主要缩略词表
ＡＢＢＲＥＶｌＡＴｌｏＮＳ
ＵＶ（Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ）紫外线
中波紫外线
ＵＶＢｆＵｌｔｒａｖｉｏｌｅｔＢ１
ＵＶＡｆＵｌｔｒａｖｉｏｌｅｔＡ１长波紫外线
ＲＯＳ（Ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ）氧自由基
ＳＳＲ（Ｓｕｎ—ｓｉｍｕｌａｔｉｎｇｒａｄｉｍｉｏｎ）模拟目光光源
ＭＭＰ（Ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）基质金属蛋白酶
ＭＴＴ（３，４，５－ｄｉｍｅｔｈｙｔｈｉａｚｏｌ一２－ｙｌ一２，５?ｄｉｐｈｅｎｙｌ－ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ）
噻唑兰
ＮＢＳ烈ｅｏｎａｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ）小牛血清
ＰＩ（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｉｎｄｅｘ）增殖指数
ＳＯＤ（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅ）超氧化物歧化酶
ＭＤＡ（Ｍａｌｏｎｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ）丙二醛
ＥＣＭ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｍａｔｒｉｘｌ细胞外基质
ＭＡＰＫ（ＭＡＰｋｉｎａｓｅｌ丝裂原活化的蛋白激酶
ＭＥＤ（Ｍｉｎｉｍａｌｅｒｙｔｈｅｍａｌｄｏｓｅ）最小红斑量
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Ｉ．ｚ＾｛镕±＃＆＊ｉ
检测皮肤ＳＯＤ活性和ＭＤＡ含量，以Ｗｅｉｇｅｒｔ染色法展示弹力纤维表达的变化，
以Ｓｉｒｉｕｒｅｄ染色法结合偏光显微镜观察分析１，ＩＩＩ型胶原纤维表达的改变。豚鼠
在每次照射蕊４０ｒａｉｎ外Ｈｊ５ｍｇ／ｍｌ或０．５ｍｇ／ｍｌ的Ｔｅｍｐｏｌ，探讨Ｔｅｍｐｏｌ对上述指
标变化的保护作刖。
结果：
第一部分体外细胞试验结果显示，ＵＶＡｌ或ＵＶＢ照射可以抑制人真皮成纤维细胞的增殖，与来照射组相比，１５Ｊ／ｃｍ２ＵＶＡＩ和４０ｍＪ／ｃｍ２ＵＶＢ照射组即具有
显著性（Ｐ＜Ｏ．０５），随着照射剂量增加，细胞增殖率逐步下降，两者具有显著的
相关性（Ｐ＜０．０１）。１５Ｊ／ｃｍ２ＵＶＡｌ照射使更多的细胞滞留于Ｇ０／Ｇ１期，增殖指数
（Ｐ１）鼹著下降。１５Ｊ／ｃｍ２ＵＶＡｌ照射或４０ｍＪ／ｅｍ２ＵＶＢ照射可以显著抑制细胞内
ＳＯＤ活性，提高细胞培养上清液。＿｝ＪＭＤＡ含量，上调ＭＭＰ．】，ＭＭＰ一３的表达，
同时抑制１，ＩＩＩ型前胶原蛋白表达，与未照射组相比，具有显著意义（Ｐ＜ｏ．０５）。
细胞在接受ＵＶＡｌ或ＵＶＢ照射的同时，加入不同浓度的Ｔｅｍｐｏｌ（Ｏ．０３，０．５，
８ｍＭ），可以恢复细胞的增殖，使更多的细胞进入Ｓ期和Ｇ２／Ｍ期，提高Ｐ１值，
不同程度的保护ＳＯＤ活性，抑制ＭＤＡ堆积，抑制ＭＭＰ．１，ＭＭＰ．３的表达及
恢复】，１１ｌ型前胶原蛋白的表达．综合分析各项研究结果，其中Ｏ．５ｍＭＴｅｍｐｏｌ
的保护作用最强，与已知的抗氧化剂ＶｉｔＣ（０．Ｉ％）相比，有相当甚至更强的保
护作用。
第二部分整体动物试验结果显示，豚鼠在以松香蜂蜡混合液脱毛后接受亚红斑量ＳＳＲ照射，每周三次，连续照射１７周，光照部位真皮浅层出现了典型的
“光化性弹力纤维变性”的损害，成纤维细胞损伤甚至破碎，弹力纤维和Ｉ，珊
型胶原纤维断裂，排列紊乱，弹力纤维样物质异常增生，Ｉ，ＩＩｌ型胶原纤维含量
下降，同时伴有单核炎症细胞的浸润，皮肤组织内ＳＯＤ活性下降，ＭＤＡ异常堆
积。照射前外用ｏ．５ｍ２／ｍｌ及５ｍｇ／ｍｌ的Ｔｅｍｐｏｌ可以不同程度地减轻真皮浅层光
化性弹力纤维变性，抑制弹力纤维异常增生，成纤维细胞的损伤减轻，Ｉ，１ＩＪ型
胶原纤维破坏减少，排列趋于整齐，含量升高，同时炎症细胞浸润明显减少，与
