下载文档原格式
质谱定量原理
质谱定量原理是一种基于质谱技术的定量分析方法，它通过测量化合物分子在质谱仪中的信号强度来确定样品中化合物的含量。
在质谱仪中，化合物经过电离后形成带电离子，然后经过质量分析器分离出不同质荷比的离子。
质谱仪在不同荷质比下的离子信号强度与化合物的含量之间存在一定的定量关系。
质谱定量的原理主要基于如下几个方面：
1. 离子信号强度与化合物的量之间的关系：质谱仪中检测到的离子信号强度与化合物的量呈线性关系。
通过在质谱仪中测量一系列已知浓度的标准溶液，可以建立标准曲线，进而使用未知浓度样品的离子信号强度来确定其含量。
2. 质谱仪的灵敏度：质谱仪的灵敏度决定了它能够检测到的最低浓度的化合物。
高灵敏度的质谱仪可以检测到低至纳摩尔甚至飞摩尔级别的化合物，从而实现对微量物质的定量分析。
3. 离子选择性：质谱仪通过质量分析器的选择作用，可以选择性地检测特定质荷比的离子。
这种选择性使得质谱仪能够对复杂样品中的目标化合物进行定量测定。
4. 矩阵效应：在复杂的样品矩阵中，矩阵化合物可能会干扰目标化合物的定量测定。
为了消除这种矩阵效应，可以采用内标物质或者校正因子等方法进行定量分析。
总之，质谱定量原理基于质谱仪测量的离子信号强度与化合物
的量之间的关系，通过建立标准曲线来确定未知样品的含量。
质谱仪的灵敏度、离子选择性和矩阵效应等因素都会影响质谱定量的准确性和可靠性。
有机化学中的质谱定量分析质谱分析是一种重要的分析技术，在化学领域中扮演着至关重要的角色。
它通过将化合物离子化并鉴定其质荷比，以定量分析样品中的化合物。
有机化学中的质谱定量分析具有广泛的应用，本文将探讨其原理、方法以及在有机化学研究中的应用。
一、质谱定量分析的原理质谱定量分析是利用化合物的质荷比（mass-to-charge ratio，m/z）来衡量各种化学分析过程中的物质。
它基于质谱仪的原理，即将化合物分子离子化并将其分离，然后通过检测离子的质荷比来确定化合物的类型和相对丰度。
二、质谱定量分析的方法1. 质谱图的解读质谱图是质谱分析的结果，通常呈现为一个横轴为质荷比（m/z），纵轴为相对丰度的图形。
在解读质谱图时，主要关注以下几个方面：- 基峰（Base peak）：质谱图中最高峰对应的质荷比，通常被定义为基峰。
其他峰的相对丰度都相对于基峰进行表示。
- 碎片峰（Fragment peaks）：质谱图中低于基峰的峰，表征了样品分子的离解和断裂过程。
- 分子峰（Molecular ion peak）：质谱图中最高的单一峰，代表化合物的分子离子。
- 同位素峰（Isotopic peaks）：由同一化合物分子离子的不同同位素引起的峰。
2. 标准曲线法标准曲线法是质谱定量分析中常用的方法之一。
它通过构建不同浓度的标准溶液，测定每个浓度下质谱图中目标化合物的峰面积，然后绘制质谱峰面积与浓度之间的关系曲线。
通过测定待测样品的质谱峰面积，然后利用标准曲线，可以准确地计算出待测样品中目标化合物的浓度。
三、有机化学中的应用1. 药物分析质谱定量分析在药物研发与检测中发挥着重要作用。
通过准确测定药物样品中的化合物浓度，可以帮助研究人员了解药物的纯度、合成效率以及在体内的代谢过程。
2. 环境分析有机污染物是环境中的重要问题之一。
质谱定量分析可以帮助分析师测定环境中有机污染物的含量，并评估其对环境和人类健康的潜在危害。
质谱定量方法嘿，咱今儿就来唠唠质谱定量方法！你说这质谱定量方法啊，就好比是一个超级侦探，能精准地找出各种物质的量。
它就像是一把神奇的钥匙，能打开物质世界里定量的秘密大门。
想象一下，我们面对的是一个无比复杂的混合物，就像一个大谜团。
而质谱定量方法呢，就是那个能理清头绪、找到关键线索的高手。
它通过各种巧妙的手段，把那些我们想要知道量的物质给准确地揪出来。
