新工艺
不同处理对大豆浓缩蛋白（SPC）粗蛋白含量及提取率的影响
山东省海洋水产研究所/李宝山王际英张利民王世信黄炳山
摘要分别用超声波处理不同粉碎粒度的高温脱脂豆粕，然后采用醇法浸提工艺提取其中的大豆浓缩蛋白
（SPC）。结果显示：40目、60目及80目豆粕提取的大豆浓缩蛋白中粗蛋白含量分别为51.63%、53.50%和54.32%（P＜0.05），提取率分别为97.65%、
97.51%和95.80%（P＜0.05）；超声波处理之后提取的大豆浓缩蛋白中粗蛋白含量分别为53.44%、55.11%和58.77%（P＜0.05），提取率分别为97.50%、
96.78%和95.65%（P＜0.05）。不同的粉碎粒度对大豆浓缩蛋白中粗蛋白的含量及提取率有显著影响，粒度越小，粗蛋白含量越高，提取率越低；在相同的粉碎粒度下，超声波处理能提高大豆浓缩蛋白中粗蛋白的含量，但是对其提取率无显著影响。
关键词大豆浓缩蛋白；高温脱脂豆粕；超声波；提取率
Abstract The aim of this study that detecting the effects of ultrasonic and different grinding particle sizes on the crude protein content and extraction rate of soybean protein concentrated (SPC). The crude protein content of SPC with 40, 60 and 80 meshes high denatured defatted soybean meal were 51.63%, 53.50% and 54.32%
(P<0.05), and the extraction rate were 97.65%, 97.15% and 95.80% (P<0.05), respectively. The crude protein content from ultrasonic dealt 40, 60 and 80 meshes high denatured defatted soybean meal were 53.44%, 55.11% and 58.77% (P<0.05), and the extraction rate were 97.50%, 96.78% and 95.65% (P<0.05). Different grinding particle sizes had signi? cantly effects on the crude protein content and extraction rate of SPC, the particle was smaller that the crude protein content was higher and extraction rate was lower. Ultrasonic can increase the crude protein content, but have no effects on the extraction rate to the same particle sizes soybean meal.
Keywords soybean protein concentrated; high denatured defatted soybean meal; ultrasonic; extraction rate
著影响[2～4]，但是不同粉碎粒度与超声波处理对SPC提取是否有影响尚未见报道。因此，本试验采用醇法浸豆粕中提取大豆浓缩蛋白，旨为高温脱脂豆粕提取大豆浓缩蛋白的研究提供依据。
豆粕粗蛋白含量在43%左右，氨基酸组成较为平衡，是性价比较高的蛋白原料之一，但是在蛋白需求较通过后加工工艺将豆粕中的粗蛋白进一步浓缩，便得到了大豆浓缩蛋白（SPC）及大豆分离蛋白（SPI），大豆浓缩蛋白的粗蛋白含量一般在70%左右，而大豆分离蛋白的粗蛋白含量在90%以上，能较好的满足水产动物
对蛋白质的需求。但是工艺要求生产大豆浓缩蛋白及大豆分离蛋白的原料为低温豆粕，低温豆粕的价格较高，而且我国浸油工业的副产物多为高温脱脂豆粕[1]，如果将会对浸油工业和饲料工业产生巨大的影响。超声波是功率在20kHz以上的声波，具有波动和能量二属性，对物质具有空化效应和机械作用。杨晓泉和李宝山等研究证明不同粉碎粒度与超声波处理对SPI的提取率有显
高的水产动物饲料中，豆粕的使用量受到了一定的限制。提工艺从不同粉碎粒度及经过超声波处理过的高温脱脂
1 材料与方法
1.1 试验材料
高温脱脂豆粕（购自市场），无水乙醇（AR），氢氧化钠（AR），氢氧化钾（AR），盐酸（GR），浓硫酸
，硼酸（AR），丙酮（AR），蒸馏水。能以高温脱脂豆粕提取大豆浓缩蛋白及大豆分离蛋白，（AR）
1.2 试验仪器
高速万能粉碎机（天津，泰斯特），超声波处理器（上海必能达，25kHz），分析天平（HR-200），半自动凯氏定氮仪（FOSS，2100），粗纤维测定仪（FOSS，2010），
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1.3 试验方法
普通处理及超声波处理的高温脱脂豆粕所提取的
恒温振荡器（金坛科析，SHA-B），溶剂过滤器（天津津腾，1L），真空泵（北京八方，BF-S2500），旋转蒸发仪（上海亚荣，B-260），马福炉（山东龙口，2001）。
试验分为两个处理：普通处理和超声波处理，每个处理分为三个梯度，40目豆粕组、60目豆粕组和80目豆粕组，每个梯度设三个重复。
豆粕经粉碎后分别过40目、60目及80目标准筛，提取工艺如下图，提取条件参考文献5～7。
超声波处理条件如下：称取50g豆粕，加入90g蒸馏水，搅拌均匀，置于超声波处理器中处理20min后，按比例加入定量的无水乙醇，后续过程如上图。
采用过滤法测定（GB/T 6434-2006）豆粕中粗纤维含量，采用105℃衡重法
（GB/T 6435-2006）和凯氏定氮法（GB/T 6432-94）测定豆粕及提取出的大豆浓缩蛋白中的水分及粗蛋白含量。为了比较方便，所有粗蛋白含量均折算为占干重的百分比。
大豆浓缩蛋白提取率的计算：
SPC粗蛋白含量×SPC质量
SPC(%)=
豆粕粗蛋白含量×豆粕质量
×100%
见，本次试验所用的高温脱脂豆粕粗蛋白含量占干重的46.62%，粗纤维含量占干重2.95%。
2.2 不同处理大豆浓缩蛋白中粗蛋白含量及提取率
大豆浓缩蛋白中粗蛋白含量见表2。由表2可见，普通处理和超声波处理的40目高温脱脂豆粕提取出的大豆浓缩蛋白粗蛋白含量分别为51.63%和53.44%（P＜0.05），60目高温脱脂豆粕提取出的大豆浓缩蛋白粗蛋白含量分别为53.50%和55.11%（P＜0.05），80目高温脱脂豆粕提取的大豆浓缩蛋白粗蛋白含量分别为54.32%和58.77%（P＜0.05）。超声波处理显著提高了大豆浓缩蛋白中粗蛋白的含量。
不同粉碎粒度的高温脱脂豆粕所提取出大豆浓缩蛋白中粗蛋白含量见图1。由图1可见40目普通处理组的大豆浓缩蛋白中粗蛋白含量显著低于60目和80目普通处理组（P＜0.01），但后两者之间无显著差异；40目、60目及80目超声波处理组大豆浓缩蛋白中粗蛋白含量有显著差异，粉碎粒度越小，所得大豆浓缩蛋白的粗蛋白含量越高（P＜0.01）。
不同处理对大豆浓缩蛋白提取率的影响见表3。由表3可见40目及60目普通处理组的大豆浓缩蛋白提取率无显著差异，但二者显著高于80目普通处理组（P＜0.05）；40目超声波处理组大豆浓缩蛋白提取率显著高于80目超声波处理组（P ＜0.05），60目超声波处理组与二者无显著差异。
在相同的粉碎粒度下，超声波处理对大豆浓缩蛋白的提取率无显著影响。