ＳＳＲ照射组相比，皮肤组织中ＳＯＤ活性显著升高．ＭＤＡ含量显著下降，其中．
５ｍｇ／ｍｌＴｅｍｐｏｌ的保护作用更强，并且这种保护作用与溶解药物的基质无关。
结论：
１．ｕｖ照射可以破坏真皮结构，干扰真皮内的正常代谢。ｕｖ照射可破坏成纤维细胞结构，抑制其增殖；削弱皮肤的抗氧化防御功能，增强氧化性损伤：
抑制胶原纤维的合成代谢；上调ＭＭＰ一１，ＭＭＰ．３的表达，加速真皮细胞外
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，：Ｂ＾掌博±掌ｎ＊文英文擅姜ＩｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆＵｌｔｒａｖｉｏｌｅｔＩｒｒａｄｉａｔｉｏｎｏｎＳｋｉｎＤｅｒｍｉｓａｎｄＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅＥｆｆｅｃｔｓｏｆＴｅｍｐｏｌ，ｏｎｅｏｆＮｉｔｒｏｘｉｄｅｓ，ａｇａｉｎｓｔＵｌｔｒａｖｉｏｌｅｔＩｒｒａｄｉａｔｉｏｎ
Ａｂｓｔｒａｃｔ
Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ：
Ｐｈｏｔｏａｇｉｎｇｉｓｄｕｅｔｏｃｈｒｏｎｉｃｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔｒａｄｉａｔｉｏｎ（ｕｖ）ｗｈｉｃｈｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓｔＯａｐｒｅｍａｔｕｒｅａｇｅｉｎｇｐｈｅｎｏｔｙｐｅｏｆｓｋｉｎａｔｓｕｎ—ｅｘｐｏｓｅｄａｒｅａａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄｂｙｃｏａｒｓｅｌｙｗｒｉｎｋｌｅｄ，ｙｅｌｌｏｗｉｓｈｓｋｉｎｉｎｃｌｉｎｉｃａｌａｐｐｅａｒａｎｃｅａｎｄ‘＂ｓｏｌａｒｅｌａｓｔｏｓｉｓ’’ｃｈａｎｇｅ
ｏｆｄｅｒｍｉｓｉｎｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌａｐｐｅａｒａｎｃｅ．Ｉｔｉｓａｃｏｍｐｌｅｘ
ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｐｒｏｃｅｓｓｗｉｔｈｔｈｅｍａｊｏｒｄａｍａｇｅｓｅｅｎｉｎｔｈｅｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅｔｉｓｓｕｅｏｆｔｈｅｄｅｒｍｉｓａｎｄｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｆｒｏｍｉｎｔｒｉｎｓｉｃａｌａｇｅｉｎｇａｓｒｅｌａｔｅｄｔｏｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ
ｐｈｅｎｏｔｙｐｅａｎｄｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ＳＯｐｈｏｔｏａｇｉｎｇｃａｎｂｅｐｒｅｖｅｎｔｅｄ．Ｃｏｎｓｉｄｅｒｉｎｇｔｈｅｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｏｆ
ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓｉｎｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ
ｏｆｐｈｏｔｏａｇｉｎｇ，ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｗｉｔｈｅｘｏｇｅｎｉｃ
ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓｔｏｓｔｒｅｎｇｔｈｅｎｔｈｅａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓｙｓｔｅｍｏｆｔｈｅｓｋｉｎｉｓ