比如说，内标法，这可是个常用的好法子呀！就好像在一场混乱的比赛中，我们找了个可靠的参照物，有了它，我们就能更准确地衡量其他选手的表现啦。
内标物就像是我们的定海神针，让定量变得更靠谱。
还有外标法呢，这就像是我们有一个已知标准的尺子，去量那些未知的东西。
我们先做好标准曲线，然后就可以拿着这个曲线去对照，找出我们想要的量。
是不是很神奇呀？再看看同位素稀释法，这可厉害了！就如同给物质贴上了特殊的标签，让我们能清楚地分辨和定量。
它就像是给物质穿上了独特的制服，一下子就变得与众不同啦。
在实际应用中，我们得根据不同的情况选择合适的质谱定量方法呀。
这可不能马虎，就像我们选鞋子，得合脚才行呢！选错了方法，那可就像是穿着不合脚的鞋子走路，别扭得很呐！我们在实验室里摆弄这些仪器，就像是在指挥一场精彩的音乐会。
各种试剂、仪器都是我们的乐手，而质谱定量方法就是那美妙的乐谱，只有三者完美配合，才能演奏出动人的乐章。
而且呀，这质谱定量方法可不是一成不变的哦。
随着科技的不断进步，它也在不断发展和完善呢。
就像我们人一样，要不断学习、进步，才能适应这个日新月异的世界。
总之呢，质谱定量方法是我们探索物质世界的重要工具，它的作用可大着呢！我们可得好好掌握它，让它为我们的科学研究和实际应用发挥最大的作用。
怎么样，现在对质谱定量方法是不是有了更清楚的认识啦？哈哈！。
质谱定量的原则系列讲座（转自分析测试百科叮当空间） 质谱定量的原则01--目录： 1．质谱定量的简介 a) 总离子流 b) 选择离子监测（SIM） c) 选择反应监测（SRM/MRM）
2．开发一个SRM方法 3．内标
4．PK/LC/MS/MS 药物代谢动力学的LC/MS/MS的反相液相色谱的方法开发 5．样品制备 6．标准和标准曲线的准备 a) 做标准曲线的步骤 b) 标准曲线的稀释方案Scheme的举例 c) 标准曲线的运行 d) 进行标准品和样品的随机化 e) 系统运行的实用性 f) “QCs”质量控制
7．相关的PK资源 8．定量的技巧Tips
质谱定量的原则02——质谱定量的简介和LC/MS监测的模式 简介 本教程主要用于：使用质谱作小分子药代动力学分析，即PK/MS。除此之外，这些同样的原则也可用于生物基质中肽和蛋白的定量。
传统上，在使用现代质谱定量之前，定量是用HPLC高效液相色谱和UV紫外检测器实现的。HPLC 药代动力学分析建立在保留时间、峰面积和紫外光谱性质的基础上的。HPLC方法的缺点是灵敏度不够、缺乏特异性。我们已经看到一些实例，一个化合物的确已经代谢了，然而保留时间和紫外光谱上，母离子和代谢物无法区分。这种缺少特异性的分析时不时会误导研究者。所以在药代动力学分析中，基于质谱的表征现在是一种新型的重要的工具。
质谱定量中已经被广泛接受的方式是MS/MS定量。这种定量常通过三级四极杆或离子阱质谱实现。要求使用MS/MS的原因是：许多化合物有同样的质量。当使用第一个维度即单级质谱MS去定量时，也会缺乏特异性，尤其是对于像血液那样的复杂的基质。第二个维度的MS（即MS/MS）在大多数情况下，能够提供唯一的断裂。合并特异的母离子质量和唯一的碎片离子信息，可以选择性地监测被定量的化合物。下面我们将讨论获得和可视化LC/MS数据的方法。
获得和可视化LC/MS的数据，或称为：质谱数据如何在一个LC/MS实验中表达？
典型的方法，质谱被设置为扫描特定的质量范围。在全扫描分析中，质量扫描范围较宽；在选择离子监测SIM时，质量扫描范围较窄。依赖于扫描的类型，一个独立的质量扫描时间可以从10 ms到5秒。在一次LC/MS分析中可获得许多个扫描。LC/MS数据的表示方法为：把每个质量扫描的离子流信息叠加，画出随时间变化的总离子流，横轴是时间，纵轴是强度。总离子流图非常像HPLC的紫外图，见图1。。
下面我们将讨论各种扫描的模式，和这些模式同质谱定量的关系。 最常见的LC/MS数据模式为： （1） 总离子流图 （2） 选择离子监测（SIM） （3） 选择反应监测（SRM）或多反应监测（MRM）：MRM和SRM本质上是同样的实验模式。
