RT-PCR原理与实验操作步骤
一、知识背景：
1、基因表达：DNA RNA Protein
单拷贝基因表达存在逐步放大机制，如一个蚕丝心蛋白基因 104个丝心蛋白mRNA（每个mRNA存活4d，可以合成105个丝心蛋白）共合成109个丝心蛋白。因此单拷贝基因的mRNA表达水平对于其功能水平的调控是非常重要的。
2、PCR技术(olymerase chain reaction)：即聚合酶链式反应。
在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促反应，其特异性由两个人工合成的引物序列决定。反应分三步：
A、变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA；
B、退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。
C、延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2＋存在下，退火引物沿5‘ 3’方向延伸。
以上三步为一个循环，如此反复。
3、逆转录酶和RT-PCR
逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性：
1、依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链；
2、Rnase水解活性：水解RNANA杂合体中的RNA；
3、依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA.
二、RT-PCR的准备：
1、引物的设计及其原则：
1）引物的特异性决定PCR反应特异性。因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重要的影响。在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚型，不同的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA对引物的特异性的影响。尽量选择覆盖相连两个内含子的引物，或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。
2）引物设计原则的把握：引物设计原则包括
a、引物长度:一般为15～30bp ，引物太短会影响PCR的特异性，引物太长PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最适温度，也影响反应的特异性。
b、碱基分布：四种碱基最好应随机分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特别是连续出现3个以上的单一碱基。GC含量（Tm值）：40％～60％，PCR扩增的复性温度一般是较低Tm值减去5～10度。
c、3‘端要求：3’端必须与模板严格互补，不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。末位碱基是A时错配的引发效率最低，G、C居中间，因此引物的3’端最好选用A、G、C而尽可能避免连续出现两个以上的T。
d、引物自身二级结构：引物自身不应存在互补序列，否则会自身折叠成发夹状结构或引物自身复性。
e、引物之间的二级结构：两引物之间不应有多于4个连续碱基互补，3’端不应超过2个。
f、同源序列：引物与非特异扩增序列的同源性应小于连续8个的互补碱基存在。
g、5’端无严格限制：5’末端碱基可以游离，但最好是G或C，使PCR产物的末端结合稳定。还可以进行特异修饰（标记、酶切位点等）等等。
根据实验目的选择适当的引物。常用引物设计软件如Primer5.0，Oligo6.0等对于这些条件都可以自行设置。
2、耗材：实验所用的接触样品的耗材如冻存管、枪头、EP管之类事先都需经过
0.1%DEPC水浸泡处理，除去RNA酶，防止操作过程中RNA降解。然后经高压灭活（灭菌和灭活DEPC）。
3、试剂准备：变性液、水饱和酚、乙酸钠、氯仿、异丙醇、75%酒精、经DEPC处理并高压的水。
三、RNA的提取方法：
RT－PCR中从细胞分离的RNA的质量至关重要，包括RNA的纯度和完整性。RNA分离的最关键因素是尽量减少RNA酶的污染。但RNA酶活性非常稳定，分布广泛，除细胞内源性RNA酶外，环境中也存在大量RNA酶。因此在提取RNA时，应尽量创造一个无RNA酶的环境，包括去除外源性RNA酶污染和抑制内源性RNA酶活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性RNA酶，通过RNA酶的阻抑蛋白Rnasin和强力的蛋白质变性剂如异硫氰酸胍抑制内源性RNA酶。
实验操作步骤
一、实验器具与材料：
1、移液枪：1ml、200μl、20μl、10μl、2μl
2、吸头：1ml、200μl、20μl
3、匀浆管：5ml
4、吸头台：放置1ml吸头的一个，放置20μl吸头的一个
5、EP管：1.5ml、0.2ml、100μl
6、试剂瓶：2个60ml的棕色试剂瓶（广口，带盖）
1个125ml的白色试剂瓶（放无水乙醇）
7、量筒：50ml、250ml、500ml
8、容量瓶：250ml、500ml、1000ml
9、试管架：5ml、1.5ml、20μl
10、盐水瓶：250ml、500ml各2个备用，一个装无水乙醇，另一个装DEPC水
11、铝制饭盒：4个
12、塑料小饭盒：1个
13、大瓷缸：2个
14、锡泊纸：一卷
15、卷纸：2卷
16、三角烧瓶：带盖，稍大
反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法中常见的污染问题及对策
反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）是一种体外核酸扩增技术，它具有特异、敏感、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点，能在几个小时内完成从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的目的产物供分析研究和检测鉴定，所以近年来RT-PCR技术被广泛应用于人和动物的多种传染病早期诊断。
笔者一直从事实验室动物疫病检测工作，现就应用RT-PCR实验方法过程中出现的一些常
见污染问题做如下论述，仅共同行参考和探讨。 RT-PCR实验有三步：提取RNA、反转
录（RT）、PCR扩增及扩增产物分析，在这一过程中，最令人头痛的问题是易污染，极
其微量的污染即可造成假阳性。污染原因主要有以下几个方面：
