用DOCK做分子对接计算的基本步骤
一、受体文件和配体文件的准备
需要用到Chimera软件（下载网址https://www.doczj.com/doc/d37595614.html,/chimera）。1.受体的准备：
用Chimera打开受体文件，没去除配体和水的要先去除配体和水（在Select 选单中选择相应结构直接删掉即可）。然后，选择Tools ->Structure Editi ng ->Dock Prep，对受体分子进行处理，如下图。
如果受体文件参数不全，则不能使用Dock Prep模块，这时需手动选择Struc ture Editing中的AddH和Add Charge对分子进行处理，并保存为mol2格式文件。
之后，删除受体文件中所有的氢，并将重原子保存为pdb文件。
2.配体的准备：
手动给配体加H，加电子，并将配体保存为mol2文件。
二、生成负模
1.生成靶蛋白的分子表面：
需要用到dms程序，命令：“dms rec_noH.pdb -n -w 1.4 -v -o rec.ms”，参数如下：
-a #使用所有原子，而非仅仅是氨基酸的原子
-d #改变点的密度
-g #输出到文件
-i #只计算指定原子所构成的表面
-n #计算表面点的垂直面
-w #改变探针半径
-v #详细输出
-o #指定输出文件名称 (必须的)
2. 生成负模
可以使用DOCK中附带的sphgen程序去生成对接需要的球形负模（需要一个I
NSPH文件，DOCK中的Demo里有吧，复制过来就OK），输入命令sphgen就可以了，得到rec.sph。
3.选择一簇负模进行对接计算
运行命令“showsphere < sphgen_cluster.in”将sph文件转换成pdb文件。其输入文件的参数如下：
rec.sph #负模聚类文件
1 #选择处理哪个簇 (<=0 为所有簇)
N #以PDB文件的形式来生成表面
selected_cluster.pdb #输出文件的名
这是最一般的方法，选择的是最大的负模簇，也可以指定某处附近的簇，方法略。
三、生成栅格
1. 在活性位点周围生成一个盒子
输入命令：“showbox < box.in”，box.in文件也可以不写，程序会以问答方式进行。
2. 生成栅格
运行命令：“nohup grid -i grid.in -o grid.out>grid.log&”，运行这一步能够大大节省对接计算时间。我的grid.in文件在这里：UploadFiles/200 6-11/1120179826.rar
Grid的参数以后再解释，不写在这里了。
四、刚性对接和柔性对接
刚性对接与柔性对接的不同只在于选择参数的不同，就不分开写了。命令都一样：“nohu p dock5 -i dock.in -o dock.out>dock.log&”，写不同的dock. in文件就行了。
我的刚性对接的dock.in文件：UploadFiles/2006-11/1120460197.rar；柔性
对接的dock.in文件：UploadFiles/2006-11/1120567533.rar。（仅供参考）
本文以大肠杆菌DH10B为例介绍外源基因在大肠杆菌中表达全过程 克隆步骤包括：模板制备（基因组DNA提取）-感受态细胞的制备-PCR-纯化回收-酶切-连接-转化-挑菌摇菌-质粒抽提-酶切鉴定-测序 1) 基因组DNA提取（以家蚕为例） 1. 取家蚕五龄后部丝腺约0.5g，于10ml匀浆器内，加2mlDNA抽提缓冲液，在 冰上充分研磨，转入5ml的离心管； 2. 加入RnaseA（10ul）至终浓度20ug/ml，37℃水浴1h； 3. 加入ProteinaseK（25ul）至终浓度100ug/ml，55℃水浴2h； 4. 分装到1.5ml eppendorff管，0.6ml/管； 5. 加入等体积的平衡酚（pH8.0），充分混匀，5000g，15min，取上清； 6. 重复5，再抽提1次； 7. 用等体积的酚/氯仿（1/1，v/v），氯仿各抽提1次 8. 将上清移入新离心管，加入1/10体积的3mol/L NaAc（pH 5.2），2倍体积的 无水乙醇，充分混匀，4℃过夜 9. 用牙签将絮状沉淀物挑出。用75%冰酒精洗涤3次，37℃控干； 10. 200μl 0.1 TE(pH8.0)溶解DNA； 11. 检测OD值； 12. 做好标记，以供进一步实验之用。 2) 感受态细胞的制备 1. -20℃冻藏的DH10B甘油菌在LB平板上复苏（划板），37℃，8-12小时； 2. 用灭菌牙签挑取单菌落，放入3ml LB培养基中，37℃振荡培养过夜； 3. 取100μl过夜培养物接种到另一3 ml LB培养基中，37℃振荡培养2～2.5 h， 使OD值在0.6左右（把握好浓度，OD值可以不用测）；将菌液分装到1.5ml EP 管中（在超净台完成） 4. 5000 g离心4 min收集菌体，将菌体重悬于800 μl 75 mmol/L冷CaCl2中， 冰浴30 min；（CaCl2要用高纯度的，切记！） 5. 4℃，5 000 g离心4 min，弃上清； 6. 加入200μl 75 mmol/L冷CaCl2，轻轻敲打管壁，使混合均匀，冰上放4 h 后用于转化，或加0.1倍体积甘油混匀，－70℃保存备用。可以保存至少6个月。 3) PCR 1、PCR反应体系： ddH2O 37.7 μL 10×PCR buffer 5 μL （25mM） dNTP 4 μL 引物1/2 1μL/1μL Taq酶 0.3μL 模板 1μL PCR反应体系总体积 50 μL 充分混匀，稍离心。 2、PCR反应条件
