常见曲霉的分类鉴定
福建省疾病预防控制中心
马群飞
第五节
现行国家标准的曲霉分群
霉菌分类鉴定的现行国家标准
GB/T 4789.16－2003
《常见产毒霉菌的鉴定》
这个标准最大的缺憾就是没有一个关于霉菌的检索表。仅仅列入了曲霉、青霉和镰刀菌的检索表。当使用者需要检索其他霉菌的时候，只能按图索骥……
曲霉的分类鉴定
以下利用GB/T 4789.16－2003附录的检索表，示范如何进行曲霉属的分类鉴定（主要根据颜色分群）。
曲霉属分群检索表
1.分生孢子头在发育过程中呈现一些绿色 (2)
1.分生孢子头呈现其他颜色 (12)
根据有无绿色调产生分成两大类。有时需要放几天才出现绿色，有的则在几周后褪去绿色。通常于培养7 d～14d时观察。
曲霉属分群检索表
2.顶囊棒形或近于棒形，小梗单层 (3)
2.顶囊不是棒形，小梗单层或两层 (4)
3.顶囊强烈棒形，分生孢子头蓝－绿色，老时变成灰色………………………………………………………棒曲霉群3.顶囊近于棒形，幼期分生孢子头黄－绿色、灰－绿色或蓝绿色，大部分种变暗……………………………华丽曲霉群
这项观察必须用油镜。
用接种针挑取菌丝及孢子头，用染色液制片。单列／双列
／单双列并存。
曲霉属分群检索表
2.顶囊不是棒形，小梗单层或两层 (4)
4.分生孢子头幼期呈鲜明的黄－绿色，有时老后变成褐色，
疏松放射状，大部分种小梗两层..................黄曲霉群4.分生孢子头呈现其他颜色，小梗单层或两层 (5)
曲霉属分群检索表
4.分生孢子头呈现其他颜色，小梗单层或两层 (5)
5.菌落大部分有裸露的黄色闭囊壳和黄色或红色裹着的菌
丝......................................................灰绿曲霉群5.菌落无裸露的黄色闭囊壳和黄色或红色裹着的菌丝 (6)
曲霉属分群检索表
5.菌落无裸露的黄色闭囊壳和黄色或红色裹着的菌丝 (6)
6.分生孢子头明显的柱状 (7)
6.分生孢子头球形、放射状或疏松的柱状 (9)
7.小梗单层 (8)
7.小梗两层；常见球形至近球形的壳细胞，一些种有闭囊壳，
子囊孢子橙红色至紫红色………………构巢曲霉群
柱状孢子头球形孢子头
曲霉属分群检索表
5.菌落无裸露的黄色闭囊壳和黄色或红色裹着的菌丝 (6)
6.分生孢子头明显的柱状 (7)
7.小梗单层 (8)
8.分生孢子头柱状，长，细窄(常常扭曲)至不规则；分生孢子
通常自小梗处以圆柱状的断节形成；无闭囊壳；典型的适高渗性……………………………………………局限曲霉群
曲霉属分群检索表
5.菌落无裸露的黄色闭囊壳和黄色或红色裹着的菌丝 (6)
6.分生孢子头明显的柱状 (7)
7.小梗单层 (8)
8.分生孢子头柱状，致密并典型地直径完全一致，分生孢子不
形成圆筒状断节；在一些种中有闭囊壳；不典型地适高渗性……………………………………………………烟曲霉群
曲霉属分群检索表
6.分生孢子头球形、放射状或疏松的柱状 (9)
9.顶囊小，形状不一 (10)
9.顶囊大，严格的球形；分生孢子梗在顶囊下端缢缩 (11)
10.分生孢子头蓝－绿色、浊黄－绿色或灰蓝－绿色，放射状
至疏松的柱状；壳细胞球形至近球形…………杂色曲霉群
分生孢子头形态
幼龄与老龄时差别很大。可将生长待测菌株的平板或试管斜面直接置低倍显微镜下，先寻找分生孢子头，然后分别观察其初生与老龄的孢子头形态及孢子排列方式。放射状/柱状/球状/放射柱状
曲霉属分群检索表
6.分生孢子头球形、放射状或疏松的柱状 (9)
9.顶囊小，形状不一 (10)
