非无菌产品微生物限度检查法标准操作规程
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部门/职务：Department/Post 签字/日期：Signature/Date
起草人：Prepared by 质量部/QC
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审核人：Reviewed by 质量部/QC主管
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批准人：Approved by 质量部/质量负责人
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颁发部门Issued by 质量部
执行日期
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替换文件
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《微生物限度检查法标准操作规程》（SOP-检验通则-047-02）
分发给
Distributed to
质量部
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1.目的
规范微生物限度检查所用的培养基、检查方法、操作步骤、结果分析，以便对检品作出正确的微生物学评价。
2.范围
本公司检品的微生物限度检查。
3.职责
QC主管和QC检验员对本标准负责。
4.参考或引用文件
《中华人民共和国药典》(2015年版)
《药品生产质量管理规范》2010年版
5.内容
5.1简述：微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。
5.2药品微生物限度检查法总则：
5.2.1抽样：
5.2.1.1供试品一般按批号随机抽样。
5.2.1.2抽样量一般为检验用量（2个以上最小包装单位）的3倍量。
5.2.2供试品保存：
5.2.2.1供试品在检验之前，应保存在阴凉干燥处，以防供试品中的污染菌因保藏条件不当而引起致死、损伤或繁殖。
5.2.2.2供试品在检验之前，应该保持原有包装状态，严禁开启，包装已开启的样品不得作为供试品。
5.2.3 培养基及其制备方法：
5.2.3.1 胰酪大豆胨液体培养基、胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖液体培养基、沙
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氏葡萄糖琼脂培养基等照各自说明书上配制方法制备。
5.2.4 供试品的检验量：
5.2.4.1 一般供试品检验量为10g或10ml；贵重的或微量包装的供试品检验量可酌减。要求检查沙门氏菌的供试品，其检验量为20g。
5.2.4.2 供试品须取自2个以上的包装单位。
5.2.5 计数培养基适用性检査和供试品计数方法适用性试验
5.2.5.1 供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。
5.2.5.2 供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的微生物计数。
5.2.5.3 若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，计数方法应重新进行适用性试验。
5.2.5.4 菌种：
5.2.5.4.1 试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。规定程序培养各试验菌株。
5.2.5.5 菌液制备：
5.2.5.5.1 取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液；取黑曲霉的新鲜培养物加入3~5ml含0.05% (m l/m l)聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的pH7.0无菌氣化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液。
5.2.5.5.2 菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2~8℃，可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2~8℃，在验证过的贮存期内使用。
5.2.5.6 阴性对照：为确认试验条件是否符合要求，应进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长。如阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。
5.2.5.7 培养基适用性检査：
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5.2.5.7.1 微生物计数用的成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基适用性检查。
5.2.5.7.2 接种不大于100cfu的菌液至胰酪大豆胨液体培养基管或胰酪大豆胨琼脂培养基平板或沙氏葡萄糖琼脂培养基平板，置规定条件下培养。每一试验菌株平行制备2管或2个平皿。同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。
5.2.5.7.3 被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.5?2范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致；被检液体培养基管与对照培养基管比较，试验菌应生长良好。
5.2.5.8 计数方法适用性试验
5.2.5.8.1 供试液制备：
5.2.5.8.1.1 根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不应超过45℃。供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。
5.2.5.8.1.2 常用的供试液制备方法如下。如果下列供试液制备方法经确认均不适用，应建立其他适宜的方法。
5.2.5.8.1.3 水溶性供试品：
5.2.5.8.1.3.1 取供试品，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或pH7.2磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1:10供试液。若需要，调节供试液pH值至6~8。必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。
5.2.5.8.1.4 水不溶性非油脂类供试品：
5.2.5.8.1.4.1 取供试品，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或pH7.2磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基制备成1:10供试液。分散力较差的供试品，可在稀释液中加入表面活性剂如0.1%的聚山梨酯80，使供试品分散均匀。若需要，调节供试液pH值至6~8。必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。
5.2.5.8.1.5 肠溶制剂供试品：取供试品，加入pH
6.8无菌磷酸盐缓冲液（用于肠溶制剂），置45℃水浴中，振摇，使溶解，制成1:10的供试液。必要时，用同一稀释液将供试液进一
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步10倍系列稀释。
5.2.5.8.2 接种和稀释
5.2.5.8.2.1 按下列要求进行供试液的接种和稀释，制备微生物回收试验用供试液。所加菌液的体积应不超过供试液体积的1%。为确认供试品中的微生物能被充分检出，首先应选择最低稀释级的供试液进行计数方法适用性试验。
5.2.5.8.2.2 试验组：取上述制备好的供试液，加入试验菌液，混匀，使每1ml供试液或每张滤膜所滤过的供试液中含菌量不大于100cfu。
5.2.5.8.2.3 供试品对照组：取制备好的供试液，以稀释液代替菌液同试验组操作。
5.2.5.8.2.4 菌液对照组：取不含中和剂及灭活剂的相应稀释液替代供试液，按试验组操作加入试验菌液并进行微生物回收试验。若因供试品抗菌活性或溶解性较差的原因导致无法选择最低稀释级的供试液进行方法适用性试验时，应采用适宜的方法对供试液进行进一步的处理。如果供试品对微生物生长的抑制作用无法以其他方法消除，供试液可经过中和、稀释或薄膜过滤处理后再加入试验菌悬液进行方法适用性试验。
5.2.5.8.3 抗菌活性的去除或灭活
5.2.5.8.3.1 供试液接种后，按下列“微生物回收”规定的方法进行微生物计数。若试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值小于菌液对照组菌落数值的50% ,可采用下述方法消除供试品的抑菌活性。
5.2.5.8.3.1.1 增加稀释液或培养基体积。
5.2.5.8.3.1.2 加入适宜的中和剂或灭活剂。中和剂或灭活剂可用于消除干扰物的抑菌活性，最好在稀释液或培养基灭菌前加入。若使用中和剂或灭活剂，试验中应设中和剂或灭活剂对照组，即取相应量稀释液替代供试品同试验组操作，以确认其有效性和对微生物无毒性。中和剂或灭活剂对照组的菌落数与菌液对照组的菌落数的比值应在0.5~2范围内。
5.2.5.8.3.1.3 采用薄膜过滤法
5.2.5.8.3.1.4 上述几种方法的联合使用。若没有适宜消除供试品抑菌活性的方法，对特定试验菌回收的失败，表明供试品对该试验菌具有较强抗菌活性，同时也表明供试品不易被该类微生物污染。但是，供试品也可能仅对特定试验菌株具有抑制作用，而对其他菌株没有抑制作用。因此，根据供试品须符合的微生物限度标准和菌数报告规则，在不影响检
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验结果判断的前提下，应采用能使微生物生长的更高稀释级的供试液进行计数方法适用性试验。若方法适用性试验符合要求，应以该稀释级供试液作为最低稀释级的供试液进行供试品检査。
5.2.5.8.4 供试品中微生物的回收
5.2.5.8.4.1 计数方法适用性试验用的各试验菌应逐一进行微生物回收试验。微生物的回收可采用平皿法、薄膜过滤法。
5.2.5.8.4.2 平皿法：平皿法包括倾注法和涂布法。每株试验菌每种培养基至少制备2个平皿，以算术均值作为计数结果。
5.2.5.8.4.3 倾注法：取照上述“供试液的制备”“接种和稀释”和“抗菌活性的去除或灭活”制备的供试液1ml，置直径90mm的无菌平皿中，注人15~20ml温度不超过45℃熔化的胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。若使用直径较大的平皿，培养基的用量应相应增加。按表1规定条件培养、计数。同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。计算各试验组的平均菌落数。
5.2.5.8.4.4 涂布法：取15~20ml温度不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基，注入直径90mm的无菌平皿，凝固，制成平板，采用适宜的方法使培养基表面干燥。若使用直径较大的平皿，培养基用量也应相应增加。每一平板表面接种上述照“供试液的制备”“接种和稀释”和“抗菌活性的去除或灭活”制备的供试液不少于0.1ml。按规定条件培养、计数。同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。计算各试验组的平均菌落数。
5.2.5.8.4.5 薄膜过滤法：薄膜过滤法所采用的滤膜孔径应不大于0.45μm，直径一般为50mm，若采用其他直径的滤膜，冲洗量应进行相应的调整。供试品及其溶剂应不影响滤膜材质对微生物的截留。滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量一般为100ml。总冲洗量不得超过1000ml，以避免滤膜上的微生物受损伤。取照上述“供试液的制备”“接种和稀释”和“抗菌活性的去除或灭活”制备的供试液适量（一般取相当于1g、1ml或10cm2的供试品，若供试品中所含的菌数较多时，供试液可酌情
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减量），加至适量的稀释液中，混匀，过滤。用适量的冲洗液冲洗滤膜。
5.2.5.8.4.6 若测定需氧菌总数，转移滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上；若测定霉菌和酵母总数，转移滤膜菌面朝上贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上。按规定条件培养、计数。每株试验菌每种培养基至少制备一张滤膜。同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。
5.2.6 供试品检查
5.2.