AutoDock和AutoDock Tools 使用教程 一、分子对接简介及软件介绍 1．分子对接理论基础 所谓分子对接就是两个或多个分子之间通过几何匹配和能量匹配而相互识别的过程。分子对接在酶学研究以及药物设计中具有十分重要的意义。在酶激活剂、酶抑制剂与酶相互作用以及药物分子产生药理反应的过程中，小分子（通常意义上的Ligand）与靶酶（通常意义上的Receptor）相互互结合，首先就需要两个分子充分接近，采取合适的取向，使两者在必要的部位相互契合，发生相互作用，继而通过适当的构象调整，得到一个稳定的复合物构象。通过分子对接确定复合物中两个分子正确的相对位置和取向，研究两个分子的构象，特别是底物构象在形成复合物过程中的变化，是确定酶激活剂、抑制剂作用机制以及药物作用机制，设计新药的基础。 分子对接计算是把配体分子放在受体活性位点的位置，然后按照几何互补、能量互补化学环境互补的原则来实时评价配体与受体相互作用的好坏，并找到两个分子之间最佳的结合模式。分子对接最初思想起源于Fisher E.的“锁和钥匙模型”（图），认为“锁”和“钥匙”的相识别的首要条件是他们在空间形状上要互相匹配。然而，配体和受体分子之间的识别要比“锁和钥匙”模型复杂的多。首先，配体和受体分子的构象是变化的，而不是刚性的，配体和受体在对接过程中互相适应对方，从而达到更完美的匹配。其次，分子对接不但要满足空间形状的匹配，还要满足能量的匹配。配体和受体之间的通过底物分子与靶酶分子能否结合以及结合的强度最终是由形成此复合物过程的结合自由能变化ΔG bind所决定的。 互补性（complementarity）和预组坦织（pre-organization）是决定分子对接过程的两个重要原则，前者决定识别过程的选择性，而后者决定识别过理的结合能力。互补性包括空间结构的互补性和电学性质的互补性。1958年Koshland提出了分子识别过程中的诱导契合（induced fit）概念，指出配体与受体相互结合时，受体将采取一个能同底物达到最佳结合的构象（图1）。而受体与配体分子在识别之前将受体中容纳配体的环境组织的越好，其溶剂化能力越低，则它们的识别效果越佳，形成的复合物也就越稳定。
分子克隆技术 一、填空题 1.PCR反应中加入矿物油的作用是___________________________。 2.分子克隆实验中外源DNA和载体片段连接之前，要对载体进行去磷酸化处理，我 们在本次试验中去磷酸化使用的碱性磷酸酶是___________________________。它 的目的是___________________________。 3.用α互补筛选转化子是，带有外源片段的菌落显___________________________色。 4.Southern杂交中进行与杂交的目的是___________________________。 5.凝胶糖凝胶电泳时加入loading buffer作用是___________________________和 ___________________________。 6.影响琼脂糖凝胶电泳的因素主要有___________________________、 ___________________________、___________________________、 ___________________________、___________________________。 二、简答题 1.简述PCR反应体系中都有哪些成分及各成分的作用。 2.为得到质量较好的水稻RNA，抽提前应做如何准备？RNA抽提过程中、RNA的 保存及以后对RNA的操作过程中应特别注意什么？ 3.简述为防止放射性同位素外照射及内照射对人体造成伤害，在操作放射性同位素 时，我们可以采取哪些措施进行防护？ 4.简述影响电转化感受态细胞转化效率的因素有哪些？ 5.质粒抽提时用到的SolutionI，SolutionII，SolutionIII及异丙醇分别起什么作用？操 作时应注意什么？ 三、分析问答题 1.描述并图示pUC19载体DNA及其在HindIII位点克隆了外源DNA片段的质粒DNA 和水稻总DNA及它们的HindIII和BamH1酶切产物在琼脂糖凝胶电泳时的带型。 2.利用质粒载体克隆外源DNA片段主要包括哪些步骤？涉及到哪些工具酶？要获得 理想的结果，各步骤操作中应主要注意哪些事项？ 3.在Southern杂交实验中，同一根杂交管内的膜曝光的····（原卷此处不清晰）冲 洗后，有些组X光片信号很强，有些组信号很弱，有的样品点样孔附近有较强的 信号，但是有的地方信号较弱，请分析造成这种结果的可能原因。 4.下面是本次课生物技术班某组β-active基因RT-PCR（反转录前没有对总RNA进 行去除DNA 的处理）试验的琼脂糖凝胶电泳图，凝胶上共点了6个样，PCR使用 的模板从左至右分别是：该组提取的水稻总DNA，该组提取的水稻总RNA，该组 的4个反转录产物。（原卷本题图不清晰） 请问： 提取的RNA的质量如何？ RT-PCR是否成功？为什么会出现这样的结果？ 有哪些地方需要改进？
笔记3（分子克隆2——主要步骤） 分子克隆可以分为以下几个步骤： 分离制备待克隆的DNA片段————将靶DNA片段与载体在体外进行连接————重组DNA分子转入宿主细胞————筛选、鉴定阳性重组子————重组子的扩增。 1.带有目的基因的DNA片段的获得： 可以用限制内切酶降解基因组DNA，再配合使用其他实验手段得到待定的DNA片段，可以用超速离心的方法分离出具有特定核苷酸组成的DNA片段，可以用mRNA做模板，用反转录酶合成互补DNA，即cDNA，也可以用化学合成的方法直接合成一段DNA。 2.重组DNA分子的构建： 重组DNA分子中包括两部分，一部分是外源DNA，即目的DNA片段，另一部分是载体DNA。用作载体的，有质粒、噬菌体或病毒DNA。它们的基本特征是能够独立复制。如果用同一种限制性内切酶切割这两种DNA，则它们的末端完全相同，由于有互补的单链末端序列存在，在连接酶的作用下，就可以形成重组DNA 分子。在没有互补单链末端的情况下，也可以用酶学方法造成一个互补单链末端之后再进行连接。