1、样品间的交叉污染收集样品的容器最好使用一次性的，如重复使用，应在使用前应于180℃的高温下干烤6小时或更长时间；样品存放时要密封严实，以防外溢造成相互间的
交叉污染；样品在提取过程中离心管及吸样枪头最好使用一次性的，以免不同实验样品间
相互污染；由于吸样枪污染会导致样品间的污染，也是一个值得注意的问题，由于操作不
慎将样品或提取物吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取时要十分小心，吸时要慢，吸取尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染；同
时要注意操作时不要剧烈地摇动反应管，开盖时也容易造成气溶胶污染。若产生气溶胶较多，会造成环境污染，不仅会导致实验失败，而且也会损害操作人员身体健康，因此每次
实验完毕都要及时清理实验台面，用0.5%次氯酸钠消毒后再打开紫外灯照射半小时。
2、RT-PCR本身使用的试剂污染在试剂配制过程中，由于加样枪、容器及其它溶液被污染。因此所有试剂都应尽量小量分装，以减少重复加样次数，避免污染机会，另外RT-PCR试剂应尽可能密封好分类存放。每次操作完毕后同样要进行台面消毒和紫外线照射
消毒。
3、扩增产物的污染这是实验中最常见的问题，极微量的扩增产物污染就可造成假阳性，
每次实验完后，扩增产物都要及时密封后处理。在做RT-PCR实验时，一般都应设阳性对照，操作不慎，污染可能性很大，因而当某一RT-PCR试剂经自己使用稳定，检验人员经验丰富心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照，或间隔性设阳性对照，以减少污染
机会。
4、操作人员污染只要存在少量的RNA酶就会引起RNA的降解，从而影响结果的准确性，RNA酶可存在操作人员手汗、唾液中，也可灰尘中，一旦器械、玻璃制品、塑料制品受到
污染，容易造成实验失败，因此操作人员应戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套
要勤换，。设置PCR操作专用实验室，所用实验用具应为专用，并合理分隔实验室，将
样品的提取、配制RT-PCR反应液、PCR循环扩增等步骤分室进行，实验前应将实验室
及实验人员工作服用紫外线或臭氧消毒以破坏残留的DNA或RNA。任一种科学的实验方
法都有其自身完善和发展的过程，RT-PCR方法也不例外，在检测质量能保证的情况下，
若能简化样品提取步骤或缩短其时间，减少扩增循环次数，都能对防止污染有利。
总之，RT-PCR不管从特异性方面还是从灵敏性方面讲都具有难以匹敌的优势，结果的可
靠性和可信性应该是最好的，是较具权威性的检测方法，我们期待着它能尽快地自身完善
和发展。
RT-PCR步骤
总RNA提取
1. 取200mg组织，放到1.5ml EP管中，加入1ml Trizol剪碎。
2. 震荡30s。
3. 加0.2ml氯仿，剧烈摇动30s，室温3min。
4. 12000×g，4℃离心，15min。
5. 吸上层无色水相，移入另一EP管中（约0.5ml）。
6. 加等体积异丙醇，-20℃，30min。
7. 12000×g，4℃离心，10min。在管底部可见微量RNA沉淀
8. 弃上清，加75%乙醇1ml，振荡。
9. 7500×g，4℃离心，10min。
10. 弃上清，用滤纸小心吸取残留液体，室温干燥5-10min。
11. 沉淀溶于20μl D EPC水，取1μl加入79μl DEPC水测OD260/OD280
12. 计算浓度与纯度，-70℃保存。
逆转录合成 cDNA
反应体系如下
混匀快速离心一次反应条件如下
-20℃冰箱冻存PCR反应
混匀快速离心一次
PCR产物-20℃冰箱保存
取PCR产物8μl加5×Loading Buffer 2μl 2%琼脂糖凝胶电泳120V 100mA 30min 溴化乙锭染色，凝胶成象仪成象并保存结果
各货运单证中文名称及解释 托运单（BOOKING NOTE） 托运单俗称“下货纸”，是托运人根据贸易合同和信用证条款内容填制的，向承运人或其代理办理货物托运的单证。承运人根据托运单内容，并结合船舶的航线、挂靠港、船期和舱位等条件考虑，认为合适后，即接受托运。 装货单(SHIPPING ORDER） 装货单是接受了托运人提出装运申请的船公司，签发给托运人，凭以命令船长将承运的货物装船的单据。装货单既可用作装船依据，又是货主凭以向海关办理出口货物申报手续的主要单据之一，所以装货单又称“关单”，对托运人而言，装货单是办妥货物托运的证明。对船公司或其代理而言，装货单是通知船方接受装运该批货物的指示文件。 收货单（MATES RECEIPT） 受货单又称大副收据，是船舶收到货物的收据及货物已经装船的凭证。船上大副根据理货人员在理货单上所签注的日期、件数及舱位，并与装货单进行核对后，签署大副收据。托运人凭大副签署过的大副收据，向承运人或其代理人换取已装船提单。 由于上述三份单据的主要项目基本一致，我国一些主要口岸的做法是将托运单、装货单、收货单、运费通知单等合在一起，制成一份多达9联的单据。各联作用如下：第一联由订舱人留底，用于缮制船务单证。第二、三联为运费通知联，其中一联留存，另一联随帐单向托运人托收运费。第四联装货单经海关加盖放行章后，船方才能收货装船。第五联收货单及第六联由配舱人留底。第七、八联为配舱回单。第九联是缴纳出口货物港务费申请书。货物装船完毕后，港区凭以向托运人收取港杂费。 海运提单（BILL OF LADING） 提单是一种货物所有权凭证。提单持有人可据以提取货物，也可凭此向银行押汇，还可在载货船舶到达目的港交货之前进行转让。 装货清单（LODING LIST） 装货清单是承运人根据装货单留底，将全船待装货物按目的港和货物性质归类，依航次、靠港顺序排列编制的装货单汇总清单，其内容包括装货单编号、货名、件数、包装形式、毛重、估计尺码及特种货物对装运的要求或注意事项的说明等。装货清单是船上大副编制配载计划的主要依据，又是供现场理货人员进行理货，港方安排驳运，进出库场以及承运人掌握情况的业务单据。 舱单（MANIFEST） 舱单是按照货港逐票罗列全船载运货物的汇总清单。它是在货物装船完毕之后，由船公司根据收货单或提单编制的。其主要内容包括货物详细情况，装卸港、提单号、船名、托运人和收货人姓名、标记号码等，此单作为船舶运载所列货物的证明。 货物积载图（CARGO PLAN）