ａｌｗａｙｓｏｎｅｏｆｉｍｐｏｒｔａｎｔｓｔｒａｔｅｇｉｅｓｔｏｐｒｏｔｅｃｔａｇａｉｎｓｔｐｈｏｔｏａｇｉｎｇ．Ｓｉｎｃｅｎｉｔｒｏｘｉｄｅｈａｓｂｅｅｎｒｅｐｏｒｔｅｄｔｏｈａｖｅａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｎｄｓｏｍｅｐｈｏｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ｉｔｍａｙｂｅｈｏｐｅｆｕｌｔｏｉｍｐｏｒｔｔｈｉｓａｇｅｎｔｔｏｆｉｇｈｔａｇａｉｎｓｔｐｈｏｔｏａｇｉｎｇ．
ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：
１．ＴｏｓｔｕｄｙｔｈｅｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆＵＶｏｎｔｈｅｄｅｒｍａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ
ｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｄｅｒｍａｌ
ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ，ｔｈｅｏｘｉｄａｔｉｖｅｄａｍａｇｅ，ｔｈｅ
ｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｏｌｌａｇｅｎＩ，ｃｏｌｌａｇｅｎ１１１，ｅｌａｓｔｉｃｆｉｂｅｒａｎｄｔｈｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ（ＭＭＰ）一１，ＭＭＰ一３．
２．Ｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅ仃ｅｃｔｓｏｆＴｅｍｐｏｌ，ｏｎｅｏｆ
ｎｉｔｒｏｘｉｄｅｓ，ａｇａｉｎｓｔｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎａｎｄｔｏｃｏｎｆｉｒｍｉｔｓｐｒｏｐｅｒｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．
Ｍｅｔｈｏｄｓ：
Ｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｗａｓｄｉｖｉｄｅｄｎｔｏｉｎ—ｖｉｔｒｏｓｔｕｄｙａｎｄａｎｉｍａｌｓｔｕｄｙ．
Ｈｕｍａｎｄｅｒｍａｌｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓｗｅｒｅｕｓｅｄｉｎｔｈｅｉｎ—ｖｉｔｒｏｓｔｕｄｙ．Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓｗｅｒｅｉｒｒａｄｉａｔｅｄ
ｂｙａｓｉｎｇｌｅｅｘｐｏｓｕｒｅｔｏＵＶＡ１（３４０－４００ｎｍ）ｏｒＵＶＢ（２８０－３２０ｎｍ）ａｎｄａｔｔｈｅｓａｍｅ
ｔｉｍｅｉｎｃｕｂａｔｅｄｗｉｔｈ，ｏｒｗｉｔｈｏｕｔ．Ｔｅｍｐｏｌａｎｄｄｅｔｅｃｔｅｄｔｗｅｎｔｙ—ｆｏｕｒｈｏｕｒｓｌａｔｅｒ．Ｃｅｌｌ
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兰苎查兰兰±兰竺兰兰苎查兰兰ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｌｌｓ．ＳＯＤａｃｔｉｖｉｔｙｗａｓｉｎｈｉｂｉｔｅｄ，ｍｅａｎｗｈｉｌｅＭＤＡｌｅｖｅｌｉｎｔｈｅｓｋｉｎｉｎｃｒｅａｓｅｄ．Ｔｅｍｐｏｌａｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ５ｍｇ／ｍｌｏｒ０．５ｍｇ／ｍｌｗａｓｅｆｆｅｃｔｉｖｅｉｎｔｈｅｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎｏｆｐｈｏｔｏｄａｍａｇｅｔｏｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅｔｉｓｓｕｅｗｈｅｎａｐｐｌｉｅｄｔｏｐｉｃａｌｌｙｂｅｆｏｒｅｅａｃｈ
