兽用生物制品概述
第一节兽用生物制品分类与命名原则
兽用生物制品是根据免疫学原理，利用天然或人工培养的微生物、寄生虫及其代谢产物或免疫应答产物制备的一类物质，专供相应的疫病诊断、治疗或预防之用。
一.兽用生物制品的分类
兽用生物制品种类繁多，按不同的标准分类有不同的归类。本书依据生物制品的性质、用途和制法等将其分为疫苗、类毒素、诊断制剂、免疫血清、免疫调节剂、微生态制剂。
1.疫苗
凡接种动物后能产生主动免疫和预防疾病的一类生物制剂均称为疫苗。
（1）活疫苗又称弱毒疫苗，它是微生物自然强毒株通过物理、化学或生物处理，并经连续传代和筛选，培养而成的丧失或减弱对原宿主动物致病力，但仍保存良好免疫原性和遗传特性的毒株，或从自然界筛选的具有良好免疫原性的自然弱毒株，经培养增殖后制备的疫苗。其优点是可以在免疫动物体内繁殖；能刺激机体产生全面的系统免疫反应和局部免疫反应；免疫力持久，有利于清除局部野毒；产量高、生产成本低。缺点：是疫苗残毒在自然界动物群体内持续传递后有毒力增强和返祖危险；有不同抗原的干扰现象；要求在低温、冷暗条件下运输和储存。
（2）灭活疫苗又称死疫苗，用标准强毒或免疫原性良好的弱毒株，经人工大量培养后，用理化方法将其灭活后制成的疫苗。其优点是微生物不能在免疫动物体内繁殖，安全性好；不存在毒力返祖现象；有利于制备多价或多联等混合疫苗；制品稳定，受外界环境影响小，有利于保存运输。缺点是该类疫苗免疫剂量大，生产成本高，有时需多次免疫；有的疫苗存在过敏反应；一般只能诱导机体产生体液免疫和免疫记忆，故常需要用佐剂来增强其免疫效果。
（3）单价疫苗利用同一种微生物菌（毒）株或同一种微生物中的单一血清型菌（毒）株的增殖培养物制备的疫苗。
（4）多价疫苗指用同一种微生物中若干血清型菌（毒）的增殖培养物制备的疫苗。（5）多联疫苗利用不同种类微生物增殖培养物，按免疫学原理和方法组合而成的疫苗。（6）同源疫苗指利用同种、同型或同源微生物株制备，又应用于同种类动物免疫预防的疫苗。如猪瘟兔化弱毒疫苗。
（7）异源疫苗①用不同种微生物的菌（毒）株制备的疫苗，接种动物后能使其获得对疫苗中并未含有的病原体产生抵抗力。如犬在接种麻疹疫苗后，能产生对犬瘟热的抵抗力；兔接种兔纤维瘤病毒疫苗后能使其抵抗兔黏液瘤病。②用同一种微生物中的一种型的菌（毒）株制备的疫苗，接种动物后能使其获得对异型病原的抵抗力。如接种猪型布鲁氏菌弱毒菌苗后，能使牛获得对牛型布鲁氏菌病的免疫力。
2.类毒素
类毒素又称脱毒素。它是指细菌生长繁殖过程中产生的外毒素，经化学药品（甲醛）处理后，成为无毒性而保留免疫原性的生物制剂。接种动物后能产生主动免疫，也可用于注射动物制备抗毒素血清。
3.抗血清
抗血清为含有高效价特异性抗体的动物血清（或卵黄），能用于治疗或紧急预防相应病原体所致的疾病，所以又称为被动免疫制品。通过给适当动物以反复多次注射同一种抗原物质，促使动物不断产生免疫应答，在血清中或禽卵黄中含有大量对应的特异性抗体，通过提取血清或卵黄中含有大量对应的特异性抗体，通常提取血清或卵黄制成。
4.诊断制品
利用微生物、寄生虫及其代谢产物，或动物血液、组织制备的，专供诊断动物疫病、监测动
物免疫状态及鉴定病原微生物的制品称为诊断制剂或诊断液。
5.免疫调节剂
该类制剂是通过刺激动物机体，提高特异性和非特异性免疫力的免疫制品，从而使动物机体对抗原物质的特异性免疫力更强更持久。
6.微生态制剂
微生态制剂又称益生素、活菌制剂或生菌剂。是用非病原性微生物，如乳酸杆菌，醋样芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或双歧杆菌等活菌制剂。
第1章生产用主要设备
第1节灭菌设备
一.干热灭菌器
干热灭菌是用于干热空气进行灭菌的方法，均采用电加热，可自动控温，温度调节范围在室温至400℃，温差±1℃。干热灭菌器主要分为箱式和层流隧道箱式，按GMP标准要求，必须使用双扉型箱式嵌墙构造，在操作区将消毒物品装箱，灭菌后从净化区取出。
使用方法：灭菌开始应把排气孔敞开，以排除冷气和潮气。灭菌器升温必须缓慢均匀，不能剧增，尤其是130~160℃之间不宜突击加温。要保持被灭菌物品均匀升温。干热灭菌法所用的温度一般规定为160~170℃，时间为1~2h。灭菌结束，必须让灭菌器内温度下降到60℃以下，才能缓慢开门，否则可能引起棉花纸张起火、器皿炸裂。
注意事项：适用于耐高温的物品以及不能使用温热方法灭菌、潮湿后容易分解或变性的物品。生产所用的玻璃瓶、注射器、试管、吸管、培养皿和离心管等常用干热法灭菌。玻璃瓶和各种玻璃器皿灭菌前必须完全干燥，以免破裂。装灭菌物品时要留有空隙，不宜过紧过挤。各种灭菌物品必须包扎装盒，包扎的纸张不能与干燥箱壁接触，以免烤焦。
二.高压蒸汽灭菌器
（1）使用方法准备→开饱和蒸汽→夹层预热→夹层冷凝水排出→放置待灭菌物品（装锅）→锁紧气门→用抽空器排出器内空气→蒸汽输入器室→排放器室内空气→开始灭菌→维持灭菌所需时间→灭菌完毕→关闭蒸汽总阀门→夹层蒸汽排出→器室送入空气→压力真空表指针降到0度→开启器门→取出灭菌物品→清洗器室→器门小开，器室通风→结束灭菌工作。
（2）灭菌时间和温度不同灭菌物品的时间和温度有不同要求。常用的培养基、培养液一般116℃20~40min ；玻璃器皿、用具等，一般121℃30min。
（3）操作注意事项
安全措施：蒸汽压力灭菌器是受压容器，务必保证设备完好，安全阀、压力表、温度计灵敏准确。用前检查，定期检修，校正仪表，技术鉴定。
灭菌物品保存期：工具、用具、器皿、工作衣帽等灭菌后保存期不超过48h；培养基、溶液等最好72h内使用，最长保存期不能超过5d。
三.电离辐射灭菌
利用γ射线、伦琴射线或电子辐射穿透物品，杀死其中微生物的灭菌方法称为电离辐射灭菌。该方法是在常温下进行，特别适用于各种怕热物品的灭菌，最适合于大规模灭菌。目前国内外大量一次性使用的医用制品都采用辐射灭菌，各种SPF动物的饲料使用辐射灭菌后，不但其营养成分不被破坏，而且使用安全、保存期长。
辐射灭菌的优点是：①消毒均匀彻底。②价格便宜，节约能源。③可在常温下灭菌，特别适用于热敏材料。④不破坏包装，消毒后用品可长期保存。⑤消毒的速度快，操作简便。⑥穿透力强。本方法唯一的缺点是一次性投资大，并要培训专门的技术人员管理。
四.无菌室
目前，根据兽药GMP要求，开始应用净化空气进入无菌室。净化空气所用的洁净技术，系将经过调温调湿和过滤的无菌空气，通过排气孔循环，使室内的空气对外保持一定的压差（正压或负压），同时室内可以保持恒温恒湿和空气洁净。洁净无菌室空调过滤系统的设备有空调机、过滤机、送回风管道等。
五.净化工作台
净化工作台应安装在无菌室或洁净室使用。
第2节微生物培养设备
一.温室
温室是生物制品生产的必备设备。用于细菌或病毒繁育，一般为36~38℃，培养温度有的也有特殊要求，如培养霉菌需20~25℃。
二.细胞培养转瓶机
是用于大量培养细胞的一种设备。这种大型转瓶机都安装在自动控温的温室中，并设有高温及低温的报警装置，转瓶机通过变速箱使转瓶的转速控制在9~12r/h。实验室及小规模生产的转瓶可安放在温箱中。细胞转瓶机应符合国际GMP标准的各项要求，具有可靠性高、平稳运转、拆装方便、耐酸、耐油耐腐蚀等特点。
三.发酵培养罐
可进行细菌和细胞的培养，目前各生物制品企业均采用培养罐培养细菌，生产规模可观。培养罐可自动调温、调PH值，用无级调速电动机、磁搅拌、消泡、控制氧压、自动补液、换液、自动高压灭菌、自动计算呼吸商等精密仪表，而罐体结构均为不锈钢质。这种深层培养法的优点是可使细菌培养有比较一致的环境，抽样时高度一致性，特别便于生物化学的分析、细胞动力学及对单位体积内细胞数目增长情况的研究，也是一个生产优质疫苗的方法。四.生物反应器
可用于培养悬浮生长或贴壁生长的动物细胞，可生产疫苗、单克隆抗体、干扰素、激素等，用生物反应器培养动物细胞比目前用的静止培养、转瓶培养有更多的优越性。
五.微生物浓缩装置
为有效地连续对微生物、抗体及生物制剂进行浓缩、分离，必须使用超滤器。根据不同用途、不同容量、超滤器可组成内压型、外压型和实验型。它们都是以中空纤维超滤膜组件为主体，中空纤维膜为不对称半透膜，呈毛细管状，膜的外表面和内表面存在致密层，可分别形成外压和内压。在压力作用下，原液在膜内或膜外流动。体积大于微孔的溶质截留在原液内，小于微孔的溶质则随溶剂透过膜，对微粒、胶体、细菌以及各种大分子有机物具有良好的分离作用，从而可达到物质分离、浓缩和提纯的目的。
内压型以获得纯净的超滤液为目的，主要用于提纯、除菌。外压型以浓缩为目的，原液循环直至达到需要的浓度为止，主要用于有用物质的回收。
六.孵化器
按GMP标准的要求，易消毒、易清洗。新型孵化器多是高分子材料制造的，耐热、耐湿，抗酸碱及消毒药，供SPF鸡胚使用的孵化器，还具有空气过滤系统，保证进入的空气呈无菌状态。
第3节乳化设备
一.胶体磨
立式胶体磨是制造佐剂的工具之一，但由于其耐磨性较差及受电压影响大的缺点，从而影响了灭活疫苗的质量。其乳化的液珠直径在1~5μm之间。
二.高压匀浆泵
这是一种制备超细液-液乳化物或液-固分散物的通用设备，其主要加工部件具有极高的耐腐
蚀性和良好的耐磨性，对加工乳化的油佐剂、抗原均不会产生不良影响，替代原来应用的胶体磨。乳化液珠直径仅0.25~2μm。
三.乳化装置
用于规模化油乳剂疫苗的生产，由贮油罐、油相制备罐、水相制备罐、剪切泵、乳化罐及贮苗罐组成。
操作步骤:先打开油相制备罐通向乳化罐的阀门，并打开贮油罐压缩空气阀门，给贮油罐加压，再打开乳化罐的无菌呼吸器的阀门，然后缓慢打开乳化罐上进油阀门。油相进入乳化罐后，启动搅拌电机，使电机缓慢搅拌。关闭贮油罐上控制压缩空气的手动球阀。打开冷却水循环的手动球阀。打开水相罐通往乳化罐的阀门，并打开水相罐压缩空气的阀门，给水相罐加压，打开乳化罐上的无菌呼吸器的手动隔膜阀，慢慢开启乳化罐上的水相进入的阀门，使流量计的指针缓慢上升。将水相输入乳化罐内。从乳化罐加样口按比例加入1%的硫柳汞溶液，硫柳汞的最终浓度为10-4.然后打开乳化罐的出料阀门同时开启乳化机，开始乳化，乳化结束，打开贮苗罐的进料阀门将乳化好的乳剂苗输入至贮苗罐中。
四.分装与包装设备
一.自动灌装半加塞联动机
二.瓶装液体制剂分装包装设备
第5节冷冻真空干燥设备
一.冻干机
冷冻真空干燥设备简称冻干机，由制冷系统、真空系统、加热系统和控制系统四部分组成，包括冻干箱、冷凝器、真空泵组、制冷压缩机组、加热装置、控制装置等。
冻干箱内设有若干层隔板，冻干的制品在隔板上，隔板内置冷冻管和加热管，分别对制品进行冷冻和加热。冷凝器又称水汽凝集器或冷阱，内装有螺旋状冷凝蛇管数组，其操作温度应低于干燥箱内制品的温度，工作温度可达-45~-60℃，其作用是捕获制品升华的水蒸气，以保证冻干过程的进行。真空泵组对系统抽真空，使冻干箱中绝对压力应保持在0.13~13.3Pa。制冷压缩机组对冻干箱中的隔板及冷凝器中的冷冻盘管降温，冻干箱中的隔板可降至-30~-40℃。常用的冷冻剂有氨、氟利昂、二氧化碳等。加热装置供制品在升华阶段时升温用，应能保证干燥箱中隔板的温度达到80~100℃，加热系统可采用电加热、辐射加热或循环油间接加热。控制装置是利用计算机输出程序控制整个工作系统正常运转。
新型冻干机冻干箱内的板层上有液压装置，箱内可通入高压热蒸汽，能够实现箱内自动压瓶塞和在线高压消毒。
二.冻干程序
冷冻真空干燥又称冷冻干燥，简称冻干。它是物质干燥的一种方法。是将物料或溶液在较低的温度下冻结成固态，然后在真空下将其中水分不经液态直接升华成气态而脱水的干燥过程。真空冷冻干燥在生物制品方面的应用十分广泛，干燥后的制品水分被排除了96%以上，易于长期保存。生物制品冷冻干燥的程序：冻干箱进行空箱降温→液态制品装箱→预冻→升华干燥→解析干燥→结束冻干→加塞封口。
（1）预冻在干燥之前，先将溶液物质在低温下冻结称为预冻。预冻是将溶液中的自由化水固化，使干燥后产品与干燥前有相同的形态，防止真空干燥时起泡、浓缩、收缩和溶质移动等不可逆变化产生。
预冻温度必须低于产品的共熔点温度，各种产品的共熔点温度是不一样的，必须认真测得。溶液达到全部凝固冻结的温度称为凝固点或共晶点，实质上物质的凝固点也是该物质的融化点，故又称此温度为共熔点。共熔点的测定是1对白金电极和1支温度计侵入待测样品溶液中，并将电极、温度计、仪表与记录仪连接，然后将溶液冷冻到-40℃以下，直至电极达到无穷大，然后缓慢升温至电阻突然降低的温度，即为该溶液的共熔点温度。实际制定工艺曲
线时，一般预冻温度要比共熔点温度低5~10℃。制品装量通常为容器容量的1/4~1/5，厚度不宜大于15mm。生物制品一般预冻时间为2~4，即可开始升华。
（2）升华干燥阶段也称第一阶段干燥。将冻结后的产品置于密闭的真空容器中加热，冰晶升华成水蒸气逸出，使产品脱水干燥。干燥是从外表面开始逐步向内推移，冰晶升华后残留下的空隙变成升华水蒸气的逸出通道。当全部冰晶除去时，第一阶段干燥完成。此时除去全部水分的90%左右，占总干燥时间的80%。此阶段箱内的真空度一般为10~30pa。
（3）解析干燥阶段也称第二阶段干燥。在第一阶段干燥结束后，必须对产品进一步干燥以除去残余水分。该阶段产品的温度应上升到该制品最高容许温度，并在该温度一直维持到冻干结束。制品最高容许温度视制品的品种而定：病毒性制品为25℃，细菌性制品为30℃，血清和抗生素等可高达40℃。箱内必须是高真空，真空度一般为15~30Pa以下，使解析出来的水蒸气逸出产品。第二阶段干燥后，产品内残余水分的含量不超过4%。