注塑件常见品质问题及原因分析、解决方法 一、注塑件常见品质问题塑胶件成型后，与预定的质量标准（检验标准）有一定的差异，而不能满足下工序要求，这就是塑胶件缺陷，即常说的品质问题，要研究这些缺陷产生原因，并将其降至最低程度，总体来说，这些缺陷不外乎是由如下几方面造成：模具、原材料、工艺参数、设备、环境、人员。现将缺陷问题总结如下：1、色差：注塑件颜色与该单标准色样用肉眼观看有差异，判为色差，在标准的光源下（D65）。2、填充不足（缺胶）：注塑件不饱满，出现气泡、空隙、缩孔等，与标准样板不符称为缺胶。3、翘曲变形：塑胶件形状在塑件脱模后或稍后一段时间内产生旋转和扭曲现象，如有直边朝里，或朝外变曲或平坦部分有起伏，如产品脚不平等与原模具设计有差异称为变形，有局部和整体变形之分。4、熔接痕（纹）：在塑胶件表面的线状痕迹，由塑胶在模具内汇合在一起所形成，而熔体在其交汇处未完全熔合在一起，彼此不能熔为一体即产生熔接纹，多表现为一直线，由深向浅发展，此现象对外观和力学性能有一定影响。5、波纹：注塑件表面有螺旋状或云雾状的波形凹凸不平的表征现象，或透明产品的里面有波状纹，称为波纹。6、溢边（飞边、披锋）：在注塑件四周沿分型线的地方或模具密封面出现薄薄的（飞边）胶料，称为溢边。7、银丝纹：注塑件表面的很长的、针状银白色如霜一般的细纹，开口方向沿着料流方向，在塑件未完全充满的地方，流体前端较粗糙，称为银丝纹（银纹）。8、色泽不均（混色）：注塑件表面的色泽不是均一的，有深浅和不同色相，称为混色。9、光泽不良（暗色）：注塑件表面为灰暗无光或光泽不均匀称为暗色或光泽不良。10、脱模不良（脱模变形）：与翘曲变形相似，注塑件成型后不能顺利的从模具中脱出，有变形、拉裂、拉伤等、称为脱模不良。11、裂纹及破裂：塑胶件表面出现空隙的裂纹和由此形成的破损现象。12、糊斑（烧焦）：在塑件的表面或内部出现许多暗黑色的条纹或黑点，称为糊斑或烧焦。13、尺寸不符：注塑件在成型过程中，不能保持原来预定的尺寸精度称为尺寸不符。14、气泡及暗泡：注塑件内部有孔隙，气泡是制品成型后内部形成体积较小或成串孔隙的缺陷，暗泡是塑胶内部产生的真空孔洞。15、表面混蚀：注塑件表面呈现无光、泛白、浊雾状外观称为混蚀。16、凹陷：注塑件表面不平整、光滑、向内产生浅坑或陷窝。17、冷料（冷胶）：注塑件表面由冷胶形成的色泽、性能与本体均不同的塑料。18、顶白/顶高：注塑件表面有明显发白或高出原平面。19、白点：注塑件内有白色的粒点，粒点又叫“鱼眼”，多反映在透明制品上。20、强度不够（脆裂）：注塑件的强度比预期强度低，使塑胶件不能承受预定的负裁二、常见品质（缺陷）问题产生原因1、色差：①原材料方面因素：包括色粉更换、塑胶材料牌号更改，定型剂更换。②原材料品种不同：如PP料与ABS料或PC料要求同一种色，但因材料品种不同而有轻微色差，但允许有一限度范围。③设备工艺原因：A、温度；B、压力；C熔胶时间等工艺因素影响。④环境因素：料筒未清干净，烘料斗有灰尘，模具有油污等。⑤色粉本身因素：有些色粉不受温，且制品很易受温度变化而改变。如：9278烤箱提手（A2945兰）。2、充填不足（缺胶）：①模具方面：A、浇注系统设计不合理，浇注系统是熔体进入模腔的通道，对塑料件成型质量有很大关系，浇口不平行，浇口的位置不是在壁厚部位；B、模具排气结构不良；C、熔体中的杂质或冷料阻塞流道；D、模具温度未达要求。②原料方面：A、原材料含水量过大；B、原料中易挥发物超标； C、原材料中杂质或再生料过多。③注塑机方面：A、注射量不足：如用150T机生产180T产品。 B、喷嘴为异物堵塞，喷嘴孔太小； C、原料供应不足：如料筒堵塞，水口料影响下料； D、止逆阀故障； E、注射行程不够。④成型操作方面：A、模具温度过低；B、注射压力太低；C、保压时间太短；D、注射速度太慢；
出口信贷 export credit 出口津贴 export subsidy 商品倾销 dumping 外汇倾销 exchange dumping 优惠关税 special preferences 保税仓库 bonded warehouse 贸易顺差 favorable balance of trade 贸易逆差 unfavorable balance of trade 进口配额制 import quotas 自由贸易区 free trade zone 对外贸易值 value of foreign trade 国际贸易值 value of international trade 普遍优惠制 generalized system of preferences-GSP 最惠国待遇 most-favored nation treatment-MFNT 货运用语中英文对照 英语船务术语简缩语 外贸英语：保险 Insurance 外贸英语：佣金 Commission -------------------价格条件---------------------- 价格术语trade term (price term) 运费freight 单价 price 码头费wharfage 总值 total value 卸货费landing charges 金额 amount 关税customs duty 净价 net price
印花税stamp duty 含佣价price including commission 港口税port dues 回佣return commission . 装运港port of shipment 折扣discount, allowance 卸货港port of discharge 批发价 wholesale price 目的港port of destination 零售价 retail price 进口许口证import licence 现货价格spot price 出口许口证export licence 期货价格forward price 现行价格（时价）current price prevailing price 国际市场价格 world (International)Market price 离岸价（船上交货价）FOB-free on board 成本加运费价（离岸加运费价） C&F-cost and freight 到岸价（成本加运费、保险费价）CIF-cost,insurance and freight --------------------交货条件---------------------- 交货delivery 轮船steamship(缩写S.S) 装运、装船shipment 租船charter (the chartered ship) 交货时间 time of delivery 定程租船voyage charter 装运期限time of shipment 定期租船time charter 托运人（一般指出口商）shipper, consignor