ｅｘｐｏｓｕｒｅ．Ｔｅｍｐｏｌａｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ５ｍｇ／ｍｌｈａｄｓｔｒｏｎｇｅｒｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｓ．ＶｅｈｉｃｌｅｈａｄｎＯｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｆｕｎｃｔｉｏｎ．
Ｃｏｎｅｌｕｓｉｏｎｓ：
Ｉ．ＵＶｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎｃｏｕｌｄｄａｍａｇｅｔｈｅｄｅｒｍａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｄｉｓｔｕｒｂｔｈｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｉｎｄｅｒｍｉｓ．Ｉｔｄａｍａｇｅｄｔｈｅｄｅｒｍａｌｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓａｎｄｉｎｈｉｂｉｔｅｄｔｈｅｉｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．Ｉｔａｌｓｏｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄｓｋｉｎａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｃａｐａｃｉｔｙ，ｉｎｈｉｂｉｔｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ，ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＭＭＰ—ＪａｎｄＭＭＰ－３ｗｈｉｃｈｗｅｒｅ
ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅｆｏｒｔｈｅｂｒｅａｋｄｏｗｎｏｆｖａｒｉｏｕｓｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｉｎｔｈｅｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｍａｔｒｉｘ．ＴｈｅｒｅｗａｓｅｌａｓｔｏｔｉｃｍａｔｅｒｉａｌｄｅｐｏｓｉｔｅｄｉｎｔｈｅＵＶ－ｅｘｐｏｓｅｄｄｅｎｎｉｓ．Ｗｈｅｎｔｈｅｓｅｄｅｇｒａｄａｔｉｖｅｐｒｏｃｅｓｓｅｓ
ｉｎｄｕｃｅｄｂｙＵＶｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎｏｖｅｒｗｈｅｌｍｅｄｔｈｅ
ｒｅｐａｉｒｉｎｇｐｒｏｃｅｓｓｅｓ，ｐｈｏｔｏａｇｉｎｇｗａｓｆｏｒｍｅｄ．
２?ＴｈｅｄｏｓｅｏｆＵＶＡｌｎｅｅｄｅｄｔｏａｃｈｉｅｖｅｔｈｅｓａｍｅｄａｍａｇｉｎｇｅｆｆｅｃｔｓＯｎｄｅｒｍａｌ
ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓｉｎｖｉｔｒｏｗａｓａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ４００ｔｉｍｅｓ
ｇｒｅａｔｅｒｔｈａｎｗｉｔｈＵＶＢ．
３．ＴｅｍｐｏｌｈａｄｐｈｏｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓａｇａｉｎｓｔＵＶｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎｉｎｖｉｔｒｏａｎｄｏｎｇｕｉｎｅａｐｉｇｐｈｏｔｏａｇｉｎｇｍｏｄｅｌ．Ｗｉｔｈａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｂｉｌｉｔｙ，Ｔｅｍｐｏｌｉｎｈｉｂｉｔｅｄ
ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｍａｔｒｉｘｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎａｎｄｐｒｅｓｅｒｖｅｄｃｏｌｌａｇｅｎ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎｄｅｒｍｉｓａｎｄｍａｙｂｅｕｓｅｄａｓａｌｌａｎｔｉ—ｐｈｏｔｏａｇｉｎｇａｇｅｎｔ．
４?ＵｓｉｎｇｔｈｅｐｈｙｓｉｃａｌｄｅｐｉｌａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄａｎｄｐｒｏｐｅｒＵＶｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎｒｅｇｉｍｅｎ，ａｌｂｉｎｏ
ｇｕｉｎｅａｐｉｇＣａｎｂｅ
ａｐｐｌｉｅｄａｓａｕｓｅｆｕｌａｎｉｍａｌｍｏｄｅｌｆｏｒｔｈｅｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓｔｕｄｙｏｆ
ｐｈｏｔｏａｇｉｎｇ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔｒａｄｉａｔｉｏｎ，ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ，ｐｈｏｔｏａｇｉｎｇ，ｄｅｒｍｉｓ
ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ，ｎｉｔｒｏｘｉｄｅ
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，：Ｅ．＾掌＊±掌。＆｛ｅ‘ｌ前７言
用｜６】。正常情况下，皮肤自身存在酶及非酶的抗氧化防御机制，但在大剂量或长
期ＵＶ作用下，ＲＯＳ的产，仁可以超过其被清除的速度，进而引起抗氧化酶（包
括超氧化物歧化酶（ＳＯＤ），过氧化氢酶（ＣＡＴ），谷胱甘肽过氧化物酶（ＧＳＨ—Ｐｘ））
含量下降，非酶自由基清除剂（包括ＶｉｔＣ，ＶｉｔＥ，符胱甘肽）耗竭＿ｌ，而损伤的
皮肤抗氧化防御体系会导致更多ＲＯＳ的产生，以正反馈形式加剧皮肤组织和细
胞的损伤，最终形成光老化的各种表现。
由于认识到ＲＯＳ在光老化发病中的重要作用，长期以来，人们一直探讨外用或补充摄入抗氧化剂来恢复并加强皮肤的抗氧化防御体系，从而防治ｕＶ引起
的各种损伤。传统的抗氧化剂ＶｉｔＥ，ＶｉｔＣ及Ｂ．胡萝ｂ素已有了较广泛的研究悼Ｊ。
研究发现，大部分的抗氧化剂在清除氧自由基的同时，自身可形成新的自由基衍
生物，因此，许多抗氧化剂在某些情况下又会表现出促氧化的作用，究竟哪种作
用占主导，受到ＰＨ，产生的自由基衍生物的活性以及是否能获得金属离子催化
等多种因素的影响。例如，硫醇的抗氧化作用依赖于反应体系的ＰＨ，Ｂ－胡萝ｈ
素的抗氧化作用依赖于氧浓度，而由于ＶｉｔＣ可以清除ＶｉｔＥ反应产生的脂类自由
基，ＶｉｔＥ需和ＶｉｔＣ混合使用才有较好的抗氧化效果１９’”Ｊ，等等。近年来，氨氧化
物受到了我们的关注。氮氧化物是一类拥对稳定的低分子量自由基化合物，在
Ｎ．Ｏ共价键中存在～个不成对电子。长期以来，氮氧化物在电磁共振（ＥＰＲ）中
作为生理探针被广泛应用，部分研究还将其作为参照物质应用于核磁共振
（ＭＲＩ），由于氮氧化物在细胞内可被还原成无磁性的羟氨（ＥＰＲ．ｓｉｌｅｎｔ）从而反
应局部组织的氧浓度，所以在提供解剖结构信息的同时，还能提供组织的代谢信
息。受氮氧化物在ＥＰＲ检测中具有上述特性的启发，Ｓａｍｕｎｉ首先在１９８８年发
现氮氧化物具有类ＳＯＤ活性…Ｊ，此后又证实氨氧化物可在细胞内迅速将Ｆｅ”氧
化成Ｆｅ”，从而阻止Ｈ２０２，０２一通过Ｆｅｎｔｏｎ’Ｓ反应在特定部位产生破坏作用更强
的ＯＨ’并能直接清除碳，氧，硫等为中心的多种自由基Ｉｌ２，”Ｊ，是一类新的抗
氧化剂。与以上传统的抗氧化剂４ｉ同，氮氧化物在清除不成对电子的同时，仅在
自身与相应的羟氨还原形态之间转换，从而终１Ｅ自由基的链式反应，Ｉ司时不会产
生新的自由基反应。最初的研究主要集中在应用氮氧化物减轻放疗的副反应，同
时提高放疗的耐受剂量，结果是令人振奋的１１４．１５］近期己在美国国家癌症研究所
的主持下完成了外用Ｔｅｍｐｏｌ防治全脑放疗引起秃发的１期临床试验【ｌ“。此后的
研究显示氮氧化物在保护细胞免受化疗药物的氧化性损伤，减少缺血后再灌注损