1.4 数据处理
试验所得数据采用SPSS11.5进行多重分析比较，结果以平均值±标准偏差（Mean±SD）表示，当P＜0.01时，视为差异极显著，当P＜0.05时，视为差异显著。
2 结果
2.1 豆粕中基本成分的含量
试验所用豆粕的基本成分含量见表1。由表1可
3 讨论
50g豆粕+250mL乙醇（75%）
保鲜膜覆盖固体
1000mL烧杯
恒温振荡器
90min50℃
50℃
真空抽虑
乙醇（90%)
250mL
SPC60℃烘干
真空抽虑
恒温振荡器
30min
乙醇旋转蒸发仪
液体
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新工艺
3.1 不同处理对大豆浓缩蛋白中粗蛋白含量的影响
大豆浓缩蛋白的提取过程是利用乙醇将豆粕中醇溶性物质如低聚糖、大豆胰蛋白酶抑制素、大豆皂甙、异黄酮以及酚酸类物质移除的过程[8]。本试验所得大豆浓缩蛋白的粗蛋白含量最高可达58.77%（干重），而市售商品大豆浓缩蛋白的粗蛋白含量在一般70%（8%左右水分）左右，二者存在较大差异。这主要是由两个原因导致的：提取原料及粉碎粒度。本试验所用的提取原料为高温脱脂豆粕，高温脱脂豆粕生产中经历高温过程，蛋白质在高温下会跟还原糖发生美拉德反应，使得醇洗过程中有部分还原糖被保留下来，从而降低了大豆浓缩蛋白中粗蛋白的
含量；本试验中，40目、60目及80目粉碎粒度的大豆浓缩蛋白粗蛋白含量分别为51.63%、53.50%和54.32%，而刘玉兰用100目高温豆粕提取的大豆浓缩蛋
表1 试验所用豆粕的基本成分含量
水分含量（%）粗蛋白含量（%，干重）粗纤维含量（%，干重）
[6]
白，其粗蛋白含量达到了59.64％（干重），说明不同的
粉碎粒度对大豆浓缩蛋白粗蛋白含量有显著影响。粉碎粒度越大，蛋白质与还原糖的结合物被破环的概率越大，因此有更多的低聚糖溶解于乙醇中，从而提高了大豆浓缩蛋白中粗蛋白的含量。
超声波是功率在20kHz以上的声波，具有波动和能量二属性。这二属性对豆粕具有空化作用，对大豆蛋白具有变性作用。经过超声波处理之后的豆粕，其细胞破碎变散，细胞壁被击穿形成空洞[9]。细胞壁破碎后增大了细胞内容物与溶剂接触的面积，使得更多的醇溶性物质溶解与乙醇，从而提高了大豆浓缩蛋白中粗蛋白含量。超声波使得大豆蛋白变性，那么原来大豆蛋白中的醇溶蛋白将不再溶于乙醇，这也提高了大豆浓缩蛋白中粗蛋白的含量。而且超声波在一定程度上能使美拉德反应的产物破碎，从而提高大豆浓缩蛋白中粗蛋白的含量。
3.2 不同处理对大豆浓缩蛋白提取率的影响
从本试验的结果来看，粉碎40目及60目对大豆浓缩蛋白提取率有下降趋势，但差异并不显著，80目粉碎粒度大豆浓缩蛋白的提取率显著低于40目及60目粉碎粒度，说明随着粉碎粒度的缩小，大豆浓缩蛋白的提取率在下降。粉碎粒度越小，细胞壁及蛋白质还原糖结合物破碎的概率更大，会释放出更多的醇溶性蛋白及糖类，从而影响大豆浓缩蛋白的提取率。由本试验的结果来看，在相同的粉碎粒度下，超声波处理并不能影响大豆浓缩蛋白的提取率，说明粉碎粒度对大豆浓缩蛋白提取率的影响要大于超声波处理。
超声波处理组的第一次浸提所用的浸提液体积要高于普通处理组，可能对大豆浓缩蛋白的提取率产生一定影响；本试验中所用的超声波为高频超声，而杨晓泉等研究发现低频超声波也能提高脱脂豆粕的大豆分离蛋白的浸出率[2]，但是对大豆浓缩蛋白浸出率是否有影响尚未有研究；此外，本试验中所用豆粕的粗纤维含量较低，如果采用粗纤维含量在3.5%的高温脱脂豆粕为原料，大豆浓缩蛋白的提取率可能更高，这些问题都有待于后续研究。
豆粕9.82±0.0946.62±0.172.95±0.01
表2 不同处理对大豆浓缩蛋白粗蛋白含量的影响
不同粉碎粒度普通处理组超声波处理组
40目（%，干重）51.63±0.6853.44±0.6160目（%，干重）
53.50±0.14A55.11±0.45B80目（%，干重）54.32±1.34A58.77±0.40B
注：同行上标小写字母不同，表示二者之间有显著性差异（P＜0.05），大写字母表示二者之间有极显著性差异（P＜0.01）。
表3 不同处理对大豆浓缩蛋白提取率影响
不同处理组SPC提取率（%，干重）
40目普通处理组97.65±1.31a60目普通处理组97.51±0.26a80目普通处理组
95.80±0.61b40目超声波处理组97.50±1.14a60目超声波处理组96.78±0.81ab80目超声波处理组95.65±0.67b
注：同列上标小写字母不同表示二者之间差异显著（P＜0.05）。
C
CBA
A
B
4 结论
不同的粉碎粒度对大豆浓缩蛋白中粗蛋白的含量及提取率有显著影响，粒度越小，粗蛋白含量越高，提取率越低；在相同的粉碎粒度下，超声波处理能提高大豆浓缩蛋白中粗蛋白的含量，但是对大豆浓缩蛋白的提取
普通处理组超声处理组
率无显著影响。
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粗蛋白测定方法—凯式定氮法 粗蛋白crude protein；crude matter（DM）食品、饲料中一种蛋白质含量的度量。不仅包括蛋白质这一物质，它涵盖的范围更广，包括含氮的全部物质，及真蛋白质和含氮物（氮化物）。换句话说，粗蛋白是食品、饲料中含氮化合物的总称，食物中以大豆的粗蛋白含量最高，肉类次之。所以说，粗蛋白是一种既包括真蛋白又包括非蛋白的含氮化合物，后者又可能包括游离氨基酸、尿素、硝酸盐和氨等。然而，不同蛋白质的氨基酸组成不同，其氮含量不同，总氮量换算成蛋白质的系数也不同。总之，粗蛋白是食品、饲料中一种蛋白质含量的度量。我们可以通过粗蛋白测定仪即凯氏定氮仪来测量粗蛋白的含量，测量步骤如：蛋白质含氮量约为16%（这已通过多次试验得出），再用凯氏法测出总氮量，再乘以 6.25就可求得粗蛋白的含量。 一、实验原理 蛋白质是由碳、氢、氧、氮及少量硫元素组成。这些元素在蛋白质中含量都有一定比例关系，其中含碳50～55%、氢6～8%、氧20～23%、氮15～17%和硫0.3～2.5%。此外在某些蛋白质中还含有微量的磷、铁、锌、铜和钼等元素。 由于氮元素是蛋白质区别于糖和脂肪的特征，而且绝大多数蛋白质的氮元素含量相当接近，一般恒定在15～17%，平均值为16%左右，因此在蛋白质的定量分析中，每测得1克氮就相当于6.25克蛋白质。所以只要测定出生物样品中的含氮量，再乘以6.25，就可以计算出样品中的蛋白质含量。含氮有机物与浓硫酸共热，被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，氮进一步与硫酸作用生成硫酸铵。由大分子分解成小分子的过程通常称为”消化”。为了加速消化，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高消化液的沸点(290℃→400℃)，加入硫酸铜作为催化剂，过氧化氢作为氧化剂，以促进反应的进行。反应(1)(2)在凯氏烧瓶内完成，反应(3)在凯氏蒸馏装置中进行，其特点是将蒸汽发生器、蒸馏器及冷凝器三个部分融为一体。由于蒸汽发生器体积小，节省能源，本仪器使用方便，效果良好。硫酸铵与浓碱作用可游离出氨，借水蒸气将产生的氨蒸馏到一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中的H+浓度降低，然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来H