1.塑料缩水就是塑料收缩的问题，很少有资料谈过.塑料收缩有四种情况:热收缩、相变收 缩、取向收缩、压缩收缩与弹性恢复。收缩过程有三部分组成：浇口凝固前的收缩、冷却收缩和脱模后收缩。 2. 缩水的主要原因：1，注射量不够2，熔体温度过高3，注射压力和保压压力过小4， 注射时间和保压时间过少5，注射速度过大6模具温度不当 3. 缩孔的主要原因：1，注射量不够2，注射压力太低3，注射速度不当4，模具温度 过低 4.注塑件缺胶、不饱模---Short Shot 原因分析 ?塑胶熔体未完全充满型腔。 ?塑胶材料流动性不好。 对策 ?制品与注塑机匹配不当，注塑机塑化能力或注射量不足。 ?料温、模温太低，塑胶在当前压力下流动困难，射胶速度太慢、保压或保压压力过低。 ?塑料熔化不充分，流动性不好，导致注射压力损失大。 ?增加浇口数，浇口位置布置要合理、多腔不平衡排布充填。 ?流道中冷料井预留不足或不当，冷料头进入型腔而阻碍塑胶之正常流动，增加冷料穴。 ?喷嘴、流道和浇口太小，流程太长，塑胶填充阻力过大。 ?模具排气不良时，空气无法排除。 5.披峰(毛边)---Burring & Flashing 原因分析 ?塑胶熔体流入分模面或镶件配合面将发生-Burring。 ?锁模力足够，但在主浇道与分流道会合处产生薄膜状多余胶料为Flash 对策 ?锁模力不足，射入型腔的高压塑胶使分模面或镶件配合面产生间隙，塑胶熔体溢进此间隙。 ?模具（固定侧）未充分接触机台喷嘴，公母模产生间隙。（没装紧） ?模温对曲轴式锁模系统的影响。 ?提高模板的强度和平行度。 ?模具导柱套摩损/模具安装板受损/拉杆（哥林柱）强度不足发生弯曲，导致分模面偏移。 ?异物附着分模面。排气槽太深。 ?型腔投影面过大/塑胶温度太高/过保压。 6. 表面缩水、缩孔(真空泡)--Sink Mark & Void & Bubble 原因分析 ?制品表面产生凹陷的现象。 ?由塑胶体积收缩产生，常见于局部肉厚区域，如加强筋或柱位与面交接区域。 ?制品局部肉厚处在冷却过程中由于体积收缩所产生的真空泡，叫缩孔（Void）。 ?塑胶熔体含有空气、水分及挥发性气体时，在注塑成型过程空气、水分及挥发性气体进入制品内部而残留的空洞叫气泡（Bubble）。 对策
PCR 扩增反应的操作 第一节PCR 扩增反应的基本原理 一、聚合酶链式反应（PCR ）的基本构成 PCR 是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA ）的扩增反应，是模拟体内DNA 复制过程，在体外特异性扩增DNA 片段的一种技术，在分子生物学中有广泛的应用，包括用于DNA 作图、DNA 测序、分子系统遗传学等。 PCR 基本原理: 是以单链DNA 为模板，4 种dNTP 为底物，在模板3'末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA 得到极大程度的扩增。在微量离心管中，加入与待扩增的DNA 片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA 膜板、四种dNTP 溶液、耐热Taq DNA 聚合酶、Mg 2+等。反应时先将上述溶液加热，使模板DNA 在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在Taq DNA 聚合酶的催化下，以dNTP 为原料，引物沿5'→ 3'方向延伸，形成新的DNA 片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。因此PCR 循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、热稳定DNA 聚合酶在适当温度下催化DNA 链延伸合成（见图）。 1．模板DNA 的变性 模板DNA加热到90~95 C时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。变性温度与DNA 中G-C 含量有关，G-C 间由三个氢键连接，而A-T 间只有两个氢键相连，所以G-C 含量较高的模板，其解链温度相对要高些。故PCR 中DNA 变性需要的温度和时间与模板DNA 的二级结构的复杂性、G-C 含量高低等均有关。对于高G-C含量的模板DNA在实验中需添加一定量二甲基亚砜（DMSO）,并且在PCR循环中起 始阶段热变性温度可以采用97 C ,时间适当延长，即所谓的热启动。 2．模板DNA 与引物的退火 将反应混合物温度降低至37~65C时，寡核苷酸引物与单链模板杂交，形成DNA模板-引物复 合物。退火所需要的温度和时间取决于引物与靶序列的同源性程度及寡核苷酸的碱基组成。一般要求引物的浓度大大高于模板DNA 的浓度 ,并由于引物的长度显著短于模板的长度, 因此在退火时,引物与模板中的互补序列的配对速度比模板之间重新配对成双链的速度要快得多,退火时间一般为1?2min。 3．引物的延伸 DNA 模板-引物复合物在Taq DNA 聚合酶的作用下,以dNTP 为反应原料,靶序列为模板, 按碱基配对与半保留复制原理,合成一条与模板DNA 链互补的新链。重复循环变性-退火-延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。延伸所需要的时间取决于模板DNA的长度。在72 C条件下，Taq DNA聚合酶催化的合成速度大约为40?60个碱基/秒。经过一轮“变性-退火-延伸”循环,模板拷贝数增加了一倍。在以后的循环中,新合成的DNA 都可以起模板作用,因此每一轮循环以后, DNA 拷贝数就增加一倍。每完成一个循环需2?4min, —次PCR 经过30?40次循环，约2?3h。扩增初期，扩增的量呈直线上升，但是当引物、模板、聚合酶达到一定比值时,酶的催化反应趋于饱和,便出现所谓的“平台效应”,即靶DNA 产物的浓度不再增加。 PCR 的三个反应步骤反复进行,使DNA 扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y =（1 + X）n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平（Y）均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%,但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期, 靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数