（4）加塞与压盖冻干程序结束，干燥制品进行加塞、压盖，入待检库。加塞可采用箱内加塞法和箱外加塞法两种方式。目前，几乎所有生物制品企业冻干制品都采用箱内加塞法。冻干箱配有液压或气压压塞的动力装置，在真空下或放入惰性气体下，将分装时放置在瓶口上的四叉胶塞自动压紧。该方法可从根本上防止干燥制品受空气中水分和氧气的影响。
冻干的总时间是指预冻时间、升华时间和第二阶段干燥时间总和。一般为18~24h，有些特殊的制品需要几天时间。
第6节冷藏设备
一.冷库
冷库可分为中、小型两类。小型只设冷藏间或活动冷库。中型冷库房，一般由主体建筑和附属建筑两部分组成。主体建筑包括冷藏库和空调间；附属建筑包括包装间、真空检验室、标准间、机房、泵房、配电房等。
保温性能应符合生物制品贮藏保管的最基本要求：①空调间，其最高库温不能超过15℃。最低在0℃以上，一般用冷风机作冷却设备。②冷藏间，要求在-15℃以下，作制品保管。为保证库温恒定，在建筑结构上，必须在其外墙、地坪、平顶设置连续的隔热层，要有足够的厚度，以阻止冷气从室内散逸；做好保温层的防潮设施，低温库要采用电动冷库门。
使用注意事项：①新冷库初次投产时，不应降温过快，避免结构内部结冰膨胀。当库温在4℃以上时，每天降温不得超过3℃，直至到达要求为止。②冷库在使用以后，要保持温度的稳定性，即高温库（10±5）℃；低温库（—18±3）℃。③严格防水、汽渗入构造保温层；低温库内不得做多水物品的作业。④合理使用库容，合理安排货位和堆放高度，保持库内地坪受荷均匀。
二.冷藏运输设备
为保证生物制品的使用效果，在运输过程中必须使用具有隔热车体及降温装置的冷藏车。这类车按性能来说可分为机器冷藏车与冰箱冷藏车。目前我国多使用后者，这种车造价低，使用维修方便。无论任何类型的冷藏车，都必须具有：①具有良好的隔热车体，减少车内与外界的热交换。②设有制冷降温装置，适应生物制品的保存条件。③设有空气循环装置，以保证车内温度的均衡。④设有温度指示，最好有自动控制仪表，以控制车内温度。
保温箱无制冷系统，亦以软木、玻璃纤维和聚氨酯泡沫塑料为保温材料。内外层常用镀锌钢板和铝板为保护层。不能自动降温至冰点以下，而是使用时将冷冻干燥的生物制品置于箱内，并加入一定的冰块，严密加盖。箱内可维持20多小时不解冻，能维持运输途中的低温保存。目前国内兽用冷冻干燥制品的运输，多使用这种简单的保温箱。
三.液氮罐
液氮罐是专供贮存液氮用的容器，液氮的温度可达-196℃，属超低温，因而是保存活细胞、活组织、生物制品、冷冻精液、微生物等理想容器。液氮罐的构造和玻璃热水瓶一样，能防止热的传导、辐射和对流。液氮罐都是双壁的，双壁之间有一夹层。夹层吧、空隙越大，真空度越高，蓄冷的时间也越长。
新罐或使用后液氮挥发已净和清洗后待用的容器，在使用前，先加入适量液氮预冷30min 左右，然后加满其余的液氮，充装后的液面应低于颈管。液氮充满后，液氮出现沸腾不止或罐的上半部结霜，证明此缸的性能已不正常。放入或提取罐内的贮存物时，要迅速浸入或离开液氮面，取出被保存物的动作要快、准、稳。
第7节污物处理设备
由于生物制品都是使用病原体进行制造和检验的，如果排放到外界，会造成环境污染，引起动物疫病流行，甚至危害人类健康。
一．污水处理
生物制品企业生产的污水，须经无害化处理，检验合格后才能排放。通常采用高压热蒸汽灭菌法。生产和检验的污水直接排放到污水储罐中，当收集于污水储罐中的污水达到一定量时，用泵向储罐夹层中通入蒸汽，待罐内温度达到100℃，煮沸60min，关闭蒸汽阀，降温后经检测合格后排放。强毒舍生产的污水排入污水管网集中到污水池，进行高压蒸汽灭菌，经检测合格后排放到污水处理站进行二次处理。
污水排放标准：①生化需氧量（5d、20℃）达到60mg/L，生化需氧量越高，表示水中有机污染物越多；②化学需氧量重铬酸钾法达到100mg/L，氧化剂也可用高锰酸钾；③动物检测
二、带毒粪便及垫草的处理
采用生物发酵法进行。原则是每池装满后能自然发酵2年以上。发酵池的内外墙用水泥沙浆粉刷外，还应涂沥青防水层，防止池内污水渗漏，池外地表、地下水渗入影响发酵效果。为了便于清除，应一半设在强毒区，一半设在隔离区外，以便发酵彻底后，启盖清出粪便和残渣、垫草的腐烂物。强毒区内产生的废弃物要经高压无害化处理后移出工作区，对不宜高温处理的应使用消毒液浸泡消毒处理后，进行生物发酵。
三、动物尸体处理
所有感染疫病死亡的动物以及检验耐过的动物，试验结束后须宰杀，将尸体用高压蒸汽消毒、焚尸炉焚烧或化制后，按粪便残渣处理办法进行生物发酵处理，安全可靠。
第2章保护剂、灭活剂与免疫佐剂
第1节保护剂
保护剂又称稳定剂，是指一类能防止生物活性物质在冷冻真空干燥时受到破坏的物质。生物制品的冷冻真空干燥一般都加冻干保护剂，以使制品在冻干后仍保持有较高的生物学活性，而且能够延长制品保存期并提高耐热性。
一.冻干保护剂的组成与作用
冻干保护剂通常由营养液、赋形剂和抗氧剂三部分组成。
（1）营养液可使因冻干而受损伤的细胞修复，对水分子起缓解作用，并能使冻干生物制品仍含有一定量水分；还可促进高分子物质形成骨架，使冻干制品呈多孔的海绵状，增加溶解度，常为低分子有机物，如蔗糖、山梨醇、乳糖、氨基酸和糖类等。
（2）赋形剂主要起骨架作用，防止低分子物质的碳化和氧化，保护活性物质不受加热的影响，使冻干制品形成多孔性、疏松的海绵状结构，从而使溶解度增加，常为高分子有机物，如脱脂乳、蛋白胨、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、葡聚糖、明胶等。
（3）抗氧剂可抑制冻干制品中的酶作用，增加生物活性物质在冻干后贮存期间的稳定性，如维生素C、维生素E和硫代硫酸钠等。
二.影响保护剂效能的因素
保护剂的效能主要表现在保证生物活性物质在冻干和保存过程中的存活率。
（1）保护剂种类用不同保护剂冻干的同一种微生物，在其保存过程中存活率不同。（2）保护剂组分浓度保护剂组分的浓度可直接影响冻干制品细菌或病毒的成活率，必须严格掌握。
（3）保护剂配制方法配置方法不同会影响保护剂的效果，例如含糖保护剂灭菌温度不宜过高，否则由于糖的炭化而影响冻干制品的物理性状和保存效果，所以均采用116℃30min 灭菌或间歇灭菌；又如血清保护剂就不能用热灭菌法，必须以滤过法除菌。
（4）保护剂酸碱度（pH）保护剂的pH应与微生物生存时的pH值相同或相近，过高或过低都能导致微生物的死亡。
对于冻干活疫苗而言，一种良好的冻干保护剂不仅能够在冻干过程中最大限度地提高疫苗微生物的存活率，而且需要提高其耐热性，延长保存期。
三.常用的冻干保护剂
（1）5%蔗糖脱脂乳保护剂蔗糖5g，加脱脂乳至100ml，充分溶解后，100℃蒸汽间歇灭菌3次，每次30min；或110~116℃高压灭菌30~40min。适用于鸡新城疫、猪瘟、羊痘和狂犬病等病毒性活疫苗保护剂。
（2）明胶蔗糖保护剂明胶1%~2%、蔗糖5%、硫脲1%~2%。先将12%~18%明胶液、30%蔗糖液和6%~12%硫脲液加热溶解，116℃高压灭菌30~40min；或100℃3次灭菌，每次30min。适用于猪肺疫和猪丹毒等细菌性活疫苗保护剂。
第2节灭活剂
一.灭活概念与灭活方法
兽用生物制品生产中的灭活，是指破坏微生物的生物学活性、繁殖能力、致病性和毒性，但尽可能不影响其免疫原性，被灭活的微生物主要用于生产灭活疫苗；或指破坏诊断血清或待检血清中的补体活性，以避免补体对诊断试验的干扰作用。灭活的主要方法有两类，即物理学方法和化学方法。
补体可以非特异性和抗原结合
（1）物理学灭活包括加热及射线照射等方法。加热灭活方法除用于血清灭活（56℃30min）外，很少用于疫苗生产，加热杀死微生物的方法比较粗糙，容易造成蛋白质变性，因而免疫原性受到明显影响。
（2）化学灭活该方法目前采用最多。用于灭活微生物的化学试剂或药物称为灭活剂。
二.常用的灭活剂
1.甲醛溶液
甲醛溶液是甲醛气体的水溶液，又称福尔马林。常用的甲醛溶液约含37%甲醛气体，为无色透明液体，有辛辣窒息味，对眼、鼻粘膜有强烈刺激性，较冷温度下久贮易变浑浊，形成三聚甲醛沉淀，虽加热可变清，但会降低其灭活性能，故一般商品甲醛溶液加10%~15%甲醇，以防止其聚合。
适当浓度的甲醛可使微生物丧失增殖力或毒性，保持抗原性和免疫原性，不同类型的微生物，使用甲醛灭活的浓度不同；一般需氧菌为0.1%~0.2%、厌氧菌0.4%~0.5%、病毒多数为0.1%~0.3%。不论是杀菌或脱毒，使用甲醛或其他灭活剂，其浓度及处理时间都要根据试验结果来确定，通常以用低浓度、处理时间短而又能达到彻底灭活目的为原则，必要时在灭活后加入硫代硫酸钠，以中断其反应。
灭活作用机理是甲醛的醛基作用于微生物蛋白质的氨基产生羟甲基胺，作用于羧基形成亚甲基二醇单酯，作用于羟基生成羟甲基甲酚，作用于巯基形成亚甲基二醇。上述反应生成的羟甲基等代替敏感的氢原子，破坏生命的基本结构，导致微生物死亡。甲醛还可与微生物
核糖体中的氨基结合，使两个亚单位间形成交联联，亦可抑制微生物的蛋白质合成。
2.烷化剂
这类灭活剂能破坏病毒的核酸芯髓，使病毒完全丧失感染力，而又不损害其蛋白衣壳，从而保留其保护性抗原。
3.苯酚
又名石炭酸。为无色结晶或白色熔块，有特殊气味，有毒及腐蚀性，暴露在空气中和阳光下易变红色，在碱性条件下更易促进这种变化。
4.结晶紫
是一种碱性染料，为绿色带有金属光泽结晶或深绿色结晶状粉末，易溶于醇，能溶于氯仿。灭活机制主要是其阳离子与微生物蛋白质带阴电荷的羟基形成弱电性化合物，妨碍微生物的正常代谢。
5.β-丙酰内酯
三.影响灭活作用的因素
（1）灭活剂特异性在选择灭活剂时，应考虑其特异性，即应考虑其对微生物的作用范围。如酚类能抑制和杀灭大部分细菌的繁殖体，真菌和病毒对酚类不太敏感。
（2）微生物种类与特性不同种类的微生物对各类灭活剂的敏感性并不完全相同；细菌的繁殖体及其芽孢对化学药物的抵抗力不同；生长期和静止期的细菌对灭活剂的敏感程度亦有差别。
（3）灭活剂浓度灭活剂浓度越高，灭活脱毒越快，但抗原损失量亦较大。有时可以采用分次加入灭活剂进行灭活、脱毒比较缓和的方法。即将灭活溶液分数次加入，加量有小至大，ph由低而高，温度逐步提高到允许的最高温度，这样利于保护抗原的免疫原性。
（4）灭活温度通常情况下，灭活作用随灭活温度上升而加速。但是温度上升，细菌死亡率可成倍增加，如果温度超过40℃或更高，对微生物的抗原性将有不利影响。
（5）灭活时间与灭活剂浓度和作用温度密切相关。一般随着灭活剂浓度及作用温度升高，灭活时间则缩短。在生物制品生产中，应以保证制品安全和效力，采用低灭活剂剂量、低作用温度和短时间处理为最佳。
（6）酸碱度（PH）pH对细菌的灭活作用有较大影响。在微酸性时灭活速度慢，抗原性保持较好，在碱性时灭活速度快，但抗原性易受破坏。同时，PH也影响灭活剂的电离度。未电离的分子一般较易通过细菌细胞膜，灭活效果较好。
（7）有机物的存在被灭活的病毒或细菌液中，如果含有血清或其他有机物质，会影响灭活剂的灭活能力。因为有机物能吸附于灭活剂的表面或者与灭活剂的化学基团相结合。则明显降低灭活剂的灭活作用。
第3节免疫佐剂
免疫佐剂是生物制品常用的物质，单独使用时一般没有免疫原性，与抗原物质混合或同时注射使用时，能非特异性增强抗原特异性免疫应答的作用。
一.概念与作用
佐剂：凡是可以增强抗原特异性免疫应答的物质均称为佐剂。
免疫佐剂作用：①抗原递呈。是指抗原分子递呈给T细胞的方法。佐剂与疫苗的联合作用，有助于抗原性物质在胞内被加工，被MHC分子特异性的结合、保护、运输并递呈给效应细胞。②抗原寻的。是指抗原传递给免疫系统中适当效应细胞的效率。佐剂可延长抗原在组织内的贮存时间，使抗原缓慢降解和缓释。③免疫调节。是指任何可以修饰的免疫效应细胞对抗原或表位进行加工的机制。通过这种机制，可以改变特异性免疫应答的本质或强度。同一抗原和不同佐剂一起使用能够引起不同的免疫反应。
二.常规免疫佐剂
1.铝盐类佐剂
（1）氢氧化铝胶佐剂又称铝胶，质优的铝胶分子细腻，胶体性良好，稳定，吸附力强，保存2年以上吸附力不变。
（2）明矾佐剂
（3）磷酸三钙佐剂
2.油乳佐剂
油乳佐剂是指一类由油类物质和乳化剂按一定比例混合形成的佐剂。此类佐剂著名的有弗氏佐剂（FA），分为弗氏不完全佐剂（FIA）和弗氏完全佐剂（FCA）。弗氏佐剂可使在正常状态下没有免疫原性的物质成为免疫原，其作用机理是先作用于Th1细胞，后作用于Th2细胞，并能启动细胞免疫而发挥作用。
（1）乳剂的概念乳剂是将一种溶液或干粉分散成细小的微粒，混悬于另一不相溶的液体中所形成的分散体系。被分散的物质称为分散相（内相），承受分散相的液体称连续相（外相），两相间的活性物质称为乳化剂。
（2）乳化剂商品乳化剂的种类很多，通常可根据用途依据乳化剂的HLB值（亲水亲油平衡值）进行选择。HLB值高，容易形成水包油型油乳剂；HLB值低，易形成油包水型油乳剂。
（3）白油制乳剂苗用的白油，为无多环芳烃化合物、粘度低、无色、无味和无毒性。（4）乳剂配方与乳化方法乳化剂、油相和水相的配合比例及乳化方法，决定了制备乳剂的性状和稳定性。一种好的乳剂疫苗应是粘度低，颗粒均匀，稳定性良好，呈乳白色。大量生产乳剂疫苗时，可将94%白油与6%司本-80混合后加1%~2%硬脂酸铝，灭菌后即为油相；将抗原液加4%吐温-80为水相。检验：取样于10ml的离心管中装满乳剂，3000r/min 离心15min，相当于保存一年以上不破乳，如不分层，即获得稳定的W/O型乳剂苗，如分层则继续乳化直至合格为止。