粗蛋白测定方法一凯式定氮法 粗蛋白crude protein ；crude matter (DM)食品、饲料中一种蛋白质含量 的度量。不仅包括蛋白质这一物质，它涵盖的范围更广，包括含氮的全部物质，及真蛋白质和含氮物(氮化物)。换句话说，粗蛋白是食品、饲料中含氮化合物的总称，食物中以大豆的粗蛋白含量最高，肉类次之。所以说，粗蛋白是一种既包括真蛋白又包括非蛋白的含氮化合物，后者又可能包括游离氨基酸、尿素、硝酸盐和氨等。然而，不同蛋白质的氨基酸组成不同，其氮含量不同，总氮量换算成蛋白质的系数也不同。总之，粗蛋白是食品、饲料中一种蛋白质含量的度量。我们可以通过粗蛋白测定仪即凯氏定氮仪来测量粗蛋白的含量，测量步骤如：蛋白质含氮量约为16% (这已通过多次试验得出)，再用凯氏法测 出总氮量，再乘以就可求得粗蛋白的含量。 一、实验原理 蛋白质是由碳、氢、氧、氮及少量硫元素组成。这些元素在蛋白质中含量 都有一定比例关系，其中含碳50?55%、氢6?8%、氧20?23%、氮15?17% 和硫?％。此外在某些蛋白质中还含有微量的磷、铁、锌、铜和钼等元素。 由于氮元素是蛋白质区别于糖和脂肪的特征，而且绝大多数蛋白质的氮元素含量相当接近，一般恒定在15?17%，平均值为16%左右，因此在蛋白质的定量分析中，每测得1克氮就相当于克蛋白质。所以只要测定出生物样品中的含氮量，再乘以，就可以计算出样品中的蛋白质含量。含氮有机物与浓硫酸共热，被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，氮进一步与硫酸作用生成硫酸铵。 由大分子分解成小分子的过程通常称为”肖化”为了加速消化，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高消化液的沸点(290C-400C )，加入硫酸铜作为催化剂，过氧化氢作为氧化剂，以促进反应的进行。反应(1)(2)在凯氏烧瓶内完成，反应(3) 在凯氏蒸馏装置中进行，其特点是将蒸汽发生器、蒸馏器及冷凝器三个部分融为一体。由于蒸汽发生器体积小，节省能源，本仪器使用方便，效果良好。 硫酸铵与浓碱作用可游离出氨，借水蒸气将产生的氨蒸馏到一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中的度降低，然后用标准无机酸滴定，直至恢 复溶液中原来H+浓度为止，最后根据所用标准酸的量计算出待测物中总氮量。 二、仪器和试剂
大豆分离蛋白的提取 ——紫苏 摘要：本文综述述了大豆分离蛋白的碱提酸沉法、双极膜法、泡沫分离法的分离原理，并讨论了其生产中影响提取率的因素。 关键词：大豆分离蛋白碱提酸沉法双极膜法泡沫分离法 大豆蛋白含量较高而且营养丰富，含有8种人体必需氨基酸，且比例比较合理。目前大豆蛋白已成为一种重要的蛋白资源，特别是大豆分离蛋白含蛋白质90%以上，是一种优良的食品原料。 目前大豆分离蛋白的生产应用较多的是以下几种： 1. 碱提酸沉法 大豆分离蛋白的传统提取方法是碱提酸沉法，主要利用大豆蛋白在大豆蛋白在高pH时溶解度最大，在等电ｐＨ条件下溶解度最小的原理，使之凝聚沉淀。一般分3个步骤：弱碱萃取蛋白质、酸沉淀、喷雾干燥。如图[1] 影响等电沉淀的因素较多： ①原料——原料豆粕应是低温或闪蒸脱脂后的低变性豆粕。这种豆粕含杂质少，蛋白含量较高，蛋白变性程度低，适于大豆分离蛋白生产[2]。 ②水分——浸提时，加水量越多，蛋白质的提取率就越高；但是加水太多，酸沉时蛋白的损失量增高；加水太少，大豆蛋白的溶出率大大下降，还会增加后续各工序的难度。试验得出,浸提时脱脂豆粕与水的比例为1∶10~12最适合提取[3]。 ③pH——蛋白质的溶解度与浸提pH有很大的关系，pH太低的时候，蛋白组分解离; pH 太高，易发生“胱赖反应”，生成有毒物质。 ④温度——温度的高低对蛋白收率、纯度及色泽有显著影响。浸提温度过高，会使蛋白变性，而且粘度增加，分离困难，耗能提高[4]。经试验认为等电酸沉温度控制在40~45℃为宜[1]。 ⑤时间——一般来说浸提时间越长，蛋白的溶出率就越高。但一定的时间后，蛋白得率随浸提时间的延长而无显著的变化。生产中要综合考虑能源消耗、生产周期、工艺成本等各种因素来确定合理的时间[4]。 ⑥另外，当浆料粒度太细反而会使蛋白得率和浸提效果下降，同时增加了过滤分离的难度。加酸速度和搅拌速度控制不好容易出现虽到等电点,但蛋白质凝集下沉缓慢,上清液混浊[1]。 ⒉双极膜电解法 双极性膜是一种新型离子交换复合膜,它通常由阳离子交换层和阴离子交换层复合而成,中 间是亲水界面层,结构如图1所示[5]： 双极膜由3层组成：阴离子交换膜和阳离子交换膜以及阴阳离子交换膜中间的亲水层。在电流作用下，水分子在双极膜上电离为H+和OH-，离子在电势的驱动下，通过膜选择透过阴离子或阳离子，导致溶液的pH值降低，达到大豆蛋白质的等电点而使蛋白质沉淀。这种方法不需要加入酸或碱调整蛋白质溶液的pH值，避免分离得到的大豆蛋白质中混入盐离子，并且可保护大豆蛋白质的功能性。[3]
粗蛋白测定方法 什么是粗蛋白，粗蛋白跟蛋白质又有什么区别，如何测量饲料中粗蛋白的含量，粗蛋白的含量高是不是一定代表着蛋白质的含量高。我想，当你看到这个题目时，肯定会联想到这一连串的问题中的其中几个。那么接下来，我就来详细介绍下粗蛋白的概念、粗蛋白测量 和其他关于饲料中粗蛋白含量的问题。 粗蛋白概念： 粗蛋白不仅包括蛋白质这一物质，它涵盖的范围更广，包括含氮的全部物质。包括真蛋白质和含氮物(氨化物)。食物中粗蛋白含量以大豆最高,肉类次之。粗蛋白英文为crude protein。粗蛋白是食品、饲料中一种蛋白质含量的度量。由于一般蛋白质中含氮量约为16%，故在概略分析中，常用凯氏(Kjeldahl)法测出总氮量，再乘以系数6.25来求得。实际上，它是食品、饲料中含氮化合物的总称，既包括真蛋白又包括非蛋白含氮化合物，后者又可能包括游离氨基酸、嘌呤、吡啶、尿素、硝酸盐和氨等。此外，不同蛋白质的氨基酸组成不同，其氮含量不同，总氮量换算成蛋白质的系数也不同，如小麦和多数谷物的换算系数为5.80，水稻5.95，大豆5.7，多数食用豆和坚果5.3，牛奶6.38等。粗蛋白只是一个粗 略的概念。 粗蛋白含量： 下面我介绍几种常见物质的粗蛋白含量，仅供大家参考。 薏苡仁粗蛋白含量：13%-14% 棉粕粗蛋白含量：可达40%以上 农大白早糯玉米粗蛋白含量：3.41% 蠡玉168 粗蛋白含量：9.63％ 台湾大青枣粗蛋白含量：0.86% 上文介绍了几种农产品或水果的粗蛋白含量情况，如果需要更多的资料，大 家可自己查阅。 粗蛋白测定： 方法一：最简便也是最快键的方法，就是用蛋白质测定仪来测量。 本标准参照采用ISO 5983—1979 《动物饲料──氮含量的测定和粗蛋白含量 计算》。 1 主题内容与适用范围 本标准规定了饲料中粗蛋白含量的测定方法。 本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和单一饲料。 2 引用标准 GB 601 化学试剂滴定分析（容量分析）用标准溶液的制备
大豆蛋白提取技术研究进展 系别：食品工程系 专业：食品科学与工程 班级：食科13-2班 学号：242013002003 姓名：陈亚林