3.重组DNA分子的转化和重组克隆的筛选： 重组DNA分子必须进入宿主细胞中，才能得到扩增和表达．这个过程叫做转化。大肠杆菌是目前使用最广泛的宿主细胞。除此以外．其他细菌、酵母、哺乳动物细胞等也可作为宿主细胞，可以根据实验的需要加以选择。在被转化的宿主细胞中，不同的单个细胞(在平板上表现为单个菌落，亦称克隆)中可能含有不同的重组质粒或非重组质粒，因此必须进行筛选，以便确定哪些是重组克隆。筛选可以使用抗菌素抗性或其他方法，依载体的性质而定。 4.特定重组克隆的鉴别： 由于重组克隆往往是较多的，而在某一克隆实验中，我们感兴趣的目的克隆只有一个或几个，所以需要进一步鉴别。使用的方法主要有核酸杂交法和免疫化学法。 此外，找出了目的克隆之后，还需要根据实验的目的，进一步弄清目的克隆中外源DNA片段上的基因的结构和功能。主要有酶切图谱的制定，基因在DNA 片段上的精确定位，确定是否有内含子，DNA序列分析，离体翻译实验，外源基因在某些宿主细胞中的表达及产物的提纯等。
分子克隆技术步骤 在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA 片段的方法。常含有目的基因，用体外重组方法将它们插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入DNA 的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。 克隆在生物学中其名词含义系指一个细胞或个体以无性繁殖的方式产生一群细胞或一群个体，在不发生突变的情况下，具有完全相同的遗传性状，常称无性繁殖( 细胞)系；其动词(clone,cloned,cloning) 含义指在生物体 外用重组技术将特定基因插入载体分子中，即分子克隆技术。 将DNA 片段( 或基因)与载体DNA 分子共价连接，然后引入寄主细胞，再筛选获得重组的克隆，按克隆的目的可分为DNA 和cDNA 克隆两类。 cDNA 克隆是以mRNA 为原材料，经体外反转录合成互补的DNA(cDNA) ，再与载体DNA 分子连接引入寄主细胞。每一cDNA 反映一种mRNA 的结构，cDNA 克隆的分布也反映了mRNA 的分布。特点是：①有些生物，如RNA 病毒没有DNA ，只能用cDNA 克隆； ②cDNA 克隆易筛选，因为cDNA 库中不包含非结构基因的克隆，而且每一cDNA 克隆只含一个mRNA 的信息； ③cDNA 能在细菌中表达。cDNA 仅代表某一发育阶段表达出来的遗传信息，只有基因文库才包含一个生物的完整遗传信息。 1. 方法： (1) DNA 片段的制备：常用以下方法获得DNA 片段：①用限制性核酸内切酶将高分子量DNA 切成一定大小的DNA 片段； ②用物理方法( 如超声波) 取得DNA 随机片段；③在已知蛋白质的氨基酸顺序情况下，用人工方法合成对应的基因片段；④从mRNA 反转录产生cDNA 。 (2) 载体DNA 的选择： ①质粒：质粒是细菌染色体外遗传因子，DNA 呈环状，大小为1-200 千碱基对(kb) 。在细胞中以游离超螺旋状存在，很容易制备。质粒DNA 可通过转化引入寄主菌。在细胞中有两种状态，一是“紧密型”；二是“松驰型”。此外还应具有分子量小，易转化，有一至多个选择标记的特点。质粒型载体一般只能携带10kb 以下的DNA 片段，适用于构建原核生物基因文库，cDNA 库和次级克隆。 ②噬菌体DNA ：常用的λ噬菌体的DNA 是双链，长约49kb，约含50 个基因，其中50% 的基因对噬菌体的生长和裂解寄主菌是必需的，分布在噬菌体DNA 两端。中间是非必需区，进行改造后组建一系列具有不同特点的载体分子。λ载体系统最适用于构建真核生物基因文库和cDNA 库。 M13 噬菌体是一种独特的载体系统，它只能侵袭具有 F 基因的大肠杆菌，但不裂解寄主菌。M13DNA(RF) 在 寄主菌内是双链环状分子，象质粒一样自主制复，制备方法同质粒。寄主菌可分泌含单链DNA 的M13 噬菌体，又能方便地制备单链DNA ，用于DNA 顺序分析、定点突变和核酸杂交。 ③拷斯(Cos) 质粒：是一类带有噬菌体DNA 粘性末端顺序的质粒DNA 分子。是噬菌体－质粒混合物。此类载体分子容量大，可携带45kb 的外源DNA 片段。也能象一般质粒一样携带小片段DNA ，直接转化寄主菌。这类载体常被用来构建高等生物基因文库。 (3) DNA 片段与载体连接：DNA 分子与载体分子连接是克隆过程中的重要环节之一，方法有：①粘性末端连接，DNA 片段两端的互补碱基顺序称之为粘性末端，用同一种限制性内切酶消化DNA 可产生相同的粘性末端。在连接酶的作用下可恢复原样，有些限制性内切酶虽然识别不同顺序，却能产生相同末端。②平头末端连接，用物理方法制备的DNA 往往是平头末端，有些酶也可产生平头末端。平头DNA 片段可在某些DNA 连接酶作用下连接起来，但连接效率不如粘性末端高；③同聚寡核苷酸末端连接。④人工接头分子连接，在平头DNA 片段末端加上一段人工合成的、具有某一限制性内切酶识别位点的寡核苷酸片段，经限制性内切酶作用后就会产生粘性末端。 连接反应需注意载体DNA 与DNA 片段的比率。以λ或Cos 质粒为载体时，形成线性多连体DNA 分子，载体与DNA 片段的比率高些为佳。以质粒为载体时，形成环状分子，比率常为1∶1。 (4) 引入寄主细胞：常用两种方法：①转化或转染，方法是将重组质粒DNA 或噬菌体DNA(M13) 与氯化钙处 理过的宿主细胞混合置于冰上，待DNA 被吸收后铺在平板培养基上，再根据实验设计使用选择性培养基筛选重组子，通常重