全扫描分析 图1
从药代分析中得到的全质量范围的总离子流图（TIC）非常像HPLC UV图，除了：质谱能检测到更多的化合物，尤其是没有紫外吸收的化合物。总离子流是一个叠加图，叠加了每个质量扫描的离子流。当一个小分子或小肽流出HPLC色谱柱时，相对强度上升，在TIC图上出现了一个峰，横轴是时间。每个质量的化合物都被记录在TIC图上。找出感兴趣的化合物可能是困难的，因为许多化合物有相同的质量。化合物的天然质量不是鉴定的唯一性数据。设置一个确定的质量，可以画出一个提取离子流图，但这个图的强度会比下面介绍的SIM实验中的强度低。
（注意：TIC指的是在一段时间内采集的质量扫描数据，不特指扫描范围或质谱实验的类型。例如，我们可以在SIM或SRM实验中获得TIC图。然而，为简单起见，我们将把这些图称为SIM和SRM图，而不是SIM TIC图。）
Selected Ion Monitoring选择离子监测 在选择离子监测中，质谱被设置为扫描一个非常小的质量范围，典型的是一个质量数的宽度。选择的质量宽度越窄，SIM的确定度越高。SIM图就是从非常窄的质量范围中得到的离子流图。只有被该质量范围选择的化合物才会被画在SIM
图中。图1和图2是同一个样品的谱图，然而它们看起来很不相同。原因是在SIM图中，画的是TIC图中较少的组分。SIM图是比TIC图更确定的图。
图2
然而，SIM图仍显示了许多峰，不能唯一地确认我们感兴趣的化合物。一个复杂的样品（比如血清或血浆）中，这样的图是一个典型的SIM图。许多化合物有同样的质量，在ESI中还有多电荷峰也和我们感兴趣的化合物有同样的m/z值。SIM实验比全扫描实验更灵敏，因为质谱在一个更小的质量范围上驻留（dwell）更长的时间。
Selected Reaction Monitoring选择反应监测 （SRM） SRM被大多数科学家在质谱定量中使用，见图3。SRM中，可以监测一个特征的唯一的碎片离子，在很多非常复杂的基质中进行定量。SRM图非常简单，通常只包含一个峰。这种特征性使SRM图成为灵敏度高且特异性强的理想的定量工具。 图3
SRM的过程：选择一个特征的母离子做MS/MS，在其碎片中选择一个特征的子离子作为监测离子。可以把SRM理解为碎片离子的SIM。这种特征性的实验被成为“transition”（跃迁），可以表示为：母离子 → 子离子，举例：534 → 375
质谱定量的原则03——建立一个SRM Transition 534 → 375
一个定量分析方法应该是特征性的、高准确度和高灵敏度的。在不牺牲上述特性的前提下，建立方法应该尽可能地快速，质谱定量可以很好地满足这些规则。
在建立一个感兴趣的化合物的MS/MS碎片transition的时候，一种优化transition
的方法是用注射泵进样（syringe pump）该化合物来优化。
先在全扫描方式中优化母离子信号。因为MS/MS的灵敏度将依赖于化合物在全扫描模式中是否响应得好，要尽可能地优化全扫描的、非CID响应的MS信号。
然后优化碰撞能CE和碰撞气体，给出丰度最高的碎片离子。不能使用太大的碰撞能CE，因为太大的CE会丢失稳定的、有价值的碎片峰。“我应如何优化碎片峰？”可以用注射泵进样化合物，进行MS/MS，挑出一个稳定的碎片峰，当改变碰撞能和碰撞气体参数时监测它的离子流。最后当获得最大的碎片离子峰响应时确定碰撞能和碰撞气体参数。现代的三重四极杆质谱都可以自动优化。 从优化好的MS/MS谱中，选择一个合适的碎片峰用于定量监测。如图A所示，母离子质量为534，似乎从图B中可以很容易选择一个碎片峰做Transition。一个基本考虑是尽可能不要选择离母离子太近的质量。非常常见的，是化合物的失水峰或失氨（ammonia）峰，例如：534－517＝17。我们应尽可能不要选择失水峰或失氨（ammonia）峰做SRM，因为这会导致一个不是很特异的transition。这里，Transition 534 → 375是一个好的选择。另外要注意的是：要选择一个稳定的峰。当直接进样化合物时，被选择做Transition的峰必须每次扫描响应都一致。
