1 pg Reserpine； SCAN S∕N ≥10∶1；50 pg Reserpine。
7．分析步骤 7. 1 环境：10℃～30℃，相对湿度小于70％。 7. 2 仪器校正：按仪器操作说明书进行调整，使得到的标准谱图在允许误差之内关注质量轴精度，质量轴稳定度，扫描分辨率，灵敏度。 7. 3 测定过程 7. 3. 1 开机： （1）开空气泵、液相色谱和质谱仪电源开关,开PC机后使其联机成功，之后打开真空泵阀门。 （2）真空度达到2╳10-5Pa后，通过调谐系统检查质谱运行情况。 7. 3. 2 设定液相色谱和质谱参数: 选择合适的色谱柱、流动相，设置梯度程序及柱温。 选择离子源模式，设置质谱参数。 数据采集的范围及条件设置。 7. 3. 3 本底检查：按设定的色谱条件运行一遍空程序以检查基线和本底，若发现柱子不干净则应冲洗柱子和质谱仪，直至基线平稳无峰为止。 7. 3. 4 运行样品 （1）PC机上运行设置好的程序。待工作站显示仪器状态为“Ready”时，设置样品信息，进样。按“Start”键，PC机自动采集数据。 （2）运行好样品后，冲洗色谱柱，流动相中如含有挥发性缓冲盐，必须用5%甲醇或5%乙腈过渡，冲洗排出流路中可能有的缓冲液。 7. 3. 5 关机： 放真空，再关液相色谱、质谱和PC机电源。 8. 分析数据 （1）调出谱图，根据定性及定量分析的需要，分别打开离子色谱图和质谱图，进行分析。 （2）若谱图未达到要求，需重新改变色谱、质谱条件。 9. 高效液相色谱的定性分析
1. 质谱信号强度与待分析物含量的关系 1 任何定量分析方法都需要建立实验测量信号与待分析物的量的关系。很幸运的2 是，在质谱中，通常也可以建立这样的关系，因此质谱信号是可以用于定量的。3 从题主的说明来看，Ta的疑惑主要在这里。 4 既然问题是“质谱是怎样做到定量的？”，我们不妨把质谱信号的产生按时间5 顺序粗略分为三个步骤，即离子的产生，传输与检测。 6 产生离子时，不同样品分子的电离通常是相互独立的。因此样品量7 越多，其产生的离子也就越多。目前常用的各种离子化方法（EI、ICP、8 ESI、MALDI等）在实验中（严格来说仅在一定浓度范围内——术语是动9 态范围，dynamic range）都至少满足样品量与产生离子量的正相关，一10 般情况下也可以进一步近似成线性相关。 11 传输离子时，简单来说可以认为传输效率与被传输离子的量无关； 12 （严格地说，被传输的离子太多时，相同电荷的互相排斥会造成离子束的13 “体积”变大，导致传输效率下降。这种影响在空间有限的离子阱中表14 现得更加明显，因此在离子阱质谱中一个重要的技术就是适当控制进入仪15 器的离子数量，使其既不太少也不太多。） 16 检测离子时，不论是使用光电倍增管的检测器，还是检测镜像电流17 的检测器（ICR/Oribtrap），其信号强度（在一定范围内）均与离子数量18 大致线性相关。 19 废话几句，可能会使题主感觉质谱不能定量的原因之一是，我们看到的质谱20 图常用相对强度作为纵坐标，即0-100%最强峰，而不展示信号的绝对强度。但21 在做质谱的时候，仪器记录的当然是绝对强度（相对强度也是通过绝对强度换22 算出来的）。我们需要用绝对强度来定量时，就需要这部分平时不常看的信息了。 23
1. 质谱信号强度与待分析物含量的关系 任何定量分析方法都需要建立实验测量信号与待分析物的量的关系。很幸运的是，在质谱中，通常也可以建立这样的关系，因此质谱信号是可以用于定量的。从题主的说明来看，Ta的疑惑主要在这里。 既然问题是“质谱是怎样做到定量的？”，我们不妨把质谱信号的产生按时间顺序粗略分为三个步骤，即离子的产生，传输与检测。 ?产生离子时，不同样品分子的电离通常是相互独立的。因此样品量越多，其产生的离子也就越多。目前常用的各种离子化方法（EI、ICP、ESI、MALDI 等）在实验中（严格来说仅在一定浓度范围内——术语是动态范围， dynamic range）都至少满足样品量与产生离子量的正相关，一般情况下 也可以进一步近似成线性相关。 ?