摘要 大豆蛋白产品分为三类，即大豆蛋白粉、大豆浓缩蛋白和大豆分离蛋白。大豆分离蛋白含有人体所必需的八种氨基酸,不含胆固醇，具有许多优良的食品性能，添加在食品中可以改善食品的品质和性能，提高食品营养价值。是一种重要的植物蛋白,在食品工业中得到了广泛的应用,是近年来的研究重点。其中,大豆浓缩蛋白的提取方法有稀酸浸提法、酒精浸提法和湿热浸提法。大豆分离蛋白有碱溶酸沉法、离子交换法、超滤膜分离法等。本文以研究方向和工艺改进方面为着力点解释大豆浓缩蛋白和分离蛋白这两种主要的提取方法的发展脉络。 关键词 大豆浓缩蛋白；大豆分离蛋白；稀酸浸提法；酒精浸提法；碱溶酸沉法；离子交换法；超过滤法；湿热浸提法 大豆分离蛋白（soy protein isolate,SPI）是把脱皮大豆中的除蛋白质以外的可能性物质和纤维素、半纤维素物质都除掉，得到的蛋白质含量不低于 90%的制品，又称等电点蛋白。与大豆浓缩蛋白相比，生产大豆分离蛋白不仅要从低温脱溶豆粕中除去低分子可溶性糖等成分，而且还要去除不溶性纤维素、半纤维素等成分。其生产方法主要有碱溶酸沉法、超过滤法和离子交换法。 一、碱溶酸沉法 1.提取原理低温豆粕中的蛋白质大部分能溶于稀碱溶液。将低温豆粕用稀碱溶液浸提后，用离心分离法除去原料中的不溶性物质，然后用酸把浸出物的PH调至4.5左右，蛋白质由于处于等电点状态而凝聚沉淀，经分离可得到蛋白质沉淀，再经洗涤、中和、干燥得到大豆分离蛋白。 2.提取工艺豆粕的质量直接影响大豆分离蛋白的功能特性和提取率，只有高质量的豆粕才能获得高质量和高得率的大豆分离。要求原料无霉变，豆皮含量低，残留溶剂少，蛋白质含量高（45%以上），脂肪含量低，NSI高（不低于80%）。豆粕粉碎后过40-60目筛。 首先利用弱碱溶液浸泡低温豆粕，使可溶性蛋白质、糖类等溶解出来，利用离心机除去溶液中不溶性的纤维素和残渣。在已溶解的蛋白质溶液中加入适量的酸液，调节溶液的PH达到4.5，使大部分蛋白质从溶液中沉析出来，这时只有大约10%的少量蛋白质人仍留在溶液中，这部分溶液称为乳清。乳清中除含有少量蛋白质外，还含有可溶性糖、灰分和其他微量成分，然后将用酸沉析出的蛋白质凝聚体进行搅动、水洗、送入中和罐，加碱中和溶解成溶液状态。将蛋白质溶液调节到合适浓度，由高压泵送入加热器经闪蒸器快速灭菌后，再送入喷雾干燥塔脱水，制成大豆分离蛋白。
实验二饲料粗蛋白的测定 一、实验目的 通过饲料样品中粗蛋白质的测定，让学生了解了解凯氏定氮法测定的基本原理，掌握半微量凯氏定氮法测定饲料粗蛋白质的方法，掌握粗蛋白质含量的计算方法。 二、实验原理 各种饲料的有机物质在还原性催化剂(如CuSO4，K2SO4或Na2SO4或Se粉)的帮助下，用浓硫酸进行消化作用，使蛋白质和其它有机态氮（在一定处理下也包括硝酸态氨）都转变成NH4+并与H2SO4化合成（NH4）2SO4，而非含氮物质，则以CO2 ↑，H2O↑，SO2↑状态逸出。消化液在浓碱的作用下进行蒸馏，释放出的铵态氮，用硼酸溶液吸收之并与之结合成为四硼酸铵，然后以甲基红溴甲酚绿作指示剂，用HCl标准溶液（0.1mol/L）滴定，求出氮的含量，根据不同的饲料再乘以一定的系数（通常用6.25系数计算），即为粗蛋白质的含量。 其主要化学反应如下： 1、2NH4（CH2）2COOH+13H2SO4→（NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2（丙氨酸） 2、（NH4）2SO4 +2NaOH→2NH 3+3H2O+2Na2SO4 3、4H3BO3+ NH 3→NH4HB4O7+5H2O 4、NH4HB4O7+HCl+5H2O→NH4C1+4H3BO3 本法不能区别蛋白氮和非蛋白氮，只能部分回收硝酸盐和亚硝酸盐等含氮化合物。在测定结果中除蛋白质外，还有氨基酸、酰胺，铵盐和部分硝酸盐、亚硝酸盐等，故以粗蛋白质表示之。 三、实验设备 1、实验室用样品粉碎机或研钵； 2、分析筛：孔径0.45mm(40目)； 3、分析天平：感量0.0001g； 4、消煮炉或电炉； 5、滴定管：酸式，25或50ml； 6、凯式烧瓶：100或500m1； 7、凯氏蔗馏装置：常量直接蒸馏式或半微量水蒸气蒸馏式； 8、锥形瓶，150或250m1； 9、容量瓶：100ml。 三、实验内容
分析化学 结课作业 常见蛋白质测定方法的总结与比较 材料科学与技术学院 林化13-1班 刘旺衢 130534106
常见蛋白质测定方法的总结与比较 刘旺衢 （北京林业大学材料科学与技术学院林化13-1班 130534106，10083） 蛋白质是构成生物体细胞组织的重要成分。食物中的蛋白质是人体中氮的唯一来源。具有糖类和脂肪不可替代的作用。蛋白质与营养代谢、细胞结构、酶、激素、病毒、免疫、物质运转、遗传等密切相关,是对人类最重要的物质之一。准确精密的测定蛋白质，关乎人类的生产、生活、生存。目前测定蛋白质含量的方法有多种,如凯氏定氮法、紫外吸收法、双缩脲法、考马斯亮蓝染色法、酚试剂法等几种方法,下面本文将总结比较这五种蛋白质的测定方法。 一、凯氏定氮法 凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收，再以标准酸滴定，就可计算出样品中的氮量。由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。蛋白质是含氮的有机化合物。蛋白质与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数计算蛋白质含量，即含氮量*6.25=蛋白含量。 凯氏定氮法具有灵敏度高, 样品用量少，最低可检出0.05mg氮；精密度、准确度高,平行误差一般小于0.5%；应用范围广,适用于一切形态的食品与生物样品；仪器装置简单,试剂廉价的优点。 但也存在操作比较繁琐费时,特别是蒸馏定氮过程的效率低,不利于大批样品的测定；定氮的结果既包括有机氮,也包括无机氮,有机氮中除蛋白氮外,还包括非蛋白氮,测定的结果只能是粗蛋白质的含量；在蛋白质氨基酸构成有差异的
蛋白质的测定方法 1、原理 蛋白质是含氮有机化合物，与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵，然后在碱性条件下蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量再乘以换算系数，即位蛋白质含量。 2、试剂 2.1、硫酸铜 2.2、硫酸钾 2.3、硫酸 2.4、2%硼酸溶液 2.5、混合指示剂：1份0.1%的甲基红与3份0.1%溴甲酚绿混合。 2.6、30%氢氧化钠溶液。 2.7、0.1M 盐酸标准溶液。 3、操作步骤 3.1、样品处理：称取0.1g-0.15g 固体样品置于消化管内再加入0.2g 硫酸铜，3g 硫酸钾及10ml 硫酸，然后放入消化装置中设定温度430℃，消化3h 。 3.2、打开蒸馏装置的电源，开启作为冷凝水的自来水龙头。 3.3、将消化好的消化管置于蒸馏装置的托盘上，落下安全门。 3.4、仪器开启后，按“设定”键光标显示在“换算系数”栏目中输入需要换算的数值6.25。 3.5、按“↑”键将光标移入“碱量”栏目中，输入需要的碱量体积50ml 。 3.6、按“↑”键将光标移入“吸收液量”栏目中，输入需要的吸收液量的体积30ml 。 3.7、按“↑”键将光标移入“样品量”栏目中，输入需要的样品量质量。 3.8、按“↑”键将光标移入“样品编号”栏目中，输入样品编号。 3.9、按“RUN ”键开始蒸馏工作，同时保存设定的参数。 4.0、滴定至终点时，仪器自动停止蒸馏。 4.1、按“保存”键返回主界面，再按“数据键”进去查看数据，选择要查看的样品编号，按“确定”键查看结果。 4、结果 ()00.014 6.25100HCl V V C M -???=?粗蛋白含量（%） V －样品消耗盐酸标准溶液的体积，单位ml ； V 0－试剂空白消耗盐酸标准溶液的体积，单位ml ； M －样品质量，单位g ； 0.014－盐酸标准溶液1ml 相当于氮克数； 6.25－氮换算成蛋白质的平均系数；