6.1 操作步骤：
5.2.
6.1.1 开启无菌室紫外线杀菌灯和空气过滤装置并使其工作30min。
5.2.
6.1.2 操作人员用肥皂洗手，关闭紫外线杀菌灯，进入缓冲间，换工作鞋，再用0.1%新洁尔灭或用75%乙醇棉球擦手，待干后，穿戴无菌衣、帽、口罩。
5.2.
6.1.3 操作前先用75%乙醇棉球擦手，并擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口周围，待干后将供试品瓶、盒、袋启封
5.2.
6.2 供试液制备：按各类制剂制备供试液的方法制备。
5.2.
6.2.1 平皿法：
5.2.
6.2.1.1 平皿法包括倾注法和涂布法。除另有规定外，取规定量供试品，按方法适用性试验确认的方法进行供试液制备和菌数测定，每稀释级每种培养基至少制备2个平板。
5.2.
6.2.1.2 培养和计数：除另有规定外，胰酪大豆胨琼脂培养基平板在30~35℃培养3~5天，沙氏葡萄糖琼脂培养基平板在20~25℃培养5~7天，观察菌落生长情况，点计平板上生长的所有菌落数，计数并报告。菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。若同稀释级两个平板的菌落数平均值不小于15，则两个平板的菌落数不能相差1 倍或以上。
5.2.
6.2.1.3 菌数报告规则：需氧菌总数测定宜选取平均菌落数小于300cfu的稀释级、霉菌和酵母菌总数测定宜选取平均菌落数小于100cfu的稀释级，作为菌数报告的依据。取最髙的平均菌落数，计算1g、1ml或10cm2供试品中所含的微生物数，取两位有效数字报告。如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1 时，以＜1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。
5.2.
6.2.2 薄膜过滤法：除另有规定外，按计数方法适用性试验确认的方法进行供试液
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制备。取相当于l g 、lml或10cm2供试品的供试液，若供试品所含的菌数较多时，可取适宜稀释级的供试液，照方法适用性试验确认的方法加至适量稀释液中，立即过滤，冲洗，冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基上培养。
5.2.
6.2.2.1 培养和计数：培养条件和计数方法同平皿法，每张滤膜上的菌落数应不超过100cfu
5.2.
6.2.2.2 菌数报告规则：以相当于1g、1ml或10cm2供试品的菌落数报告菌数；若滤膜上无菌落生长，以＜1报告菌数（每张滤膜过滤1g、1ml或10cm2供试品），或＜1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。
5.2.7 结果判断：
5.2.7.1 需氧菌总数是指胰酪大豆胨琼脂培养基上生长的总菌落数(包括真菌菌落数);
霉菌和酵母菌总数是指沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的总菌落数(包括细菌菌落数）。若因沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的细菌使霉菌和酵母菌的计数结果不符合微生物限度要求，可使用含抗生素（如氯霉素、庆大霉素）的沙氏葡萄糖琼脂培养基或其他选择性培养基（如玫瑰红钠琼脂培养基)进行霉菌和酵母菌总数测定。使用选择性培养基时，应进行培养基适用性检查。
各品种项下规定的微生物限度标准解释如下：
101cfu：可接受的最大菌数为20；
102cfu：可接受的最大菌数为200；
103cfu：可接受的最大菌数为2000，依此类推。
5.2.7.2 若供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的检査结果均符合该品种项下的规定，判供试品符合规定；若其中任何一项不符合该品种项下的规定，判供试品不符合规定。
5.2.8 控制菌检查：
5.2.8.1 控制菌检查法系用于在规定的试验条件下，检査供试品中是否存在特定的微生物。
当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合相应的微生物限度标准时，应按下列规定进行检验，包括样品取样量和结果判断等.
5.2.8.2 供试品检出控制菌或其他致病菌时，按一次检出结果为准，不再复试。
5.2.8.3 供试液制备及实验环境要求同“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法《中
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国药典》2015年版四部(通则1105)”。
5.2.8.4 如果供试品具有抗菌活性，应尽可能去除或中和。供试品检查时，若使用了中和剂或灭活剂，应确认有效性及对微生物无毒性。
5.2.8.5 供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。
5.2.8.6 供试品控制菌检查中所使用的培养基应进行适用性检査。
5.2.8.7 供试品的控制菌检查方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的控制菌检查。
5.2.8.8 若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，控制菌检查方法应重新进行适用性试验。
5.2.8.9 菌种及菌液制备：
5.2.8.9.1 菌种试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。
金黄色葡萄球菌【CMCC（B）26003】
铜绿假单胞菌【CMCC（B）10104】
大肠埃希菌【CMCC（B）44102】
乙型副伤寒沙门菌【CMCC（B）50094】
白色念珠菌【CMCC（F）98001】
生孢梭菌【CMCC（B）64941】
5.2.8.9.2 菌液制备：将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、沙门菌分别接种于胰酪大豆胨液体培养基中或在胰酪大豆胨琼脂培养基上，30~35℃培养18~24小时；将白色念珠菌接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基上或沙氏葡萄糖液体培养基中，20~25℃培养2~3天。上述培养物用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液。菌液制备若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2~8℃，可在24小时内使用。
5.2.8.9.3 阴性对照：为确认试验条件是否符合要求，应进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长。如阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。
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5.2.8.10 培养基适用性检查：
5.2.8.10.1 控制菌检査用培养基的适用性检查项目包括促生长能力、抑制能力及指示特性的检查。
5.2.8.10.2 液体培养基促生长能力检査：分别接种不大于100cfu的试验菌于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及不大于规定的最短培养时间下培养，与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌应生长良好。
5.2.8.10.3 固体培养基促生长能力检査：用涂布法分别接种不大于100cfu的试验菌于被检培养基和对照培养基平板上，在相应控制菌检査规定的培养温度及不大于规定的最短培养时间下培养，被检培养基与对照培养基上生长的菌落大小、形态特征应一致。
5.2.8.10.4 培养基抑制能力检査：接种不少于100cfu的试验菌于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检査规定的培养温度及不小于规定的最长培养时间下培养，试验菌应不得生长。
5.2.8.10.5 培养基指示特性检査：用涂布法分别接种不大于100cfu的试验菌于被检培养基和对照培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度及不大于规定的最短培养时间下培养，被检培养基上试验菌生长的菌落大小、形态特征、指示剂反应情况等应与对照培养基一致。
5.2.8.11 控制菌检验方法适用性试验：
5.2.8.11.1 供试液制备：按下列“供试品检査”中的规定制备供试液。
5.2.8.11.2 试验菌：根据各品种项下微生物限度标准中规定检查的控制菌选择相应试验菌株，确认耐胆盐革兰阴性菌检查方法时，采用大肠埃希菌和铜绿假单胞菌为试验菌。
5.2.8.11.3 适用性试验：按控制菌检査法取规定量供试液及不大于100cfu的试验菌接人规定的培养基中；采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，在最后一次冲洗液中加入试验菌，过滤后，注人规定的培养基或取出滤膜接入规定的培养基中。依相应的控制菌检査方法，在规定的温度和最短时间下培养，应能检出所加试验菌相应的反应特征。
5.2.8.11.4 结果判断：上述试验若检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查方法进行供试品检查；若未检出试验菌，应消除供试品的抑菌活性[见非无菌产品微生物检査：微生物计数法《中国药典》2015年版四部(通则1105)中的“抗菌活性的去除或灭活”] ，并重
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新进行方法适用性试验。如果经过试验确证供试品对试验菌的抗菌作用无法消除，可认为受抑制的微生物不易存在于该供试品中，选择抑菌成分消除相对彻底的方法进行供试品的检查。
5.2.8.12 供试品检査:
5.2.8.12.1 供试品的控制菌检查应按经方法适用性试验确认的方法进行。
5.2.8.12.2 阳性对照试验：阳性对照试验方法同供试品的控制菌检查，对照菌的加量应不大于100cfu。阳性对照试验应检出相应的控制菌。
5.2.8.12.3 阴性对照试验：以稀释剂代替供试液照相应控制菌检查法检查，阴性对照试验应无菌生长。如果阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。
5.2.8.12.4 耐胆盐革兰阴性苗(Bile-Tolerant Gram-Negative Bacteria)：
5.2.8.12.4.1 供试液制备和预培养：取供试品，用胰酪大豆胨液体培养基作为稀释剂照“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法《中国药典》2015年版四部(通则1105)”制成1:10供试液，混勻，在20~25C培养，培养时间应使供试品中的细菌充分恢复但不增殖(约2小时)。
5.2.8.12.4.2 定性试验：除另有规定外，取相当于1g 或1ml供试品的上述预培养物接种至适宜体积(经方法适用性试验确定）肠道菌增菌液体培养基中，30~35℃培养24~48小时后，划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上，30~35℃培养18~24小时。如果平板上无菌落生长，判供试品未检出耐胆盐革兰阴性菌。
5.2.8.12.4.3 定量试验：选择和分离培养取相当于0.1g 、0.01g和0.001g(或0.1ml、0.01ml 和0.001ml) 供试品的预培养物或其稀释液分别接种至适宜体积(经方法适用性试验确定）肠道菌增菌液体培养基中，30~3 5℃培养24~48小时。上述每一培养物分别划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上，30~35℃培养18~24小时。
5.2.8.12.4.4 结果判断：若紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上有菌落生长，则对应培养管为阳性，否则为阴性。根据各培养管检查结果，从表1查1g或1ml供试品中含有耐胆盐革兰阴性菌的可能菌数。
表1耐胆盐革兰阴性菌的可能菌数（N）
各供试品量的检查结果每1g（或1ml）供试品
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0.1g或0.1ml 0.01g或0.01ml 0.001g或0.001ml 中可能的菌数cfu
+ + + N＞103
+ + - 102＜N＞103
+ - - 10＜N＞102
- - - N＜10
注：（1）+代表紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上有菌落生长；一代表紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上无菌落生长。
(2 )若供试品量减少10倍（如0.01g或0.01ml，0.001g或0.001ml，0.0001g或0.0001ml)，则每1g (或1ml)供试品中可能的菌数(N)应相应增加10倍。
5.2.8.12.5 大肠埃希菌(Escherichia coli)：
5.2.8.12.5.1 供试液制备和增菌培养：取供试品，照“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法《中国药典》2015年版四部（通则1105)”制成1:10供试液。取相当于1g或1ml 供试品的供试液，接种至适宜体积(经方法适用性试验确定）的胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，30~35℃培养18~24小时。5.2.8.12.5.2 选择和分离培养取上述培养物1ml接种至100ml 麦康凯液体培养基中，42~44℃培养24~48小时。取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，30~35℃培养18~72小时。
5.2.8.12.5.2 结果判断若麦康凯琼脂培养基平板上有菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验，确证是否为大肠埃希菌；若麦康凯琼脂培养基平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，判供试品未检出大肠埃希菌。
5.2.8.12.6 沙门菌(Salmonella)：
5.2.8.12.