3.蜂胶佐剂
三、新型免疫佐剂
1.细胞因子类佐剂
细胞因子是机体的各种细胞在其生命周期中所释放的具有不同生物学效应的物质，是免疫细胞间相互作用的调节信号。细胞因子的作用特点表现为多效性、靶细胞的多样性、多源性、高效性和快速反应性。几种重要的细胞因子为白细胞介素-1、白细胞介素-2、白细胞介素-4、白细胞介素-12、γ-干扰素。
2.CpG DNA
含有非甲基化CpG（胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸）基序的脱氧核糖核酸DNA。它在诱导机体非特异性免疫应答、增强抗原特异性免疫应答及调控免疫应答类型等方面发挥着重要作用。3.毒素佐剂
目前，已证明经过基因突变体外表达的霍乱毒素（CT）、大肠杆菌不耐热毒素（LT）和破伤风类毒素（TT）等没有毒性，具有很好的佐剂作用。
4.免疫刺激复合物（ISCOM）佐剂
应用于多种细菌、病毒和寄生虫病的疫苗，具有产生全面免疫应答的效力，可长期增强特异性抗体应答。
5.脂质体（LIP）佐剂
脂质体在宿主体内可以生物降解，本身无毒性，并且能降低抗原的毒性，无局部注射反应。脂质体与弗氏佐剂或氢氧化铝胶混合使用，效果最佳。
第3章细菌性疫苗生产技术
第1节细菌性疫苗生产工艺流程
1.培养基制备
培养基是人工制备的供细菌生长繁殖的一种营养物质，是维持与繁殖细菌的基础。2.生产用种子制备
（1）原种由中国兽医药品监察所或其委托的单位负责保管。
（2）基础种子由中国兽医药品监察所或其委托的单位负责制备、检验、保管和供应。（3）生产种子有生产企业自行制备、检验和保管。
以上种子如果按菌（毒、虫）种的毒力可以分为:①强毒菌（毒、虫）种：是指具有强大致病力的菌（毒、虫）种，一般免疫原性好，常用于制造某些灭活疫苗、免疫血清以及疫苗的效力检验等。②弱毒菌（毒、虫）种：是指对动物无致病力而具有一定免疫原性的菌（毒、虫）种，主要用于制造弱毒疫苗。
生产用种子是由基础种子扩繁制备而成，包括一级种子和二级种子。通常将基础种子划线接种于适宜琼脂平板培养基中，选取经分离培养后获得的典型菌落5~10个，混合接种于适宜琼脂斜面若干支，一般37℃培养，经纯粹检查和鉴定实验，合格后，作为一级种子。
3.制苗用菌液制备
将合格的种子液以1%~2%的量接种于适宜的培养基，然后依不同菌苗的要求进行培养。
4.半成品检验
上述培养获得的菌液即为半成品。半成品检验包括纯粹检验和活菌计数。如果制备灭活菌苗，菌液经纯粹检验和活菌计数检验合格后，还需用灭活剂进行灭活，灭活后需进行无菌检验。
第2节培养基制备技术
一、培养基的原料标准
（1）水是制造培养基的重要原材料，是细菌生长所需营养成分的良好溶剂。
（2）肉浸汁是生产培养基的基础原料。
（3）蛋白胨是蛋白质经蛋白酶或酸水解后的水解产物。
（4）明胶是由动物胶原组织加工处理制成，是一种蛋白质。
（5）琼脂是从石花菜等海藻类中提取的复杂多糖，为半乳糖胶。
（6）酵母浸出液酵母浸出液含有某些维生素与生长因子，是促进细菌生产繁殖的重要材料之一。
二、培养基分类
1.按原料来源分类
（1）天然培养基
（2）人工合成培养基
2.按物理性状分类
（1）液体培养基
（2）半固体培养基
（3）固体培养基
3.按用途分类
（1）基础培养基
（2）营养培养基
（3）选择培养基
（4）鉴别培养基
（5）增菌培养基
（6）厌气培养基
（7）生化培养基
（8）检验培养基
三、培养基制造程序
1.配制
根据培养基配方准确称取各种成分放于容器中，加少量水浸透原料后，补足水量，使原料溶解。也可用热水或加热进行溶解，并随时搅拌，防止外溢。
2.调整酸碱度
由于细菌对酸碱度很敏感，培养基的酸碱度经过调整后才能使用。
3.过滤与澄清
培养基配制成后一般有沉渣或混浊，须过滤澄清使其清晰透明才可使用。可用纱布、脱脂棉或滤纸进行过滤。澄清是利用培养基中引起混浊的胶体混悬物在高温下聚集沉淀的特性，将制好的培养基置于高压锅内110℃加热30min后，放置数小时，使培养基自然冷却凝固，然后取上层澄清部分进行分装。
4.灭菌
一般培养基均用高压蒸汽灭菌，通常为116℃灭菌30min
5.无菌检验
一般将制好的培养基于37℃保温24~48h，证明无菌后方可应用。
第3节细菌培养技术
细菌培养是指细菌在动物体外的人工培养基以及人工控制的环境中生长繁殖的过程。制备细菌性疫苗首先应通过细菌分离培养，获得单个细菌菌落，制备细菌菌种，然后，进行规模化细菌培养。
一、细菌分离培养
（1）划线接种法此法最为常用，即在不同培养基平面上，以多种方法划线接种细菌，使细菌生成单个菌落。根据菌落特性进行鉴别、挑选典型菌落进行纯培养，制备种子培养物。（2）倾注培养法该法适用于深层条件下生长良好的细菌的分离培养。即先将营养琼脂培养基加热溶解，冷至45~50℃，加入适量细菌培养液，混匀后倾入灭菌培养皿内，制成平板。置37℃培养24~36h后，挑取典型菌落移植培养。
厌氧菌的分离培养多数在含二氧化碳条件下进行。
二、细菌的规模化培养
1.菌种接种量
细菌菌种是指有一定标准的菌体增殖培养物，简称菌种。如接种量过少，会引起生长繁殖缓慢，影响活菌数，有时甚至出现无菌生长；接种量过多，就会将过多的代谢物带入培养基内，造成有害物质的抑制生长。通常菌种接种量为1%~2%。
2.培养时间
最佳培养时间通常依据细菌的生长曲线而定。多数在对数繁殖后期至稳定前期间活菌数最高，生命力最强，宜于收获。
3.培养方法
（1）固体表面培养法常用大扁瓶琼脂平板，经无菌检验后，无菌接入菌种液，使其均匀分布于琼脂表面，平放静置培养，收集菌苔，制成细菌悬浮液，用于制备诊断抗原或疫苗。（2）液体静置培养法适于一般细菌性疫苗的生产。培养容器可用大玻璃瓶或培养罐，培养基装量为容器体积的1/2~2/3，灭菌后，冷却至37℃接入菌种，保持适宜温度静置培养。（3）液体深层通气培养法适用于需氧菌的培养，可加速细菌分裂繁殖，缩短培养时间，提高细菌数量。
（4）透析培养法透析培养是指培养室与培养基室之间隔1层半透膜的培养方法。该系统把培养基与培养物分开为各自的循环系统，中间经透析器交换营养物。
4.采用通气培养需注意的问题
（1）补充营养物质根据被培养的细菌对营养要求，在培养过程中注意补充营养物质。如适当地加葡萄糖补充碳源；适当加蛋白胨或必需氨基酸补充氮源，才能更好发挥通气培养作用，增加菌数，提高制品的质量。
（2）控制通气量细菌对氧的需要，在不同生长发育阶段又有所不同，各种细菌繁殖过程中需氧量亦不一样。
（3）控制最适PH值深层通气培养PH值变化较快，保持培养过程的最适PH值很重要。（4）培养温度在培养过程中要适当调节培养温度，培养罐夹层直接用蒸汽加热往往不稳定，最好用自控调节的温水循环控制温度，以使最适培养温度上下不超过1℃。
（5）控制污染主要是通入的空气处理不当、搅拌轴密封不严或底盘与进出液阀门灭菌不彻底等，为此，培养罐的罐体与部件，应以不锈钢制造，垫圈用聚四氟乙烯制品，使之密封良好，易于灭菌。此外空气滤过装置，首先是将压缩出来的空气通过油水分离。不能使有气味的空气进入培养罐内，经过棉花与活性炭滤器，再经过除菌过滤，以免通气带进杂菌，造成培养液污染。同时培养过程的排气管口也应有消毒设备，以免污染环境。
三、细菌计数计数
1.活菌计数法
活菌计数是将待测样品精确地做一系列稀释，然后再吸取一定量的某稀释度的菌液样品，用不同的方法进行培养。经培养后，从长出的菌落数及其稀释倍数就可换算出样品的活菌数，通常用菌落形成单位（CFU）表示。
（1）倾注平板培养法根据标本中菌数的多少，用普通肉汤将被检标本进行10倍递进稀释。取某稀释度的菌液样品1ml加在灭菌平皿中，然后取预先加热融化且冷至45~50℃的琼脂培养基分别倾入上述平皿中，立即摇匀放平，待其充分凝固后，置37℃培养一定时间。统计平皿上长出的菌落数，乘以稀释倍数，即为每毫升标本中含有的活菌数。
（2）平板表面散布法按常规方法制作琼脂培养基平板，分别取不同稀释度细菌液0.1ml 滴加于平板上，并使其均匀散开。
（3）微量点板计数法本法中培养基的制备、处理及样品的稀释与平板表面散布法相同，只是每个稀释度的接种量为0.02ml，使其自然扩散。
2.比浊计数法
其原理是菌液中含菌数多少与其混浊度成正比。取一定稀释度的菌液与标准比浊管进行比浊，能概略计算出每毫升菌液中的菌数。
3.颜色改变法
其原理是在液体培养基中按0.1%量加入1%酚红溶液，利用支原体生长过程中产酸，使得培养基的颜色由粉红变成黄色，从而确定支原体含量，以每毫升颜色变化单位计数。主要用于支原体培养物的菌数测定。
细菌自家苗
1.细菌分离：取病料，分离致病菌。
2.毒力鉴定：将单个细菌分别接种营养肉汤，37℃培养20h，取1ml接种鸡，选择死亡最快菌株，检验合格作为菌种。
3.菌液培养：将菌种2%比例加入营养肉汤，37℃18~20h。（时间长会产生内毒素）
4.灭活：加入0.5%甲醛，37℃灭活20~24h
5.灭活彻底检验
6.铝胶佐剂制备：将NaOH溶液缓慢加入Alcl3溶液中，当溶液由絮状沉淀变为均一的白色时，停止加热。
7.配苗：菌液：铝胶=1:2充分混匀
8.浓缩：弃去一定上清液，1/2上清液0.5%硫柳汞
9.检验，安检
第4章病毒性组织疫苗生产技术
第1节病毒性组织疫苗生产工艺流程
1.健康动物或敏感禽胚选择
禽胚质量对于病毒和生物制品质量极为重要。目前理想的禽胚是无特定病原体（SPF）鸡胚。据国家标准，SPF鸡胚不应含有鸡的特定的22种病原体，可适用于各种禽疫苗的生产。但由于SPF鸡饲养条件严格，价格昂贵，商品化种蛋供不应求，故常用非免疫鸡胚加以补充，这种蛋只用于灭活疫苗的生产，不能用于活疫苗生产。
2.生产中毒制备
生产毒种是由基础种子扩繁制备而成。通常将基础种子经适当稀释接种于动物或鸡胚中，按规定时间和温度培养，收获含病毒组织或病毒液。经毒种鉴定合格后，直接分装或冻干，注明收获日期、代次，作为生产用毒种。
3.接种、病毒培养与收获
将合格的生产用毒种经适当稀释接种于动物或鸡胚中，接种方法很多，可根据培养的病毒种类进行选择。接种后的动物或鸡胚，按各自规定时间和温度进行培养，收获含毒组织或病毒液，即为半成品。
4.半成品检验
半成品检验包括无菌检验和病毒含量测定。如果制备灭活疫苗，经无菌检验和病毒含量测定合格后病毒液，还需用灭活剂进行灭活，灭活后需进行无菌检验。半成品必须无菌，才可以进行配苗。如不合格经无害化处理。
5.配苗与分装
将合格的半成品加入保护剂或佐剂，定量分装，制成活疫苗或灭活疫苗，轧盖、贴标、包装后入待检库。活疫苗通常加入5%蔗糖牛奶保护剂，经冷冻真空干燥制成，低温冷冻保存。灭活疫苗常用油乳佐剂，按比例与灭活毒液混匀乳化后直接分装，低温保存。
第2节动物增殖病毒技术
一、动物的选择
选择动物的标准：对相应病毒有易感性高；健康，体重、年龄要基本一致，个体差别不宜过大；大动物应来源于非疫区，未接种过相应病毒疫苗的青壮年动物。
二、接种方法
（1）脑内接种法
（2）皮内接种法
（3）皮下接种法
（4）静脉接种法
（5）腹腔接种法
三、接种后动物观察和收获病毒
动物接种后应每天观察特征性变化，如体温曲线、特征性临床症状等。根据观察选出接种后出现符合所要求的反应症候的动物，按规定的时间，规定的方法剖杀，采取含毒组织或器官，各项检验合格后即可使用。
第3节禽胚增殖病毒技术
一、接种途径
（1）绒毛尿囊膜接种多用于嗜皮肤性病毒的增殖，如痘病毒、疱疹病毒等。选择10~12日龄鸡胚，划出气室，将卵气室向上直立，经消毒后于气室中央打孔，用细针头插入刺破壳膜，再退出气室内接种0.2ml病毒液，将病毒滴在气室的壳膜上，病毒即慢慢渗到气室下面
的绒尿膜上，封口后将鸡胚直立培养。另一种方法需作人工气室法，照检后划出气室和胚位，将卵横卧于蛋架上，胚胎位置向上，消毒后于气室部位和胚位的卵壳上分别钻一个小孔，用吸耳球紧贴气室孔轻吸，鸡胚面小孔处的绒毛膜下陷形成一个人工气室，天然气室消失。在人工气室处接种0.1~0.2ml病毒液，封孔，人工气室向上横卧培养。
（2）尿囊腔接种通常选9~11日龄鸡胚，在气室边界上2~3mm处避开血管处，消毒后打孔，接种病毒0.1~0.2ml，封口后孵育。
（3）卵黄囊接种法通常用5~8日龄鸡胚，经照检后划出气室和胎位，在气室中心壳上钻一小孔，接种的针头沿胚的纵轴插入约3cm，注入0.1~0.2ml
（4）羊膜腔接种法
二、病毒培养与病毒收获技术
（1）绒毛尿囊膜的收获将整个蛋内容物倒掉，用灭菌镊子撕下整个绒毛尿囊膜，放灭菌容器中备用。经研磨制成病毒悬液。病毒在绒毛尿囊膜上可形成肉眼可见的痘斑。
（2）尿囊液的收获用镊子压住胚体，用灭菌吸管插入尿囊液腔，吸取尿囊液。
（3）羊水的收获收获尿囊液后，用无菌镊子夹起羊膜，用灭菌吸管或注射器刺入羊膜腔吸取羊水。
（4）卵黄囊的收获
（5）胚胎的收获用眼科镊子撕破绒毛尿囊膜和羊膜，挑起鸡胚，置灭菌容器中。
三、病毒含量测定计术
毒力或毒价单位基本上采用半数致死量（LD50）表示，而且LD50的计算应用了统计学方法，减少了个体差异的影响，因此结果比较正确。以感染发病作为指标的可用半数感染量（ID50）；以体温反应作指标者，可用半数反应量（RD50）。用鸡胚测定时，可用鸡胚半数致死量（ELD50）或鸡胚半数感染量（EID50）；在细胞培养上测定时，可用细胞半数感染量（TCID50）.