粗蛋白含量的测定（凯氏定氮法） I.试剂 1. CuSO4·5H2O 2.K2SO4 3.H2SO4 4.硼酸（20g/L） 5.NaOH溶液（40g/L） 6.标准H2SO4/HCl（0.05mol/L） 7.甲基红指示剂（0.1g甲基红溶于100mL95%乙醇），溴甲酚绿指示剂（0.1g溴 甲酚绿溶于100mL95%乙醇），临用前1∶5(V/V)混合。 II．供试样品的制备 称取0.20-2.00g固体试样或2.00 g-5.00半固体试样或吸取10.00m L-25.00m L液体试样(约相当氮30mg-40mg)，移人干燥的100mL或500mL定氮瓶中，加人0.2g 硫酸铜,6g硫酸钾及20mL硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45“角斜支于有小孔的石棉网上。小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5 h-1h。取下放冷，小心加入20mL水。放冷后，移入100mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并人容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。同时做试剂空白试验。 III．测定 按图安装定氮装置。 1--电炉; 2--水蒸气发生器(2L平底烧瓶); 3--螺旋夹;
4--小漏斗及棒状玻塞; 5--反应室; 6--反应室外层; 7--橡皮管及螺旋夹; 8--冷凝管; 9--蒸馏液接收瓶 于水蒸气发生瓶内装水至三分之二处，加人数粒玻璃珠，加甲基红指示液数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，用调压器控制，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。 IV．向接收瓶内加入10mL硼酸溶液(20g/L)及1-2滴混合指示液，并使冷凝管的下端插入液面下，准确吸取10mL试样处理液由小漏斗流入反应室，并以10mL 水洗涤小烧杯使流入反应室内，棒状玻塞塞紧将10mL氢氧化钠溶液(400g/L)倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应室，立即将玻塞盖紧，并加水于小玻杯以防漏气。夹紧螺旋夹，开始蒸馏。蒸馏5min。移动接收瓶，液面离开冷凝管下端，再蒸馏1min。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部。取下接收瓶。以硫酸或盐酸标准滴定溶液(0.05mol/L)滴定至灰色或蓝紫色为终点。同时准确吸取10mL 试剂空白消化液按IV操作。 V．结果计算 式中： X--试样中蛋白质的含量，单位为克每百克或克每百毫升(g/100g 或g/100m L)；V1--试样消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，单位为毫升(mL)； V2--试剂空白消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，单位为毫升(mL)； c--硫酸或盐酸标准滴定溶液浓度，单位为摩尔每升(mol/L)； 0.0140--1.0mL硫酸[c(1/2H2SO4)=1.000mol/L]或盐酸[c(HCI)=1.000mol/L]标准滴 定溶液相当的氮的质量，单位为克(g)； m--试样的质量或体积，单位为克或毫升(g或mL)； F--氮换算为蛋白质的系数。 计算结果保留三位有效数字。 参考GB/T5009.5-2003
饲料粗蛋白测定的测定方法 Method for the determination of crude protein in feedstuffs 本标准参照采用ISO5983-1979《动物饲料-氮含量的测定和粗蛋白含量计算》。 1 主题内容与适用范围 本标准规定了饲料中粗蛋白含量的测定方法。 本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和单一饲料。 2 引用标准 GB 601 化学试剂滴定分析（容量分析）用标准溶液的制备 3 原理 凯氏法测定试样中的含氮量，即在催化剂作用下，用硫酸破坏有机物，使含氮物转化成硫酸铵。加入强碱进行蒸馏使氨逸出，用硼酸吸收液吸收后，再用酸滴定。测出氮含量，将结果乘以换算系数6.25，计算出粗蛋白的含量。 4 试剂 4.1硫酸（GB625）:化学纯，含量为98%，无氮。 4.2混合催化剂 0.4g 硫酸铜，5个结晶水（GB665），6g 硫酸钾（HG3-920）或硫酸钠（HG3-908），均为化学纯，磨碎混匀。 4.3 氢氧化钠（GB629）：化学纯，40%水溶液（M/V）。 4.4硼酸（GB628），化学纯，2%水溶液（M/V）。 4.5混合指示剂溶液 甲基红（HG3-958）0.1%乙醇溶液，溴甲酚绿（HG3-1220）0.5%乙醇溶液，两溶液等体积混合，在阴凉处保存期为三个月。 4.6盐酸标准溶液，c(HCl)=0.1mol/L、0.02mol/L 配制如下： 移取8.3mL 盐酸(分析纯)，于1000mL 容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀。此溶液为c(HCl)=0.1mol/L。 移取1.67mL 盐酸(分析纯)，于1000mL 容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀。此溶液为c(HCl)=0.02mol/L。 4.7蔗糖，分析纯。 4.8硫酸铵，分析纯，干燥。 4.9硼酸吸收液 1%硼酸水溶液1000mL，加入0.1%溴甲酚绿乙醇溶液10mL，0.1% 甲基红乙醇溶液7mL，4%氢氧化钠水溶液0.5mL，混合，置阴凉处保存期为一个月(全自动程序用)。
饲料粗蛋白测定方法 1适用范围 本标准适用于配合饲料和单一饲料。 2原理 凯氏法测定试样含氮量，即在催化剂上，用硫酸破坏有机物，使含氮物转化成硫酸铵。加入强碱并蒸馏使氨逸出，用硼酸吸收后，用酸滴定测出氮含量，乘以氮与蛋白质的换算系数6.25计算粗蛋白质量。 此法不能区别蛋白氮和非蛋白氮，只能部分回收硝酸盐和亚硝酸盐等含氮化合物。 3仪器设备 ①实验室用样品粉碎机或研钵。②分析筛：孔径0.45mm(40目)。③分析天平：感量0.0001g。④消煮炉或电炉。⑤滴定管：酸式，25或10ml。⑥凯氏烧瓶：100或500ml。⑦凯氏蒸留装置：常量直接蒸馏式或半微量水蒸汽蒸馏式。⑧锥形瓶：150或250ml。⑨容量瓶：100ml。 4试剂 ①硫酸(GB 625—77)：化学纯。②硫酸铜(GB 665—78)：化学纯。③硫酸钾(HG 3-920-76)：化学纯或硫酸钠(HG 3-908-76)：化学纯。④氢氧化钠(GB 629-77)：化学纯,40 g溶成100 IIll配成40％水溶液(W／V)。⑤硼酸(GB628-78)：分析纯，2 g溶于100ml水配成2％溶液(W／V)。⑥混合指示剂：甲基红(HG 3-958-76)0.1％乙醇溶液，溴甲酚绿(HG 3—1220-79)0.5％乙醇溶液，两溶液等体积混合，阴凉处保存期1个月以内。⑦0.05N盐酸标准溶液(邻苯二甲酸氢钾法标定)：4.2ml 盐酸(GB 622—77)，分析纯，注入l 000 rm蒸留水中。⑧蔗糖(HG 3—1001—76)：分析纯。⑨硫酸铵(GB 1396-78)：分析纯。 5试样的选取和制备 取具有代表性试样，粉碎至40目，用四分法缩减至200g，装于密封容器中，防止试样成分的变化或变质。 液体或膏状粘液试样应注意取样的代表性。用干净的、可放入凯氏烧瓶的小玻璃容器称样。 6测定步骤