常用分子克隆实验方法I 一、植物总DNA的小量提取 方法1：提取吸附法。无须巯基乙醇、氯仿等有毒物质，产物无须Rnase处理。 (1)充分研磨。称取约0.2克植物组织，加入液氮充分研磨3-5min，稍后加约1ml溶液 A，继续研磨至略粘稠的组织匀浆，用大口1ml吸头将所有溶液移至1.5ml离心管 中，55℃水浴30min； (2) 高速离心去杂质。10,000rpm离心5min，取约600ul上清至新1.5ml离心管； (3) 核酸吸附。往上清液中加入1倍的异丙醇，轻轻混匀，再加入总体积1/4已混匀的 溶液B，静置3min; (4) 低速离心沉淀。5000rpm离心1min，轻轻倒掉上清，并用吸水纸轻吸离心管口， 再用移液枪吸走大部分残余液体； (5) 75%乙醇清洗。加入1ml75%乙醇，5000rpm离心30s，轻轻倒掉上清，用吸水纸稍 吸离心管口。重复该步骤一次，再5000rpm离心30s，然后用移液枪吸走管底的残 液，晾干5min； (6) 核酸洗脱。加入约55ul TE（PH8.0）至管底，轻轻重悬硅土，静置3min，10,000rpm 离心1min，用小枪头轻轻吸取出50ul管底溶液，冷藏。 方法2：CTAB法，此为在经典方法基础上，经过摸索改进，提高了得率，减少了污染。 (1)充分研磨。称取约0.2克植物组织，加入液氮充分研磨3-5min，稍后加约1ml CTAB 提取液，继续研磨至略粘稠的组织匀浆，用大口1ml吸头移至1.5ml离心管，65℃ 水浴30-60min。 (2) 氯仿抽提。10,000rpm离心3min，取约600ul上清。加入1倍的氯仿，轻轻混匀， 10,000rpm离心3min，取上清再抽提1遍。 (3) 核酸沉淀。加入预冷的1倍异丙醇或2倍乙醇，轻混匀，6000rpm离心3min，弃 上清。 (4) 清洗沉淀。轻加入1ml 75%乙醇，再吸掉上清，重复一次，倒置于吸水纸或横放于 离心管架上晾干5min。 (5) 溶解DNA。加50ul含Rnase A（约10ug/ml）的TE，常温下放置30min。取约3-5ul 电泳检测后，低温冷藏。
分子对接 ——使用AutoDock和AutoDock Tools 一、分子对接简介及软件介绍 二、对接准备及对接操作 三、结果分析 一、分子对接简介及软件介绍 1．分子对接理论基础 所谓分子对接就是两个或多个分子之间通过几何匹配和能量匹配而相互识别的过程。分子对接在酶学研究以及药物设计中具有十分重要的意义。在酶激活剂、酶抑制剂与酶相互作用以及药物分子产生药理反应的过程中，小分子（通常意义上的Ligand）与靶酶（通常意义上的Receptor）相互 分子正确的相对位置和取向，研究两个分子的构象，特别是底物构象在形成复合物过程中的变化，是确定酶激活剂、抑制剂作用机制以及药物作用机制，设计新药的基础。 互补的原则来实时评价配体与受体相互作用的好坏，并找到两个分子之间最佳的结合模式。分子对接最初思想起源于Fisher E.的“锁和钥匙模型”（图），认为“锁”和“钥匙”的相识别的首要条件是他们在空间形状上要互相匹配。然而，配体和受体分子之间的识别要比“锁和钥匙”模型复杂的多。首先，配体和受体分子的构象是变化的，而不是刚性的，配体和受体在对接过程中互相适应 程的结合自由能变化ΔG bind所决定的。 互补性（complementarity）和预组坦织（pre-organization）是决定分子对接过程的两个重要原则，前者决定识别过程的选择性，而后者决定识别过理的结合能力。互补性包括空间结构的互补性和电学性质的互补性。1958年Koshland提出了分子识别过程中的诱导契合（induced fit）概念，指出配体与受体相互结合时，受体将采取一个能同底物达到最佳结合的构象（图1）。而受体与配体分子在识别之前将受体中容纳配体的环境组织的越好，其溶剂化能力越低，则它们的识别效果越佳，形成的复合物也就越稳定。
分子对接的原理，方法及应用 （PPT里弄一些分子对接的照片，照片素材文件里有） 分子对接 是将已知三维结构数据库中的分子逐一放在靶标分子的活性位点处。通过不断优化受体化合物的位置、构象、分子内部可旋转键的二面角和受体的氨基酸残基侧链和骨架，寻找受体小分子化合物与靶标大分子作用的最佳构象，并预测其结合模式、亲和力和通过打分函数挑选出接近天然构象的与受体亲和力最佳的配体的一种理论模拟分子间作用的方法。 通过研究配体小分子和受体生物大分子的相互作用，预测其亲和力，实现基于结构的药物设计的一种重要方法。 原理： 按照受体与配体的形状互补，性质互补原则，对于相关的受体按其三维结构在小分子数据库直接搜索可能的配体，并将它放置在受体的活性位点处，寻找其合理的放置取向和构象，使得配体与受体形状互补，性质互补为最佳匹配 （配体与受体结合时，彼此存在静电相互作用，氢键相互作用，范德华相互作用和疏水相互作用，配体与受体结合必须满足互相匹配原则，即配体与受体几何形状互补匹配，静电相互作用互补匹配，氢键相互作用互补匹配，疏水相互作用互补匹配） 目的： 找到底物分子和受体分子的最佳结合位置 问题： 如何找到最佳的结合位置以及如何评价对接分子之间的结合强度 方法： 1、首先建立大量化合物的三维结构数据库 2、将库中的分子逐一与靶分子进行“对接” 3、通过不断优化小分子化合物的位置以及分子内部柔性键的二面角，寻找小分子化合物与靶标大分子作用的最佳构象，计算其相互作用及结合能 4、在库中所有分子均完成了对接计算之后，即可从中找出与靶标分子结合的最佳分子 应用： 1）直接揭示药物分子和靶点之间的相互作用方式 2）预测小分子与靶点蛋白结合时的构象 3）基于分子对接方法对化合物数据库进行虚拟筛选，用于先导化合物的发现