6.1 供试液制备和增菌：培养取10g或10ml供试品直接或处理后接种至适宜体积（经方法适用性试验确定）的胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，30~35℃培养18~24小时。
5.2.8.12.
6.2 选择和分离培养：取上述培养物0.1ml接种至10mlRV沙门增菌液体培养基中，30~35℃培养18~24小时。取少量RV沙门增菌液体培养物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上，30~35℃培养18~48小时。沙门菌在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上生长良好，菌落为淡红色或无色、透明或半透明、中心有或无黑色。用接种针挑选疑似菌落于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种，培养18~2 4小时，
非无菌产品微生物限度检查法标准操作规程
或采用其他适宜方法进一步鉴定。
5.2.8.12.
6.3 结果判断：若木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上有疑似菌落生长，且三糖铁琼脂培养基的斜面为红色、底层为黄色，或斜面黄色、底层黄色或黑色，应进一步进行适宜的鉴定试验，确证是否为沙门菌。如果平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，或三糖铁琼脂培养基的斜面未见红色、底层未见黄色（或斜面黄色、底层未见黄色或黑色，判供试品未检出沙门菌。
5.2.8.12.7 铜绿假单胞菌{Pseudomonas aeruginosa)：
5.2.8.12.7.1 供试液制备和増菌培养：取供试品，照“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法《中国药典》2015年版四部（通则1105)”制成1:10供试液。取相当于1g或1ml 供试品的供试液，接种至适宜体积（经方法适用性试验确定的）的胰酪大豆胨液体培养基中，混匀。30~35℃培养18~24小时。
5.2.8.12.7.2 选择和分离培养：取上述培养物划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上，30~35℃培养18~72小时。取上述平板上生长的菌落进行氧化酶试验，或采用其他适宜方法进一步鉴定。
5.2.8.12.7.3 氧化酶试验：将洁净滤纸片置于平皿内，用无菌玻棒取上述平板上生长的菌落涂于滤纸片上，滴加新配制的1%二盐酸N ,N-二甲基对苯二胺试液，在30秒内若培养物呈粉红色并逐渐变为紫红色为氧化酶试验阳性，否则为阴性。
5.2.8.12.7.4 结果判断：若溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上有菌落生长，且氧化酶试验阳性，应进一步进行适宜的鉴定试验，确证是否为铜绿假单胞菌。如果平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，或氧化酶试验阴性，判供试品未检出铜绿假单胞菌。
5.2.8.12.8 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）：
5.2.8.12.8.1 供试液制备和增菌培养：取供试品，照“非无菌产品微生物限度检査：微生物计数法《中国药典》2015年版四部（通则1105)”制成1:10供试液。取相当于1g或1ml 供试品的供试液，接种至适宜体积(经方法适用性试验确定）的胰酪大豆胨液体培养基中，混勻。30~35℃培养18~24小时。5.2.8.12.8.2 选择和分离培养：取上述培养物划线接种于甘露醇氣化钠琼脂培养基平板上，30~35℃培养18~72小时。
5.2.8.12.8.2 结果判断：若甘露醇氣化钠琼脂培养基平板上有黄色菌落或外周有黄色环
非无菌产品微生物限度检查法标准操作规程
的白色菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验，确证是否为金黄色葡萄球菌；若平板上没有与上述形态特征相符或疑似的菌落生长，或虽有相符或疑似的菌落生长但鉴定结果为阴性，判供试品未检出金黄色葡萄球菌。
5.2.8.12.9 白色念珠菌（Candida albicans)：
5.2.8.12.9.1 供试液制备和増菌培养：取供试品，照“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法《中国药典》2015年版四部（通则1105)”制成1:10供试液。取相当于1g或1ml 供试品的供试液，接种至适宜体积(经方法适用性试验确定）的沙氏葡萄糖液体培养基中，混匀，30~35℃培养3~5天。
5.2.8.12.9.2 选择和分离：取上述预培养物划线接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，30~35℃培养24~48小时。白色念珠菌在沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的菌落呈乳白色，偶见淡黄色，表面光滑有浓酵母气味，培养时间稍久则菌落增大，颜色变深、质地变硬或有皱褶。挑取疑似菌落接种至念珠菌显色培养基平板上，培养24~48小时(必要时延长至72小时），或采用其他适宜方法进一步鉴定。
5.2.8.12.9.3 结果判断：若沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上有疑似菌落生长，且疑似菌在念珠菌显色培养基平板上生长的菌落呈阳性反应，应进一步进行适宜的鉴定试验，确证是否为白色念珠菌；若沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，或疑似菌在念珠菌显色培养基平板上生长的菌落呈阴性反应，判供试品未检出白色念珠菌。
6.变更历史
文件编号版本变更描述
对公司名称进行规范化，由“威特药业”修订为“威特（湖南）药SMP-检验通则-047-02 02
业有限公司”
SOP/QC-041-03 03 按照《药品生产质量管理规范》2010年修订的要求，进行统一修订SOP/QC-041-04 04 按照《中国药典》2015年版修订的要求，进行统一修订
无菌操作规程 1.目的 建立无菌检查标准操作规程，确保检查结果准确、可靠。 2.适用范围 本公司无菌产品的无菌检查 3.职责 质量部QC 4.依据 2015版《中国药典》通则1101 5.内容 5.1无菌检查环境保障 5.1.1无菌检查的所有操作均需在严格控制微生物污染的环境下进行，即无菌检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行。 5.1.2操作环境的无菌保障程度将直接影响无菌检查结果，为了保证无菌检查用洁净室（区）环境的稳定性，确保检查结果的可靠性，对洁净室（区）的环境定期检测并采取合理的措施保证洁净环境符合要求。 5.1.3无菌检查全过程必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染。 5.1.4洁净区的温度、湿度等参数必须符合相应洁净级别的要求 5.1.5无菌检查操作还需要对环境进行监控， 5.2培养基、稀硫酸、缓冲液 5.2.1硫乙醇酸盐流体培养基，市售培养基干粉。除另有规定，接种后应置30-35℃培养。 5.2.2胰酪大豆胨液体培养基，市售培养基干粉。接种后应置20-35℃培养。 5.2.3中和或灭活用培养基，按上述硫乙醇酸盐流体培养基或胰酪大豆胨液体培养基的处方及制法，在培养基灭菌或使用前加入适宜的中和剂、灭活剂或表面活性剂，其用量同方法实用性试验。 5.2.4胰酪大豆胨琼脂培养基，市售培养基干粉。 5.2.5沙氏葡萄糖液体培养基，市售培养基干粉。 5.2.6沙氏葡萄糖琼脂培养基，市售培养基干粉。 5.2.7PH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液，市售培养基干粉。 5.2.80.9%无菌氯化钠溶液。 5.2.9培养基使用性检查 无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基等应符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求。本检查可在供试品的无菌检查或与供试品的无菌检查同时进行5.2.9.1无菌性检查：每批培养基随机取5支（瓶），按各培养基规定的温度下培养14天，用无菌生长。 5.2.9.2灵敏度检查 5.2.9.2.1菌种：培养基灵敏度检查所用的菌株传代数不得超过5代（从菌钟存中心获得的干菌种第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以证试验菌株的生物学特性。 金黄色葡萄球菌【CMCC(B)26 003】 铜绿假单胞菌[CMCC(B)10 104] 枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63 501] 生孢梭菌[CMCC(F)64 941] 白色念球菌[CMCC(F)98 001] 黑曲霉[CMCC(F)98 003]