饲料中粗蛋白测定方法 1、原理 凯氏法测定试样中的含氮量，即在催化剂作用下，用硫酸破坏有机物，使含氮物转化成硫酸铵。加入强碱进行蒸馏使氨逸出，用硼酸吸收后，再用酸滴定，测出氮含量，将结果乘以换算系数 6.25，计算出粗蛋白含量。 2、试剂 2.1 硫酸（ GB 625）：化学纯，含量为 98％，无氮。 2.2混合催化剂：0.4g硫酸铜，5个结晶水（GB 665）,6g硫酸钾（HG 3 —920）或硫酸钠（ HG 3—908），均为化学纯，磨碎混匀。 2.3 氢氧化钠（ GB 629）：化学纯， 40％水溶液（ m/V）。 2.4 硼酸（ GB 628）：化学纯， 2％水溶液（ m/V）。 2.5 混合指示剂：甲基红（HG 3—958）0.1％乙醇溶液，溴甲酚绿（HG 3—1220） 0.5％乙醇溶液，两溶液等体积混合，在阴凉处保存 期为三个月。 2.6 盐酸标准溶液：邻苯二甲酸氢钾法标定，按 GB 601制备。 2.6.1 盐酸标准溶液：c （HCl） =0.1mol/L。8.3mL 盐酸（GB 622,分析纯），注入 1 000mL 蒸馏水中。 2.6.2 盐酸标准溶液：c（HCl）=0.02mol/L。1.67mL 盐酸（GB 622, 分析纯），注入 1 000mL 蒸馏水中。
2.7 蔗糖（ HG 3—1001）：分析纯。 2.8 硫酸铵（ GB 1396）：分析纯,干燥。 2.9硼酸吸收液：1%硼酸水溶液1 OOOmL,加入0.1%溴甲酚绿乙醇溶液10mL， 0.1％甲基红乙醇溶液 7mL， 4％氢氧化钠水溶液 0.5mL，混合，置阴凉处保存期为一个月（全自动程序用）。 3、仪器设备 3.1 实验室用样品粉碎机或研钵。 3.2分样筛：孔径0.45mm （40目）。 3.3 分析天平：感量 0.0001g。 3.4 消煮炉或电炉。 3.5 滴定管：酸式， 10、25mL。 3.6 凯氏烧瓶： 250mL。 3.7 凯氏蒸馏装置：半微量水蒸气蒸馏式。 3.8 锥形瓶： 150、250mL。 3.9 容量瓶： 100mL。 3.10 消煮管： 250mL。 3.11 定氮仪：以凯氏原理制造的各类型半自动。 4、试样的选取和制备 选取具有代表性的试样用四分法缩减至200g,粉碎后全部通过 40目筛，装于密封容器中，防止试样成分的变化。
实验一大豆分离蛋白的提取 1．实验目的 学习掌握大豆分离蛋白的碱提酸沉法。 2．分离原理： 大豆分离蛋白的制取方法，按工艺特点主要有三种：第一种是碱提酸沉法；第二种是离子交换法；第三种是超滤法。 碱提酸沉法生产大豆分离蛋白的原理，是将脱脂大豆内的蛋白质溶解在稀碱溶液中，分离除去豆粕中的不溶物，然后用酸将大豆蛋白质提取液的pH值调至大豆蛋白的等电点，使大豆蛋白质沉淀析出，再经分离清洗，回调pH，得到粉状大豆分离蛋白。 3. 试剂材料：豆粕，5%NaOH，2N HCl（17ml浓盐酸，缓慢用水稀释至100ml）。 4. 提取方法： 将2g大豆磨碎，得到可通过80目筛的豆粕。用重量10倍于豆粕的蒸馏水与脱脂豆粉混合，用5%NaOH 水溶液将豆粉悬浮液的pH调节到8.5，室温或40℃搅拌1.5h。然后将提取液离心除渣4000rpm×15min，得上清液。用2N的HCl将上清液的pH值调到4.5，同时轻度搅拌均匀，可见开始出现沉淀，室温静置30min，然后以4000rpm×15min离心，用蒸馏水清洗沉淀2次，将蛋白沉淀物溶于20 ml水中，并调节pH到7.0，考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度，计算蛋白提取率。 5. 产品测定指标： （1）可溶性蛋白质的浓度：采用考马斯亮蓝法。 （2）蛋白质的提取率计算公式： 可溶蛋白质的浓度(ug/ml) ×稀释度×体积(ml) 提取率（%）＝×100% 原料质量(g) ×106 （附）考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度 一、实验目的 掌握考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度的原理和方法，掌握离心机和移液器的正确使用方法。 二、实验原理 考马斯亮蓝G-250是一种甲基取代的三苯基甲烷，在465nm处有最大吸收值。考马斯亮蓝G-250能与蛋白质通过范得华相互作用形成蛋白质-考马斯亮蓝复合物蓝色溶液，引起该染料的最大吸收λmax的位置发生转移，在595nm处有最大吸收值。在一定范围内(蛋白质浓度范围为0～1000μg／mL)，蛋白质-考马斯亮蓝复合物溶液颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。 该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还 高4倍，可测定微克级蛋白质含量，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。 三、实验试剂 1．标准蛋白液：准确称取100mg牛血清白蛋白，用蒸馏水溶解并定容至1000ml，制成100μg /ml 的原液。 2．考马斯亮蓝G250试剂：准确称取100mg考马斯亮蓝G250，溶于50ml 90％～95％乙醇中，再加入85%磷酸（m/v）100ml，用蒸馏水定容至1000ml。常温下可放置1个月。 四、操作步骤 1．标准曲线的制备 取7支具塞试管，按下表进行编号并加入试剂。以第1管为空白，于波长595nm处比色，读取吸光度，以吸光度为纵坐标，各标准液浓度(μg／mL)作为横坐标作图得标准曲线。
中华人民共和国专业标准中华人民共和国专业标准 全氮和粗蛋白测定法 Determination of total nitrogen and ZB X 66026-87 crude protein ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 本方法适用于酿造酱油的原料、半成品、副产品的全氮、粗蛋白测定。 1 仪器 a. 分析天平:感量0.1mg; b. 凯氏烧瓶; c. 铁架、铁圈、石棉网; d. 煤气灯(或电炉); e. 干燥管、抽气管、橡皮管; f. 氮气球、冷凝管、锥形瓶; g. 粉碎机等。 2 试剂与溶液 2.1 甲基红-溴甲酚绿混合指示剂 甲基红40mg,溴甲酚绿1g,溶于60mL95%乙醇中。 2.2 硫酸铜-硫酸钾混合试剂 硫酸铜: 硫酸钾= 6∶100 (硫酸铜和硫酸钾都为分析纯)。 2.3 玻璃珠(φ3mm)或锌粒。 2.4 4%硼酸溶液 称取化学纯硼酸4g,用蒸馏水溶解后定容至100mL。
2.5 浓硫酸(分析纯) 2.6 40%氢氧化钠溶液 称取化学纯氢氧化钠40g,加蒸馏水溶解,定容至100mL。 2.7 0.1N盐酸标准溶液 量取分析纯盐酸9mL,加蒸馏水稀释至1000mL。 2.7.1 用无水碳酸钠标定:准确称取无水碳酸钠(预先在180℃的烘箱中烘至恒重)3份, 每份重约0.17g,称准至0.0002g。分别置于150mL锥形瓶中,各加已煮沸过蒸馏水30mL, 温热摇动,使之溶解。再各加甲基红-溴甲酚绿混合指示剂2 滴,然后用待标定的盐酸 溶液滴定,直至溶液刚呈暗红色为终点,记下耗用毫升数(V)。 计算:盐酸标准溶液的当量浓度N 按下式计算 G N = ━━━━━━ (3) V ×0.05299 式中:N——盐酸标准溶液的当量浓度; G——无水碳酸钠之重量,g; V——盐酸溶液之用量,mL; 0.05299——每毫克当量Na2CO3之重量,g。 2.7.2 用已知当量浓度的氢氧化钠标定:准确吸取25mL需要标定的盐酸溶液于150mL锥形瓶中,加酚酞指示剂2滴,用0.1N氢氧化钠标准溶液滴至微红色,在30s内不退色为终点。记下耗用mL数。 计算: N NaOH×V NaOH