伤和抵抗炎症反应中的氧化性损伤方面都显示出了有价值的应用前景。近来发
现，在体外，两种氮氧化物Ｔｅｍｐｏｌ及Ｔｅｍｐｏ（４ｍＭ）可保护人皮肤角质形成
细胞免受Ｈ２０２的氧化性损伤，避免细胞内抗氯化酶活件减弱１１７Ｊ，Ｔｅｍｐｏ／
（１００ｍＭ）还可抑制ＵＶＢ及ＵＶＡ诱导的转摹因光老化鼠模型真皮成纤维细胞
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夏且大掌饽．士掌位论文第一节ＬＶ照射对细胞增殖的最｝响ａｌｅｍｐｏ】的保护作用
第一部分
ｕＶ照射对真皮成纤维细胞的影响及Ｔｅｍｐｏｌ保护作用的研究ｌｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎｏｎｈｕｍａｎｄｅｒｍａｌｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓａｎｄ
ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆＴｅｍｐｏｌｏｎｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔｅｘｐｏｓｅｄｄｅｒｍａｌｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ
成纤维细胞是真皮中的主要细胞，ｕｖ照射可以引起成纤维细胞结构和功能的改变，从而影响真皮的结构和功能，导致光老化的产生。由于细胞培养技术
具有研究条件易于控制、结果便，‘观察且经济易行等优点，并且培养的正常体细
胞可保持体内原细胞一定的性状、结构和功能，因此本部分研究将采用从正常的
皮肤组织中分离获得的真皮成纤维细胞，建立有限细胞系，以它为研究对象，分
别观察长波紫外线（ＵＶＡｌ，３４０—４００ｎｍ）及中波紫外线（ＵＶＢ，２８０．３２０ｎｍ）照
刳对细胞增殖率，抗氧化酶，脂质过氧化程度的影响以及对成纤维细胞表达
ＭＭＰ一１，ＭＭＰ．３，Ｊ，ＪｌＩ型前胶原蛋Ｆ１的作用，同时选用一种市售的水溶性氮氧
化物Ｔｅｍｐｏｌ（４．羟基．Ｔｅｍｐｏ，分予式：Ｃ９Ｈ１８Ｎ０２），研究不同浓度Ｔｅｍｐｏｌ在体
外，对ＵＶＡＩ或ＵＶＢ照射引起的人真皮成纤维细胞各种损伤的保护作用，并摸
索出合适的作用浓度。
第一节ｕＶ照射对成纤维细胞增殖的影响及Ｔｅｍｐｏｌ的保护作用
材料与方法
１．试剂
Ｔｅｍｐｏｌ（美国Ａｌｄｒｉｃｈ公司，分子结构式见图１．１．１）；ＤＭＥＭ培养基（美国ＧｉｂｃｏＢＲＬ公司）；胰酶（美国Ａｍｅｒｅｓｃｏ公司）；小牛血清（杭州四季青公司）；
胰岛素（上海生物化学制药厂）；青霉素（苏州第＿制药厂）；链霉素（上海四药
股份有限公司）
鼠抗广谱角蛋Ｆ１（ｐａｎｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ）抗体和抗波形蛋白单克隆抗体（美国Ｓｉｇｍａ公司武汉博士德公司分装）；ＳＡＢＣ试剂盒（武汉博士德公司）：噻唑兰
（３，４，５一ｄｉｍｅｔｈｙｔｈｉａｚｏｌ一２一ｙｌ一２，５一ｄｉｐｈｅｎｙｌ－ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ．ＭＴＴ．美国Ｆｌｕｋａ公
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第一，ＵＶｍ＃目自ｍ《’ｎ∞＊自＆［ｅｍｐｏｌ∞＊ｐ”月
于３７。Ｃ培养箱内３ｈ以利ｒ组织块的贴附。然后小一Ｏ，ｈＨ入含１０％ＮＢＳ的ＤＭＥＭ
培养液，并将培养瓶小心翻转，置于培养箱内。２天后换液，以后每２－３天换液
一次。观察细胞的牛长情况，当细胞牛长融合率达９０％时，进行细胞的传代。
３．２成纤维细胞的传代
当细胞生长至融合率达９０％以上时，去除培养基，用滴管轻轻将贴壁的组织块挑除，细胞用Ｄ．ＰＢＳ漂洗３次，用０．２５％的胰酶消化，当细胞皱缩变圆时，
倾去胰酶，加入含１０％ＮＢＳ的ＤＭＥＭ轻轻吹打，收集细胞并离心，计数细胞，
用ＤＭＥＭ将细胞浓度调整为１×１００接种于７５ｃｍ２培养瓶中。待生长至融合率达
９０％以上时，进行下一次传代。取３－８代细胞进行实验。