传输离子时，简单来说可以认为传输效率与被传输离子的量无关；（严格地说，被传输的离子太多时，相同电荷的互相排斥会造成离子束的“体 积”变大，导致传输效率下降。这种影响在空间有限的离子阱中表现得 更加明显，因此在离子阱质谱中一个重要的技术就是适当控制进入仪器的 离子数量，使其既不太少也不太多。） ?检测离子时，不论是使用光电倍增管的检测器，还是检测镜像电流的检测器（ICR/Oribtrap），其信号强度（在一定范围内）均与离子数量大致线 性相关。 废话几句，可能会使题主感觉质谱不能定量的原因之一是，我们看到的质谱图常用相对强度作为纵坐标，即0-100%最强峰，而不展示信号的绝对强度。但在 做质谱的时候，仪器记录的当然是绝对强度（相对强度也是通过绝对强度换算出来的）。我们需要用绝对强度来定量时，就需要这部分平时不常看的信息了。另外，在谈到色谱-质谱联用方法时，待分析物与实验测量信号的关系之中又多了一层色谱，即待分析物含量->色谱流出物中样品含量->质谱信号。与EI谱图分析以相对强度为主不同，在色谱-质谱联用时，信号的绝对强度就成了我们天天都要关心的内容，因为质谱信号强度随时间的变化就是实验的色谱图，通常以总离子强度或者某一特定质荷比离子的强度作图。
质谱数据分析资源 1 数据库 （1）蛋白质序列数据库： https://www.doczj.com/doc/da5951474.html,/ https://www.doczj.com/doc/da5951474.html,/sites/entrez?db=Protein https://www.doczj.com/doc/da5951474.html,/IPI/IPIhelp.html （2）实验数据： https://www.doczj.com/doc/da5951474.html,/pride/startBrowse.do https://www.doczj.com/doc/da5951474.html,/OPD/ https://www.doczj.com/doc/da5951474.html,/ https://www.doczj.com/doc/da5951474.html,/data.jsp Adipose Proteome Database: http://proteome.biochem.mpg.de/adipo Organellar Map Database: http://proteome.biochem.mpg.de/ormd/ Body Fluid Database - Seminal: http://proteome.biochem.mpg.de/seminal/ Body Fluid Database - Tear: http://proteome.biochem.mpg.de/tear/ Body Fluid Database - Urinary: http://proteome.biochem.mpg.de/urine/ Red Blood Cell Database: http://proteome.biochem.mpg.de/rbc/ 2 数据分析工具 （1）蛋白质组专家系统：https://www.doczj.com/doc/da5951474.html,/tools/ 提供的工具链接： Aldente：利用PMF数据鉴定蛋白质，使用了Hough变换来处理图谱，对图谱进行再校正和异常值排除。提供单机版下载。 FindMod：利用PMF数据鉴定蛋白质中存在的修饰，考虑的修饰是Swiss-Prot数据库中包含的注释。 FindPept：利用PMF数据鉴定蛋白质，处理非特异性酶切的数据，考虑了化学修饰，翻译后修饰等因素。 GlycoMod：利用PMF数据预测蛋白质中可能发生的糖基化修饰，鉴定糖肽。 Mascot：商业化的数据库搜索软件，提供PMF搜库，PFF搜库以及混合搜库的功能，网站有大量的背景知识介绍。网址为：https://www.doczj.com/doc/da5951474.html,/。 PepMAPPER：PMF数据搜索软件。 