无菌技术操作流程 评估环境 环境清洁宽敞，定期消毒，在操作前30分钟停止一切清扫活动，减少人员走动，避免尘埃飞扬，操作台面清洁干燥，操作前用消毒毛巾擦拭操作台面。 操作前准备 1、操作前检查指甲清洁，按七步洗手法洗手，戴口罩 2、用物准备：（1）检查无菌手套密封包装，型号合适，在有效期内。 （2）无菌治疗碗包无破损、无潮湿、消毒条码变色，在有效期内。 （3）无菌治疗巾无破损、无潮湿、消毒条码变色，在有效期内。 （4）无菌持物钳包无破损、无潮湿、消毒条码变色，在有效期内。 （5）无菌敷料容器消毒条码变色，在有效期内。 （6）无菌溶液瓶口无松动，瓶身无裂缝，对光检查溶液透明，澄洁、无混浊、无沉淀、无絮状物，在有效期内。 （7）棉签在有效期内，消毒液在有效期内。 （8）弯盘清洁干燥，治疗盘清洁干燥。 操作过程 一、无菌持物钳的使用法 目的：取用或者传递无菌的敷料、器械等。 流程： 1、打开无菌包，将无菌持物钳置于操作台面上，标明打开日期及时间，有效期为4小时。 2、取放无菌钳时，钳端闭合向下，不可触及容器口边缘，用后立即放回容器内， 3、取远处物品时应当连同容器一起搬移到物品旁使用，从贮槽中取物时应将盖子完全打开，避免物品触碰边缘而污染。 注意事项：无菌持物钳不能夹取油纱布和未灭菌的物品，也不能用来换药或消毒皮肤。使用无菌持物钳时不能低于腰部。 二、无菌包使用法无菌容器使用法铺无菌盘法取用无菌溶液法 1、无菌包使用法： 打开无菌包，手不可触及无菌包内面，无菌治疗巾包消毒指示条码变色，用无菌持物钳夹取无菌治疗巾放治疗盘内，无菌包内物品未用完时，按原折痕包好，系带横向结扎，有效期为24小时。 2、铺无菌盘法：上层向远端呈扇形折叠，开口边向外，治疗巾内面构成无菌区，铺无菌盘区域必须清洁干燥，无菌巾避免潮湿。 打开无菌换药碗，无菌包内物品一次用完时，一手抓住无菌巾四角，包裹另一手拿住无菌物品放于无菌巾内。 无菌容器使用法：手持无菌容器时，应托住底部，从无菌容器内夹取物品时
无菌技术操作规程 一、无菌技术操作原则 1、环境要清洁。进行无菌技术操作前半小时，必须停止清扫地面等工作，避免不必要的人群流动，防止尘埃飞扬。治疗是每日用紫外线照射消毒一次。 2、进行无菌操作时，衣帽穿戴要整洁。帽子要把全部头发遮盖，口罩须遮住口鼻，并修剪指甲，洗手。 3、无菌物品与非无菌物品应分别放置，无菌物品不可暴露在空气中，必须存放于无菌包或无菌容器内，无菌包应注明无菌名称，消毒灭菌日期，并按日期先后顺序排放，以便取用，放在固定的地方。无菌包在未被污染的情况下，可保存7 天，过期应重新灭菌。 4、工作人员面向无菌区域，用无菌取无菌物品，手臂须保持在腰部水平以上，不可触及无菌物或跨越无菌区，从无菌容器中取出的物品，虽未使用，也不可放回无菌容器内。 5 进行无菌操作时不可面对无菌区讲话、打喷嚏。怀疑无菌物品被污染，不可使用。 6 进行无菌操作时如器械、用物疑有污染或已被污染，即不可使用可，应更换或重新灭菌。 7、一套无菌物品，只能供一个病人用，以免发生交叉感染
二、准备质量标准 1、工作人员着装整洁，洗手、戴口罩、修剪指甲。 2、备齐用物。 3、治疗盘、无菌持物钳或镊，浸泡于消毒液溶液内，无菌溶液、无菌包布、无菌容器及物品、无菌手套、弯盘、75％酒精、无菌棉签。 4、查对无菌物品、灭菌日期及手套好。 5 用物排放有序，符合无菌操作要求。 三、操作流程质量标准 1、选择清洁、干燥、宽阔的场所进行操作。 2 无菌持物钳使用法： 无菌持物钳须置于无菌容器内，有效期限 4 小时；取、放无菌持物钳时，应将盖打开，钳端闭合，不可在盖孔中取、放；如需取远处物品时，应连同容器一起搬移，就地取出无菌物品。 3、无菌包使用法： 1）、查看无菌包的名称、灭菌日期，查看化学指示胶带粘贴。 2）、将无菌包放在清洁、干燥处，撕开粘贴。 3）、用拇指和食指先揭开左右两角，最后揭开内角，注意手不可触及包布的内
1.目的： 建立无菌检查的标准操作规程，确保检验结果的准确性。 2.范围： 适用于本厂质监科化验室对本厂生产的注射剂进行无菌检查。 3.责任： 化验员有责任按本操作规程操作，并对检验结果负责。 4.定义： 无菌检查法系指检查药品是否无菌的一种方法。 5.内容： 5.1无菌操作设备： 无菌操作室或超净工作台，无菌衣、口罩、帽子、消毒鞋、酒精灯等。5.1.1无菌室分无菌操作室和缓冲间。在缓冲间内应有洗手盆、干手器、无菌衣放置架及挂钩、拖鞋等。无菌操作室应具有空气除菌过滤的层流装置，局 部洁净度100级超净工作台。缓冲间及操作室内均设置能达到空气消毒的紫外光灯和照明灯，操作室或工作台应保持空气正压。 5.1.2无菌室应每周和每次操作前用0.1％新洁尔灭或2％甲酚液擦拭操作台及可能污染的死角，开动无菌空气过滤器及紫外光灯杀菌1小时。在每次操作完毕，同样用2％甲酚或0.1％新洁尔灭溶液擦拭工作台面，用紫外光灯杀菌半小时。 5.1.3无菌室的无菌程度检查：无菌室在消毒处理后，无菌试验前及操作过程中需检查空气中菌落数。取直径90mm双碟，在接种室内点燃酒精灯，在酒精灯旁，以无菌操作，将双碟半开注入溶化的营养琼脂培养基约20ml，制成平板：
在35-37℃预培养48小时，证明无菌后将3个平板以无菌方式带入无菌操作间的洁净区域左、中、右各放1个；打开碟盖扣置，平板在空气中暴露30分钟后将盖盖好，置35-37℃培养48小时，取出检查，3个平板上生长的菌落数相加总数不得超过10个。 无菌操作台面或超净工作台应定期请有关部门检测其洁净度，应达到100 级（一般用尘埃粒子计数仪），检测尘埃粒径≤5μm的粒数不得超过3.5个／升；空气流量应控制在0.75-1.0m3/s；细菌菌落数平均<1个，可根据无菌状况定期置换过滤器。 5.1.4无菌室内应准备好盛有消毒用5％甲酚的玻璃缸、酒精灯、火柴、镊子、75％酒精棉及拖鞋等。 5.2仪器、用具： 5.2.1真空泵、恒温培养箱、生物显微镜、托盘天平（精度0.1g）、抽滤瓶（500ml）、三角瓶（100、500 ml）、移液管（1、10ml）、注射器（要求规格）、试管、双碟（9cm）、注射针、镊子、剪刀、白金耳、橡皮管、纱布、棉花（原棉）、不锈钢吸管筒、接种环、微孔滤膜（直径约5cm），孔径应在0.45±0.02μm )载玻片、洒精灯、取样勺、吸耳球、喷雾瓶。 5.2.2用具的包扎： 5.2.2.1移液管 在移液管上端管内,松松地塞进少许原棉,然后放入不锈钢灭菌筒内。 5.2.2.2试管 在管口塞上纱布棉塞。 5.2.2.3无菌衣、裤、帽、口罩
产品无菌检验操作规程 产品无菌检验操作规程 编制日期 审核日期 批准日期 版号生效日期 公司
1 目的 通过无菌检验，确保灭菌后产品能够达到无菌的要求。 2 适用范畴 适用于灭菌后医疗器械产品（列举）的无菌检验。 3 检验依据 本厂产品注册标准（编号） EN1174-1996 医疗器械灭菌产品中微生物数量的评估 《中国药典》（2005年版） GB14233.2-2005 医用输液、输血、注射器具检验方法第二部分：生物试验方法 GB15980-1995 一次性使用医疗用品卫生标准 4 仪器、设备 百级层流超净工作台、电热干燥箱、电热恒温培养箱、霉菌培养箱、压力蒸汽灭菌器、集菌仪（器）、电子天平、PH计、冰箱、恒温水浴锅、酒精灯、三角烧瓶，接种环、无菌棉签、镊子，试管架，大试管若干等。 5 无菌检验室的环境要求 5.1 无菌检验应在环境洁净度10000级下的局部百级的单向流空气区域内进行。 5.2 缓冲区与外界环境、无菌检验室与缓冲区之间空气应保持正压，阳性对比室与缓冲区之间空气应保持负压。无菌检验室与室外大气之间静压差应大于10Pa。无菌检验室的室温应保持18～26℃，相对湿度：45～65%。 5.3 无菌检验室的单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的监测。每年至少检测一次。 5.4 无菌检验过程中应同时检查超净工作台单向流空气中的菌落数：每次操作时在层流空气所及台面的左中右置3个营养琼脂平板，暴露30min，于30～35℃培养48小时，菌落数平均应不超过1CFU/平板。 6 无菌检验前的预备 6.1 器具灭菌、消毒 6.1.1 灭菌：试验过程中与供试品接触的所有器具必须采纳可靠方法灭菌。可经电热干燥箱160℃以上干烤2小时，或置压力蒸汽灭菌器内121℃蒸汽灭菌30分钟后使用（依照灭菌成效验证决定灭菌参数）。所有的灭菌物品不应超过2周即用毕，否则应重新灭菌。 6.1.2 消毒：凡检验中使用的器材无法灭菌处理的，使用前必须经消毒处理。如无菌检验室的试管架、电子天平、工作台面、工作人员的手、橡胶吸头等。可采纳消毒剂浸泡或擦拭。消毒剂应每月更换，以防止产生耐药菌株。 6.1.3 标识：器具的灭菌、消毒后必须做好标识，标明灭菌、消毒时刻和使用有效期。 6.2 人员、物料进入无菌检验室