３．３成纤维细胞免疫组化鉴定
皮肤成纤维细胞以１×１０５个细胞／平皿密度接种于３５ｍｍ培养皿中，待生长达８０％融合时，吸弃，卜清液，ＰＢＳ洗涤细胞三次，９５％乙醇固定细胞２０ｍｉｎ，ＰＢＳ
洗涤两次（５ｍｉｎ／次），正常血清（１：５０）封闭３０ｍｉｎ。培养皿中分别加入用ＰＢＳ
稀释的抗广谱角蛋白单克隆抗体（１：２００）或抗波形蛋白单克隆抗体（１：２００），４℃
Ｆ作用过夜。次ＩＡＰＢＳ洗涤两次（５ｍｉｎ／次）．然后加入生物素化山羊抗鼠
ｌｇＧ（】：ｌｏｏ），窜温下３０ｍｉｎ，ＰＢＳ洗涤两次（５ｍｉｎ／次），室温加入ＳＡＢＣ（１：１００）
３０ｍｉｎ，ＤＡＢ显色，以ｄｄＨ２０洗涤终ＪＰ反应，并用苏木素对细胞核进行染色，
光镜下观察细胞质，有相应抗原的应为黄色。
３．４ＵＶ光源
ＵＶＡｌ光源：ＵＶＡ】紫外线辐射仪由四根并排的ＴＬＫ４０ｗ／ＩＯＲ灯管（Ｐｈｉｌｉｐｓ公司）组成，波长范围３４０．４００ｎｍ，波谱曲线如图１．１．２所示。细胞照射时摘掉
原培养皿盖，并覆盖上经过消毒的无菌的石英玻璃以防污染，照射时距离灯管
１５ｃｍ，由ＰＭＡ２１１０探测头连接ＰＭＡ２１００辐照计测定此处透过石英玻片的辐照
强度为１０ｍＷ／ｃｍ。。
ＵＶＢ光源：ＵＶＢ紫外线辐射仪由八根交叉排列的‘ＰＬ．Ｓ’９ｗ／１２Ｈ型灯管（Ｐｈｉｌｉｐｓ公司）组成，光源能量主要集中存２８０．３２０ｎｍ，波谱曲线如图１．１．３所
示。细胞照射时摘掉原培养皿盖，并覆盖上经过消毒的无菌的石英玻璃以防污染，
照射时距离灯管１５ｃｍ，由ＰＭＡ２１０６探测头连接ＰＭＡ２１００辐照计测定此处透过
石英玻片的辐照强度为１．１ｍＷ／ｃｍ。。
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，．１＾＃镕±＃＆镕ｉ￥一々ＵＶ月＊对自＿№ｍＨ的ｔ；响ａＴｅｍｐｏ】白々女ｐ”月
４．统计分析
实验结果以均数±标准著表示，所有数据处理应用统计软件ＳＰＳＳ】Ｉ．０进行单因素方差分析（ＡＮＯＶＡ），多重比较采用ＬＳＤ法，显著性榆验水平为Ｏ．０５。
结果
１．皮肤成纤维细胞鉴定
原代培养的皮肤成纤维细胞自第二周起从皮片边缘或从角质形成细胞的边缘爬出，相差显微镜卜观察细胞呈梭形，贴壁生长（图１．１．４）。传代后的细胞，在
１０代以内，生长良好，无明显形态学改变（图１．１．５）。随着传代数口增多，细胞
逐渐变大，轮廓增强，胞质中出现空泡和颗粒状物并逐步增多，同时出现核分裂
现象，凶此我们选择３－８代的细胞进行试验。应用抗成纤维细胞表面抗波形蛋白
抗体免疫组化染色鉴定，成纤维细胞胞浆染色呈棕褐色（图１．１．６），而抗角蛋白
单克隆抗体染色为阴性（图１．１．７），证明所培养的细胞是成纤维细胞，而非上皮
细胞。
２．ｕｖ照射对成纤维细胞增殖的影响及Ｔｅｍｐｏｌ的保护作用
２．１ＵＶＡＩ照射对成纤维细胞增殖率的影响及Ｔｅｍｐｏｌ的保护作用
ＭＴＴ法测定结果显示，随着ＵＶＡＩ照射剂量的升高（５，１０，１５，２０Ｊ／ｃｍ２），２４ｈ后细胞的增殖率逐步下降，１５Ｊ／ｃｍ２ＵＶＡｌ照射使细胞增殖率降至非照射组的
（８９．９±２．３）％，与非照射组相比有显著意义（尸＜Ｏ．０５），照射剂量增至２０Ｊ／ｃｍ２时，
细胞增殖率进＋步下降至非照射组的（７４．３＋９．３）％（尸＜Ｏ．０１）（图１．１．８）。ＵＶＡＩ
照射剂量的增高与增殖抑制程度之间具有明显的相关性（Ｐｅａｒｓｏｎ相关系数：
Ｏ．８３４，Ｐ＜０．０１）。当细胞接受２０Ｊ／ｃｍ２ＵＶＡＩ照射同时加入不同浓度的Ｔｅｍｐｏｌ（Ｏ．０３，
０．１２５，０．５，２，８ｍＭ），２４ｈ后的测定结果显示Ｔｅｍｐｏｌ可以减少ＵＶＡ】对细胞增
殖的抑制作用，且保护作用随药物浓度升高而增强，８ｍＭＴｅｍｐｏｌ可使细胞增殖
率恢复至（９０．５＋６．２１％，与不加Ｔｅｍｐｏｌ的照射组相比，有显著意义（Ｐ＜Ｏ．０１）（图
】１．９）。
２．２ＵＶＢ照射对成纤维细胞增殖率的影响及Ｔｅｍｐｏｌ的保护作用
ＭＴＴ法测定结果显示，随着ＵＶＢ照射剂量的升高（２０，４０，６０，８０ｍＪ／ｃｍ２），２４ｈ后细胞的增殖率逐步下降，４０ｍＪ／ｃｍ２ＵＶＢ照射使细胞增殖率降至非照射组
的（８０．５＋１．ｏ）％，与非照射组相比有显著意义（Ｊｐ＜Ｏ．０１），照射剂量增军８０ｍＪ／ｃｍ２