PFMUTS：从PMF数据中寻找可能的肽段突变（1~2个）。 ProFound：基于贝叶斯模型的搜库软件。 ProteinProspector：系列搜库软件，包括MS-Fit, MS-Pattern, MS-Digest 等。 Popitam：从图谱数据中寻找未知修饰。 Phenyx：商业化串联质谱数据搜库软件。 OMSSA：开放源码的搜库软件，由NCBI提供。 PepFrag： 搜库软件。 SearchXLinks：搜索修饰、cross-linked的特殊搜库软件。 （2）系统生物学研究所：https://www.doczj.com/doc/da5951474.html,/software.php提供的连接： S E Q U E S T：https://www.doczj.com/doc/da5951474.html,/sequest/ 搜库软件SEQUEST的使用资料，十分详细。还同时提供extractms ，2to3，MS2，SQTSort，DTASelect，DaughterDB，RelEx等工具的使用说明，可以向网站维护者索要这些工具。
质谱分析方法解析 质谱仪种类很多，不同类型的质谱仪主要差别在于离子源。离子源的不同决定了对被测样品的不同要求，同时，所得信息也不同。质谱仪的分辨率同样十分重要，高分辨质谱仪可给出化合物的组成式，对于未知物定性至关重要。因此，在进行质谱分析前，要根据样品状况和分析要求选择合适的质谱仪。 目前，有机质谱仪主要有两大类： 气相色谱-质谱联用仪与液相色谱-质谱联用仪，现就这两类仪器的分析方法叙述如下： GC-MS分析条件的选择 在GC-MS分析中，色谱的分离与质谱数据的采集同时进行，为了使每个组分都得到分离和鉴定，必须设备合适的色谱和质谱分析条件： 色谱条件包括色谱柱类型（填充柱或毛细管柱），固定液种类，汽化温度，载气流量，分流比，温升程序等。 设置原则是： 一般情况下均使用毛细管柱，极性样品使用极性毛细管柱，非极性样品采用非极性毛细管柱，未知样品可先用中等极性毛细管柱，试用后再调整。当然，如果有文献可以参考，就采用文
献所用条件。 质谱条件包括： 电离电压，电子电流，扫描速度，质量范围，这些都要根据样品情况进行设定。为了保护灯绿和倍增器，在设定质谱条件时，还要设置溶剂去除时间，使溶剂峰通过离子源之后再打开灯绿和倍增器。在所有的条件确定之后，将样品用微量注射器注入进样口，同时，启动色谱与质谱，进行GC-MS分析。 GC-MS数据采集 有机混合物样品用微量注射器由色谱仪进样口注入，经色谱柱分离后进入质谱仪离子原在离子源被电离成离子。离子经质量分析器，检测器之后即成为质谱仪信号并输入计算机。样品由色谱柱不断流入离子源，离子由离子源不断进入分析器并不断得到质谱，只要没定好分析器扫描的质量范围和扫描时间，计算机就可以采集到一个个的质谱。如果没有样品进入离子源，计算机采集到的质谱各离子强度均为0。当有样品过入离子源时，计算机就采集到具有一定离子强度的质谱。并且计算机可以自动将每个质谱的所有离子强度相加。显示出总离子强度，总离子强度随时间变化的曲线就是总离子色谱图，总离子色谱图的形状和普通的色谱图是相一致的，它可以认为是是用质谱作为检测器得到的色谱图。
台式气相色谱-质谱联用仪校准规范 1 范围 本规范适用于离子阱和四极杆型台式气相色谱-质谱联用仪（以下简称台式GC-MS）的校准，其它类型台式GC-MS 的校准可参照此规范进行。 2 引用文献 JJF 1001―1998 通用计量术语及定义 JJF 1059―1999 测量不确定度评定与表示 GB/T 15481―1995 校准和检验实验室能力的通用要求 GB/T 6041―2002 质谱分析方法通则 JJG (教委) 003―1996 有机质谱仪检定规程 JJG 700―1999 气相色谱仪检定规程 OIML/TC16/SC2/R83 Gas chromatograph/mass spectrometer system for analysis of rganic pollutants in water 使用本规范时，应注意使用上述引用文献的现行有效版本。 