无菌检查用培养基的适用性检查标准操作规程 目的：建立无菌检查用培养基适用性检查标准操作规程。 范围：适用于无菌检查使用培养基的适用性检查。 依据：中国药典》2015年版 《药品生产质量管理规范》2010年修订 《中国药品检验标准操作规程》2010年版 责任：QC化验员对实施本规程负责。 内容: 1、概要：无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基等应符合培养基的无菌检查及灵敏度检查要求。本检查可在供试品的检查前或与供试品的检查同时进行。 2、材料及设备 2.1 生化培养箱 2.2 生物安全柜 2.3 中国浊度标准管（由中国药品生物制品检定所提供） 2.4 灭菌试管、灭菌注射器 2.5 0.9%无菌氯化钠溶液 2.6 0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液：取聚山梨酯80 0.05ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%氯化钠至100ml，混匀，灭菌即可。3、无菌检查培养基的适用性检查 3.1无菌性检查 取新鲜配制灭菌的培养基各5瓶，硫乙醇酸盐流体培养基置30～35℃，胰酪大豆胨液体培养基置20～25℃，培养14天，应无菌生长。 3.2灵敏度检查 3.2.1菌种 培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的干燥菌种为第0代），
并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。 金黄色葡萄球菌[Staphylococcus aureus CMCC(B) 26003] 铜绿假单胞菌[Pseudomonas aeruginosa CMCC(B) 10104] 枯草芽孢杆菌[Bacillus subtilis CMCC(B) 63501] 生孢梭菌[Clostridium sporogenes CMCC(B) 64941] 白色念珠菌[Candida albicans CMCC(F) 98001] 黑曲霉[Aspergillus niger CMCC(F) 98003] 3.2.2菌液制备 3.2.2.1 金黄色葡萄球菌菌悬液制备 3.2.2.1.1 取金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体或胰酪大豆胨琼脂培养基上，30～35℃培养18～24小时，取新鲜传代菌种一支待用。取一支灭菌中试管，加入3ml 0.9%无菌氯化钠溶液，把新鲜传代菌种培养物用接种环轻轻刮取，在加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液的试管壁上研磨，使之成为均匀悬液。 3.2.2.1.2 取菌悬液1ml于比浊管中，用0.9%无菌氯化钠溶液逐步稀释至与标准管的浊度一致。记录下所加入的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液的量，余下的2ml菌液盖上试管塞以备用。 3.2.2.1.3 打开试管塞，取1ml菌液于中试管中，加入比浊时所需的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液的量一致的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液，此时试管中的细菌浓度与标准比浊管相一致。根据细菌浊度标准菌数表的菌数，将菌悬液用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9％无菌氯化钠溶液系列稀释至不大于100cfu/ml。 3.2.2.1.4 铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的菌悬液制备方法同金黄色葡萄球菌。 3.2.2.2 生孢梭菌菌悬液的制备 3.2.2.2.1取生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基上，30～35℃培养18～24小时，取一支灭菌中试管，用灭菌注射器吸取硫乙醇酸盐流体培养基中底部三分之二处的新鲜菌液1ml，加入
无菌检查操作规程 1.目的 建立无菌检查标准操作规程，确保检查结果准确、可靠。 2.使用范围 本公司无菌产品的无菌检查 3.职责 质量部QC 4.依据 2015版《中国药典》通则1101 GB/T 19973.2-2005（ISO11737-2:1998） 《疗器械的灭菌微生物学方法第2部分：确认灭菌过程的无菌试验》 GB/T 14233.2-2005 《医用输液、输血、注射器具检验方法第2部分：生物学试验方法》 5.内容 5.1.无菌检查环境保障 5.1.1.无菌检査的所有操作均需在严格控制微生物污染的环境下进行，即无菌检 査应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行。 5.1.2.操作环境的无菌保障程度将直接影响无菌检查结果，为了保证无菌检查用 洁净室（区）环境的稳定性，确保检查结果的可靠性，对洁净室（区）的环境定期监测并采取合理的措施保证洁净环境符合要求。 5.1.3.无菌检查全过程必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染。 5.1.4.洁净区的温度、湿度等参数必须符合相应洁净级别的要求。 5.1.5.无菌检查操作还需要对检查环境进行监控， 5.2.培养基、稀释液、缓冲液 5.2.1.硫乙醇酸盐流体培养基，市售培养基干粉。除另有规定，接种后应置 30~35℃培养。 5.2.2.胰酪大豆胨液体培养基，市售培养基干粉。接种后应置20~35℃培养。 5.2.3.中和或灭活用培养基，按上述硫乙醇酸盐流体培养基或胰酪大豆胨液体培
养基的处方及制法，在培养基灭菌或使用前加入适宜的中和剂、灭活剂或表面活性剂，其用量同方法适用性试验。 5.2.4.胰酪大豆胨琼脂培养基，市售培养基干粉。 5.2.5.沙氏葡萄糖液体培养基，市售培养基干粉。 5.2. 6.沙式葡萄糖琼脂培养基，市售培养基干粉。 5.2.7.PH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液，市售培养基干粉。 5.2.8.0.9%无菌氯化钠溶液。 5.2.9.培养基使用性检查 无菌检査用的硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基等应符培养基的无菌性检査及灵敏度检査的要求。本检查可在供试品的无菌检査或与供试品的无菌检査同时进行。 5.2.9.1.无菌性检查：每批培养基随机取5支（瓶），按各培养基规定的温度下 培养14天，应无菌生长。 5.2.9.2.灵敏度检查 5.2.9.2.1.菌种：培养基灵敏度检查所用的菌株传代数不得超过5代(从菌种存中 心获得的干菌种第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以 证试验菌株的生物学特性。 金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26 003] 铜绿假单胞菌[CMCC(B)10 104] 枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63 501] 生孢梭菌[CMCC(B)64 941] 白色念珠菌[CMCC(F)98 001] 黑曲霉[CMCC(F)98 003] 5.2.9.2.2.菌液制备：接种金色葡萄球菌、铜绿假胞菌、枯草芽孢杆菌的培养物 至胰酪大豆胨液体培养基中或胰酪大豆胨琼脂培养基上，接种生孢梭 菌的培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30?35℃培养18?24小时； 接种白色念珠菌的培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中或沙氏葡萄糖琼 脂培养基上，20?25℃培养24?48小时，上述培养后的新鲜培养物用 PH7.0无菌化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌化钠溶液制成每lml菌数小