RNA提取 ①取TRIZOL冻存裂解的细胞，室温放5分钟使其完全溶解。 ②两相分离，每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。 手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。 4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。 RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。 ③RNA沉淀：将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。 加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。 此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗：移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。 ⑤RNA干燥：小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀：溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 逆转录 1.First-strand cDNA synthesis 体系oligo(DT) 50uM 1ul 10pg-500ng mRNA 10ul Random primer 1ul dNTP mix (10mM) 1ul
2.65°C，5min后冰上孵育至少1min 3. 稍微离心后，加入 5Xfirst-strand buffer 4ul DTT(0.1M) 1ul RNase out Recombinant RNase Inhibitor 1ul Superscript IIIRT 1ul 4.PCR 25°C，10min；42°C，50min；70°C，5min；4°C 10min PCR 1. DNA 模板2ul 正向引物2ul 反向引物2ul 2×Taq PCR star mix 20ul ddH20 14ul 条件 94°C 5min 94°C 30S 55-65°C 30S 72°C 30-60s/kb 72°C 5min 25-30个cycles
分子克隆及细胞培养基本实验方法 1.载体构建实用操作技术 1.1菌种的保存—20%甘油菌 2体积菌液与1体积70%的甘油混合后，储存于-20℃或-70℃备用。（甘油菌中甘油的浓度为20-30%均可） 1.2甘油菌复苏、培养 方法一、挑取甘油菌一环，接种在含100ug/ml Amp的LB固体培养基上（活化菌种），37℃培养过夜（约16小时）；挑取一个菌落转接在含100ug/ml Amp 的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。 方法二、直接吸取10~20ul甘油菌，接种在含100ug/ml Amp的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。 1.3小规模制备质粒DNA（QIA miniprep kit ） 适于从1~5ml 菌液中制备20ug高拷贝质粒 ⑴收集菌液，离心1000rpm，１分，弃上清 ⑵以250ul P1重悬细菌（P1中已加RNase） ⑶加入250ul P2，颠倒4~6次轻混，约2~3分（轻混以免剪切基因组DNA，并免 长时间消化） ⑷加入350ul N3，迅速颠倒4~6次轻混；离心10分，13 000rpm ⑸上清入QIAprep柱，离心30~60秒，滤液弃之 ⑹加入0.5ml PB洗，离心30~60秒 ⑺加入0.75ml PE洗，离心30~60秒，弃滤液，再离心1分 ⑻换新管，加入50ul EB，静置1分（EB 37℃预热），离心1分。 1.4酶切反应 ⑴体系构成（反应体系尽可能小！） pGEM3ZF-huCTLA4-Ig（ul）pAdTrack-CMV（ul）
①dd.H2O 17 17 ②10×NEbuff 2 3 3 ③10×BSA 3 3 ④底物DNA 5 5 ⑤内切酶HindⅢ 1 1 XbaⅠ 1 1 Total : 30 ul 30ul ⑵37℃水浴1~2小时，必要时延长酶切时间至12小时 ⑶酶切2小时后，取5-10ul 电泳观察酶解是否完全 ⑷65℃灭活内切酶 ⑸-20℃保存备用 1.5回收目的片段（QIAquick Gel extraction Protocol） ⑴胶，尽可能去除多余的胶，称重； ⑵加入适量buff QG（300ul QG /100mg胶）；>2%的胶，应加大QG用量（600ul QG /100mg）； ⑶水浴50℃，10min，每2-3min混匀一次，使胶完全溶解！必要时延长水浴时间， 胶完全溶解后混合物颜色应为黄色，与buff QG 相似； ⑷当DNA片段在<500bp或>4kb时，应加入异戊醇100ul/100mg胶，以提高产物 量。此步不离心。DNA片段在500bp~4kb时，加入异戊醇并不能提高产量； ⑸结合：将混合物转入QIAquick柱，离心13000rpm，1min；（柱容量800ul/次）； ⑹洗：0.75ml buff PE，离心13000rpm，1min；（DNA用于盐敏感操作时，如平 端连接、直接测序，加入PE后静置2-5min）；弃离心液，再离心13000rpm， 1min，以去除剩余的乙醇； ⑺将QIAquick柱置于一清洁的1.5ml Ep管，加入30~50ul buff EB或H2O （滴 于QIAquick 膜上！），静置1min，离心15000rpm，1min； ⑻-20℃保存备用。 1.6连接反应
分子克隆实验标准步骤 一、 常规分子克隆实验流程： 二、 分子克隆实验标准步骤（含实验编号）： 1. PCR 扩增目的基因（编号Clone SOP-1） 以本实验室常用酶KOD-Plus-Neo （TOYOBO ）为例 体系（50ul ）： 10×KOD buf 5ul dNTP(2mM) 5ul Mg 2+ 3ul Primer1 1ul Primer2 1ul Template50-200ng KOD0.5ul ddH 2O up to 50ul 程序： 95℃2min 98℃10s 58℃30s 35cycle 68℃2kb/min 68℃7min 12℃∞