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，：旦＾掌博士掌位论文）宵一’节ＩＶ照射对细胞增埴的影响ＡＴｅｍｐｏ］的保护ｒ｝用
Ｔｅｍｐｏｌ（０．５，２，８ｍＭ），结果显示Ｔｅｍｐｏｌ可以抑制ＵＶＡＩ的上述作用，使更多的细胞进入Ｓ期和Ｇ２／Ｍ期，恢复ＰＩ值，且这种保护作用随药物浓度升高而增强，８ｒａＭＴｅｍｐｏｌ可使细胞Ｐ】值恢复至（５５．７９－１１．８７）％，与不加Ｔｅｍｐｏｌ的照射组相比，有显著意义（尸．＜０．０１）（表１．１．１）。
５Ｊ／ｃｍ２ＵｙＡｌ躁魁塑纲！哩凰塑舱垦獭爨五凰鎏廪Ｔｅｍｐ９１堕堡螋塑……一…～、
墨搜她亘坌警（墅）（銎ｓ）
ＧＯ／Ｇ１Ｓ
末照射组
４４．２５＋０．７６５０．７７＋３．９０１５Ｊ／ｃｍ２ＵＶＡｌ照射组５５．８９＋５．６７“４２．７５＋４．７９。ＵＶＡｌ＋ｍ５ｍＭＴｅｍｐｏｌ４７８９＋５．０２＊５１．６８＋５３９¨ＵＶＡＩ＋２ｍＭＴｅｍｐｏｌ４５３３＋２．６６８＋５１．８２＋１．８８＋｝ＵＶＡｌ＋８ｍＭＴｅｍｐｏｌ４４２１＋１．８７＋＋５２０６＋０４４＋｝
ＵＶＡｌ＋０１％ＶｉｔＣ
４８．３５＋０．６４＊４９．４７＋０．４６＊
Ｇ２／Ｍ４．９８＋３＿３３１３６＋０８８“０４２＋０３７２．８６＋２．２８３．７３＋１８４２．】８＋Ｊ．０４
注：与未照射组相比：＃Ｐ＜０．０５，＃＃Ｐ＜Ｏ０ｌ；￡ｊＵＶＡｌ照射组相比：＋Ｐ＜０．０５
讨论
ＰＪ（％）
５５７５＋０．７６
４４１１＋５６７““
５２．１０＋５．０２＋
５４．６７＋２６７＋＋
５５７９＋ｌ８７＊＋，，鄹竺熹！?！！：＋＋．Ｐ＜０．０ｌ，ｎ＝３。
日光中的紫外线主要分为三个波段，其中ＵＶＣ（２００．２８０ｎｍ）被大气层阻隔而无法到达地球表面，因此到达地球表面对人体皮肤产生作用的主要是ＵＶＢ
（２８０．３２０ｎｍ，占到达地表ｕｖ总量的５％）和ＵＶＡ（３２０．４００ｎｍ，占到达地表
ＵＶ总量的９５％），而ＵＶＡ又可进一步分为ＵＶＡ２（３２０．３４０ｎｍ）和
ＵＶＡｌ（３４０－４００ｎｍ），认为ＵＶＡ２的生物学作用与ＵＶＢ类似。由于ＵＶＡ和ＵＶＢ
具有不同的物理学特性，因此在不同地点，不同季节，时间和天气状况下，日光
中ＵＶＡ和ＵＶＢ的含量都是不同的，而对于隔着普通玻璃的室内，虽然ＵＶＢ无
法到达，但ＵＶＡ还是存在的。以往，由于在产生生物学效应方面，ＵＶＢ致红斑
的作用要比ＵＶＡ强１０００倍，因此人们一直较关注ＵＶＢ的各种损伤作用，近来
开始逐步认识到ＵＶＡ，尤其是ＵＶＡｌ对皮肤的损伤作用，Ｉ如于ＵＶＡＪ可以到达
真皮更深的部位，因此在光老化的发生中具有非常重要的作用。考虑到ＵＶＡｌ
和ＵＶＢ不同的作用特点及在光老化发病中的重要作用，奉研究选择了可提供
ＵＶＢ和ＵＶＡＩ的两种光源，分别研究这两种ｕＶ对真皮成纤维细胞增殖圾各种
功能的影响，以期较系统全面的了解日光中的ＵＶＢ和ＵＶＡｌ引起光老化的机制，
为进一步的合理防护提供试验依据。虽然‘ＰＬ—Ｓ’９ｗ／１２灯管的波谱曲线覆盖了
２８０—４００ｎｍ的范闱，但其能量主要集巾在２８０—３２０ｎｍ（图１．１．３），而且在试验过
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第一节ＵＶ脚ｕ时对细胞增殖的熏；响及Ｔｅｍｐｏ］的保护作用
毒理学研究认为．任何化学物到达一定浓度时均可日ｌ起器官、组织或细胞的损伤，因此，在进行Ｔｅｍｐｏｌ抗ＵＶ损伤的各项研究之前，确定Ｔｅｍｐｏｌ安全的，
对细胞无损伤的作用浓度是十分必要的，故本节研究也为后续的试验奠定了基
础。在预实验中，己存较大的范围内筛选Ｔｅｍｐｏｌ合适的作用浓度，通过反复的
ＭＴＴ试验测定结合相差显微镜下对细胞形态的观察，结果显示Ｔｅｍｐｏｌ在
０．０３．８ｍＭ的浓度范围，对体外培养的人真皮成纤维细胞无毒性作用，同时能够
减弱２０Ｊ／ｃｍ２ＵＶＡｌ或４０ｍＪ／ｃｍ２ＵＶＢ照射对真皮成纤维细胞增雅的抑制作用，因
此在以后的实验中，我们选择了该浓度范围中的乏个浓度（Ｏ．０３，０．５，８ｍＭ）
进行研究。
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