生化自主实验 一、大豆蛋白的提取 目的要求 1、掌握大豆蛋白的提取原理和方法 2 、计算粗提产率 2、学习计算蛋白质收率 实验原理 大豆中含有丰富的蛋白质、根据其性质不同，可以分为水溶蛋白、盐溶蛋白、醇溶蛋白、碱溶蛋白。将豆粉依次用上述溶剂提取，并用有机溶剂沉淀，可制得各部分蛋白质的干粉。本实验主要是水溶提取大豆蛋白。 称出提出蛋白质的重量，已知原料重量，可以求出蛋白质的收率。 试剂和器材 1、试剂 （1）10%Nacl （2）0.2%NaoH （3）75%乙醇（4）6mol/L HCL （5）1mol/L HCL （6）1 mol/L NaoH 2、器材 （1）离心机（2）烧杯（3）滴管 （4）PH试纸等 操作方法 1、水抽提 将豆粉5g用约40毫升左右的蒸馏水少量多次的添加搅拌，常温下搅拌抽提15min，3800r/min离心15min，取上清液，如上清液不清澈再经过滤。 其余清液加入等体积在冰箱中预冷的丙酮，用滴管少量多次慢慢滴加（搅拌）6mol/L和 1 mol/L HCL，调PH4.5~5.0，3800r/min，离心15min，收集沉淀物，反复用丙酮搅拌洗涤离心2次，得到粉末状蛋白质干粉，称重，计算粗产率。 蛋白质产物重量 蛋白质产率= --------------------------- ×100% 原料总重量 Folin酚法测定蛋白质含量 目的要求 掌握Folin酚法测定蛋白浓度的原理和方法 实验原理
蛋白质浓度可以从它们的物理化学性质，如比重、紫外吸收，折射率等测定而得知；或用化学方法，如定氮、双缩脲反应，Folin酚试剂反应等方法来计算。其中双缩脲法和Folin 酚法是一般实验室中常用的方法，它们操作简便，迅速，不需要复杂而昂贵的仪器。Folin 酚法灵敏度高，比双缩脲法灵敏100倍。 Folin酚法所用试剂是由两部分组成，试剂甲相当于双缩脲试剂，可与蛋白质中的肽链起显色反应。试剂乙中的磷钼酸和磷钨酸在碱性条件下不稳定，易被酚类还原而呈兰色（钼兰和钨兰混合物）。由于蛋白质中含有带酚基的酷氨酸还原呈兰色，溶液兰色的深浅与蛋白浓度有较好的线性关系。因此用Folin酚法测定蛋白质含量，灵敏度较高。 样品中含酚类化合物及柠檬酸均有干扰作用，如果样品酸度较高则显色较浅，要提高碳酸钠一氢氧化钠的浓度。此法也可测定溶液中酪氨酸的色氨酸的浓度。 Folin酚法有不少具有操作方法，但基本原理都是一个，只是在各溶液的浓度及填加量上，保温的温度及保温时间上有所不同而已，本实验所介绍的是本室常用的，灵敏度较高的操作方法。 试剂和器材 1、材料： 本实验所提取大豆蛋白水提取液，经合适稀释至可测定范围。 2、试剂： （1）0.03mol/L PH7.8的磷酸缓冲液。 （2）200μg/ml的标准酪（牛血清）蛋白溶液。 （3）Folin试剂甲：（俗称碱性铜试剂）：10g NaoH溶于400ml水中，再加50gNa2CO3； 称取0.5g酒石酸钾钠溶于80mlH2O中，再加0.25gCuSO4；以上两溶液混合定容到500ml，冰箱保存可用一个月。 （4）Folin试剂乙：在2升磨口回流装置的烧瓶内，加钨酸钠（NaWO4·2H2O）100g，钼酸钠（NaMoO·2M2O）25g，蒸馏水700ml，85%的磷酸50ml，浓盐酸100ml，充分混合后，小火回流10小时，再加硫酸锂（Li2SO4）150g，蒸馏水50ml及数滴溴。然后开口沸腾15min，以驱除过量的溴，冷却后定容到1000ml，过滤后呈金黄色，于棕色并中保存，可使用多年。 上述制备的Folin试剂乙的贮备液浓度一般在2mol/L左右，几种操作方案都是把Folin试剂乙稀释至1mol/L的酸度作为应用液，我们是把贮备液于作用前稀释18倍，使之浓度为0.1mol/L略高。这种稀释18倍后的Folin试剂乙就是下文称之为应用液，Folin试剂乙贮备液浓度的标定，一般是以酚酞为指示剂，用Folin试剂乙去滴定1mol/L左右的标准NaOH 溶液，当溶液颜色由红变为紫灰色，再突然变成黑绿既为终点。如果用NaOH去滴定Folin 乙，终点不太好掌握，溶液的颜色是由浅黄色变为浅绿色，再变为灰紫色为终点。 3、器材： 试管10支、试管架一个、移液管、移液管架、洗瓶、恒温水浴、723型分光光度计 实验步骤 1、标准曲线的制作： 按表进行操作
凯氏定氮法 仪器设备 1 样品粉碎机或研钵 2 分析筛孔径0.45nm（40目） 3 分析天平感量0.0001g 4 消化炉或电炉 5 滴定管酸氏25 50ml 6 凯氏烧瓶250ml 7 凯氏蒸馏装置常量蒸馏氏或半微量蒸馏氏8 锥形瓶150 250ml 9 容量瓶100ml 10消化管250ml 11定氮仪 试剂及配制 1 浓硫酸（GB 625）化学纯 2 硫酸铜（GB 665）化学纯 3 硫酸钾（HG 3-920）化学纯或硫酸钠（HG 3-905）化学纯 4 400g/l NaOH溶液40g NaOH（GB629）溶于100ml水中 5 20g/l 硼酸溶液2g硼酸（GB628）溶于100ml水中 6 盐酸标准滴定溶液邻苯二甲酸氢钾法标定c(hcl)=0.1mol/l:盐酸标准滴定溶液。8.3ml 盐酸（GB622,分析纯），注入1000ml水中 C(hcl)=0.2mol/l:盐酸标准滴定溶液，16.7ml盐酸（GB622,分析纯），注入1000ml水中 7 混合指示剂。甲基红（HG3-958）1g/L乙醇溶液与溴甲酚绿（HG 3-1220）5g/l乙醇溶液，两溶液等体积混合，阴凉处保存3个月以内 8 硫酸铵（GB 1396）分析纯，干燥 9 蔗糖（HG 3-1001）分析纯 10 硼酸吸收液。10g/L硼酸溶液1000ml,加入甲基红1g/L乙醇溶液7ml，与溴甲酚绿1g/L 乙醇溶液10ml，40g/L氢氧化钠溶液0.5ml,混合，至阴凉处保存期为1个月（全自动定氮分析仪用） 测定步骤 1 消化 称取0.5-1g试样（含氮量5-80mg），准确至0.0002g，无损地放入凯氏烧瓶或消化管中，加入硫酸铜（CuSO4.5H2O）0.4g,无水硫酸钾（或无水硫酸钠）6g，与试样混合均匀，再加浓硫酸10ml和2粒玻璃珠。把凯氏烧瓶或消化管放在通风柜里的电炉或消煮炉上小心加热，待样品焦化，泡沫消失，在加大火力（360-400度），直至溶液澄清后，再加热消化15min.。试剂空白测定：另取凯氏烧瓶或消化管一个，加入硫酸铜0.4g,无水硫酸钾（或硫酸钠）6g，浓硫酸10ml,加热消化至溶液澄清。 2 氨的蒸馏 1 常量直接蒸馏法。将试样消煮液冷却，加水60-100ml，摇匀，冷却。将蒸馏装置冷凝管的末端浸入35ml硼酸吸收液和加混合指示剂2滴的锥形瓶中，然后小心地向凯氏烧瓶或消化管中，加入氢氧化钠溶液至溶液颜色变黑，再稍加少许，使溶液混匀后，加热蒸馏，直至流出液体积约150ml。降下锥形瓶，使冷凝管末端离开页面，继续蒸馏1-2min,并用水冲洗末端，洗液均需流入锥形瓶内，然后停止蒸馏。 2 半微量水蒸气蒸馏法 将试样消煮液冷却，加水20ml，移入100ml容量瓶中，冷却后用水稀释至刻度，摇匀，作为试样分解液。取35ml硼酸溶液，加混合指示剂2滴，使半微量装置的冷凝管末端浸入此液。蒸汽发生器的水中应加入甲基红指示剂数滴，硫酸数滴，在在蒸馏过程中此溶液为橙红色，否则需补加硫酸。准确移取试样分解液10-20ml,注入蒸馏装置的反应室中，用少量水冲洗进样入口，塞好入口玻璃塞，再加10ml 400g/L氢氧化钠溶液，小心拉起玻璃塞使之进入反应室，将玻璃塞塞好，且在入口处加水封好，防止漏气，蒸馏4min,使冷凝管末端离开吸收液面，再蒸馏1min,用水冲洗冷凝管末端，洗液均流入锥形瓶内，然后停止蒸馏。