单证要求—汇总 1、任何航线，不可以顺签提单，即不可以将开航日期向后延。 2、关于倒签提单，必须要求订舱人和提单上的SHIPPER盖公章出具保函。到巴基斯 坦和美国的提单，不允许倒签。 3、关于冷箱显示温度的问题。 无论主单、小单，提单上禁止显示冷箱温度，如果是信用证要求必须显示，需客户提供保函并传真信用证进行确认，但是即便如此，也决不能显示与事实不符的内容。尤其是到‘西班牙’的冷箱，提单绝对不允许显示温度。 到其他港口的，在客户出具信用证和保函的情况下，显示温度时，需显示为‘XXX C SET BY SHIPPER’字样。 4、提单禁止显示到港日期。由于海上航行受天气、风浪、港口等多种因素影响，船 期表发布的日期仅为参考，而不是承诺。 5、关于最终目的地条款 由于信用证的要求，托运人可能会要求在货物描述一栏中加入货物的最终目的地，而此目的地与提单上的交货地不同，如加入此描述，承运人的责任期间会延长至货物的最终目的地，而不是提单上的交货地。因此，在加入最终目的地时，需在该条款后再强调交货地点和内陆运费的承担人。例如“FINAL DESTINATION XXX；BUT DELIVERY AT XXX，ALL RELATIVE INLAND HAULAGE CHARGES RISKS AND RESPONSIBILITIES ARE ON CARGO RECEIVER’S ACCOUNT” 6、铅封号一定要准确。现已发生多起收货人企图利用实际到港铅封号与我公司提单 记载不符这一点，将其损失转嫁于我公司的案例。铅封号与单证记载的不一致恰恰是我公司的致命弱点。这也表明单证制作的准确无误是承运人规避风险、澄清责任的重要基础。 7、原则上不同意Seaway Bill做第三地付款。
注塑过程中常见问题及对策?首先说说成型的原理，注塑成型又可称为模内浇注。简单说就是一个产品模型的空壳，通过注 塑机炮筒的高温溶解使塑胶原料成液体状，同时通过螺杆的旋转增压，使塑胶液体高速填充模型空隙。冷却后，开模后即成成品。 ?经常牵涉到的成型参数：注射速度、注射压力、保压压力、保压时间、炮筒温度、模温。 注塑过程中的常见问题 气眼/气泡 黑点/黑纹/异色 料脆/脆断 烧焦/焦痕 飞边/毛边/批锋 分层起皮 流痕 欠注/缺胶 银纹/料花 缩水 熔接痕/夹水线 1成型问题-气眼/气泡 气眼是指空气被困在型腔内而使制件产生气泡的现象. ?它是由于两股熔体前锋交汇时气体无法从分型面、顶杆或排气孔中排出造成的。 ?气眼通常位于熔体最后填充的地方。 ?缺少排气口或排气口尺寸不足将导致在最后填充部位产生气眼或其他表面缺陷. ?如果制件设计薄厚不均，也非常容易造成气眼现象。 气眼可能引起的问题: ?困在型腔内气体不能被及时排出，易导致出现表面起泡，制件内部夹气，注塑不满等现象。 改进方法 2成型问题-黑点/黑纹/异色 黑点/黑纹/异色是指在制件表面存在黑色斑点，或是其它色泽条纹。 黑点/黑纹/异色的起因 材料降解: 塑胶过热分解将导致黑点或条纹。塑胶如果在封闭的料筒内、螺杆表面停留时间过长，将导致炭化降解，故而在注塑过程中产生黑点或条纹。色粉分布不均或困气烧焦也会产生黑纹或异色。 材料污染: 塑胶中存在脏的回收料、异物、其他颜色的材料或易于降解的低分子材料，都可能引起上
述现象。空气中的粉尘也容易引起制件表面的黑点。 改进方法 材料?采用无污染的原材料 ?将材料置于相对封闭的储料仓中 ?增加材料的热稳定性 模具设计?清洁顶杆和滑块. ?改进排气系统. ?清洁和抛光流道内的任何死角，保证不产生积料 ?注塑前清洁模具表面. 注塑机?选择合适的注塑机吨位 ?检查料筒内表面、螺杆表面是否刮伤积料. 工艺条件?降低料筒和喷嘴的温度. ?清洁注塑过程的各个环节. ?避免已经产生黑点/黑纹的料被重新回收利用. 3成型问题-料脆/脆断 制件料脆是指制件在某些部位出现容易开裂或折断。发脆主要是由于材料降解导致大分子断链，降低 了大分子的分子量，从而使聚合物的整体物理性能下降。 发脆原因分析 ?干燥条件不适合 ?注塑温度设置不对 ?浇口和流道系统设置不恰当 ?螺杆设计不恰当 ?熔解痕强度不高 ?使用过多的回收料 改进方法 材料?注塑前设置适当的干燥条件 塑胶如果连续干燥几天或干燥温度过高，尽管可以除去挥发分等物质，但同时也易导致材料降解，特别是 热敏性塑料。 ?减少使用回收料，增加原生料的比例. ?选用高强度的塑胶. 模具设计?增大主流道、分流道和浇口尺寸 过小的主流道、分流道或浇口尺寸容易导致过多的剪切热从而导致聚合物的分解。 注塑机?选择设计良好的螺杆，使塑化时温度分配更加均匀。如果材料温度不均，在局部容易积聚过多热量，导致材料的降解 工艺条件?降低料筒和喷嘴的温度 ?降低背压、螺杆转速和注塑速度，减少过多剪切热的产生，避免聚合物分解. ?如果是熔解痕强度不足导致的发脆，则可以通过增加熔体温度，加大注塑压力的方法，提高熔解痕强度 4成型问题- 烧焦/焦痕
提取组织或细胞中的总RNA以其中的mRN作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCF使测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量 RNA羊品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。 （一）反转录酶的选择 1. Moloney 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活 性相对较弱。最适作用温度为37 C。 2. 禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和 RNA 酶 H 活性。 最适作用温度为42 C。 3. Thermus thermophilus 、 Thermus flavus 等嗜热微生物的热稳定性反转录 酶：在Mn2存在下，允许高温反转录 RNA，以消除RNA模板的二级结构。 4. MMLV 反转录酶的 RNase H- 突变体：商品名为 SuperScript 和 SuperScript U。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一 特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的 m 模板合成较长 cDNA 。 （二）合成 cDNA 引物的选择 1. 随机六聚体引物：当特定 mRNA 由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝 其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长 mRNA 。 用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了 cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的 cDNA 中 96%来源 于 rRNA。 2. Oligo(dT) ：是一种对 mRNA 特异的方法。因绝大多数真核细胞 mRNA 具有