10.分生孢子头橄榄色、橄榄－灰色、淡褐色至浅褐色，放射
状至宽阔的柱状；壳细胞长形至扭曲……………焦曲霉群
曲霉属分群检索表
6.分生孢子头球形、放射状或疏松的柱状 (9)
9.顶囊大，严格的球形；分生孢子梗在顶囊下端缢缩 (11)
11.分生孢子头蓝－绿色或橄榄－浅黄色，老时呈灰色………………………………………………………………稀疏曲霉群11.分生孢子头淡黄－绿色或浅黄－褐色…………淡黄曲霉群
曲霉属分群检索表
1.分生孢子头呈现其他颜色 (12)
12.在察氏琼脂上生长很稀疏，且孢子形成很少………………………………………………鹿皮色曲霉群
12.在察氏琼脂上生长良好孢子形成很多 (13)
13.分生孢子头疏松至致密的柱状 (14)
13.分生孢子头为球形至放射状 (15)
14.分生孢子头为疏松的柱状，白色、肉色或奶油色－浅黄色…………………………………黄柄曲霉群
曲霉属分群检索表
14.分生孢子头为致密的柱状，榛色至肉桂色……土曲霉群
15.分生孢子头始终为白色，较大的头呈明显的球形或放射状…………………………………………………………白曲霉群
菌种鉴定手段 （1）常规鉴定 常规鉴定内容有形态特征和生理生化特征。形态特征包括显微形态和培养特征；理化特性包括营养类型、碳氮源利用能力、各种代谢反应、酶反应等。 （2）BIOLOG碳源自动分析鉴定 BIOLOG鉴定系统以微生物对不同碳源的利用情况为基础，检测微生物的特征指纹图谱，建立与微生物种类相对应的数据库。通过软件将待测微生物与数据库参比，得出鉴定结果。 该系统已获美国FDA认可，已逐步应用于食品和饮品企业、环保、海洋生物/水产品、制药、农业微生物、生物治理、化妆品、临床等领域的微生物鉴定试验中。 BIOLOG是一种微生物菌种快速鉴定系统，涉及革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、厌氧菌、酵母、丝状真菌在内近2000种微生物。 （3）分子生物学鉴定 应用分子生物学方法从遗传进化角度阐明微生物种群之间的分类学关系，是目前微生物分类学研究普遍采用的鉴定方法。CICC拥有微生物菌种分类鉴定的分子生物学实验室，配有PCR仪、高速冷冻离心机、电泳仪、HPLC、凝胶成像系统、紫外控温分析系统等先进仪器设备，以及DNAMAN、BIOEDIT、CLUSTALX、TREEVIEW等序列分析软件。目前CICC可采用核酸序列分析法分析细菌16S rDNA/16S-23S rDNA区间序列、酵母18S rDNA/26S rDNA（D1/D2）序列及丝状真菌的18S rDNA/ ITS1-5.8S-ITS2序列，提供科学的鉴定结果。（4）API细菌数值鉴定系统
API鉴定系统涵盖15个鉴定系列，约有1000种生化反应，目前已可鉴定超过600种的细菌。鉴定过程中，可根据细菌所属类群选择适当的生理生化鉴定系列，通过软件将待测细菌与数据库参比，得出鉴定结果。 CICC目前可应用API 50CH系列、API 20 E系列、API Staph系列对乳酸杆菌（Lactobacillus sp.）和相关细菌、芽孢杆菌（Bacillus sp.）、葡萄球菌属（Staphylococcus sp.）、微球菌属（Micrococcus sp.）和库克菌属（Locuria sp.）进行鉴定。 （5）功能性分析及功能基因 CICC不断致力于工业微生物资源的功能及其功能基因研究，目前通过木聚糖酶、纤维素酶、葡萄糖异构酶、β-甘露聚糖酶等功能基因的克隆进行菌种产酶的功能性分析。