成品料及原料中粗蛋白质的测定 原料与成品中蛋白质的测定是饲料化验中特别重要的一项，目前国家标准中用于检测饲料中蛋白质的方法共有三种：1、凯氏定氮法；2、乙酰丙酮分光光度法；3、燃烧法。其中凯氏定氮法在饲料的蛋白质的测定中应用最广泛。下面主要介绍凯氏定氮法。 凯氏定氮方法简介：凯氏定氮法是1883年Kjeldahl发明，当时凯氏只使用H2SO4来分解试样，来定量谷物中的蛋白质，后来由Gunning加入改进，在消化时加入K2SO4使沸点上升，加快分解速度，凯氏定氮法至今仍在使用。 凯氏定氮法所测得的含氮量为物质的总氮量，其中还包括少量的非蛋白氮，如尿素氮、游离氨氮、生物碱氮、无机盐氮等，因此由凯氏定氮法测得的蛋白质称为粗蛋白质。 原理：原料或成品与催化剂和硫酸一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵，然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后以0.1mol/L盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质的含量。其反应方程式如下： 蛋白质+ H2SO4 →（NH4）2SO4 （NH4）2SO4+NaOH=NH4OH+Na2SO4 NH4OH →H2O + NH3 →NH4OH NH3+(标准) HCL→NH4CL 试剂和材料：蒸馏水，硫酸铜，硫酸钾，硫酸，硼酸，甲基红指示剂（C15H15N3O2），溴甲酚绿指示剂（C21H14Br4O5S），氢氧化钠，95%乙醇（C2H5OH），硼酸溶液，40%氢氧化钠溶液，盐酸标准滴定溶液（0.1mol/L），消化炉，凯氏定氮仪。 步骤：1、消化，2、蒸馏，3、滴定，4、计算。 1．消化过程：称取充分混匀的固体试样0.2g精确至0.001 g，移入干燥的消化管中，加入3.2 g 催化剂及7mL 浓硫酸，放在消化炉上打开开关，整个消化过程需要2.5h。在此过程中混合指示剂是硫酸钾与硫酸铜以15:1的质量比混合的，其中硫酸钾的作用是可以提高温度加快有机物分解，它与硫酸反应生成硫酸氢钾，可提高反应温度，一般纯硫酸加热沸点330℃，而添加硫酸钾后，温度可达400℃，加速了整个反应过程；硫酸铜的作用是在蒸馏过程中与氢氧化钠反应指示其加入量；硫酸起到强氧化剂的作用，与蛋白质反应生成硫酸铵，与蛋白质中的有机物反应生成CO2，SO2，H2O。 2．蒸馏过程：在250mL锥形瓶中加入50 mL 硼酸溶液，并使冷凝管的下端插入液面下，根据试样中氮含量，向消化管中通如40%氢氧化钠溶液至溶液变黑，打开“汽”开关，开始蒸馏。 样液中的硫酸铵在碱性条件下释放出氨，在这操作中：一是加入氢氧化钠溶液要过量；二是要防止样液中氨气逸出，防止氨气溢出的方法为硫酸铵校正，该方法为称取0.06g硫酸铵加入到消化管中，放在凯氏定氮仪上蒸馏，加入氢氧化钠的量大致在20~30mL。如果蛋白含量在21.19±0.2则说明氨气没有溢出。 3．滴定过程：蒸馏过程中放出的氨可用一定量的硼酸进行氨的吸收，然后再用标准盐酸溶液滴定从而计算出总氮量。以盐酸标准滴定溶液滴定至终点，颜色由蓝色变成灰红色。
饲料中粗蛋白测定注意事项 张世娟,徐英江,宫向红,张秀珍,于召强 (山东省海洋水产研究所,山东 烟台 264006) 摘 要:系统研究了饲料中粗蛋白测定中消化温度、消化时间、催化剂用量、蒸馏时间等对粗蛋白测定的影响,并对凯氏定氮法 中的一些注意事项进行了讨论。 关键词:饲料;粗蛋白;测定 N o t e w o r t h y I s s u e s o f C r u d e P r o t e i nA n a l y s i s o f F e e d s t u f f Z H A N GS h i -j u a n ,X UY i n g -j i a n g ,G O N GX i a n g -h o n g ,Z H A N GX i u -z h e n ,Y UZ h a o -q i a n g (M a r i n e F i s h e r i e s R e s e a r c h I n s t i t u t e o f S h a n d o n g P r o v i n c e ,S h a n d o n g Y a n t a i 264006,C h i n a ) A b s t r a c t :Al o t o f e x p e r i m e n t a l p a r a m e t e r s s u c h a s d i g e s t i o n t e m p e r a t u r e a n d d i s t i l l a t i o n t i m e t h a t m a y i n f l u e n c e t h e a c c u r a c y o f c r u d e p r o t e i n a n a l y s i s w e r e s t u d i e d ,a n d s o m e n o t e w o r t h y i s s u e s w e r e a l s o p r o p o s e d f o r K j e l d a h l p r o t e i n a n a l y -s i s m e t h o d . K e y w o r d s :f e e d s t u f f ;c r u d e p r o t e i n ;a n a l y s i s 作者简介:张世娟(1981-),女,硕士,山东省海洋水产研究实习员,主要从事水产品及饲料质量安全研究。 随着饲料工业的快速发展,饲料产量迅速增长,饲料中蛋白质含量的测定显得日益重要,虽然粗蛋白测定无法鉴别三聚氰胺和尿素等物质,但是在目前条件下,饲料中粗蛋白的测定仍然是评价饲料营养价值的重要指标[1]。 饲料中粗蛋白的测定大致分为两种:凯氏定氮法和自动定氮仪法[2-3]。凯氏定氮法仪器虽然设备简单,试剂消耗少,但人为因素影响比较大;自动定氮仪法虽然自动化程度高,但是该法的测定试剂消耗比较大。本文就凯氏定氮法(蒸馏法)和全自动凯氏定氮法中常见的影响饲料蛋白测定的因素进行了讨论,为饲料中粗蛋白测定人员提供参考。 1 实验材料及仪器 1.1 实验样品 山东升索鱼用饲料。 1.2 仪器 电子天平(精密度为0.0001g )、2300全自动凯氏定氮仪(瑞 典福斯特卡托公司)、凯式蒸馏装置。 1.3 试剂 标准盐酸(0.1036m o l /L 盐酸标准溶液);接收液(10g /L 硼酸溶液)、400g /L 氢氧化钠溶液、1g /L 溴甲酚绿溶液、1g /L 甲基红溶液;浓硫酸;基尔特克催化剂(m K 2S O 4∶m C u S O 4.5H 2O =60:5);硫酸铵(A R ,纯度≥99.5%)。以上试剂均为分析纯度剂,溶液均用不含氨的蒸馏水配制。 2 分析方法及结果 2.1 硼酸吸收液的调节 为了使实际样品和空白样品的酸度一致,消化的时候一般选用无氮蔗糖做空白。空白样品消耗盐酸的量以0.05～0.15m L 为宜,如果空白样品消耗盐酸的量为0或者空白样品的吸收液不变色,则需要调节硼酸吸收液得到正的空白值,空白值可通过调整硼酸的p H 值来进行调节。国标G B /T 6432-94[4]中规定吸收液中加碱可能是为了防止出现空白收液不变色的现象,但是如果空白本身就已经得到非常合适的滴定值,吸收液中加碱反而不利于精密度的提高。本文实验了自动定氮仪法中吸收液酸碱度的影响,1000m L 的硼酸吸收液一份按照国标要求加0.5m L 4%N a O H ,一份不加碱,分别作了空白和回收率实验,结果如表1所示。 表1 吸收液酸碱性实验 硼酸吸收液空白值回收率/%不加碱0.05199.699加碱 0.067 99.532 结果表明,实验中硼酸吸收液中加适量的碱会导致空白值增大,但对结果影响不大,因为吸收液酸碱度对样品和空白的作用是一致的,可以相减扣除。实验中吸收液的酸碱度是否合适,可通过以下方式简单判断:取10m L 硼酸吸收液,加入100m L 蒸馏 水和几滴指示剂,如果指示剂变色说明酸度合适,如果仍为红色,则需要在硼酸吸收液中加入适量的碱。 2.2 消化温度的影响 消化过程采用全自动凯氏定氮仪自备消化装置,样品消化之前用浓硫酸浸泡过夜,升温过程时在200℃保持1小时,并保 · 155·2009年37卷第5期广州化工