Lg EID50=高于50%死亡的稀释倍数的对数×稀释系数的对数+距离比
距离比=（高于50%的死亡率—50%）/(高于50%的死亡率—低于50%的死亡率)
四、影响禽胚增殖病毒的因素
（1）种蛋质量种蛋质量直接与增殖病毒的质和量相关。最理想的禽胚是SPF种蛋，其次是非免疫种蛋。
①病原微生物家禽有很多疫病及病原可垂直传递于鸡胚，如白血病等。这些病原体既可污染制品本身，又可影响病毒在鸡胚内的增殖。
②母源抗体鸡感染病原或使用抗原后会使其种蛋带有母源抗体，从而影响病毒在鸡胚内的增殖。
③禽胚污染禽胚污染是危害病毒增殖最严重的因素之一，应严格防止。定期清扫消毒孵化间，保持室内空气新鲜，无尘土飞扬。
（2）孵化技术
①温度通常禽胚发育的适宜温度为37~39.5℃，其适宜温度应控制在37.8~38℃。鸭、鹅孵化温度比鸡胚高。此外，鸡胚较能忍受低温，短期降温对鸡胚发育还有促进作用，故禽胚孵化温度应严格控制，宁低勿高。有些病毒对温度比较敏感，如鸡胚接种传染性支气管炎病
毒后，应严格控制孵化温度，不应超过37℃。
②湿度湿度可控制孵化过程中蛋内水分的蒸发。鸡胚孵化湿度标准为55%~65%
③通风禽胚在发育过程中吸入氧气，排出二氧化碳。因此需更换孵化机内空气。
④翻蛋在孵化过程中定期翻蛋，既可使胚胎受热均匀，有利于发育；又可防止胚胎与蛋壳粘连。翻蛋还可改变蛋内部压力，强制胚胎定期活动，促使胚胎发育。
（3）接种技术
不同病毒的增殖有不同的接种途径，同一种病毒接种不同日龄禽胚获得的病毒量也不同。如通常鸡胚发育至13~15日龄，鸭胚发育至15~16日龄，尿囊液含量最高，平均6~8ml，羊水1~2ml。因此，由尿囊腔接种病毒时，应根据不同病毒培养所需要的时间选择最恰当的接种胚龄，以获得最高量病毒液。
第5章病毒性细胞疫苗生产技术
第1节病毒性细胞疫苗生产工艺流程
1.细胞选择与制备
可根据培养的病毒种类选择敏感细胞。选择的依据是病毒的适应性强、毒价高；细胞来源方便、制备简单、生命力强。
2.生产毒种制备
生产毒种是由基础种子扩繁制备而成。通常将基础种子按规定在易感动物、禽胚或敏感细胞继代培养，经检验合格后，作为生产用毒种。毒种继代不超过3~5代。
3.接毒、培养与收获病毒
将合格的生产用毒种接种于细胞单层，病毒接种一般按维持液的1%~10%量接入。科学接种量应以TCID50为依据。病毒接种细胞方法有异步接毒和同步接毒两种。异步接毒是细胞长成单层后倒去生长液，将毒种37℃吸附1h后加入维持液。多数病毒采用该接毒方式。同步接毒是在制备细胞的同时或在制备细胞后4h内将病毒接入，主要用于病毒复制发生在细胞有丝分裂时期的病毒，如细小病毒等。
接毒后选择适宜温度进行培养，大多数病毒增殖温度为37℃。病毒在敏感细胞内增殖一般会产生细胞病变（CPE），当CPE达75%左右时收获，反复冻融多次使病毒释放，细胞培养物；或将细胞培养物离心除去细胞碎片，收集上清液，即为半成品，-20℃保存。
4.半成品检验
半成品检验包括无菌检验和病毒含量测定。
5.配苗与分装
将合格的半成品加入保护剂或佐剂，制成活疫苗或灭活疫苗，入待检库。成品检验合格后，可以销售使用。
第2节细胞制备技术
细胞体外培养已成为增殖病毒的主要方法。细胞增殖病毒技术的原理主要是为病毒易感的组织细胞提供良好的体外生长环境，使细胞适应并繁殖，从而为病毒增殖提供宿主进行复制。
一、细胞类型
（1）原代细胞是指由新鲜组织经胰酶消化后，将细胞分散制备而成，如鸡胚成纤维细胞（CEF）。原代细胞对病毒的检测最为敏感，但制备和应用不方便。
（2）次代细胞原代细胞长成单层后用胰酶从玻璃瓶壁上消化下来后，再作培养的细胞称次代细胞，又称继代细胞。它保持原来细胞的理化特性不变，可在体外传代几代到几十代，最后不可避免地衰老死亡。次代细胞形态和染色体与原代细胞基本相同。
（3）传代细胞是指从原代细胞经传代培养后得来的可以长期连续传代的细胞。包括细胞株和细胞系。
细胞系是指从原代细胞经传代培养后得来的一群不均一的细胞，可以长期连续传代。细胞系
又分为有限细胞系和无限细胞系，有限细胞系在体外传代是有限的，无限细胞系能在体外无限传代，其染色体数目及增殖特性均类似于恶性肿瘤细胞，且多来源于癌细胞。
细胞株由细胞系克隆获得的、具有特殊遗传、生化性质或特异标记的细胞群，其生物学性质、生化性质呈均一性。细胞株又分有限细胞株和连续细胞株。有限细胞株的大多数染色体为二倍体，能连续传很多代，但为有限生命；没有肿瘤原。广泛应用于病毒性生物制剂制备，安全可靠。连续细胞株可以连续传代，如HeLa细胞株。
二、细胞培养液的配制
1.生理平衡盐溶液
（1）汉克氏液
（2）欧氏液
2. 7.5%碳酸氢钠溶液
3. 细胞分散液
（1）0.25%胰蛋白酶溶液
（2）EDTA-胰酶分散液
4. 指示剂
（1）1%酚红溶液
（2）0.1%中性红溶液
5. 营养液
（1）0.5%乳汉液
（2）0.5%乳欧液
（3）合成培养液
（4）3%谷氨酰胺溶液
6.血清
血清是细胞污染支原体、病毒等的重要来源。因此，对血清的质量控制尤为重要。血清必须无菌，不得有支原体污染，不得有牛黏膜病毒污染，血清中细菌内毒素含量应不高于10EU/ml
7.抗生素溶液
三、细胞制备方法
1.原代细胞
首先选取适当组织或器官，采用机械分散法如剪碎、挤压等使之成为约1mm3小块，然后用0.25%胰酶消化掉细胞间的组织蛋白，消化的时间长短与温度、组织的来源及大小等有关，一般37℃消化10~50min，4℃消化需要12h左右。消化好的组织块去掉胰酶经吹打成分散的细胞，加上营养液进行培养。
（1）鸡胚成纤维细胞（CEF）制备
（2）犊牛睾丸细胞（BTC）制备
2.传代细胞
多采用EDTA-胰酶消化法，胰酶浓度为0.05%，其作用是消化细胞间的组织蛋白；EDTA浓度为0.01%，其作用是螯合维持细胞间的钙镁离子和细胞与细胞瓶间的钙镁离子，使细胞易脱落和分散。
3.细胞冻存与复苏
细胞株与细胞系均需保存于液氮中（-196℃）。为保持细胞最大存活率，一般采用慢冻快融法。
四、细胞培养法
（1）静置培养培养瓶和营养液都静止不动，细胞沉降后贴附在培养瓶内面上生长分裂，3~5d形成细胞单层。静置培养是最常用的细胞培养方法。
（2）转瓶培养将培养瓶放在转瓶机上，使营养液和培养瓶作相对运动，转瓶转速一般为9~11r/h，使贴壁细胞不始终浸于培养液中，有利于细胞呼吸和物质交换。可在少量的培养液中培养大量的细胞来增殖病毒，多用于生物制品生产。
（3）悬浮培养是通过振荡或转动装置使细胞始终处于分散悬浮于培养液内的培养方法，培养瓶不动营养液运动。主要用于一些在振荡或搅拌下能生长繁殖的细胞，如生产单克隆抗体的杂交瘤细胞。
（4）微载体培养微载体是以细小的颗粒作为细胞载体，通过搅拌悬浮在培养液内，使细胞在载体表面繁殖成单层的一种细胞培养技术，兼有单层和悬浮细胞培养的优点。
五、细胞培养要素
（1）培养液不同培养液适用于不同细胞，
（2）血清血清中含有细胞生长的部分必需氨基酸，还有促进细胞生长和贴壁的成分。因此在细胞培养中必须加入一定量的血清方能获得成功。目前国内多用犊牛血清，使用前56℃水浴灭活30min。细胞培养时血清含量为营养液的10%，接毒后含量不超过5%。（3）细胞接种量在适宜的培养条件下，需要有一定量活细胞才能生长繁殖，这是因为细胞在生长过程中分泌刺激细胞分裂的物质，若细胞量太少，这些物质分泌量少，细胞生长为单层的速度也慢，但细胞过多对细胞生长也不利。
（4）PH 细胞生长的PH值为6.6~7.8，但最适PH值为7.0~7.4。细胞代谢产生的各种酸性物质可使PH值下降，因此要使用缓冲能力强的培养液。
（5）温度细胞培养的最适温度应与细胞来源的动物体温一致，在此基础上，如升高2~3℃，则对细胞产生不良影响，甚至在24h内死亡。
六、细胞培养污染与控制
细胞培养污染以微生物的污染最常见，化学物污染较少，而细胞交叉污染近几年来随细胞种类的增多也有发生。
（1）细菌污染多见于消毒不彻底、操作不严格和环境污染所致，表现为营养液很快混浊和PH值下降，随之细胞死亡脱落。
（2）真菌污染也与消毒不彻底和操作不严格有关。在培养液中可见白色或黄色小点状悬浮物，镜检时可见菌丝结构。
（3）支原体污染支原体在细胞培养中最常见，不宜觉察，危害较大。目前细胞支原体污染率为50%~60%，主要来源于犊牛血清、实验人员、细胞原材料及已污染的细胞。目前多用以下方法：①抗生素处理②41℃18h ③加入特异性抗支原体高免血清等。这些方法在一定程度上能降低支原体在细胞培养中的滴度，但很难彻底清除。
（4）病毒污染病毒污染是指细胞培养中出现非目的病毒。其来源有组织带毒和培养液带毒。细胞一旦污染病毒，就很难排除。
（5）胶原虫污染在犊牛血清中，有时会发现一种新的对细胞培养有害的胶原虫，一经污染就难于消除。目前唯一的方法是将犊牛血清37℃培养1个月以上，然后高速离心取沉淀物镜检检查胶原虫。
第3节细胞增殖病毒技术
一、细胞的选择
病毒须在敏感的宿主细胞中增殖，宿主细胞一般选择相应易感动物的组织细胞。通常病毒的细胞感染谱是通过试验获得的，同一病毒在不同敏感细胞增殖后其毒价不尽相同。二、病毒增殖指标与收获
细胞接种病毒后，在适宜温度下培养，多数病毒在敏感细胞内增殖可引起细胞代谢等方面的变化，发生形态改变，即细胞病变，显微镜下主要表现为：①细胞圆缩②细胞聚合③细胞融合形成合胞体④轻微病变。有些病毒在细胞上增殖并不产生CPE，如猪瘟病
毒和猪圆环病毒等。一般在CPE达75%左右时收获细胞培养物，低温冷冻保存。
三、细胞培养病毒要素
病毒在敏感细胞上增殖需要一定条件，只有在最佳条件下，病毒才能大量增殖，毒价才会最高。
（1）血清细胞培养必须加一定量血清以维持细胞的生长。但是，血清中存在一些非特异性抑制因子，它们对某些病毒的生长和增殖有抑制作用，经56℃30min不能被灭活。为了克服血清中非特异性抑制因子的作用，病毒维持液内血清含量一般不超过5%。目前已有无血清培养液可替代，以维持细胞活力并避免血清中某些物质对病毒增殖的抑制作用。
（2）温度病毒细胞培养的温度多数为37℃，此温度有利于病毒吸附和侵入细胞，如口蹄疫病毒于37℃可在3~5min内使90%的敏感细胞发生感染，而在25℃时需要20min，15℃以下则很少引起污染。但有些病毒的最适温度或高于37℃或低于37℃。
（3）PH PH值一般在7.2~7.4才能防止细胞过早老化，有利于病毒增殖。如果维持液PH下降过快或过低，也可用7.5%NaHCO3液调整。
（4）接毒量接种量小，细胞不能完全发生感染，会影响毒价；接种量过大，会产生大量无感染性缺陷病毒，如水泡性口炎病毒。为获得培养液中典型病毒和高度感染性，接种时必须用高稀释度的病毒液，如应用高浓度的病毒液传代，在第3~4代时会出现明显的缺陷病毒，发生自我干扰现象，病毒滴度下降。
（5）接毒方法应根据病毒特点选择异步接毒和同步接毒，以获得高效价病毒。
（6）支原体污染问题支原体污染不仅消耗维持液的营养，从而影响细胞生长；同时，也可以影响病毒的增殖。
第6章治疗用生物制品生产技术
第1节概述
治疗用生物制品是指用于治疗动物传染病的制品。一般是指利用微生物及其代谢产物等作为免疫原，经反复多次注射同一动物体，所产生的一类高效价抗体，主要包括免疫血清、卵黄抗体和牛奶抗体等。免疫血清又称高免血清或抗血清，根据免疫血清作用对象不同，可分为抗病血清和抗毒素两类。
1.作用机理
治疗用生物制品中都含有特异性的免疫球蛋白即抗体，输入动物体后，动物即可被动地获得抗体，从而形成免疫力，即所谓的人工被动免疫，因此可以在疫区对未发病动物进行紧急预防接种，一般不用于平时的预防接种。当动物已感染某种病原微生物发生传染病时，注射大量抗病血清后，血清中的抗体可抑制动物体内的病原体继续繁殖，并协助体内正常预防机能，消灭病原微生物，使病畜逐渐恢复健康。
2.应用
治疗用生物制品用作紧急预防注射，通常是在已经发生传染病或受到传染病威胁的情况下使用，其优点是注射后立即产生免疫，疫苗是起不到这种作用的。
第2节免疫血清生产工艺流程
1.免疫动物的选择
制备免疫血清的动物有马、牛、绵羊等。用同种动物生产的称同源血清，用异种动物生产的称异源血清。为了避免疫病的传播，制备抗血清时，一般要求用异种动物，通常用马和牛等大动物制备。生产中制备免疫血清用马较多，因为血清渗出率较高，外观颜色较好。由于动物存在个体免疫应答能力差异，所以选定动物应有一定的数量，一个批次应用多头动物。
2.免疫抗原的制备
制造免疫血清的抗原，一般是用微生物或其毒素，或微生物的提取物等纯化的完全抗原。
（1）细菌免疫原制备基础免疫用抗原多为疫苗或死菌，而加强免疫的抗原，一般