鼻饲饮食操作流程及注意事项 鼻饲的目的：对昏迷病人或不能由口进食者,从胃管供给食物和药物,以维持病人的营养和治疗。 适应症：常用于不能由口进食者,如昏迷、口腔疾患、口腔手术后的病人;早产婴儿和病情危重的病人;拒绝进食的病人。 鼻饲的操作步骤要点 1、插管前物品准备齐全（治疗盘、一次性胃管包、无菌注射器、医用纱布、石蜡 固定胶条、手电筒、无菌棉签) 2、向病人解释，取适当卧位，清洁一侧鼻腔，润滑胃管前端。 3、插管长度:前发际至剑突或耳垂至鼻尖再至剑突,约45-55CM。 4、昏迷病人插管前应将头部梢向后仰,插至会厌部14--16cm时将病人头部托起,使其下 颌靠近胸骨柄、再缓缓插入。 5、插管中特殊情况的处理:如插入不畅时应检查胃管是否盘在口中;如病人出现恶心,嘱 患者深呼吸,可稍停片刻再插入;如病人出现呛咳、紫绀、呼吸困难时,立即将管拔出、休息片刻再重插。 6、固定好胃管后先注入少量(10ml)的温开水，再注入鼻饲液，鼻饲液温度38℃-40℃, 每次量不超过200ml,间隔时间不少于2h。食物注入完后再注人少量（20ml)的温开水，防止食物存积胃管内阻塞管腔。 7、防止鼻饲液存积在管腔中变质,造成胃肠炎或堵塞管腔;药片应研碎溶解后灌入;灌入 速度不可过快,鼻饲液不可过冷或过热;若灌入新鲜果汁,应与奶液分别灌入,防止凝块产生;鼻饲过程中,避免灌入空气,以防造成腹胀。 8、将胃管开口端反折，用纱布包好，固定于病人枕边。 9、长期鼻饲者,应每天进行口腔护理。 10、每次抽鼻饲液时应反折或夹住胃管末端、鼻饲完毕应再注入温开水,并将胃管提起, 使全部流入胃内。 11、拔管：用于病人停止鼻饲或长期鼻饲为减少鼻黏膜刺激，每周或每月需要更换一次 胃管。拔管时胃管开口端用夹子夹紧，边拔边用纱布擦胃管，拔管余14cm左右, 嘱病人屏气,快速拔管,以防管内液体滴入气。拔管后帮助病人清洁鼻孔、面部及漱 口。
报检中的单证注意事项 捷高国际货运代理有限公司专业为您提供服务 1、报检范围 (1)、国家法律法规规定必须由检验检疫机构检验检疫的； (2)、输入国家或地区规定必须凭检验检疫机构出具的证书方准入境的； (3)、有关国际条约规定须经检验检疫的； (4)、申请签发普惠制原产地证或一般原产地证的； (5)、对外贸易关系人申请的鉴定业务和委托检验； (6)、对外贸易合同、信用证规定由检验检疫机构或官方机构出具证书的； (7)、未列入《检验检疫商品目录》的入境货物经收、用货单位验收发现质量不合格或残损、短缺，需检验检疫局出证索赔的； (8)、涉及出入境检验检疫内容的司法和行政机关委托的鉴定业务； 2、报检证单的更改 (1)报检人申请撤销报检时，应书面说明原因，经批准后方可办理撤销手续。 (2)报检后３0天内未联系检验检疫事宜的作自动撤销报检处理。 (3)有下列情况之一的应重新报检： A、超过检验检疫有效期限的； B、变更输入国家或地区，并又有不同检验检疫要求的； C、改换包装或重新拼装的； D、已撤销报检的。 (4)报检人申请更改证单时，应填写更改申请单，交附有关函电等证明单据，并交还原单证，经审核同意后方可办理更改手续。 (5)品名、数（重）量、检验检疫结果、包装、发货人、收货人等重要项目更改后与合同、信用证不符的，或者更改后与输出、输入国家或地区法律法规规定不符的，均不能更改。 (6)报检人遗失检验检疫证单的，必须由报检人书面说明理由，经法定代表人签字，加盖公章，并在报纸或刊物上声明作废，经检验检疫局同意后，再重新签发。 3、报检单填制说明 (1)报检单应由持有报检员证的人员如实填制，并加盖单位公章；代理报检的应加盖代理报检机构在检验检疫机构备案的印章。 (2)原则上一批货物填制一份报检单。入境货物一批指：同一合同、发票、提单；出境货物一批指：同一品名、运输工具、运往同一地点、同一收货人。 (3)报检单填制应完整、真实、准确、不得涂改。栏目内容确实无法填制的，应以“＊＊＊”注明。采用打印或钢笔填制，字迹要清晰。 (4)任何人不得涂改已受理报检的单据。 (5)发货人/受货人：应按对外贸易合同的发货人或信用受益人填制；HS编码：按《商品分类及编码协调制度》中所列货物的编码。报检数量：填申请检验检疫的数量，并注明货物计量单位的名称；报检重量：填申请检验检疫的重量，并注明净重/毛重和计量单位；货物总值：按合同、发票所列货物值填制，注明币种；检验检疫项目：对法检项目或合同约定项目逐条填制完整；申请检验检疫单证：准确注明所需检验检疫证书的种类。 （6）必须在报检人声明栏内签上报检员姓名。 4、更改申请单填制说明 （1）、申请人：填报检单位，并加盖公章。
一、注塑件常见品质问题 塑胶件成型后，与预定的质量标准（检验标准）有一定的差异，而不能满足下工序要求，这就是塑胶件缺陷，即常说的品质问题，要研究这些缺陷产生原因，并将其降至最低程度，总体来说，这些缺陷不外乎是由如下几方面造成：模具、原材料、工艺参数、设备、环境、人员。现将缺陷问题总结如下：1、色差：注塑件颜色与该单标准色样用肉眼观看有差异，判为色差，在标准的光源下（D65）。2、填充不足（缺胶）：注塑件不饱满，出现气泡、空隙、缩孔等，与标准样板不符称为缺胶。3、翘曲变形：塑胶件形状在塑件脱模后或稍后一段时间内产生旋转和扭曲现象，如有直边朝里，或朝外变曲或平坦部分有起伏，如产品脚不平等与原模具设计有差异称为变形，有局部和整体变形之分。4、熔接痕（纹）：在塑胶件表面的线状痕迹，由塑胶在模具内汇合在一起所形成，而熔体在其交汇处未完全熔合在一起，彼此不能熔为一体即产生熔接纹，多表现为一直线，由深向浅发展，此现象对外观和力学性能有一定影响。5、波纹：注塑件表面有螺旋状或云雾状的波形凹凸不平的表征现象，或透明产品的里面有波状纹，称为波纹。6、溢边（飞边、披锋）：在注塑件四周沿分型线的地方或模具密封面出现薄薄的（飞边）胶料，称为溢边。7、银丝纹：注塑件表面的很长的、针状银白色如霜一般的细纹，开口方向沿着料流方向，在塑件未完全充满的地方，流体前端较粗糙，称为银丝纹（银纹）。8、色泽不均（混色）：注塑件表面的色泽不是均一的，有深浅和不同色相，称为混色。9、光泽不良（暗色）：注塑件表面为灰暗无光或光泽不均匀称为暗色或光泽不良。10、脱模不良（脱模变形）：与翘曲变形相似，注塑件成型后不能顺利的从模具中脱出，有变形、拉裂、拉伤等、称为脱模不良。11、裂纹及破裂：塑胶件表面出现空隙的裂纹和由此形成的破损现象。12、糊斑（烧焦）：在塑件的表面或内部出现许多暗黑色的条纹或黑点，称为糊斑或烧焦。13、尺寸不符：注塑件在成型过程中，不能保持原来预定的尺寸精度称为尺寸不符。14、气泡及暗泡：注塑件内部有孔隙，气泡是制品成型后内部形成体积较小或成串孔隙的缺陷，暗泡是塑胶内部产生的真空孔洞。15、表面混蚀：注塑件表面呈现无光、泛白、浊雾状外观称为混蚀。16、凹陷：注塑件表面不平整、光滑、向内产生浅坑或陷窝。17、冷料（冷胶）：注塑件表面由冷胶形成的色泽、性能与本体均不同的塑料。