提示：当优化MS条件时，最好能模拟实际做样的条件。例如：实际做样时色谱流速是400 ul/min，化合物在30%有机相时流出，用注射泵进样优化MS条件时最好模拟这个条件，即设置HPLC流速为400 ul/min，30%有机相；然后用三通注入化合物。
同时，第一次优化实验时，我们可以选择60/60的梯度，去表征化合物的疏水性，从而得知它在C18反相柱上的色谱行为。如果你对所有的化合物都按这样的方法实验，你就可以建立一个洗脱数据库，可以作为将来实验的参考。
注： 60/60梯度的意思是：梯度从近100% 水相开始，在60分钟内到达60%有机相。
质谱定量的原则04——内标 在做MS定量时应该使用内标。选择一个合适的内标，将能减少因为样品提取、HPLC进样和离子化的多样性造成的差异。在复杂基质的分析中，在SRM积分图上，在标准曲线的低端，常会见到：两个不同的浓度水平，会给出近乎一致的响应。只有当使用一种内标时，这两个点才能被区分。一些研究者试图在实验中不用内标去做标准曲线，但成功率不高。我们在标准曲线上每个浓度水平都重复进样3次。没有内标的情况下，重现性％RSD常常会高于20%；而当使用内标时，%RSD能降低到近2%。
我要如何选择一个内标? 最好的内标是待定量的化合物的同位素内标。同位素标记的内标将和待测物有相似的回收率、ESI离子化响应，和相似的色谱保留时间。如果你运行的不是临床药代动力学定量，可能很难判断上述说法，因为特殊的合成一个同位素标记的内标，是非常昂贵和耗时的。
通常，如果你和一个医学的化学家工作，他们会有一个化合物相似物库，可以被用作内标。这些类似物，在化合物合成中被测试，和该化合物性质相似可以被用户定量内标，而且更重要的是，这些类似物和该化合物的母离子质量有微小的差异。
尽量不要使用去甲基化（－14）或者是氧化的（＋16）的类似物作内标，因为待测化合物的母离子常会发生同样的代谢。 常见的做内标的类似物是氯代的化合物。氯代的化合物类似物会和待测化合物有相似的色谱保留时间，这是内标的一个重要特性。我们已经发现内标物的一个最重要的特性是它和待测化合物共流出。
我该如何使用内标？ 首先，内标添加需在样品测试方法的开始阶段，典型的，应在血浆crash或固相萃取之前。内标应用同一浓度水平添加（包括标样）。内标应给出可靠的质谱响应。应该注意的是：内标的量应添加得合适，应高于定量限，但不能过高，因为过高的内标响应会抑制被分析物的离子化。“我应该添加多少量的内标？”这是一个重要的问题。通过做一些试分析：早、中、晚的时间点，也许一个或两个标准点，你应该知道你的样品中化合物的大概量。这些信息非常有价值，可以帮助建立一个合适的标准曲线，并知道应添加多少量的内标。举例来说：如果待定量的样品浓度范围是100 fg ～ 25 pg，检测限是100 fg，你应该添加5～10 pg的内标。一个好的经验法则是：内标物的量大概是标准工作曲线浓度最高点的1/3。这将给出一个比较不错的响应，并且不会抑制和干扰待测样品的离子化。见图1
图1 内标的量（内标.gif）
质谱定量的原则05——液相色谱串联质谱联用药代动力学方法开发 更快就是更好！在每一个药代动力学分析中更快就是更好！ 样品组/系列包括：重复的标准品，QC质控样品，和样品，加起来大概要进行300次分析。如果每个样品实验耗时15分钟，整套分析要75个小时。高要求的实验（加上质谱）总计要超过3天时间。一些该领域的研究者可以只花1～2分钟分析一个样品；而大多数的PK/MS的实验室一般很容易做到花3～4分钟分析