无菌检查法标准操作规程 目的： 建立无菌检查的基本操作，为无菌检查人员提供正确的操作规程。 2.依据： 《中华人民共和国药典》2000年版二部。 3.范围： 本标准适用于QC无菌检查的操作。 4. 职责： QC无菌检查人员对本标准的实施负责。 5.程序： 5.1. 定义： 无菌检查法：系指检查药品、无菌器具及适用于药典要求无菌检查的其它品种是否无菌的一种方法。 5.2. 无菌操作室应具有空气除菌过滤的层流装置，局部洁净度100级或放置同等级别的超净工作台，室内温控（18~26）℃及除湿装置，操作室或工作台应保持空气正压。 5.2.1. 无菌室的清洁与消毒应符合QC洁净室清洁、消毒规程（SOP ZL0014）。 5.2.1.无菌室无菌程度的检查应符合规定：见沉降菌监测规程（SOP ZL0006）、悬浮粒 子监测规程（SOP ZL0005）。 实验设备及用具： 5.3.1.电热干燥箱、电热手提式压力蒸汽灭菌器、电热恒温培养箱、试管、注射器、针头、试管架、刻度吸管、手术剪、手术镊、砂轮、注射器盒、搪瓷托盘、双碟、75%酒精棉球、无菌工作服（衣、裤、帽、口罩等）。 5.3.2.微孔滤膜：直径50mm、孔径0.45μm，应符合规定。 5.3.3.除菌滤器： 除菌滤器采用的是HTY-2000型全封闭式薄膜过滤器。 5.3.4. 所有进入无菌室的物品必须经过消毒或灭菌，应严格按照进入QC无菌室物品清洁、消毒、灭菌规程（SOP ZL0015）进行操作。
5.4. 稀释剂：灭菌注射用水。 5.5. 培养基： 5.5.1.需气菌、厌气菌培养基（流体硫乙醇酸盐培养基）；真菌培养基。 5.5.2. 培养基的使用，配制、管理及灵敏度检查应按照培养基管理规程（SMP ZL0036）、培养基灵敏度检查规程（SOP ZL0019）、培养基配制规程（SOP ZL0016）进行操作。 5.6. 对照用菌液： 5.6.1. 金黄色葡萄球菌（Staphyoccus sureus）菌液：取金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]的营养琼脂斜面新鲜培养物1白金耳，接种至营养肉汤培养基内，在30~35℃培养16~18小时后，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至每1ml中含10~100个菌。 5.6.2. 生孢梭菌（Clostridum sporgenes）菌液：取生孢梭菌[CMCC（B）64 941]的需气菌、厌气菌培养基新鲜培养物1白金耳，接种至相同培养基内，在30~35℃培养18~24小时后，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至1ml中含10~100个菌。 5.6.3. 白色念珠菌（Candida albicans）菌液：取白色念珠菌[CMCC（F）98 001]的 真菌琼脂培养基斜面新鲜培养物1白金耳，接种至真菌培养基内，在20~25℃培养24小时后，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至每1ml中含10~100个菌。 5.7. 操作法： 5.7.1. 供试品、培养基在移入缓冲间之前应先编号，并用75%酒精棉球擦拭瓶（管）外壁，然后连同其它用具（包括无菌衣、帽、口罩等）移入缓冲间，打开无菌间紫外光 灯和空气过滤装置开关，并使其工作在30分钟以上。 5.7.2. 将所需物品移入无菌室，每次试验中所用物品，必须计划好，并有备用物。操作人员进入无菌室应严格遵守QC洁净室进出规程（SOP ZL0013）。 5.7.3. 供试品外部消毒： 5.7.3.1. 橡皮塞、铝盖、压封小瓶：先用75%酒精棉球擦拭外壁及瓶塞，待干，用消毒镊子剔去铝盖上的铝质小圆片，用酒精棉球擦拭瓶盖及橡皮塞，并将酒精棉球盖于橡皮塞上待取样。 5.7.3.2. 安瓶：先用酒精棉球将安瓶外部擦拭消毒待干，用砂轮轻轻割安瓶颈部，便于折开安瓶。 5.7.4. 供试品溶液的制备：取供试品加入该药品项下规定的稀释剂用量，制成该药品项下规定浓度的供试品溶液。 5.7.5. 根据供试品的抑真菌和抑细菌试验，判定该供试品有无抑菌性，而决定采用直接
无菌技术操作流程 开始：各位老师下午好，我操作的项目是无菌技术操作。 1. 无菌技术操作的目的：保持无菌物品无菌区域不被污染，防止一切微生物侵入机体，避免给患者带来不应有的损失和危害 2. 环境评估：操作前30分钟停止清扫，操作中减少人员走动，开窗、通风、换气，操作台宽敞、平坦、整洁、干燥。 3. 用物准备：治疗盘无菌包：包内置无菌巾若干无菌容器内置无菌持物钳棉签无菌包：内置治疗碗一个，镊子两把，弯盘一个无菌纱布罐无菌棉球罐无菌生理盐水一次性无菌手套 铺无菌盘 1. 洗手戴口罩。 2. 治疗盘清洁，干燥。铺无菌换药盘。 3. 开无菌包：（化学指示胶带有变色，在有效期内，无潮湿、无破损。）斜角打开（打开无菌包内角时，手不可触及包布内面，不得跨越无菌区域）看化学指示卡，有变色。用无菌持物钳夹取一块无菌巾放入治疗盘内，将无菌包按原折痕“一字”包好后，看时间：记录日期、时间、并签名、24 小时内有效。 4. 铺无菌巾：双手捏住无菌巾一侧两角外面轻轻抖开，由近及远的将治疗巾一半铺于治疗盘上，将上下对齐后上层扇形折三次，开口外边向外，使治疗巾内面构成一无菌区。 5. 开无菌包，（指示胶带变色，在有效期内，侧孔、底孔闭合） 1）打开无菌包，看化学指示卡变色 2）用无菌钳分别取治疗碗（内含两把镊子）、弯盘放入无菌盘内。 3）打开无菌纱布罐夹取纱布置无菌盘内；同法夹取无菌棉球置治疗碗内（手不可触及容器边缘或内侧），无菌容器盖内面朝下直接盖上。 6. 倒无菌溶液：（拿起溶液瓶，看瓶签）口述：瓶身干净，标签完整、字迹清楚， 0.9%Nacl500ml，在有效使用期内，瓶盖无松动，瓶身瓶底无无裂缝，对光检查：（溶液澄清、无杂质）。除盖：查棉签（无漏气，在有效试用期内）写好开包日期，消毒瓶盖、手指，开瓶盖。倒溶液于治疗碗内，再次消毒瓶口，盖回瓶盖看时间：记录日期、时间、签名，（24 小时有效）。 7. 铺完盘，看时间口述：记录名称、时间并签名（小标签贴于盘缘）、4 小时内有效。述：已铺好换药盘，可以给病人进行换药护理。一份无菌物品只供一位病人使用，以防交叉感染。 带无菌手套 1．检查手套：7 号无菌手套，在有效使用期内，无潮湿、破损，将手套放置于操作台，打开手套，戴手套，戴手套时应防止手套外面（无菌面）触及手套内面及非无菌物品或区域。为使手套与手贴合，可双手交叉互推。边做边口述：手套完好无破损，可进行无菌操作。3．脱手套，置于医疗垃圾桶内，将用物推至处置室归类处理。 无菌技术操作原则：
产品无菌方法验证 一、概述 1、简介 无菌检查法是指检查无菌药品、医疗器械等是否无菌的一种方法。无菌检查是在洁净度百级的单向流空气区域内进行，其全过程严格遵守无菌操作，防止微生物污染。本验证方案参考《中华人民共和国药典2010版二部》附录无菌检查法和GB/T19973.2-2005/ISO 11737-2:1998 医疗器械的灭菌微生物学方法第二部分：确认灭菌过程的无菌试验。二、验证目的 通过对无菌方法的培养基适用性检查、无菌检查方法的适用性检查，并且结果符合规定，证明培养基的适用性以及无菌检验方法的适用性，以达到用适合的方法对样品进行无菌检查的目的。 三、范围 本验证方案适用于X公司医疗器械无菌检查方法。本文件规定了无菌验证的程序、方法、标准和记录。 四、验证参考文件 五、验证人员及职责 1质量部QC：负责验证计划、方案起草、按监控计划执行，做好检验工作，并进行记录，出具报告。 2质量部：质量部经理负责验证方案的审核、记录的审核和报告的审核。按文件管理要求，作好验证方案文件的控制工作。 六、验证内容 1、验证试验项目