2.PCR产物的琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶的制备（编号Clone SOP-2） 琼脂糖溶液的制备：称取琼脂糖，置于三角瓶中，按1%-1.5%的浓度加入相应体积的TBE或TAE缓液，将该三角瓶置于微波炉加热至琼脂糖溶解。 胶板的制备：①取有机玻璃内槽，洗净、晾干；②将有机玻璃内槽置于一水平位置模具上，安好挡板，放好梳子。在距离底板上放置梳子，以便加入琼脂糖后可以形成完好的加样孔。 ③将温热琼脂糖溶液倒入胶膜中，使胶液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀 的胶层。④室温下静置30min左右，待凝固完全后，轻轻拔出梳子，在胶板上即形成相互隔开的上样孔。制好胶后将铺胶的有机玻璃内槽放在含有0.5～1×TAE（Tris-乙酸）或TBE（Tris-硼酸）工作液的电泳槽中使用，没过胶面1mm以上。 3.试剂盒回收DNA片段（编号Clone SOP-3） 以本实验室常用DNA凝胶回收试剂盒（天根）为例 使用前请先在漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。 ①柱平衡步骤：向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）加入500μl平衡液BL， 12,000rpm(~13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子） ②将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中， 称取重量。 ③向胶块中加入等倍体积溶液PN（如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100μl，则加入100μlPN 溶液），60℃水浴放置，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可继续放置几分钟或再补加一些溶胶液，直至胶块完全溶解(若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块)。 注意：对于回收<300bp的小片段可在加入PN完全溶胶后再加入1/2胶块体积的异丙醇以提高回收率；胶块完全溶解后最好将溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在室温时结合DNA 的能力较强。 ④将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中），室温放置2min， 12,000rpm(~13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。 ⑤向吸附柱CA2中加入600μl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇）， 12,000rpm(~13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。 ⑥重复操作步骤⑤。 ⑦将吸附柱CA2放回收集管中，12,000rpm(~13,400×g)离心2min，尽量除尽漂洗液。将吸附 柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。 ⑧将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB或 ddH2O，室温放置2min。12,000rpm(~13,400×g)离心2min收集DNA溶液。 4.酶切反应（编号Clone SOP-4） 以本实验室常用酶FastDigest restriction enzymes（Thermo）为例 双酶切体系（若是单酶切则只用加一种酶）： 10×FastDigest? buffer or 10×FastDigest? Green buffer 5ul FastDigest restriction enzyme 1 0.5-1ul FastDigest restriction enzyme 2 0.5-1ul DNAN ddH2Oupto50ul 酶切体系混合均匀后置于37℃条件下反应，反应时间应大于30min，若是载体（2-3ug）至少酶切2小时。 5.酶切产物的回收（编号Clone SOP-5） 以本实验室常用Axygen?AxyPrep?PCRClean-UpKit（Axygen）为例 ①在PCR、酶切、酶标、或测序反应液中，加入3个体积的BufferPCR-A（若BufferPCR-A
分子对接简介 分子对接(molecular docking)是通过研究小分子配体与受体生物大分子相互作用，预测其结合模式和亲和力进而实现基于结构的药物设计的一种重要的方法。其本质是两个或多个分子之间的识别过程，其过程涉及分子之间的空间匹配和能量匹配。 分子对接的基本原理 分子对接的最初思想起源于Fisher E提出的“锁和钥匙模型”，即受体与配体的相互识别首要条件是空间结构的匹配。 分子对接锁和钥匙模型 分子对接方法的两大课题是分子之间的空间识别和能量识别。空间匹配是分子间发生相互作用的基础，能量匹配是分子间保持稳定结合的基础。对于空间匹配的计算，通常采用格点计算、片断生长等方法，能量计算则使用模拟退火、遗传算法等方法。各种分子对接方法对体系均有一定的简化，根据简化的程度和方式，可以将分子对接方法分为三类： 刚性对接：刚性对接方法在计算过程中，参与对接的分子构像不发生变化，仅改变分子的空间位置与姿态，刚性对接方法的简化程度最高，计算量相对较小，适合于处理大分子之间的对接。比较有代表性的是Wodak和Janin研发的分子对接算法和Jiang等发展的软对接(soft dock)方法。 半柔性对接：半柔性对接方法允许对接过程中小分子构像发生一定程度的变化，但通常会固定大分子的构像，另外小分子构像的调整也可能受到一定程度的限制，如固定某些非关键部位的键长、键角等，半柔性对接方法兼顾计算量与模型的预测能力，是应用比较广泛的对接方法之一。由于小分子相对较小，因此在一定程度考察柔性的基础上，仍可以保持很高的计算效率，在药物设计中，特别是在基于分子对接的数据库搜索中，多采用半柔性分子方