18、顶白/顶高：注塑件表面有明显发白或高出原平面。19、白点：注塑件内有白色的粒点，粒点又叫“鱼眼”，多反映在透明制品上。20、强度不够（脆裂）：注塑件的强度比预期强度低，使塑胶件不能承受预定的负裁 二、常见品质（缺陷）问题产生原因 1、色差：①原材料方面因素：包括色粉更换、塑胶材料牌号更改，定型剂更换。②原材料品种不同：如PP料与ABS料或PC料要求同一种色，但因材料品种不同而有轻微色差，但允许有一限度范围。③设备工艺原因：A、温度；B、压力；C熔胶时间等工艺因素影响。④环境因素：料筒未清干净，烘料斗有灰尘，模具有油污等。⑤色粉本身因素：有些色粉不受温，且制品很易受温度变化而改变。如：9278烤箱提手（A2945兰）。 2、充填不足（缺胶）：①模具方面：A、浇注系统设计不合理，浇注系统是熔体进入模腔的通道，对塑料件成型质量有很大关系，浇口不平行，浇口的位置不是在壁厚部位；B、模具排气结构不良；C、熔体中的杂质或冷料阻塞流道；D、模具温度未达要求。②原料方面：A、原材料含水量过大； B、原料中易挥发物超标； C、原材料中杂质或再生料过多。③注塑机方面：A、注射量不足：如用150T机生产180T产品。B、喷嘴为异物堵塞，喷嘴孔太小；C、原料供应不足：如料筒堵塞，水口料影响下料； D、止逆阀故障； E、注射行程不够。④成型操作方面：A、模具温度过低；B、注射压力太低；C、保压时间太短；D、注射速度太慢；E、熔体温度太低。3、翘曲变形：①模具方面：主要是针对模具设计方面不合理原因造成，在此不作讲述。②成型操作方面：A、注射压力过高，流体方向和垂直流向方向分子取向相差较大，塑胶力图恢复
XX单证工作总结3篇 刚开始到公司，被分配先做单证，虽说在学校学的是外贸专业，可我什么都做不好，被老单证员瞧不起，说什么大学生呀?我高中生都能做好的事，他却老出错。(因为是他最后审核)，停止我做单证。那时我是按书本上学到的知识来套用的!脱离的实际的业务操作。我知道我很欠学，但我是个不服输的人，别人能做好的事，我一定能做好，而且一定比他们做的更好! 我开始留心看他做单证，看别人做单证。那时，公司分八个部，每个部都有单证员，独立核算，彼此之间的业务也保密，就是想到别的部门也要经过上级领导批准。我无法看到别人做的单证，我只能想办法!我在同部门里就是看他们作废的单证，当他们要撕掉的时候，我就说给我做草稿纸吧。另外找机会帮他们做他们不想做的事，因为他们不想去做，他们就会教你怎么去做，你就有机会锻炼自己。我还想办法做其它部门的单证(我常在下班时，去其它部门找好友聊天和打牌。从中探听他们的牢骚和单证情况。从中吸取教训。) 这样一来，三个月后，我很快就掌握了做单证的经验和技巧，加上学校学到的知识，公司里所有的单证我都会做，并且做的最好，两年内没有一笔单证出错，没有一笔不符点和退证退单，是公司第一位单证员!连公司老总和别的部门
经理都要求我去帮他们做单证。我具体的操作规程情况如下： 1)当拿到l/c后，先仔细审查和合同有出入的地方，产品名称、数量、开证行、公司名称、有效期、最迟装运期、有没有软条款、特别的规定等等。 如果有的话，请立即与业务人员商洽这些事情，把所有的问题最好一次向外商提出，请他修改l/c。 2)督促跟单员紧跟这份合同(如果没有跟单员，是自己的话，提前完成那些能提前的工作，比如说：invoice，packinglist，forma，insurancepolicy，等等。 3)货物装船后，请及时联系船公司或船代理，要求他们先将做好b/lcopy传真给你确认。你需要认真仔细地按l/c 上面的要求来核对。发现问题，应该立即要求他们修改。 4)所有单证都必须反复核对，一笔l/c的单证，至少全面核对五次，做到单证一致，单单一致。如果客户有临时要求，可以说服客户修改l/c，或者做t/t。 比方说：上次我的客户已经开了l/c给我，但在装柜时，他突然想起还有一些零配件要求装上，(他已经答应他的批发商了，但忘记写在l/c里了)，数量还不少，这时候去改l/c已经是不可能的事了，我说这样吧，我先帮你装上船，然后我去补办手续，l/c就不要修改了，零配件的钱，请你t/t给我们，我们再补做发票装箱单给你。客户很高兴地说：
注塑生产中常见的问题 1. 刚开机时产品跑披锋，生产一段时间后产品缺胶的原因及解决方案。 刚开机时注塑机料管内的熔胶由于加热时间长，熔胶粘度低，流动性好，产品易跑披锋，生产一段时间后由于熔胶不断把热量带走，造成熔胶不足，粘度大，流动性差，使产品缺胶。在生产一段时间后，逐渐提高料管温度来解决。 2. 在生产过程中，产品缺胶，有时增大射胶压力和速度都无效，为什么？解决方法？ 是因为生产中熔胶不断把热量带走，造成熔胶不足，胶粘度大，流动性差，使产品缺胶。提高料管温度来解决。 3. 产品椭圆的原因及解决方法。 产品椭圆是由于入胶不均匀，造成产品四周压力不匀，使产品椭圆，采用三点入胶，使产品入胶均匀。 4. 精密产品对模具的要求。 要求模具材料刚性好，弹变形小，热涨性系数小。 5. 产品耐酸试验的目的 产品耐酸试验是为了检测产品内应力，和内应力着力点位置，以便消除产品内应力。 6. 产品中金属镶件受力易开裂的原因及解决方法。 产品中放镶件，在啤塑时由于热熔胶遇到冷镶件，会形成内应力，使产品强度下降，易开裂。在生产时，对镶件进行预热处理。 7. 模具排气点的合理性与选择方法。 模具排气点不合理，非但起不到排气效果，反而会造成产品变形或尺寸变化，所以模具排气点要合理。选择模具排气点，应在产品最后走满胶的地方和产品困气烧的地方开排气。 8. 产品易脆裂的原因及解决方法。 产品易脆裂是产品使用水口料和次料太多造成产品易脆裂，或是料在料管内停留时间过长，造成胶料老化，使产品易脆裂。增加新料的比例，减少水口料回收使用次数，一般不能超过三次，避免胶料在料管内长时间停留。 9. 加玻纤产品易出现泛纤的原因及解决方法 是由于熔胶温度低或模具温度低，射胶压力不足，造成玻纤在胶内不能与塑胶很好的结合，使纤泛出。加高熔胶温度，模具温度，增大射胶压力。 10. 进料口温度对产品的影响。 进料口温度的过高或过低，都会造成机器回料不稳定，使加料量不稳定，而影响产品的尺寸和外观。 11. 透明产品有白点的原因及解决方法。 透明产品有白点是因为产品内进入冷胶造成，或料内有灰尘造成的。提高射嘴温度，加冷料井，原料注意保存，防止灰尘进入。 12. 什么是注塑机的射出能力？ 射出能力※※=射出压力（kg/cm2）×射出容积（cm3）/1000