1.1 培养基的的适用性检查。 1.2方法适用性检查 2、验证实施步骤 2.1 所用培养基 胆盐硫乙醇酸盐流体培养基 改良马丁培养基 2.2 培养基的配制 硫乙醇酸盐流体培养基：称取硫乙醇酸盐流体培养29.3g，加入蒸馏水或去离子水1L，煮沸至完全溶解，分装试管，121℃灭菌15min。 改良马丁：称取改良马丁28.5g加入蒸馏水或去离子水1L，搅拌加热至完全溶解，分装试管，121℃灭菌30min。 2.3 菌悬液配制 所用菌种：金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003 铜绿假单胞菌CMCC(B)10104 枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501 生孢梭菌CMCC(B)64941 白色念珠菌CMCC(F)98001 黑曲霉CMCC(F)98003 用无菌生理盐水将所用菌种稀释至30-100CFU/ml（2～8℃保存24h内使用）。 2.3 检验方法以及培养条件的选择 依据产品特点和标准推荐，优先选用直接浸泡于生长培养基（硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基）中，然后硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基分别在23～28℃和30～35℃培养14天，逐日观察，并记录结果。 2.4 培养基的适用性检查 2.4.1 培养基的无菌检查 硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基分别取5支，培养14天，应无菌生长。2.4.2 灵敏度检查 2.4.2.1 接种 取每管装量12ml的硫乙醇酸盐流体培养基9支，分别接种小于100CFU的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2支，另一支不接种作空白对照,培养3天；取每管装量9ml的改良马丁培养基5管，分别接种白色念珠菌、黑曲霉2支，另一支不接种作空白对照，培养5天。逐日观察结果。 2.4.2.2 结果判断 空白对照管应无菌生长，加菌的培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。 2.5 无菌方法适用性检查 2.5.1 接种 取装量为25ml的硫乙醇酸盐流体培养基8管，分别接入小于100cfu的金黄的葡萄球
一、目的：建立注射剂检验标准操作规程，防止错检、漏检的发生。 二、范围：适用于注射剂的检验操作方法。 三、责任：质量部、化验室相关操作人员。 四、内容： 注射剂 注射剂（《中国药典》2010年版二部附录IB）系指药物与适宜的溶剂或分散介质制成的供注入体内的溶液、乳状液或混悬液，以及供临用前配制或稀释成溶液或混悬液的粉末或浓溶液的无菌制剂。 注射剂可分注射液（其中供静脉滴注用的大体积注射液也称静脉输液）、注射用无菌粉末与注射用浓溶液。 注射剂除应按药典品种项下规定的检验项目外，还应检查“装量”或“装量差异”、“可见异物”和“无菌”。静脉用注射剂应加查“热原”或“细菌内毒素”；溶液型静脉用注射液、溶液型静脉注射用粉末及注射用浓溶液应加查“不溶性微粒”；静脉输液及插管注射用注射液应加查“渗透压摩尔浓度”。 混悬型注射液，除另有规定外，药物粒度应控制在l5um以下，含15～20um(间有个别20～50um)者，不应超过10%，若有可见沉淀，振摇时应容易分散均匀；乳状液型注射液不得有相分离现象；静脉用乳状液型注射液分散相球粒的粒度90%应在lum以下，并不得有大于5um的乳滴。 “装量”检查法 1 简述 1.1本法适用于50ml及50ml以下的单剂量注射液的装量检查，其目的在于保证单剂量注射液的注射用量不少于标示量，以达到临床用药剂量要求。 1.2标示装量为50ml以上的注射液和注射用浓溶液，按最低装量检查法标准操作规范检查，应符合规定。
1.3 凡规定检查含量均匀度的注射液（如塞替派注射液）．可不进行“装量”检查。 2 仪器与用具 2.1注射器及注射针头。 2.2量筒（量入型）规格l、2、5、1O、20及50ml的量筒，均应预经标化。 3 操作方法 3.1 按下表规定取用量抽取供试品。 标示装量供试品取用量（支） 2ml或2ml以下 5 2ml以上至50ml 3 3.2取供试品，擦净瓶外壁，轻弹瓶颈部使液体全部下落，小心开启，将每支内容物分别用相应体积的干燥注射器（包括注射器针头）抽尽，注入预经标化的量筒内，在室温下检视，读出每支装量。 3.3如供试品为油溶液或混悬液时，检查前应先微温摇匀，立即按3.2项下方法操作，并冷至室温后检视。 4 注意事项 4.1所用注射器及量筒必须洁净、干燥并经定期校正；其最大容量应与供试品的标示装量相一致，量筒的体积应使待测体积至少占其额定体积的40%。 4.2 注射器应配上适宜号数的注射针头，其大小与临床使用情况相近为宜。 5 记录与计算主要记录室温，抽取供试品支数，供试品的标示装量，每支供试品的实测装量。 6 结果与判定 每支注射液的装量均不得少于其标示装量；如有少于其标示装量者，即判为不符合规定。 “装量差异”检查法 l 简述 1.1本法适用于注射用无菌粉末的装量差异检查。 1.2本项检查的目的在于控制各瓶间装量的一致性，以保证使用剂量的准确。 1.3凡规定检查含量均匀度的注射用无菌粉末，可不进行“装量差异”检查。 2 仪器与用具 分析天平感量0. 1mg（适用于平均装量为0.15g及其以下的粉针剂）或感量1mg
无菌操作规程 （一）无菌技术操作原则 1、环境要清洁。进行无菌技术操作前半小时，须停止清扫地面等工作，避免不必要的人群流动，防止尘埃飞扬。治疗室每日用紫外线照射消毒一次。 2、进行无菌操作时，衣帽穿戴要整洁。帽子要把全部头发遮盖，口罩须遮住口鼻，并修剪指甲，洗手。 3、无菌物品与非无菌物品应分别放置，无菌物品不可暴露在空气中，必须存放于无菌包或无菌容器内，无菌物品一经使用后，必须再经无菌处理后方可使用，从无菌容器中取出的物品，虽未使用，也不可放回无菌容器内。 4、无菌包应注明无菌名称，消毒灭菌日期，并按日期先后顺序排放，以便取用，放在固定的地方。无菌包在未被污染的情况下，可保存7-14天，过期应重新灭菌。 5、取无菌物品时，必须用无菌钳（镊）。未经消毒的物品不可触及无菌物或跨越无菌区。 6、进行无菌操作时如器械、用物疑有污染或已被污染，即不可使用，应更换或重新灭菌。 7、一套无菌物品，只能供一个病员使用，以免发生交叉感染。（二）准备质量标准 1、工作人员着装整洁，洗手、戴口罩、修剪指甲。 2、备齐用物。
3、治疗盘、无菌持物钳或镊，浸泡于消毒溶液内，无菌溶液、无菌包布、无菌容器及物品、无菌手套、弯盘、75%酒精、无菌棉签。 4、查对无菌物品、灭菌日期及手套号。 5、用物排放有序，符合无菌操作要求。 （三）操作流程质量标准 1、选择清洁、干燥、宽阔的场所进行操作。 2、解开无菌包系带卷放在包布下边。 3、用拇指和食指先揭左右两角，最后揭开内角，注意手不可触及包布的内面。用无菌钳（镊）取出一块无菌巾放于治疗盘内，剩余部分按原折痕包起扎好，并注明开包时间。 4、铺无菌盘： 单巾铺盘：双手拇、食指捏住治疗巾两上角外面，轻轻抖开，双折铺于治疗盘上，内面为无菌区，盖的半幅成扇形折到对面无菌盘上，开口边向外，放入无菌物品后，边缘对齐盖好。将开口处向上翻折两次，两侧边缘向下翻一次，以保持无菌。 双巾铺盘：双手捏住无菌巾的左右两上角的外面，轻轻抖开，由远向近铺于治疗盘上，无菌面向上，放入无菌物品。依上法夹取另一块无菌巾，由近侧向对侧覆盖于治疗盘内上，边缘多余部分反折，不应暴露无菌区。 5、打开无菌容器盖，必须把盖的无菌面（内面）向上，放在稳妥处，夹取所需物品放入无菌盘内后立即盖严。 6、倒无菌溶液，仔细检查核对溶液后，面对瓶签两拇指将橡皮
余姚市吉康医疗器械厂 无菌检验操作规程 1 目的 确保本企业所生产的成品符合产品标准要求。 2 范围 本规程供检验员成品的无菌检验用。 3 职责 检验员负责做好成品(指无菌产品)的无菌检验，并作好检验记录。 4 工作程序 4.1试剂 质量浓度为9g/L的无菌氯化钠溶液、其他符合《中国药典》要求的稀释液和冲洗液。 4.2主要设备 超净工作台、恒温培养箱、恒温水浴箱、压力蒸汽灭菌器、电热干燥箱。 4.4试验前准备 4.4.1 器具灭菌 与供试液接触的所有器具应采用可靠方法灭菌，置压力蒸汽灭菌器内120℃30min，或置电热干燥箱内160℃2h。 4.4.2 无菌室要求 4.4.2.1超净工作台局部应符合洁净弃100级单向流空气区域要求。无菌室在消毒处理完毕后，应检查空气中的菌落数，方法如下：取直径约90mm培养皿，无菌操作注入融化的营养琼脂培养基约20mL，在30℃～35℃培养48 h证明无菌后，取3只培养皿在超净工作台平均位置打开上盖，在暴露30min后盖好置30℃～35℃培养48h后取出检查。3只培养皿上生长的菌落数平均应不超过1个。 4.4.2.2 无菌试验过程中应检查空气中的菌落数，方法同上。在试验开始进行时打开培养皿盖，至试验结束后盖好照上法培养，应符合上述要求。 4.5培养基 用于培养需（厌）气菌和真菌的培养基的制备、培养基灵敏度检查及其他各项要求应符合《中国药典（二部）》附录中《无菌检查法》的规定。 4.6 供试品抑菌性验证试验 对未知或可疑的供试品，在进行无菌试验前，应按照《中国药典（二部）》附录中“无菌检查法”的规定进行方法验证试验，以确认供试品在该试验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可以忽略不计。 4.7试验方法 4.7.1 供试品数量 同一批号（灭菌批）3个～5个单位供试品。 4.7.2 浸提介质 质量浓度为9g/L的无菌氯化钠溶液或其他符合《中国药典》要求的稀释液和冲洗液。 4.7.3 供试液制备 优先采用将供试品或其有代表性的各部分直接投放入培养基内培养。如供试品不适宜直接投放，可按下列方法制备供试液，应使浸提介质充分洗提供调节器的浸提表面。供试液制备应按无菌操作法进行，在制备后2h内使用。 质量浓度为9g/L的无菌氯化钠溶液、其他符合《中国药典》要求的稀释液和冲洗液。 4.7.4 接种、培养和观察 根据供试品具体特性选择《中国药典（二部）》附录中“无菌检查法”规定的适宜接种方式，以无菌操作法进行。 供试品的培养观察按《中国药典（二部）》附录中“无菌检查法”的规定。 4.7.5 结果判定 按《中国药典（二部）》附录中“无菌检查法”的规定。 4.8记录 对每一产品的灭菌批作好《细菌检验原始记录》记录保存期限为五年。 起草人/日期：批准人/日期：实施日期：2008-12-10