应用gyrA、atpD及pheS等看家基因于微生物菌种鉴定，在某些种、亚种、株间有较好的分辨效果。 （6）RAPD、SSCP技术 随着微生物菌种应用的进一步发展，在食品安全管理、生物产品出口认证、知识产权保护等行业需求日益增加，微生物菌种株水平的鉴别技术成为一个迫切需要解决的问题。 CICC采用随机扩增多态性DNA（Randomly amplified polymorphism DNA，RAPD）技术和单链构象多态性(Single Strand Conformation Polymorphism，SSCP）技术对微生物菌株进行鉴别。如采用RAPD技术能够对同一菌种原始菌株与诱变菌株进行鉴别，对诱变菌株知识产权保护具有重要意义；采用SSCP技
几种曲霉的形态特征 常见曲霉菌鉴定： 菌落：菌落生长速度，表面质地、颜色、形态和气味等。其中颜色是曲霉菌分类的依据之一 ②分生抱子头：分生抱子头的形状、颜色和大小。分生抱子头由顶囊、瓶梗、梗基和分生抱子链组成，为曲霉的特征性结构 ③分生抱子梗或分生抱子柄：注意分生抱子梗的长短、颜色、表面粗糙或光滑、是否有隔等 ④具有性生殖的曲霉能产生闭囊壳：为封闭式的薄壁子囊果，含子囊和子囊抱子; ⑤足细胞，也为曲霉的特征性结构。 1、烟曲霉困 在SDA培养基上菌落生长快，棉花样，开始为白色，2~3天后转为绿色，数日后变为深绿色，呈粉末状。分生抱子头的顶囊烧瓶状，小梗单层，排列成木栅状，布满顶囊表面3/4 ,顶端有链形分生抱子，分生抱子球形，有小棘，绿 烟曲霉菌菌落 2、黄曲霉菌
在SDA培养基上菌落生长快，黄色，表面粉末状。分生抱子头顶囊球形或近球形，小梗双层，第一层长，布满顶囊表面，呈放射状排列，黄色，顶端有链形抱子 黄曲霉菌菌落 黄曲霉菌分生抱子头 3、土曲霉困 在SDA培养基上菌落生长快，小，圆形，淡褐色或褐色。分生抱子头的顶囊半球形，小梗双层，第一层短，第二层长，呈放射状排列，分布顶囊表面2/3，顶端有链形抱子
土曲霉菌落 F列图片为分生抱子头
4、黑曲霉困 在SDA培养基上菌落生长快，表面黑色，粉末状。分生抱子头的顶囊球形或近球形，小梗双层，第一层粗大，第二层短小，呈放射状排列，布满整个顶囊，黑色，顶端有链形抱子 黑曲霉菌洛 黑曲霉分生抱子头
5、杂色曲霉困 在SDA培养基上菌落生长慢，菌落圆形紧密，绒毛状，羊毛状，颜色有数环，从青绿到红绿。分生抱子头的顶囊近球形，小梗双层，第一层长，第二层短, 呈放射状排列，布满顶囊4/5 ,顶端有链形抱子 杂色曲霉菌菌落 杂色曲霉菌分生抱子头
1. 菌落形态观察 观察菌落的大小、形状、隆起度、边缘、表面性状、颜色与透明度、质地和干湿度。 2. 革兰氏染色 按照革兰氏染色方法进行制片、初染、媒染、脱色、复染、干燥、镜检；干燥后，用油镜观察。 3. 鞭毛染色 挑取18~30 h新鲜平板培养物制备菌悬液，制片，室温自然干燥。滴加硝酸银染色A液覆盖3~5 min，用蒸馏水充分洗去A液，再滴加B液染色约1 min，当涂面出现明显褐色时，立即用蒸馏水冲洗。自然干燥后用油镜观察。菌体呈深褐色，鞭毛显褐色。 4. 糖类分解试验 将被检菌接种于糖发酵培养基中，37℃培养2－3天。如果培养基变黄，说明产酸；如变黄的同时，还有气泡，说明既产酸又产气。培养基仍呈蓝色，说明未产酸。选取木糖、葡萄糖、半乳糖和蔗糖。 5. 吲哚（靛基质）试验 将待检菌种接种于邓享氏蛋白质的胨溶液中，37℃培养1－2天。于培养液中加入戊醇或二甲苯2－3ml，摇匀，静置片刻后，沿管壁加入试剂2ml，如出现红色沉淀，表示为阳性。 6. 淀粉水解试验 将LB琼脂加热融化，使冷到50℃，加入淀粉溶液，混匀后，倾注平板。