分子克隆技术实验讲义 黑龙江大学生命科学学院 2016年3月 甜菜M14品系BvM14-glyI基因的克隆与鉴定 一、实验目的 1、熟悉和了解目的基因克隆与鉴定的过程和方法。 2、学习和掌握质粒、T载体的特点。 3、学习和掌握TA克隆的连接体系及操作要点。 4、学习和掌握XcmⅠ酶切制备T载体的过程及方法。 5、学习和掌握CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的原理和方法。 6、学习并掌握热激法转化技术的原理和操作步骤。 7、学习并掌握重组子鉴定和筛选的原理及蓝白筛选的原理和方法。 8、学习并掌握碱法小量制备质粒DNA的原理及操作步骤。
二、相关知识 （一）T载体的制备 pMD18-T Vector是一种高效克隆PCR产物（T-A Cloning）的商业化专用载体，由pΜC 18载体改建而成。在pΜC 18多克隆位点处的XbaⅠ和SalⅠ识别位点之间插入了Eco RⅤ识别位点，用Eco RⅤ进行酶切反应后，再左两侧的3′端添加“T”而成，可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。 相关知识点：（1）质粒的提取；（2）酶切；（3）PCR等。 （二）DNA的重组与连接（PCR产物的克隆） 把DNA片段从某一类型的载体无性繁殖到另一类型载体中，例如从某种质粒克隆到另一种质粒，这个过程称为亚克隆。所谓重组，就是把外源目的基因“装进”载体的过程，即DNA的重新组合。为了将目的基因重组于载体分子中，需要将载体DNA和目的基因分别进行适当处理，一般采用内切酶法将载体DNA分子切割成可与外源基因连接的线性分子，使其与相同酶切过的载体分子相互连接，彼此成为配伍末端（compatible end），以产生末端连接。现在一些生物公司也开发了针对不同插入DNA片段的专用载体，如专门用于克隆PCR产物的载体，大大方便了实验操作。 相关知识点：（1）克隆与亚克隆；（2）DNA重组；（3）内切酶；（4）粘性末端与平末端；（5）连接酶；（6）连接酶的分类及功能等。 （三）大肠杆菌感受态细胞的制备 外源基因与载体在体外连接成重组体DNA分子后，需将其导入受体细胞进行扩增和筛选，得到大量、单一的重组体分子，这就是外源基因的无性繁殖，或称为克隆。受体细胞也叫宿主细胞，大肠杆菌宿主菌是目前基因工程最常用的受体细胞。感受态细胞（competent cell）是经过一定方法处理后，具有接受外源DNA能力的大肠杆菌，只有发展了感受态的细胞才能稳定地摄取外来的DNA分子。 相关知识点：（1）克隆；（2）宿主细胞的定义及分类；（3）感受态细胞定义及其功能；（4）转化定义及方法（DMSO、MnCl2、TB aq、PEG）等。 （四）重组DNA的转化及重组子的鉴定 将外源DNA分子导入某一宿主细胞的过程称为转化。把重组DNA分子导入到细菌中产生克隆有两个目的，一是大量产生重组DNA分子，在完成连接反应后，重组DNA分子往往只有纳克级的量，不易操作和进行下一步的分析，若把重组DNA分子导入到细菌细胞中，细菌细胞可分裂多次产生克隆，克隆中每一个细胞都含有很多个拷贝的重组DNA分子，这样重组DNA分子的量就多了；二是对重组DNA 分子进行纯化，在构建重组DNA分子的过程中很难保证体系中不污染其他的DNA分子，连接过程完成以后体系中有多种分子存在，除了需要的重组DNA分子以外，还含有没有连接上的载体分子、没有连接上的DNA片段、自身环化的DNA分子和连接上污染DNA片段的重组DNA分子，未连接上的载体和DNA片段对实验影响不大，因为它们即使导入细菌细胞，因为不能复制，很快就要被细菌细胞中的酶降
一、扩增 1、LB培养基5ml； 2、抗生素：1000X，即1:1000比例。种类根据细菌抗性决定； 3、菌体：看浑浊度，1%-5%，取500ul于其中； 4、37℃摇床220转，过夜，12-16h。 二、纯化质粒DNA 1、1.5ml离心管，编号一定要写清楚； 2、加满离心管，离心12000xg. 1min，弃上清。取三次； 3、加Buffer S1 200ul，溶解沉淀，5min； 4、加S2（用完立刻盖紧瓶盖，以免CO2中和Buffer中的NaOH）200ul，不能剧烈（以免基因组DNA的污染），上下翻转4-6次，直至形成透亮的溶液，时间少于5min。目的是使蛋白包裹基因组DNA，游离质粒； 5、加S3 280ul，温和充分翻转混合6-8次，12000xg，10min(此步呈白色絮状)； *备注：S1：S2：S3=5:5:7 6、取上清加入制备管（置于2ml离心管），12000xg，1min，去滤液； 7、加Buffer W1 500ul，12000xg，1min，弃滤液； 8、加Buffer W2 700ul，12000xg，1min，弃滤液。重复一遍； 9、空管离心12000xg，1min； 10、制备管移入新的1.5ml离心管，管膜中加60-80ul去离子水，静置1min，12000xg，1min。（将去离子水加热至65度，将提高洗脱效率） 四、跑胶回收：sost回收失败 1、2%浓度胶，Loading Buffer如是6X，则加10ul到样品，全部加样到胶孔中。 插入：配胶方法 大块胶60ml；小块胶25ml； 需要配置大块胶、大孔胶； Agarose 0.6g，TAE60ml，微波中火2min； 趁热但不烫手时加入gold view 0.5ul/25ml； 倒入槽里。 2、跑胶：单位厘米/5-10v。所以大槽25cm，150v即可。小槽100v即可。 3、紫外灯下切胶，纸巾吸进液体，计算凝胶重量（1mg=1ul）； 4、加3个凝胶体积的凝胶结合液DB（0.1ul视为100ul；如凝胶浓度大于2%，则加入6倍体积溶胶液；凝胶块最大不能超过400ul，超过可多个离心柱）；