选用毒力较强的菌株。多价抗病血清用的抗原，要求用多血清型菌株。菌种接种于最适生长的培养基，按常规方法进行培养。通常活菌抗原需用新鲜培养菌液，并按规定的浓度使用，培养时间较死菌抗原稍短为好，多用16~18h培养物，经纯粹检查，证明无杂菌者，即可作为免疫抗原。为减少由培养基带来的非特异性成分，可通过离心，弃上清，再将菌体制成一定浓度的细菌悬液，作为免疫原。
（2）病毒免疫原制备以病毒为免疫原，须通过反复冻融或超声裂解方法，将病毒从细胞中释放出来，并尽可能地提高病毒滴度和免疫原性。如猪瘟血清，基础免疫的抗原，可用猪瘟兔化弱毒疫苗；加强免疫抗原，则用猪瘟血毒或脾淋毒乳剂等强毒。猪接种猪瘟强毒发病后5~7d，当出现体温升高及典型猪瘟症状时，由动脉放血，收集全部血清，经无菌检验合格后即可作为抗原使用。接种猪瘟强毒的猪，除血中含有病毒外，脾脏和淋巴结也有大量的病毒，可采集并制成乳剂，作为抗原使用。
（3）抗毒素血清免疫原制备免疫原可用类毒素、毒素或全培养物（活菌加毒素），但后两者只有需要加强免疫刺激的情况下才应用，一般多用类毒素作免疫原。
3.免疫程序
免疫程序分为两个阶段，第一阶段为基础免疫，第二阶段为加强免疫。从被免疫动物初次接受免疫原刺激，到产生少量抗体，这段时间在制造程序中称为基础免疫。基础免疫对第二阶段的加强免疫有重要关系。
（1）基础免疫通常先用本病的疫苗按预防剂量作第1次免疫，经1~3周再用较大剂量的灭活苗或活菌或特制的灭活抗原再免疫1~3次，即完成基础免疫。基础免疫大多数1~3次即可，抗原无须过多过强，可为加强免疫产生有效地回忆应答打下基础。
（2）加强免疫亦称高度免疫。一般在基础免疫后2~4周开始进行。注射的抗原可采用灭活抗原，也可采用强毒微生物。微生物的毒力越强，一般免疫原性越好。免疫剂量逐渐增加，每次注射抗原间隔时间多为5~7d，加强的注射次数要视血清抗体效价而定。再用强毒微生物进行加强免疫时，必须在强毒动物舍或负压隔离器中进行，并采取严格的控制措施，以防散毒。
（3）免疫途径免疫原注射途径一般采用皮下或肌肉注射。如果免疫剂量大，应采用多部位注射法，尤其在应用油佐剂抗原时更应注意此点。
4、血液采集与血清提取
（1）采集次数和方法一般血清抗体的效价高峰在最后1次免疫后的7~10d。采血可以全放血或部分采血，即1次采集或多次采集，尽可能做到无菌操作。多次采血者，按体重每千克采血约10ml。全放血者，在最后1次高免之后的8~11d进行放血。放血前，动物应禁食24h，但需饮水以防止血脂过高。
（2）血清的分离采血时一般不加抗凝剂，全血在室温中自然凝固。待血液凝固后进行剥离或者将凝血切成若干小块，并使其与容器剥离。先置于37℃1~2h，然后置于4℃冰箱过夜，次日离心收集血清。如果采集的血量较大时，可采用自然凝固加压法。
第3节卵黄抗体制备
产蛋的禽类感染某些病原后，其血清和卵黄内均可产生相应的抗体，而且，卵黄中的抗体水平同样也随抗原的反复刺激而升高。因此，通过免疫注射产蛋鸡，即可由其生产的蛋黄中提取相应的抗体，与高免血清一样只限用于相应疫病的治疗和紧急预防接种。该类制剂称为卵黄抗体（IgY）。
第7章诊断用生物制品生产技术
利用微生物、寄生虫及其代谢产物，或动物血液、组织制备的，专供诊断动物疫病、监测动物免疫状态及鉴定病原微生物的制品称为诊断制剂或诊断液。
第1节诊断抗原
诊断抗原按性质分为颗粒性抗原、可溶性抗原两种，颗粒性抗原主要用于凝集性反应，可溶性抗原可用于沉淀性反应极其他种类的诊断试验。按照诊断试验的种类可将诊断抗原分为凝集反应抗原、沉淀反应抗原、补体结合反应抗原、中和试验抗原及变态反应抗原等。一、凝集反应抗原
凝集反应抗原有直接凝集反应抗原和间接凝集反应抗原两种。
1.凝集反应抗原制备方法
一般选择符合要求的合格菌株，若型别不同，则根据需要选择使用。接种于适宜培养基培养。用含福尔马林生理盐水洗下培养基上的细菌，经一定时间灭活，或用生理盐水洗下后加热灭活。将灭活的菌液过滤，除去大颗粒，离心弃上清，将沉淀用福尔马林生理盐水或石炭酸生理盐水稀释成每毫升含规定菌数。经无菌检验、特异性检验和标化合格者即为浓菌液。间接凝集抗原制备使用的载体多为红细胞。先取可溶性抗原，然后将抗原按量吸附于双醛化的载体红细胞上，使红细胞致敏，即为间接凝集反应。
2.常用的凝集反应抗原
目前应用的有布氏杆菌凝集反应抗原、马流产凝集反应抗原、猪萎缩性鼻炎凝集反应抗原、鸡白痢伤寒多价平板凝集试验抗原。
二、沉淀反应抗原
根据使用方法不同，沉淀反应抗原可分为环状反应抗原、絮状反应抗原、琼脂扩散反应抗原和免疫电泳抗原等。
1.沉淀抗原制备方法
（1）细菌沉淀抗原制备选择适宜菌种接种于合适的培养基上培养。培养完毕后收集细菌培养物，灭菌、研磨成菌粉，按一定比例加入0.5%石炭酸生理盐水浸泡，过滤后的滤液即为沉淀抗原。也可将收集的细菌培养物直接加入一定量的福尔马林或酒精，静置一定时间；或加入一定量醋酸，100℃水浴30min；或用裂解菌体等方法提取抗原，然后离心，收集上清，必要时浓缩即成为沉淀抗原。
（2）病毒沉淀抗原制备选用适宜的动物组织或细胞培养病毒。收获含毒高的动物组织制成匀浆，加入缓冲液或生理盐水，裂解细胞，置于40℃浸毒。高速离心取上清，灭活后即成沉淀抗原。
2.常用的沉淀反应抗原
鸡法氏囊病琼脂扩散反应抗原、马立克氏病琼脂扩散反应抗原、标准炭疽抗原、小鹅瘟病沉淀抗原、山羊痘沉淀抗原等。
三、补体结合反应抗原
补体结合反应是一种广泛应用的经典性检测抗原抗体的方法，补体结合反应抗原主要用于检测相应抗体。
1.补体结合反应抗原制备方法
（1）细菌性抗原制备先将合格的菌株在培养基上大量培养，然后用0.5%石炭酸生理盐水冲下，收集菌液，高压灭菌或加温水浴灭活，或加福尔马林灭活，然后离心除去上清，将沉淀悬浮于0.5%石炭生理盐水中，置冷暗处浸泡一段时间，收集上清即为抗原。
（2）病毒性抗原制备病毒在细胞上大量增殖后，收获病毒液，冻融3次，3000r/min离心30min，收集上清，经适当处理即为抗原。
2.常用的补体结合反应抗原
鼻疽补体结合试验抗原、布鲁氏菌补体结合试验抗原、马传染性贫血补体结合试验抗原等。
四、变态反应抗原制造
细胞内寄生菌，如鼻祖杆菌、结核杆菌、布氏杆菌等，在感染过程中引起以细胞免疫为主的变态反应，即感染机体再次遇到同种病原菌或其代谢产物时出现一种具有高度特异性和敏感
动物养殖场兽药、兽用生物制品管理制度 一、贯彻预防为主的方针。 二、进行预防、治疗、诊断时使用的兽药，应来自具有《兽药生产许可证》和产品批准文号的生产企业，所用兽药标签符合《兽药管理条例》规定。 三、疫苗等生物制剂符合“兽医生物制品质量标准”要求，并按规定运输、保管和使用。 四、杜绝使用镇痛药、镇静药、中枢兴奋药、化学保定药及骨骼肌松驰药。 五、慎重使用经农业部批准的拟肾上腺素药、平喘药、抗（拟）胆碱药、肾上腺皮质激素类药和解热镇痛药。 六、坚持科学用药，严格遵守规定的用法、用量。 七、严格遵守药物安全使用规定和休药期规定。 八、建立并保存全部购药、用药记录。 九、禁止使用人用药物和兽用药物原粉。 十、禁止使用未经国家批准或已经淘汰的兽药。 动物养殖场兽用药品休药期制度 一、兽药保管员在新购药品时，依据发票查清件数，根据产品保管要求分类存放，如有过期药品及时销毁。 二、各车间取药必须凭处方取药，由兽医、防疫员开处方，主管兽医签字方可取药，所有处方药司药员必须凭执业兽医师签字发药。 三、生物制品，如疫苗、血清、类毒素等必须严格执行冷链制度，需要低温保存的药品必须用保温箱装取，并做到随用随取。 四、使用饲料添加剂，应具有农业部颁发的饲料添加剂生产许可证的正规企业生产的，并具有产品批准文号。 五、不得在饲料中直接添加兽用原料药，不得使用国家禁止使用的违禁药物。
六、配合饲料中有害物质及微生物含量符合GB13078规定。 七、严禁使用国家《无公害食品、生猪生产使用准则》规定中的禁用品。 八、严格执行兽药休药期，60kg以上生猪使用了有休药期的兽药必须作好记录并单独饲养，达到休药期之后方可出售，产蛋期的禽类，产乳期的乳用药物、使用兽药，必须严格执行弃蛋期和弃乳期，并作好记录。
兽用生物制品的分类与使用 一、兽用生物制品的分类 兽用生物制品指应用微生物学、寄生虫学、免疫学、遗传学和生物化学的理论和方法制成的菌苗、疫苗、虫苗、类毒素、诊断制剂和抗血清等制品。用于预防、治疗、诊断畜禽等动物特定传染病或其他有关的疾病。我国现生产的品种已有近200个，最常用的有几十个品种，按照其用途分为以下三大类： （一）预防用生物制品包括疫苗、菌苗、虫苗和类毒素。 1.疫苗疫苗是利用病毒经除去或减弱它对动物的致病作用而制成的。疫苗可分为两类：一类是活毒或弱毒疫苗。制成这种疫苗的病毒毒力必须是减弱了的，没有致病能力，也不会使动物发生严重反应。如猪瘟兔化弱毒冻干疫苗、鸡新城疫活疫苗等。另一类是死毒疫苗或灭活疫苗。制成这种疫苗的病毒已被化学药品或其他方法杀死或灭活。如猪口蹄疫O型灭活油佐剂疫苗、鸡产蛋下降综合征灭活疫苗等。 2.菌苗菌苗是利用病原细菌经除去或减弱它对动物的致病作用而制成的。菌苗可分为两类：一类是毒力减弱的细菌制成的活菌苗，如Ⅱ号炭疽芽胞苗、布鲁氏菌Ⅱ号活菌苗等；另一类是用化学方法或其他方法杀死细菌制成的死菌苗，如猪丹毒灭活疫苗、鸡大肠杆菌病灭活疫苗等。 3.虫苗虫苗是利用病原虫体除去或减弱它对动物的致病作用而制成的。常将菌苗、疫苗、虫苗通称为疫苗。 4.类毒素某些病原细菌，在生长繁殖过程中产生对动物有害的毒素，用甲醛等处理后除去它的有害作用，使动物注射后产生抵抗该细菌的能力，这类处理过的毒素，叫类毒素，如破伤风类毒素。 （二）治疗用生物制品包括抗血清和抗毒素。 1.抗血清动物经反复多次注射某种病原微生物时，会产生对该病原微生物的高度抵抗能力。采取这种动物的血液提出血清，经过处理即可制成抗
兽用生物制品管理制度范本精选 公司兽药销售工作必须遵守《兽药管理条例》、《兽药经营质量管理规范》《新疆维吾尔自治区兽药经营质量管理规范实施细则》 等法律法规和公司相关管理规定。公司凡与兽药相关的部门、岗位 必须严格遵守兽药销售管理制度。 1、兽用生物制品销售要由销售内勤根据业务员订货单微机打印 三联销售出库凭证。销售出库凭证要载明兽用生物制品商品名、通 用名、批号、规格、生产单位、购货单位、销售数量、销售日期等。销售内勤电脑保存销售信息，并将第一联交会计与业务员对账。 2、业务员凭销售出库凭证到仓库提货。库管员要遵循先进先出 的原则按批号和有效期先后给予出库。并留存销售出库凭证第三联 作为出库和记录。业务员在出库凭证上签字。 3、出库时库管员和质量检验管理员要对出库产品质量进行逐一 检验。有外观破损超期或其它任何质量问题的一律不准出库销售。 4、零盒或零支药品要分类，按运输保管要求打包。兽用生物制 品必须装疫苗保温周转箱加冰袋或冰瓶密封避光运输，并建立记录。 5、兽用生物制品送到客户处要现场按销售出库凭证一一点验， 核实产品数量及相关信息。并将销售出库单第二联交客户作为购货 凭证备查。业务员要把生物制品放到客户指定的保存仓库内摆放整齐。 6、业务员送货必须结算现款，不得赊销。 7、业务员送货回公司当天或第二天必须与财务部会记核对销售帐，并交回货款。 第一条为进一步加强兽用生物制品管理工作，根据《兽药管理条例》、《兽药管理条例实施细则》，制定本规定。
第二条本规定适用于在我国境内从事生产、经营、使用兽用生物制品的单位和个人。 第三条开办兽用生物制品生产企业必须报所在省、自治区、直辖市畜牧行政主管部门和农业部审核同意后方可列项目计划。开办生产兽用生物制品的“三资企业”必须在确定意向之前报所在省、自治区、直辖市畜牧行政主管部门和农业部批准后，方可确定意向。 第四条现有兽用生物制品生产企业，应按照《兽药生产质量管理规范》(简称GMP)的要求，制定切实可行的技改方案并尽快实施，对确无条件进行改造的兽用生物制品厂要逐步转向生产其他产品，逾期达不到GMP要求的兽用生物制品生产企业，农业部将明令其停止生产兽用生物制品。 第五条兽用生物制品生产企业应加强和健全质量检验监督检查，配备必需的检验设备和技术人员，严格按照国家标准从事生产和检验，严禁出售不合格产品。生产企业监察室(质检室)主任具有质量否决权。 第六条鼓励和支持兽医科研、教学及其他单位研究兽用新生物制品。兽用新生物制品的研究、中试及区域试验，必须严格遵守《兽用新生物制品管理办法》的规定。严禁未经试验所在省、自治区、直辖市畜牧行政主管部门批准，擅自用“中试”产品进行扩大区域试验。 第七条提倡和鼓励研究单位通过有偿转让、有偿服务或技术入股等多种形式与兽用生物制品生产企业横向联合。 第八条农业科研、科学单位生产兽用生物制品必须遵守《生物制品生产车间管理办法》的规定。上述单位生产的兽用生物制品试产品批准文号及产品批准文号一律由农业部畜牧兽医司核发，严禁生产和销售无批准文号产品。 严禁不符合《生物制品生产车间管理办法》规定的任何单位生产兽用生物制品。 第九条“三资企业”的产品批准文号由农业部畜牧兽医司核发。