医疗器械产品无菌检验操作规程 1目的 通过无菌检验,确保灭菌后产品能够达到无菌的要求。 2适用围 适用于灭菌后医疗器械产品的无菌检验。 3检验依据 《中国药典》 (2005年版 GB14233.2-2005医用输液、输血、注射器具检验方法第二部分:生物试验方法GB15980-1995一次性使用医疗用品卫生标准 4仪器、设备 超净工作台、电热干燥箱、电热恒温培养箱、霉菌培养箱、压力蒸汽灭菌器、集菌仪(器、电子天平、 PH 计、冰箱、恒温水浴锅、酒精灯、三角烧瓶,接种环、无菌棉签、镊子,试管架,大试管若干等。 5无菌检验室的环境要求 5.1无菌检验应在环境洁净度 10000级下的局部百级的单向流空气区域进行。 5.2缓冲区与外界环境、无菌检验室与缓冲区之间空气应保持正压,阳性对照室与缓冲区之间空气应保持负压。无菌检验室与室外大气之间静压差应大于 10Pa 。无菌检验室的室温应保持 18~26℃,相对湿度:45~65%。 5.3无菌检验室的单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室(区悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的监测。每年至少检测一次。
5.4无菌检验过程中应同时检查超净工作台单向流空气中的菌落数:每次操作时在层流空气所及台面的左中右置 3个营养琼脂平板,暴露 30min ,于 30~35℃培养 48小时,菌落数平均应不超过 1CFU/平板。 6无菌检验前的准备 6.1器具灭菌、消毒 6.1.1灭菌:试验过程中与供试品接触的所有器具必须采用可靠方法灭菌。可经电热干燥箱 160℃以上干烤 2小时,或置压力蒸汽灭菌器 121℃蒸汽灭菌 30分钟后使用(根据灭菌效果验证决定灭菌参数。所有的灭菌物品不应超过 2周即用毕, 否则应重新灭菌。 6.1.2消毒:凡检验中使用的器材无法灭菌处理的,使用前必须经消毒处理。如无菌检验室的试管架、电子天平、工作台面、工作人员的手、橡胶吸头等。可采用消毒剂浸泡或擦拭。消毒剂应每月更换,以防止产生耐药菌株。 6.1.3标识:器具的灭菌、消毒后必须做好标识,标明灭菌、消毒时间和使用有效期。 6.2人员、物料进入无菌检验室 6.2.1开启紫外线灯或臭氧发生器进行空间灭菌处理,消毒时间不得少于 30min 。 6.2.2物料进入无菌检验室流程 6.2.2.1脱包:进入无菌检验室的物品若有双重包装的,需将外包装在传递窗 /缓冲间拆除后,传入试验室。 6.2.2.2消毒:进入无菌操作室的所有培养基、供试品等的外表都应采用适用的方法进行消毒处理,以避免将外包装污染的微生物带入无菌检验室。 6.2.2.3传递:查看所有进入无菌检验室的器具上的灭菌、消毒标识, 是否在有效期。符合要求的经传递窗传入无菌检验室。
无菌检查操作规程 1、目的 建立无菌检查标准操作规程，规范无菌检查操作过程，确保检查结果的准确性。 2、范围 本规程适用于广州赛哲生物科技股份有限公司无菌检查操作过程。 3、职责 相关操作人员负责本规程的具体实施，质检部负责对本规程的实施过程进行监督。 4、工作程序 4.1培养基的制备及培养条件 培养基可按以下给出的处方制备，也可使用按处方生产的符合规定的脱水培养基或成品培养基。配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。制备好的培养基应保存在2～25℃、避光环境下，三周内使用。 4.1.1硫乙醇酸盐流体培养基主要用于厌氧菌的培养，也可用于需氧菌的培养。配方如下： 除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调节p H 为弱碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节pH,使灭菌后在25℃的pH值为7.1土0.2。 分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色)不超过培养基深度的1/2。灭菌。在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5，否则，须经100°C水浴加热至粉红色消失（不释过20分钟），迅速冷却，只限加热一次，并防止被污染。 除另有规定外，硫乙醇酸盐流体培养基置30?35℃培养。 4.1.2胰酪大豆胨液体培养基用于真菌和需氧菌的培养。配方如下：
除葡萄糖外，取上述成分，混合，微温溶解，滤过，调节pH使灭菌后在25℃的pH 值为7.3±0.2，加入葡萄糖，分装，灭菌。 胰酪大豆胨液体培养基置20?25℃培养。 4.1.3胰酪大豆胨琼脂培养基配制方法如下： 除琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH使灭菌后在25℃的pH值为7.3±0.2，加人琼脂，加热溶化后，摇匀，分装，灭菌。 4.1.4沙氏葡萄糖琼脂培养基用于黑曲霉的培养。培养如下： 除葡萄糖、琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH使灭菌后在25℃的pH 值为5.6士0.2，加入琼脂，加热溶化后，再加入葡萄糖，摇匀，分装，灭菌。 4.2培养基的无菌性检查 每批培养基随机取不少于5支（瓶），置各培养基规定的温度培养14天，应无菌生长。 4.3培养基的灵敏度检查 4.3.1菌种培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5代(从菌种保存中心获得的干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。 金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus)〔CMCC(B)26 003〕 铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa ) 〔CMCC(B)10 104〕 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)〔CMCC(B)63 501〕
无菌检测规程 1．目的： 建立无菌检查的标准操作规程，确保检验结果的准确性。 2．适用范围 本规程适用于本公司质检科对本厂生产的的无菌检测。 3．引用相关文件 制定本规范参考了下列文件中的一些信息，但没有直接引用里面的条文。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T 14233.2-2005 医用输液、输血、注射器具检验方法第2部分：生物学试验方法《中华人民共和国药典2010年版二部》附录Ⅺ H 无菌检查法 4．设备、用具与试剂 4.1 设备要求 无菌操作室、超净工作台、培养箱、高压消毒锅、高温烘箱。 4.1.1 无菌室应每周用0.1％新洁尔灭或2％甲酚液擦拭操作台及可能污染的死角，每次操作前开动无菌空气过滤器及紫外光灯杀菌1小时。在每次操作完毕，用2％甲酚或0.1％新洁尔灭溶液擦拭工作台面，用紫外光灯杀菌0.5小时。每次使用无菌室都应详细填写无菌室使用记录。 4.1.2 无菌室、超净台在消毒处理完毕后，应检查空气中的菌落数，方法如下：取直径90mm 培养皿，无菌操作注入融化的营养琼脂培养基20ml，在30～35℃培养48h证明无菌后，取3只培养皿在无菌室超净工作台内平均位置打开培养皿上盖，暴露30min后盖好，置30-35℃培养48小时后取出检察， 3只培养皿上生长的菌落数平均不得超过1个。 4.1.3 无菌试验过程中检查空气中的菌落数，方法同上。在试验开始进行时，打开平皿盖在空气中暴露，至试验结束，盖好。照上法培养，应符合上述要求。