3 术语和计量单位 分辨力（resolution） 分辨两个相邻质谱峰的能力，对于台式GC-MS以某离子峰峰高50％处的峰宽度（简称半峰宽）表示，记为W1/2，单位 u。 基线噪声（baseline noise） 基线峰底与峰谷之间的宽度，单位计数。 信噪比(signal-to-noise ratio) 待测样品信号强度与基线噪声的比值，记为S/N。 质量色谱图（mass chromatogram）质谱仪(和色谱图是两回事) 质谱仪在一定质量范围内自动重复扫描所获得的质谱数据，可以不同形式再现，其中以一个或多个离子强度随时间变化的谱图，称为质量色谱图。 质量准确性（mass accuracy） 仪器测量值对理论值的偏差。 u (atomic mass unit) 原子质量单位。 4 概述 气相色谱－质谱联用仪是将气相色谱仪与质谱仪通过一定接口耦合到一起的分析仪
质谱法是将被测物质离子化，按离子的质荷比分离，测量各种离子谱峰的强度而实现分析目的的一种分析方法。质量是物质的固有特征之一，不同的物质有不同的质量谱——质谱，利用这一性质，可以进行定性分析（包括分子质量和相关结构信息）；谱峰强度也与它代表的化合物含量有关，可以用于定量分析。 质谱仪一般由四部分组成： 进样系统——按电离方式的需要，将样品送入离子源的适当部位； 离子源——用来使样品分子电离生成离子，并使生成的离子会聚成有一定能量和几何形状的离子束； 质量分析器——利用电磁场（包括磁场、磁场和电场的组合、高频电场、和高频脉冲电场等）的作用将来自离子源的离子束中不同质荷比的离子按空间位置，时间先后或运动轨道稳定与否等形式进行分离； 检测器——用来接受、检测和记录被分离后的离子信号。一般情况下，进样系统将待测物在不破坏系统真空的情况下导入离子源（10-6～10-8mmHg），离子化后由质量分析器分离再检测；计算机系统对仪器进行控制、采集和处理数据，并可将质谱图与数据库中的谱图进行比较。 一、进样系统和接口技术 将样品导入质谱仪可分为直接进样和通过接口两种方式实现。 1. 直接进样 在室温和常压下，气态或液态样品可通过一个可调喷口装置以中性流的形式导入离子源。吸附在固体上或溶解在液体中的挥发性物质可通过顶空分析器进行富集，利用吸附柱捕集，再采用程序升温的方式使之解吸，经毛细管导入质谱仪。 对于固体样品，常用进样杆直接导入。将样品置于进样杆顶部的小坩埚中，通过在离子源附近的真空环境中加热的方式导入样品，或者可通过在离子化室中将样品从一可迅速加热的金属丝上解吸或者使用激光辅助解吸的方式进行。这种方法可与电子轰击电离、化学电离以及场电离结合，适用于热稳定性差或者难挥发物的分析。 质谱进样系统发展较快的是多种液相色谱/质谱联用的接口技术，用以将色谱流出物导入质谱，经离子化后供质谱分析。主要技术包括各种喷雾技术（电喷雾，热喷雾和离子喷雾）；传送装置（粒子束）和粒子诱导解吸（快原子轰击）等。 2. 电喷雾接口 带有样品的色谱流动相通过一个带有数千伏高压的针尖喷口喷出，生成带电液滴，经干燥气除去溶剂后，带电离子通过毛细管或者小孔直接进入质量分析器。传统的电喷雾接口只适用于流动相流速为1～5μl/min的体系，因此电喷雾接口主要适用于微柱液相色谱。同时由于离子可以带多电荷，使得高分子物质的质荷比落入大多数四极杆或磁质量分析器的分析范围（质荷比小于4000），从而可分析分子量高达几十万道尔顿（Da）的物质。 3. 热喷雾接口 存在于挥发性缓冲液流动相（如乙酸铵溶液）中的待测物，由细径管导入离子源，同时加热，溶剂在细径管中除去，待测物进入气相。其中性分子可以通过与气相中的缓冲液离子（如NH4+）反应，以化学电离的方式离子化，再被导入质量分析器。热喷雾接口适用的液体流量可达2ml/min，并适合于含有大量水的流动相，可用于测定各种极性化合物。由于在溶剂挥发时需要利用较高温度加热，因此待测物有可能受热分解。 4. 离子喷雾接口 在电喷雾接口基础上，利用气体辅助进行喷雾，可提高流动相流速达到1ml/min。电喷雾和离子喷雾技术中使用的流动相体系含有的缓冲液必须是挥发性的。