AFLP分子标记实验 扩增片段长度多态性 Amplified fragment length polymorphism（AFLP 是在随机扩增多态性（RAPD和限制性片段长度多态性（RFLP技术上发展起来的DNA多态性检测技术,具有RFLP技术高重复性和RAPD技术简便快捷的特点,不需象RFLP 分析一样必须制备探针，且与RAPD标记一样对基因组多态性的检测不需要知道其基因组的序列特征，同时弥补了 RAPD技术重复性差的缺陷。同其他以PCR为基础的标记技术相比，AFLP技术能同时检测到大量的位点和多态性标记。此技术已经成功地用于遗传多样性研究，种质资源鉴定方面的研究，构建遗传图谱等。 其基本原理是：以PCR（聚合酶链式反应为基础,结合了 RFLP、RAPD的分子标记技术。把DNA进行限制性内切酶酶切，然后选择特定的片段进行PCR扩增（在所有的限制性片段两端加上带有特定序列的’接头”用与接头互补的但3-端有几个随机选择的核苷酸的引物进行特异PCR扩增,只有那些与3-端严格配对的片段才能得到扩增，再在有高分辨力的测序胶上分开这些扩增产物，用放射性法、荧光法或银染染色法均可检测之。 一、实验材料 采用青稞叶片提取总DNA 实验设备 1. 美国贝克曼库尔特CEQ8000毛细管电泳系统, 2. 美国贝克曼库尔特台式冷冻离心机， 3. 美国MJ公司PCR仪,
4. 安玛西亚电泳仪等。 三、实验试剂 1. 试剂:请使用高质量产品，推荐日本东洋坊TOYOBO公司的相关产品 DNA提取试剂盒； EcoRI酶,Msel酶,T4连接酶试剂盒； Taq 酶,dNTP, PCR reactio n buffer; 琼脂糖电泳试剂：琼脂糖，无毒GeneFinder核酸染料替代传统EB染料;超纯水（18.2M ? ? cm 2. 其他实验需要物品 微量移液枪（一套及相应尺寸Tip头,PCR管，冰浴等。 四、实验流程 1、总DNA提取 使用DNA提取试剂盒提取植物基因组DNA,通过紫外分光光度计检测或用标准品跑胶检测。一般来说，100ng的基因组DNA作为反应模板是足够的。 2、EcoR1酶消化（20ul体系/样品 EcoR1 1ul
鼻饲的注意事项 鼻饲饮食的注意事项： ①鼻饲饮食的量应遵医嘱，从少量开始逐步增加，一般每天1200～1500ml，6～7次/天，每次200ml； ②鼻饲饮食的温度为38℃，温度过高烫伤粘膜，温度过低引起胃部不适； ③鼻饲饮食应现配现用，未用完的冰箱保存，24小时内用完，用时温水浸泡后使用； ④滴注时不能加入粉状物，以防堵管。不能加入酸性较强的食物（如西红柿）或药物（维生素C），以防凝块。 2.鼻饲操作时的注意事项： ①插管时遇到阻塞，应停止插管，检查原因，不能强插，以免组织损伤。 ②注入食物后，不得搬动病人，可稍抬高床头，防止呕吐。 ③每次放入、取出胃管、注食前后都应夹闭胃管末端，防止空气进入。 ④长期鼻饲的病人，每1-2周更换胃管一次(夏天);每3-4周更换胃管一次(冬天)。 （1）根据病人情况和需求制定膳食种类。 （2）家庭自备鼻饲膳食要注意餐具卫生并用清洁纱布过滤。 （3）配制鼻饲液时最好现用现配。
（4）鼻饲液温度控制在38～40℃。可将鼻饲液滴在上肢前臂内侧试温。 （5）灌注药液前先核对药物，确认准确无误再研碎，用温开水融解后灌入胃内。 （6）每次灌入后用少量温开水冲洗胃管，以免堵塞胃管。 （7）加强口腔护理，预防并发症。 （8）一般胃管每周更换一次，换管时先将管子轻柔、迅速拔出，冲洗后晾干消毒以备以后使用，经济情况允许可更换新的鼻饲管。3．1 防止误吸 鼻饲时要抬高床头，使之成30°～60°的角。在病情允许的情况下，可采取半卧位，头偏向健侧，防止返流误吸。鼻饲后30min 不要翻身和搬动病人。 3．2 避免胃潴留和腹胀 严重脑卒中时，中枢神经系统功能障碍，影响迷走神经对胃运动的调节；下丘脑调节失衡，血管收缩常引发胃黏膜缺血、缺氧，从而影响胃的正常消化功能；过多的胃内容物刺激十二指肠肠壁上的脂肪和渗透压感受器，通过胃肠反射抑制胃排空。因此，脑卒中的病人要多餐少量，必要时给予胃黏膜保护的药或胃动力药。
单证工作总结3篇 单证工作总结3篇呀?我高中生都能做好的事，他却老出错.(因为是他最后审核)，停止我做单证.那时我是按书本上学到的知识来套用的!脱离的实际的业务操作.我知道我很欠学，但我是个不服输的人，别人能做好的事，我一定能做好，而且一定比他们做的更好! 我开始留心看他做单证，看别人做单证.那时，公司分八个部，每个部都有单证员，独立核算，彼此之间的业务也保密，就是想到别的部门也要经过上级领导批准.我无法看到别人做的单证，我只能想办 法!我在同部门里就是看他们作废的单证，当他们要撕掉的时候，我就说给我做草稿纸吧.另外找机会帮他们做他们不想做的事，因为他们不想去做，他们就会教你怎么去做，你就有机会锻炼自己.我还想办法做其它部门的单证(我常在下班时，去其它部门找好友聊天和打牌.从中探听他们的牢骚和单证情况.从中吸取教训.) 这样一来，三个月后，我很快就掌握了做单证的经验和技巧，加上学校学到的知识，公司里所有的单证我都会做，并且做的最好，两年内没有一笔单证出错，没有一笔不符点和退证退单，是公司第一位单证员!连公司老总和别的部门经理都要求我去帮他们做单证.我具体的操作规程情况如下： 1)当拿到l/c后，先仔细审查和合同有出入的地方，产品名称、数量、开证行、公司名称、有效期、最迟装运期、有没有软条款、特别的规定等等. 如果有的话，请立即与业务人员商洽这些事情，把所有的问题最好一次向外商提出，请他修改l/c.
2)督促跟单员紧跟这份合同(如果没有跟单员，是自己的话，提前完成那些能提前的工作，比如说：invoice，packinglist，forma，insurancepolicy，等等. 3)货物装船后，请及时联系船公司或船代理，要求他们先将做好b/lcopy传真给你确认.你需要认真仔细地按l/c上面的要求来核对.发现问题，应该立即要求他们修改. 4)所有单证都必须反复核对，一笔l/c的单证，至少全面核对五次，做到单证一致，单单一致.如果客户有临时要求，可以说服客户修改l/c，或者做t/t. 比方说：上次我的客户已经开了l/c给我，但在装柜时，他突然想起还有一些零配件要求装上，(他已经答应他的批发商了，但忘记写在l/c里了)，数量还不少，这时候去改l/c已经是不可能的事了，我说这样吧，我先帮你装上船，然后我去补办手续，l/c就不要修改了，零配件的钱，请你t/t给我们，我们再补做发票装箱单给你.客户很高兴地说：非常感谢，你怎么想到的?我说：这只是一点小经验而已. 5)交单的时候，也要注意：有没有b/l背书，i/p背书等等，发票装箱单是不是做的不好，不规范，有没有忘了一些特别的规定：l/c 号码必须显示，hscode必须显示，船代理必须显示，电话传真必须显示等等. 总之：一句话，做单证也不是一件很容易的事!必须有耐心、有恒心、更要细心，祝所有做单证的朋友工作顺利哦! 通过近8个月的学习、实践工作，从最初的统计门表、画图送审到独立下单、五金、门型及结构的独立设计再到现场与客户沟通交底，不可否认自己进步了许多，在这里多谢同事及领导的大力支持与帮助.但也有很多地方需要学习，我都会一一记录下来，积极请教领导，提高自己的水平.