兽用生物制品管理制度 第一条人员着装管理和个人卫生管理制度 一、保持良好的个人卫生习惯，坚持个人卫生四勤（勤洗手、剪指甲；勤洗澡、 理发；勤换衣服、被褥；勤换工作服、帽）做到个人卫生整洁。 二、工作人员工作时间要保持服装干净整洁。 三、库房管理人员进出冷库要注意穿防护服装，做好个人防护。 四、每年对直接接触兽用生物制品的人员进行健康检查，并建立健康档案，患有可能污染兽用生物制品的疾病的人员应当调离直接接触兽用生物制品的岗位。 第二条兽用生物制品出入库核对制度 一、兽用生物制品入库时，首先由质量管理员进行质量核对，质量合格后由库 房保管员进行实物核对，出库时由库房保管员进行核对； 二、质量管理员进行质量核对，逐批、逐品种核对生产单位、批准文号、标签、说明书、中国兽用生物制品监查所的批签发证明、包装质量、生产批号、出厂日期和有效期，填写《兽用生物制品验收记录》，对具有特定管理要求的兽用生物制品，要核对有关证明和文件。不符合规定的兽用生物制品不得入库或者出库； 三、库房保管员进行实物核对，首先按生产单位提供的随货同行单内容进行核对，然后按购进记录要求记录的内容对购入的每一批兽用生物制品都要进行逐批检查验收，填写《兽用生物制品经营单位购进记录》； 四、库房保管员进行出库核对时，要按出库单和销售记录要求记录的内容，对售出的兽用生物制品进行逐项检查、核对，并建立真实、准确完整的《兽用生物制 品经营单位销售记录》； 五、做好真实、准确、完整的检查验收核对记录，记录至少保存至兽用生物制
品有效期后二年。 第三条兽用生物制品订购制度 一、严格按《河北省动物防疫条例》第六条和第九条的规定，全省动物防疫所需的计划免疫和强制免疫用兽用生物制品，全部由省动物疫病预防控制中心统一订 购，省、市、县、乡逐级供应； 二、订购国内兽用生物制品应当为中国合法兽用生物制品生产企业生产的，并 依法取得产品批准文号、具有批签发证明的兽用生物制品； 三、订购的进口兽用生物制品应当为国外企业依法在国内设立的销售机构或者依法委托的国内代理机构销售的合法产品，并取得进口产品注册证书的合法产品； 四、单位定购的兽用生物制品应保存生产单位的供货凭证，建立真实、完整的 采购记录； 五、采购记录应当载明兽用生物制品通用名称、批准文号、批号、规格、有效期、生产厂商、供货单位、购入数量、购入日期、经手人或者负责人以及国务院兽 医行政管理部门规定的其它事项； 第四条退回和不合格兽用生物制品管理制度 一、退回兽用生物制品产品管理规定 1、质量负责人会同仓库管理人员对退回兽用生物制品按兽用生物制品验收制度 进行逐批验收； 2、退回兽用生物制品应先存放于待验区，确认无质量问题后，移入合格品区； 3、怀疑兽用生物制品产品有内在质量问题时，应将退回兽用生物制品送有关部 门检验； 4、不合格的退回兽用生物制品产品按不合格兽用生物制品处理规定处理。 二、不合格兽用生物制品管理规定
兽用生物制品概述 兽用生物制品是根据免疫学原理，利用微生物、寄生虫及其代谢产物或免疫应答产物制备的一类物质。这类物质专供相应疾病的诊断、预防和治疗之用。从狭义上讲，可将用于畜禽疾病的诊断、检疫、治疗和免疫预防的诊断液、疫苗和抗血清统称为兽用生物制品。 一、生物制品简史 自11世纪起，我国就有峨嵋山人用天花病人的痂皮接种儿童鼻内或皮肤划痕以预防天花的记载，以后又相继传到日本和欧洲，这种种痘术被视为生物制品创制及主动免疫的雏型。1976年英国医生詹纳根据种痘术的启示，用牛痘浆或痘痂给人接种预防天花，发明了牛痘疫苗，在英语中也由牛痘（Vaccinia）而延伸为疫苗(Vaccine）。其后，法国免疫学家巴斯德在1881年及其之后的工作中，用理化方法以及生物学方法，减低病原微生物毒力，相继研制成了用减毒株制成的炭疽芽孢苗、连续通过兔体获得的减毒狂犬病疫苗以及减毒禽霍乱和猪丹毒，为免疫学和生物制品学奠定了基础。1889年耶森等从白喉杆菌培养物滤液中分离到白喉菌素，免疫小鼠和家兔后在血清中发现有中和白喉菌素的物质，从而创制了抗毒素血清，用于治疗感染，使之获得被动免疫，这一血清学的发现为以后制备各种被动免疫血清提供了科学依据。贝菲福和科勒在1898年提出制造灭活苗的方法。罗曼在1923年用加热或福尔马林溶液使一些细菌的蛋白毒素（如破伤风毒素）失去毒性，但免疫原性不变，并命名为类毒素，用以免疫动物获得保护。此后，又相继研制出了明矾、氢氧化铝和矿物油等作佐剂，为提高生物制品的免疫效果起到了重要作用。值得一提的是活德菲等人在本世纪30年代用鸡胚增殖鸡痘病毒获得成功，首次成功地在实验室大量增殖病毒，为病毒疫苗的研制奠定了基础。冈德氏1949年又用鸡胚组织培养技术，为生物制品的研制开辟了一个新途径。1975年科勒和密尔斯坦又创造了淋巴细胞杂交瘤技术，从而使单克隆抗体的研制得到蓬勃发展。自20世纪80年代起基因工程技术迅速发展，获得了大量基因重组疫苗和遗传工程疫苗新制品，把生物制品的研制推向了现代高新技术领域。生物制品生产工艺中应用生物发酵法大量培养细菌、细胞培养法大量增殖病毒、真空冷冻干燥技术生产活疫苗等先进技术的应用，使生物制品的生产得到了很大的发展与提高。 我国从1918年起便研制出了鼻疽菌素、牛瘟血清等，开创了我国兽医生物制品的新时代。1930年上海商检局设立了兽医生物制品研究机构，生产出了牛瘟、炭疽、猪瘟及禽霍乱等高免血清及牛痘、狂犬病组织苗等。继后南京中央农业实验所畜牧兽医系、广西家畜保育科、四川家畜保育所、兰州西北防疫处、江西农学院、中央畜牧实验所以及在全国先后建立的以生产抗血清和组织苗为主的血清厂，生产为数不多的抗血清和几种疫苗。到1950年，全国共有9个兽医生物药品厂，年生产生物制品3500余万毫升，1952年组建了国家兽医生物制品监察所，制定出了我国第一部《兽医生物药品制造及检验规程》，及至80年代末，全国已有29个兽医生物制品厂，年产量达90亿毫升以上，从业人员超过万名，截止1993年国家批准的兽医生物制品标准已达138种。 二、兽用生物制品分类 生物制品由于微生物种类、动物种类、制备方法、毒株性状、应用对象等不同而品种繁杂。按其性质、用途和制造方法可分为疫苗、类毒素、诊断制剂、抗血清、微生态制剂等几大类。我们在此只对防制动物疫病的重要生物制品——疫苗进行讨论。
黑龙江省兽用生物制品经营许可审批制度 一、审批事项 兽用生物制品（非强制性）经营许可。 二、法定依据 《兽药管理条例》第二十二条、第二十四条和《兽用生物制品经营管理办法》。 三、申报条件 （一）具有与所经营的兽用生物制品相适应的专业技术人员； （二）具有与所经营的兽用生物制品品种、数量相适应的贮存、运输条件； （三）具有与所经营的兽用生物制品品种、数量相适应的固定经营场所、办公用房； （四）具有与所经营的兽用生物制品相适应的质量管理机构或者人员（质量管理机构负责人或质量管理人员，必须具有药学或畜牧、兽医等相关专业大专以上学历并取得执业资格或中级以上技术职称。质量管理机构负责人或质量管理人员必须是本企业的专职人员，不得在其他企业兼职。）。 四、申报需提交的材料 （一）兽用生物制品经营申请报告和《兽用生物制品经营许可审批表》（审批表可从黑龙江省畜牧兽医信息网中下载）各1份； （二）企业法人代表身份证和质量管理负责人身份证（复印件）各1份； （三）质量管理机构负责人或质量管理人员学历和技术职务证明材料（复印件）1份；
（四）从事销售兽用生物制品的人员、年龄、学历、专业和技术职务（复印件）等相关资料1份； （五）管理制度文本： (1质量管理目标； (2各组织机构、岗位和人员的职责； (3对供货单位和采购兽用生物制品的质量评估体系； (4兽用生物制品采购、运输、验收、入库、储存、出库、销售、陈列等环节的管理； (5环境卫生、人员健康状况的管理； (6兽用生物制品不良反应报告等质量信息的管理； (7不合格药品和退货药品的管理； (8质量事故、质量查询和质量投诉的管理； (9有关记录、档案和凭证的管理； (10质量管理方面教育、培训、考核的管理。 （六）经营企业管理记录文本： (1人员培训、考核记录； (2控制温度、湿度的设施，设备的维护、保养、清洁、运行状态的记录； (3兽用生物制品采购、验收、入库、陈列、储存、运输、销售、出库等记录； (4兽用生物制品质量投诉、质量纠纷、质量事故、不良反应等情况的记录；
第一章 1、生物制品学（biopreparatics）：指研究各类生物制品的来源、结构功能特点、应用、生产工艺、原理、存在问题与发展前景等诸多方面知识的一门学科。 2、生物制品（biological. product）：以微生物、细胞、动物或人源组织和体液等为原料，应用传统技术或现代生物技术制成，用于人类疾病的预防、治疗和诊断的药品。 第二章 一、生物制品原料的保存方法：（1）冷冻法：该方法适用于所有生物原料。（2）有机溶剂脱水法：常用的有机溶剂是丙酮。该法适用于原料少而价值高、有机溶剂对活性物质没有破坏作用的原料，如脑垂体等。（3）防腐剂保鲜：常用乙醇、苯酚、甘油等。该法适用于液体原料，如发酵液、提取液等。对于不同的生物还有不同的保存方法，例如对于动物细胞，有组织块保存法、组织悬液保存法、单层细胞保存法等。 二、蛋白类制品的分离纯化方法：【1】根据蛋白质的分子大小、形状和密度差异进行分离纯化（1）过滤和超过滤技术：过滤、微过滤、超过滤（2）离心和超离心技术（3）凝胶过滤层析技术（4）透析【2】利用蛋白质的电性进行分离纯化（1）等电点沉淀（2）离子交换层析技术（3）电泳和等电聚焦电泳【3】利用蛋白质的亲水性和疏水性（即溶解度）进行分离（1）盐析技术（2）乙醇和聚乙二醇沉淀法（3）疏水层析法【4】利用蛋白质的化学性质分离纯化（1）辛酸沉淀法（2）利凡诺沉淀（3）固相化染料层析（4）螯合柱层析【5】利用蛋白质的生物学活性分离纯化：亲和层析法【6】利用蛋白质的多种结合能力，用羟基磷灰石层析进行分离纯化 三、原料选择的注意事项：生物在不同的生长、发育期可合成不同的生化成分，所以生物的生长期对生理活性物质的含量影响很大。对于不同来源的原料，要注意选取其最佳生长时期。植物原料要注意它生长的季节性；微生物原料最好选取对数生长期，因为这时的微生物生长代谢能力最强；动物原料要选取适当的年龄和性别。 四、选择原料时应遵循的原则：原料来源丰富，产地接近，成本低；原料新鲜，其有效成分含量高并易于获得；杂质含量尽可能少，对原料中的杂质、异构体，必要时应进行相关的研究并提供质量控制方法；起始原料应质量稳定、可以控制，原材料应由来源、标准和供货商的检验报告，必要时应根据制备工艺的要求建立内控标准。 第三章 ⒈GMP: 即药品生产质量管理规范，是用科学、合理、规范化的条件和方法来控制药品生产的全过程，将差错发生的可能性降到最低，从而保证生产出优质药品的一套管理制度。生物制品属于药品，其生产和质量管理也应遵循GMP要求。 ⒉生物制品的物理化学检定:生物制品中的某些有效成分和不利因素，需要通过物理化学和生物化学的方法检查出来，这是保证制品安全和有效的一个重要方面。㈠物理性状检定⑴外观①透明液制品:应为本色和无色透明液体，不得含有异物、白点、凝块、浑浊或摇不散的沉淀物②悬浊液制品:应为乳白色混悬液，不得有摇不散的菌块和其他异物。③冻干制品:应为淡黄色、白色疏松体，呈海绵状或结晶状，应无融化现象。⑵真空度:冻干制品进行真空封口，可进一步保证冻干制品的生物活性和稳定性。 ⑶溶解时间:取一定量冻干制品，按药典要求，加适量溶剂，检查溶解时间，其溶解时间应在规定时限内。㈡化学检定⑴蛋白质含量测定:①凯氏定氮法②酚试剂法③双缩脲法⑵防腐剂含量测定:①苯酚含量测定法②游离甲醛含量测定③汞类防腐剂含量测定④氯仿含量测定⑶纯度检查:很多生物制品的主要成分为蛋白质，因此常用电泳法进行纯度检查。①区带电泳②免疫电泳③凝胶层析⑷其他①水分含量测定②氢氧化铝与磷酸铝含量测定。③磷含量测定④O-乙酰基含量测定。 ⒊生物制品的安全检定:生物制品必须做好以下三方面的安全性检查:①菌毒种和主要原材料的检查②半成品（包括中间品）检查③成品检查。⒈一般安全性检查①异常毒性试验:是生物制品的非特异性毒性的通用安全试验，检查制品中是否污染有外源性毒性物质以及是否存在意外的不安全因素。除另有规定外，异常毒性实验包括小鼠试验和豚鼠试验。②无菌试验:生物制品不得含有杂菌，灭活疫苗不得含有活的本菌本毒，无菌检查全过程必须严格遵循无菌操作，防止微生物污染。③热原试验:生物制品厂制造过程中被某些细菌和其他物质所污染，可引起机体的致热反应，即热源反应。致热物质主要是指细菌性热原质即革兰阴性细菌内毒素。