分子克隆主要技术： （1）限制性内切酶酶切与连接 基因克隆也叫DNA分子克隆，即在体外重组DNA分子，而实现该技术的关键是一种被称作限制性核酸内切酶的工具酶。每一种限制性核酸内切酶可以识别DNA分子上特定的碱基序列，切断DNA分子。依据碱基互补的原理，在DNA连接酶的作用下可以把切开的DNA片段连接起来，因此可以把目的片段连接到合适的载体上形成重组子。 （2）转化与转染 作为表达载体，必须具有复制起始序列、多克隆位点及选择标记，可以在宿主细胞中进行自我复制或整合到宿主基因组中进行复制。作为宿主的工程菌或细胞在某些化学条件或物理刺激下会改变其细胞膜的通透性，从而易于将细胞表面附着的外源基因吸收到胞内，这一过程即转化（工程菌）或转染（细胞）。 利用选择标记可以很容易鉴别成功导入目的基因的工程菌或细胞，比如抗生素抗性筛选—凡是成功导入重组载体的工程菌或细胞均获得某种抗生素抗性，而未导入的工程菌或细胞则不能在含该抗生素的培养基中生长。 （3）聚合酶链式反应 聚合酶链式反应，即PCR。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃（具体退火温度根据引物的Tm值确定）左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
软件安装： 将D软件中pymol-1.5.0.3.win32-py2.7文件夹中的文件按序号安装，安装3_mgltools_win32_1.5.6_Setup.exe文件时如出错，则直接点开U盘中的mgltools_win32_1.5.6_Setup.exe安装，一直安装到5. 安装后将pymol27 解压后复制到C盘将原有的pymol27文件替换 新建一个文件夹存储要做分子对接的“E盘科研，实验方法，分子对接饶燊强，P2X4 and 青藤碱”这个不行,因为文件名要在英文输入状态，不能有空格，不能有中文，而且要区分大小写E/dock/P2X4_s inomenine 在C盘打开Program files （x86），打开The Scripps Research Institute文件夹，打开Autodock，打开4.2.6 将autogrid4.exe，autodock4.exe和The Scripps Research Institute文件夹中Vina中的vina.exe这三个文件同时复制到新建的存储文件夹中“E盘科研，实验方法，分子对接饶燊强，P2X4 and 青藤碱” 1 用pymol打开E/dock/P2X4_sinomenine中的P2X4.pdb文件 Display sequence 找到ATP和其他天然配体分子（绿色的）
去水加氢后直接将4DW1.pdb命名为P2X4.pdb 保存为P2X4.pdb 2打开软件autodock tools ,打开受体文件处理过的文件P2X4.pdb 受体
计算吉布斯能：菜单栏Edit ——Charges ——Compute Gasteiger 转换文件格式：ADT4.2 菜单Grid——Macromolecule——Choose——P2X4 选择p2x4 后，弹出一个提醒框 点击确认，跳出一个文件保存框，把文件保存到工作文件夹（注意：在这里在命名后加上”.pdbqt”）就是P2X4.pdbqt 配体
分子克隆技术 DNA重组技术是在分子水平对基因进行体外操作，因而也称为分子克隆（Molecular Cloning）或基因克隆，是在体外对DNA分子按照既定的目的进行人工重组，并导入到合适的受体细胞中，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得DNA 分子大量复制，并使受体细胞获得新的遗传特征的过程。 其基本原理是：将编码某一多肽或蛋白质的基因（外源基因）经过特定限制性酶切割以及与目标载体连接，组装到细菌质粒（质粒是细菌染色体外的双链环状DNA分子）中，再将这种质粒（重组质粒）转入大肠杆菌体内，这样重组质粒就随大肠杆菌的增殖而复制，从而表达出外源基因编码的相应多肽或蛋白质，并且来源于一个菌株的质粒是一个分子克隆，而随质粒复制出的外源基因也就是一个分子克隆。 分子克隆技术的成就对于工业、农牧业和医学产生深远影响，并将为解决世界面临的能源、食品和环保三大危机开拓一条新的出路。 实验前准备 实验开始前，需准备好所需的试剂，如PCR扩增及酶切，连接所需酶类试剂及相应的buffer，均为TaKaRa产品分装，Buffer、dNTP、引物试剂等需要从-20℃取出至室温融化、涡旋震荡混匀离心后使用，酶类试剂从-20℃取出瞬时离心（小于4000 rpm）放置冰浴中备用。 还有各项实验所需的药品（如琼脂糖），以及配置好培养基，抽提质粒用的溶液一、二、三等试剂。 本次实验所涉及的常规仪器及耗材有：Thermo Scientific Arktik PCR仪，水平电泳槽，超净工作台，恒温水浴锅，紫外照胶仪，赛默飞公司提供的F1，F2和F3一系列量程的单道移液器等仪器，1.5ml离心管，玻璃试管，赛默飞公司提供的QSP盒装吸头及15ml离心管等。 接下来进入实验部分，本实验操作流程为：首先在GenBank中查询目的基因序列，然后根据得到的序列进行酶切位点分析及引物的设计，通过RT-PCR获取目的基因，酶切以及与载体连接，转化进入宿主菌中，针对得到的菌落进行菌落PCR快速筛选，得到初步的阳性克隆，最后通过质粒提取及鉴定，得到的阳