包括家兔试验法和鲎试验法。家兔试验法是将一定剂量的待检品，经静脉注入家兔体内，在规定的时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定待检品中所含热原的限度是否符合规定。鲎试验法是用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定。⒉杀菌灭活和脱毒情况的检查①活毒检查:主要是检查灭活疫苗解毒是否完善。②解毒试验主要用于检查类毒素等需要脱毒的制品。③残余毒力实验:用于活疫苗的检查。⒊外源性污染检查①野毒检查:组织培养疫苗有可能通过培养带病毒的细胞带入有害的潜在病毒，因此需要进行野毒检查。②支原体检查:病毒类疫苗的病毒收获液、原液采用培养法检查支原体，必要时可采用指示细胞法筛选培养基。③乙肝表面抗原、丙肝抗体和艾滋抗体的检查:乙肝表面抗原检测方法是放免和酶联免疫法。检测丙肝抗体和艾滋抗体可用酶联免疫法.④残余细胞DNA检查:用分子杂交技术的方法检测来源于宿主细胞的残余DNA含量，以确保制品的安全性。⒋过敏性物质检查:以异种蛋白为原料制成的某些生物制品，需要检查其中过敏原的去除是否达到允许限度。①过敏性试验②牛血清蛋白含量测定③血型物质的检测:通常待检测的血型物质有抗A抗B血凝素和类A血型物质。 第七章 1疫苗的基本成分 其基本成分包括抗原，佐剂，防腐剂，稳定剂，灭火剂及其他相关成分。这些基本要素从不同角度确保了疫苗能够有效刺激机体，产生针对病原微生物的特异性免疫反应，同时确保疫苗在制备和保存过程中稳定存在。 ①抗原在机体内能够刺激免疫系统发生免疫应答，并能够诱导机体产生可与其发生特异反应的抗体或效应细胞的物质称为抗原。抗原是疫苗最主要的有效活性成分，他决定了疫苗的特异免疫原性。免疫原性和反应原性是抗原的两个基本特性，免疫原性（immunogenicity）是指抗原进入机体后引起的免疫细胞间的一系列免疫反应。抗原的反应原性（reactivity）是指抗原与抗体或效应t细胞发生特异反应的特性。构成抗原的基本条件:异物性，一定的理化特性，特异性。 ②佐剂能增强抗原的特异性免疫应答，这种加强可表现为增强抗体的体液免疫应答和细胞免疫应答，或两者兼有。 ③防腐剂为了保证疫苗在保存过程中不受微生物污染而添加的一种适量的防腐剂。 ④稳定剂有效抗原表位是疫苗的作用基础，而某些抗原表位对环境中的温度，光等因素非常敏感，极易发生变性而导致疫苗的免疫原性降低。为保证作为抗原的病毒和其他微生物存活，并保持免疫原性，需加入适量的稳定剂或保护剂。 ⑤灭火剂及其他相关成分灭火器主要用于疫苗生产过程中对活体微生物的杀灭 2疫苗的基本性质 ⑴免疫原性指疫苗接种进入机体后引起机体产生免疫应答的强度和持续时间。影响免疫原性强弱的因素包括①抗原的强弱，大小和稳定性，2抗原的理化性质。 ⑵安全性疫苗的安全性，包括接种后的全身和局部反应，接种引起免疫应答的安全程度，人群接种后引起的疫苗株散播情况。 ⑶稳定性疫苗，必须具有一定稳定性e保证经过一定时间的储存和冷链运输后仍能保持期有效的生物活性。 3疫苗的种类（112页表格） 4计划免疫与联合免疫概念 ①计划免疫（Planned immunization）是根据特指的某些传染病疫情检测和人群免疫状况分析，按照规定的免疫程序，有计划的利用免疫制剂进行人群预防接种，以提高人群免疫水平达到控制以致最终消灭相应传染病的目的。 ②联合免疫（Combined immunization）就是采用多种具有免疫原性的抗原联合制成多联和多价疫苗，注射这种疫苗可预防多种传染病或相同疾病的不同亚型，也可将多种疫苗同时进行免疫接种，以达到预防多种传染病的目的。 5免疫佐剂（adjuvant）:凡能非特异的通过物理和化学的方式与抗原结合而增强其特异免疫性的物质称为免疫佐剂。 6目前人和兽用免疫佐剂的主要类型。 ①铝佐剂抗原中加入适量的佐剂，可以将抗原完全吸附接种后，佐剂将抗原缓慢释放，起到抗原仓库的作用，从而延长抗原与巨噬细胞或其他抗原呈细胞的接触，是抗体的产生量剧增。氢氧化铝的功能主要是刺激机体的体液免疫反应，产生高效价的IgG和爱IgE抗体，激活Th2细胞，但他不能刺激Th1细胞，也不能加强细胞毒t淋巴细胞的活性，因此对许多疫苗不适用，尤其是对以细胞免疫为主的疫苗。 ②矿物油乳剂这类佐剂在提高抗体的幅度和免疫持久性方面，远高于佐剂。可是副反应严重，注射后多引起无菌化脓，且含有的矿物油，会长期留于植物中不能代谢，而且容易引起过敏反应，因此不予允许用于人。 ③植物油佐剂这种佐剂是由高纯度花生油做乳化剂，与液体疫苗制成的乳剂。由于植物油可被人体缓慢吸收，副反应小于矿物油佐剂，因此可用于人。 。 第八章 1.基因工程疫苗分类包括哪几种？ 答：（1）基因工程亚单位疫苗（2）基因工程载体疫苗：①以细菌为载体的基因工程疫苗。②以病毒为载体的基因工程疫苗。（3）核酸疫苗（4）基因缺失活疫苗（5）蛋白工程疫苗（6）转基因植物疫苗 第九章 1.灭活疫苗（inactivated vaccine）：灭活疫苗又称死疫苗，是指利用加热或甲醛解毒等理化方法将人工大量培养的完整的病原微生物杀死，使其丧失感染性和毒性但仍保持免疫原性，并结合相应的佐剂而制成的疫苗。 减毒活疫苗（attenuated live vaccine）:又称弱毒疫苗，是指将微生物的自然强毒株通过物理、化学和生物学方法，连续传代。使其对原宿主丧失致病力，或只引起亚临床感染，但仍保持良好的免疫原性、遗传特性，用这样的菌毒株制备的疫苗即为减毒活疫苗 2.常用灭活细菌疫苗：霍乱疫苗，伤寒疫苗，百日咳疫苗。 常用减毒活疫苗：炭疽疫苗，结核疫苗，鼠疫疫苗，卡介苗。 3.细菌性监督和疫苗生产工艺流程图。菌种〔→传代检定（培养特性、独立试验、安全实试验、免疫力试验）〕→生产培养（37~39℃培养一定时间）（克氏瓶固体培养或发酵罐液体培养）→收菌→合并→原液检定（细菌试验、浓度测定）→半成品配制（稀释、加冻干保护剂）〔→检定（纯菌试验、浓度测定）〕→分装及冻干→成品检定（鉴别试验、物理检查、水分、无菌试验、活菌计数、热稳定性试验、效力实验） 4外毒素exotoxin：细菌在生产过程中所产生的毒素，可从菌体扩散和或自溶后释放到菌体外。是细菌的代谢产物，为一种蛋白质，所以又称细菌蛋白质毒素，可用于制造类毒素。 内毒素endotoxin：菌体细胞壁的结构成分，细菌在生活状态时不能释放出来，只有在细菌死亡之后，通过菌体自溶或人工方法使细菌崩解后才能释放至外界环境中，它是由脂质、多糖及蛋白质形成的复合体，所以内毒素已逐渐被脂多糖一词所代替。第十章 1、HIV的复制:当H I V接触宿主细胞时，gp120与靶细胞的CD4分子结合，暴露出gp41，在gp41的参与下发生病毒膜与宿主细胞膜的融合，HIV的反转录酶随病毒RNA进入宿主细胞内，HIVRNA在反转录酶作用下利用宿主细胞的核苷酸反转录成一单链DNA，以此单链DNA为模版，在DNA聚合酶的作用下，复制另一条DNA链，从而形成双股的cDNA，cDNA可以进行转录，形成病毒RNA，并进一步形成病毒颗粒，由宿主细胞释放再去感染其他细胞，这样的病毒成为活动性病毒。活动性病毒的生成过程即是病毒复制的过程。 2、AIDS的现状：目前研究AIDs疫苗还具有困难，HIV的病毒颗粒结构已经相对较了解，与此相比，疫苗的研究，却很缓慢，主要原因在于该病毒本身的生物学特点。虽然研究HIV疫苗困难重重，然而近年来大量的研究结果表明，研制有效的HIV疫苗是有可能的。艾滋疫苗的现状，表现为新型疫苗和传统疫苗两大分枝，新型疫苗以基因工程疫苗为主，同时还包括合成多肽疫苗。基因工程疫苗根据表达形式及克隆载体可分为亚单位疫苗，病毒样颗粒，活载体疫苗及核酸疫苗等。 3新型的乙肝疫苗的研究方法：乙型肝炎DNA疫苗主要是将HBsAg的基因重组到质粒上构建成的，它在小动物的实验中显示了理想的免疫保护效果，如小鼠肌肉注射表达HBsAg的质粒后，迅速产生强烈而持续的体液和细胞免疫反应，但在大动物中却不能诱导出显著的免疫应答，这是DNA疫苗技术在当前所面临的共同的重要问题。利用含CpG基序的寡聚核苷酸与HIV的DNA疫苗同时免疫大猩猩，可以明显增强HBVDNA疫苗诱导体液和细胞免疫反应的免疫原性。另外，将相关的细胞因子基因插入到HBV的DNA疫苗载体中，也可是DNA疫苗的免疫反应提高数十倍。 第十一章 输血的原则。 答：1.鉴定血型。要保证供血者与受血者的ABO血型相合，因为ABO血型系统不相容的输血常会引起严重的反应。2.抗体检查和鉴定。要检测受血者血清中是否存在血型不规则抗体，如抗C、抗E、抗s等抗体；若检查结果为阳性，只要时间允许，在交叉配血前，应该对其进行特异性免疫球蛋白类别分析。3.交叉配血试验。把供血者的红细胞与受血者的血清进行配合试验，称为主侧实验；把受血者的红细胞与供血者的血清作配合试验，称为次侧实验。交叉配血试验应在37摄氏度下进行，以保证可能发生的凝集反应得以充分显示。4.成分输血。成分输血就是把人血中的各种有效成分，如红细胞、粒细胞、血小板和血浆等分别制备成高纯度或高浓度的制品，根据患者的需要输注相应的成分。成分输血具有提高疗效、减少不良反应和节约血源等优点。 第十二章 一.血液制品的种类，用途。 1.白蛋白类制剂：①维持调节血液渗透压；②运输和解毒作用；③营养供给。（治疗休克、低蛋白血症、脑水肿、胸腹水） 2.免疫球蛋白制剂：免疫球蛋白制剂有三类，①正常人免疫球蛋白、②特异性免疫球蛋白（预防或治疗相应传染病感染症）、③静脉注射免疫球蛋白（预防和治疗感染症，免疫缺陷性疾病），主要作用是给受着补充免疫抗体以增强机体的体液免疫的，其功效取决于所含抗体的种类及生物效价。 3.凝血因子制剂：①凝血因子Ⅷ制剂（用于治疗血友病的出血症状，凝血因子Ⅷ缺乏症），②凝血因子Ⅸ制剂（用于治疗乙型血友病的出血症状）③纤维蛋白原制剂（主要用于先天性纤原缺乏症及继发性纤源缺失的治疗，如胎盘早期剥离引起的大出血等）。 二、低温乙醇沉淀法的原理及影响沉淀的因素。 原理：在介电常数大的溶液中蛋白质的溶解度大，在介电常数小的溶液中蛋白质的溶解度就小。乙醇能显著地降低蛋白质水溶液的介电常数，从而使蛋白质从溶液中沉淀析出。 影响因素：①PH：当PH位于等电点时蛋白质的溶解度最小，所以最易沉淀。通常低温乙醇法在PH4.4~7.4进行分离。②温度：温度低蛋白质的溶解度低。溶液中加入乙醇，因乙醇的水合作用会产生放热现象，而温度升高可能造成蛋白质变性，所以在低温乙醇工艺中，整个过程均应控制在0~-8℃。温度降低可以使蛋白质溶解度降低。若温度控制不当，轻则会影响蛋白质的获得率，重则会引起蛋白质变性。③蛋白质浓度：在分离过程中，可将蛋白质溶液作适当稀释，以减少蛋白质之间的相互作用，避免多种蛋白质共同沉淀，但过分稀释易使蛋白质变性，同时增大分离的容量，也不可取，所以应选择适宜的浓度。该方法中蛋白质浓度适宜范围为0.2%~6.6%④离子强度：在低盐溶液中盐浓度的很小改变即可引起蛋白质溶解度的极大变化，盐类与蛋白质的互相影响，随离子强度而变化。该法中离子强度的变化范围在0.01~0.16。，⑤乙醇浓度：乙醇能降低蛋白质溶液的介电常数，随着乙醇浓度的增加，蛋白质溶液的介电常数逐渐降低，而其溶解度急剧下降，在低温乙醇工艺中，乙醇的浓度范围在0~40%。 第十三章 1.人血液代用品的分类 答：（1）全氟碳化合物。（2）血红蛋白类血液代用品。①天然血红蛋白②化学修饰血红蛋白③人工红细胞④基因重组血红蛋白（3）红细胞类血液代用品。①万能型红细胞②造血干细胞培养定型红细胞。 第15章 细胞因子分类及功能 细胞因子（cytokine,CK）是人类和动物的各类细胞分泌的具有多样生物活性的因子。他们是一组可溶性的不均一的蛋白质分子，能调节细胞的生长与分化。 1干扰素（interferon，IFN）是最先被发现的细胞因子。IFN除具有抗病毒作用外，还有抗肿瘤，免疫调节，控制细胞增殖，引发发热等作用。 2集落刺激因子（colony stimulating factor,CSF）在进行造血细胞的体外研究中，发现一些细胞因子可刺激不同的造血干细胞在半固体培养基中形成细胞集落。根据作用的靶细胞不同，可将CSF分为以下几类①刺激白细胞的CSF②刺激红细胞的促红细胞生成素③刺激造血干细胞的干细胞因子④刺激胚胎干细胞的白血病抑制因子⑤刺激血小板的血小板生成素。这些细胞因子均有集落刺激，不同的CFS对不同发育阶段的造血干细胞和造血祖细胞起促增殖分化作用，是血细胞发生必不可少的刺激因子。 3白细胞介素（interleukin,IL）是由多种细胞分泌的一类具有免疫调节活性的细胞因子。这类物质主要有白细胞合成，且主要介导白细胞间的相互作用。用极小的量就可以起到重要的介导效应。 4肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）是一类能直接造成肿瘤细胞死亡的细胞因子。分为TNF-α和TNF-β。除有杀肿瘤作用外，TNF还可引起发热和炎症反应，大剂量的可引起恶液质，使患者表现出进行性消瘦。 5趋化因子（chemokine）是一组具有趋化作用的细胞因子，主要调节淋巴细胞和巨噬细胞的趋化性，激活巨噬细胞或单核细胞，促进定向造血干细胞的增殖，促进内皮细胞和一些转化细胞的机能，在机体炎症反应和抗感染及创伤愈合中发挥重要作用。6生长因子（growth factor，GF)。对机体不同细胞具有促生长作用的细胞因子称为生长因子。通过旁分泌、自分泌和内分泌等途径对靶细胞的增殖、运动、收缩、分化和组织改造起调控作用。 包括①胰岛素样生长因子IGF：用于治疗糖尿病、胰岛素抵抗综合症、侏儒症及神经系统疾病等。②表皮生长因子EGF：可作为化妆品添加剂及用于面部整形手术，具有修复皮肤组织的功能③血小板衍生生长因子PDGF：是一种存在于血清中的结缔组织细胞有丝分裂促进剂。④成纤维细胞生长因子FGF：在创伤愈合和慢性炎症中，对新生儿血管的形成及肌纤维母细胞、上皮细胞、血管内皮细胞的分裂、移动具有刺激作用，对胚胎横纹肌的发育和肺的成熟也起调控作用。⑤神经生长因子NGF：能促进神经元的生长、发育、分化和成熟，维持神经元的存活。⑥转化生长因子TGF：可用于骨伤愈合，慢性创伤和抗肿瘤。⑦抑制素inhibin、⑧骨形态形成蛋白BMP等。 第十九章 1、基因治疗（gene therapy）就是将外源基因导入目的细胞并有效表达，从而达到治疗疾病的目的。 2、基因治疗的方法（方式）：（1）基因置换gene replacement指用正常基因置换整个致病基因，使致病基因永久得到更正。这种以正常基因替换缺陷基因的方法是最理想的，它可以除去全部致病基因，使突变的基因在原位得到更正。（2）基因修正gene correction 是指将致病基因的突变碱基序列纠正，而正常部分予以保留。（3）基因修饰gene augmentation 是指将目的基因导入病变细胞或其他细胞，目的基因的表达产物特异的修饰缺陷细胞的功能或使原有的功能得到加强，但致病基因本身并未得到
一、《生物制品学》有关的概念 1、什么是生物制品（biological products） 指以微生物、植物、动物体作为起始材料，采用现代生物技术或手段人为地创造条件，生产某些初级代谢产物或次级代谢产物,制成用以诊断、治疗或预防疾病或达到某种特殊医学目的的医药用品，通称生物制品. 2、什么是外毒素？什么是类毒素？ 外毒素：一些细菌在培养过程中产生的毒性物质。 类毒素：外毒素经化学法处理后，失去毒力作用，而保留抗原性，这种类似毒素而无毒力作用的物质称为类毒素。 制剂的特点：吸收慢，刺激时间长，抗体滴度高，免疫效果好。 3、高免疫血清 指由特定抗原免疫动物（如，马），分离血浆或血清，精制而成的生物制品。 4、等电点沉淀法（Isoelectric point precipitation） 是利用蛋白质在等电点时溶解度最低，而各种蛋白质又具有不同等电点的特点进行分离的方法。 5、质量管理（quality management，QM） 确定质量方针、目标和职责并在质量管理体系中通过诸如质量策划、质量控制、质量保证和质量改进使其实施的全部管理职能的所有活动。 6、质量控制（quality control，QC） 为达到质量要求所采取的作业技术或活动。 7、什么是血液制品（blood products）？ 指由健康人的血浆或特异免疫人血浆，经分离、提纯或由重组DNA技术制成的血浆蛋白组分，以及血液有形成分统称为血液制品。 用于治疗或被动免疫预防。 8、什么是冷沉淀（cryoprecipitate）？ 又称冷沉淀抗血友病因子。 将约200ml 新鲜冷冻血浆在1～6摄氏度复融后留下冰渣状不溶性成分，迅速高速离心，移去上层血浆，剩下的白色沉淀物即为“冷沉淀”。 用于治疗甲型血友病、血管性血友病、先天性或获得性纤维蛋白原缺乏症及因子XⅢ缺乏症病人。 9、什么是疫苗？ 疫苗是针对疾病的病原微生物或其蛋白质（多肽、肽）、多糖或核酸，以单体或通过载体经预防接种进入人体后，能诱导产生特异性体液免疫和细胞免疫，从而使机体获得预防该疾病的免疫力。 10、什么是基因工程疫苗（engineering vaccine）？ 指通过基因工程方法或分子克隆技术，分离出病原的保护性抗原基因，将其转入原核或真核表达系统，使其表达出该病原的保护性抗原，制成疫苗；或者将病原的毒力相关基因删除掉，使成为不带毒力相关基因的基因缺失苗。 ●基因工程疫苗类型 基因工程亚单位疫苗 基因工程载体疫苗 蛋白质工程疫苗 基因缺失疫苗 基因疫苗
兽用生物制品质量管理培训考试题（附答案）姓名：得分： 一、不定项选择题：（共20题，每题1.5分） 1、质量管理部门应履行生产全过程的（AB ）职责。 A、质量管理 B、检验 C、监督 D、控制 2、GMP中规定的自检是指 C 。 A、产品质量的检查 B、生产过程的验证 C、企业内部的质量审核 D、产品质量的验证 3、公司哪些人员必须进行GMP培训？（ABC ） A.各级管理人员. B.质量检验人员 C.生产操作人员(包括维修、清洁人员) D.炊事员 4、在中华人民共和国境内从事兽药的研制、生产、经营、进出口、使用和监督管理，应当遵守的法规是（ B ）。 A、《动物防疫法》 B、《兽药管理条例》 C、《湖北省兽药管理实施办法》 5、新建、改扩建和复验企业应当在《兽药GMP证书》有效期满（B）前提交申请。 A、3个月 B、6个月 C、9个月 D、12个月 6、兽药GMP证书申请中，申请资料不存在严重缺陷但需补充资料的，书面通知申请企业在（ C ）工作日内补充有关资料，逾期未补充的，驳回申请。 A、10个 B、15个 C、20个 D、30个 7、兽药监管的主要方式有：（ABCD ） A、GMP检查验收 B、兽药监督检验 C、飞行检查 D、驻厂监督 8、产品包装盒上应注明（BC ）。 A、生产日期 B、生产批号 C、有效期至 D、以上都是 9、关于产品说明书说法中不正确的是（ D ）。 A、应注明兽用标识及兽药名称 B、应说明其接种对象 C、应标明主要成分、含量及有效期 D、产品名称可以用企业宣传名 10、批签发报告中，必须有生产企业的( ABC )签字，缺一不可。 A、质管部负责人 B、企业质量负责人 C、企业总经理 D、生产负责人
生物制品的发展
我国生物制品发展摘要:首先陈述了我国生物制品的历史与发展并在客观分析我国兽用生物制品发展状况的基础上,从加强宏观管理和提高企业的竞争力两个方面提出了我国兽用生物制品的发展对策。 关键词:兽用生物制品; 发展状况; 疫苗；简史； 生物制品是生物工程中具有免疫特性的一种药品，它是人类历史长河中与疾病作斗争的产品。欲溯其源尚无法真切描述，只能从1912年至近期的历史简要叙之，故称简史。 据公元203年(战国时期)的“黄帝内经”就有记载“正气存内，邪不可干”“邪之凑，其气必虚”，这是对免疫的最早描述。“免疫”一词首见于明朝的“免疫内方”意思是免除传染，“明朝种痘新法”即有“熟苗”的记载，用来防御天花病，2500年前我国古藉的“左传”就记载了狂犬病，并研究了它的治疗方法。“牛疫即牛瘟病”的流行曾记载于后汉永平十八年，《五行记》上。三百年前藏族同胞采用牛瘟弱毒(即自然感染黄羊含牛瘟病毒的血液作毒种)，灌服牛只预防牛瘟病，算是古老的兽医减毒疫苗。而正式有记载的中国人自办的兽用疫苗制造所是1930年，实业部青岛商品检验局王汝川教授首创的【1】。 建国以来我国兽医生物制品取得了长足发展，研制了一些世界领先的兽医生物制品，对疫病防制起到很大的推动作用。如牛瘟兔化弱毒疫苗和牛肺疫兔化弱毒疫苗，消灭了我国的牛瘟和牛肺疫。1967年联合国粮农组织和欧共体认为中国C株弱毒苗（猪瘟兔化弱毒株苗）控制和消灭欧洲国家的猪瘟作出了卓越贡献。我国首创的马传贫弱毒疫苗1983年在国际马传贫学术会议上得到高度
的评价。我国研制的猪2号（S2）布氏杆菌苗和羊5号(M5)布氏杆菌苗免疫力均优于国外的19号布氏杆菌苗，安全性优于国外羊用的Reul号菌苗。仔猪副伤寒弱毒菌苗、羊痘鸡胚化弱毒疫苗、羊痘细胞苗制品均达到先进水平。我国在诊断液和菌株的选育方面也取得巨大成就，如牛鼻气管炎抗原、牛黏膜病抗原、副结核菌素诊断液等品。我国也进行了大量弱毒菌种、毒株的培育和筛选，如中国C株弱毒株(猪瘟兔化弱毒株)、马传贫弱毒疫苗株等都是我国自己选育的优秀毒株。目前，我国已形成了独立的兽医生物制品产、供、销监督检测体系，1966年农业部颁发了《兽用生物制品管理办法》。据农业部《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》（2001年），我国兽医生物制品共有188种，其中灭活疫苗56种，活疫苗 57种，抗血清7 种，诊断制品61 种，其他制品 7 种。我国兽医制品生产企业30家，其中，有3个兽用生物制品企业通过 GMP认证，15个生产车间通过 GMP验收。同时，我国兽医生物制品发展中也存在一些问题，需要认真加以解决【2】。 有专家预测,在当今和未来高科技的激烈竞争中,现代医药学及生物技术将成为时代竞争的焦点,并将占居制高点。兽用生物制品作为现代医药学及生物技术领域的重要组成部分,在有效防治动物疫病、保障畜牧业发展、促进农牧民增收、保护和增进人民健康、提高生活质量、促进经济发展和社会进步等方面均具有十分重要的作用。在21世纪的今天,兽用生物制品作为高科技生物产品,由于其科技含量高,受宏观经济的影响小,价格基本稳定,盈利水平高于社会平均利润率水平,已经成为新经济时期极具吸引力的产业。正因为如此,兽用生物制品领域成为资本投入的热点。兽用生物制品生产企业的重组、兼并与上市,有力地促进了我 国现代兽用生物制品产业的飞速发展。 1我国兽用生物制品发展状况 我国兽用生物制品研究和生产始于1918年创建的青岛商品检验局血清所和1919年建立的北平中央防疫处。1949年以前,我国兽用生物制品的品种很少,仅有10余种疫苗的生产与研究,且产量不大,没有统一的产品质量标准,生产设备简陋,技术水平较低。新中国建立初期,党和政府十分重视动物疫病防治工作,积极培训技术人员,加强生产技术交流,开展新产品研究,改进生产工艺,并且制订
附录3： 生物制品 第一章范围 第一条生物制品得制备方法就是控制产品质量得关键因素。采用下列制备方法得生物制品属本附录适用得范围： （一）微生物与细胞培养，包括DNA重组或杂交瘤技术； （二）生物组织提取； （三）通过胚胎或动物体内得活生物体繁殖。 第二条本附录所指生物制品包括：细菌类疫苗（含类毒素）、病毒类疫苗、抗毒素及抗血清、血液制品、细胞因子、生长因子、酶、按药品管理得体内及体外诊断制品，以及其它生物活性制剂，如毒素、抗原、变态反应原、单克隆抗体、抗原抗体复合物、免疫调节剂及微生态制剂等。 第三条生物制品得生产与质量控制应当符合本附录要求与国家相关规定。 第二章原则 第四条生物制品具有以下特殊性，应当对生物制品得生产过程与中间产品得检验进行特殊控制： （一）生物制品得生产涉及生物过程与生物材料，如细胞培养、活生物体材料提取等。这些生产过程存在固有得可变性，因而其副产物得范围与特性也存在可变性，甚至培养过程中所用得物料也就是污染微生物生长得良好培养基。 （二）生物制品质量控制所使用得生物学分析技术通常比理化测
定具有更大得可变性。 （三）为提高产品效价（免疫原性）或维持生物活性，常需在成品中加入佐剂或保护剂，致使部分检验项目不能在制成成品后进行。 第三章人员 第五条从事生物制品生产、质量保证、质量控制及其她相关人员（包括清洁、维修人员）均应根据其生产得制品与所从事得生产操作进行专业知识与安全防护要求得培训。 第六条生产管理负责人、质量管理负责人与质量受权人应当具有相应得专业知识（微生物学、生物学、免疫学、生物化学、生物制品学等），并能够在生产、质量管理中履行职责。 第七条应当对所生产品种得生物安全进行评估，根据评估结果，对生产、维修、检验、动物饲养得操作人员、管理人员接种相应得疫苗，并定期体检。 第八条患有传染病、皮肤病以及皮肤有伤口者、对产品质量与安全性有潜在不利影响得人员，均不得进入生产区进行操作或质量检验。 未经批准得人员不得进入生产操作区。 第九条从事卡介苗或结核菌素生产得人员应当定期进行肺部X 光透视或其它相关项目健康状况检查。 第十条生产期间，未采用规定得去污染措施，员工不得从接触活有机体或动物体得区域穿越到生产其它产品或处理不同有机体得区域中去。 第十一条从事生产操作得人员应当与动物饲养人员分开，不得