将细菌划线接种于平板上，37℃培养24小时，生长后取出，在菌落处滴加革兰氏碘液少许，培养基呈深蓝色，能水许解淀粉的细菌菌落周围有透明环。 9. V－P试验 将被检菌接种于试验培养基中（葡萄糖、K2 HPO4、蛋白胨各5g，溶于1 000ml 水中，分装于试管中，0.075MPa灭菌10分钟），培养2－7天后，于培养物中加入1ml 10％的NaOH，混匀，再加入3－4滴2%氯化铁溶液。数小时后，培养基表面的下层出现红色者，为阳性。 10.甲基红（M.R）试验 接种细菌，于37℃培养2－7天后，于培养物中加入几滴甲基红酒精溶液（0.1g 甲基经溶于300ml 95%乙醇中，加蒸馏水至500 ml），如呈红色，表示阳性。 11. 柠檬酸盐利用试验 将被检菌接种到Simmons固体柠檬酸盐培养基上，37℃下培养2－4天，能利用柠檬酸盐的细菌表现为有细菌生长，培养基变为蓝色，不能利用柠檬酸盐的细菌不生长，培养基不变色。 12. 硝酸盐还原试验 将被检细菌接种于硝酸盐培养基中，37℃培养1－2天，每管中先加入甲试剂0.1ml，再加乙试剂数滴，如出现红色，表示阳性。 13. 接触酶试验 将1ml 3%的H2O2倾注于生长物（菌落或菌苔）上，有气泡（O2）发生者为阳性。也可于清洁小试管中加少量H2O2（30%），再用清洁无菌的细玻棒（或火焰封口的毛细管或镍铬做成的接种环）醮细菌少许，插入H2O2液面下，有气
常见细菌鉴定 平装: 331页 正文语种: 简体中文 开本: 16 ISBN: 9787117119610 条形码: 9787117119610 尺寸: x x cm 重量: 540 g 百分网内容简介 《临床常见细菌、真菌鉴定手册》着重对院内感染的常见细菌、真菌及其耐药性检测和研究进行了细致阐述。细菌耐药也是当前临床面临的重大难题之一，抗生素滥用是造成耐药性不断增长的主要原因。微生物是进化史上最成功的例子，存在几十亿年了，新兴的微生态学理论认为，人类和微生物之间是适应而不是对抗。院内感染菌株绝大部分是条件致病菌，当机体免疫力低下、抗生素使用不合理破坏了正常菌群，导致微生态失衡情况下，引起感染的发生、发展。我从事微生态研究多年，深刻认识到只有从生态平衡角度，将传统的单纯“杀菌”理论转变为“杀菌”加“促菌”理论，保护人体的正常菌群，维护人体微生态平衡，提高机体免疫能力，才是控制感染的根本办法。 百分网目录
上篇临床细菌学 第一章需氧及兼性厌氧，革兰染色阴性杆菌、球杆菌、球菌及弯曲菌和螺旋菌 第一节心杆菌属 第二节放线杆菌属、艾肯菌属、金氏杆菌属和色杆菌属 第三节弗朗西丝菌属 第四节布鲁菌属 第五节军团菌属 第六节假单胞菌属 第七节伯克霍尔德菌属、窄食单胞菌属、丛毛菌属和食酸菌属 第八节不动杆菌属 第九节莫拉菌属 第十节金黄杆菌属和威克斯菌属 第十一节奈瑟菌属 第十二节鲍特菌属 第十三节产碱杆菌属、无色杆菌属、苍白杆菌属和根瘤菌属 第十四节弧菌属 第十五节气单胞菌属 第十六节肠杆菌科
第十七节巴斯德菌属 第十八节弯曲杆菌属和弓形菌属 第十九节螺杆菌属 第二十节巴尔通体属 第二十一节钩端螺旋体属 第二十二节疏螺旋体属 第二十三节密螺旋体属 第二章需氧革兰染色阳性球菌及杆菌 第一节葡萄球菌属 第二节链球菌属 第三节肠球菌属 第四节气球菌属及其相关菌属 第五节李斯特菌属和丹毒丝菌属 第六节棒状杆菌属及相关菌属 第七节芽胞杆菌属和其他需氧芽胞杆菌 第八节分枝杆菌属 第九节奴卡菌属、红球菌属 第三章专性厌氧菌 第一节消化球菌属、消化链球菌属、嗜胨菌属、微金菌属和厌氧球菌属 第二节韦荣菌属、氨基酸球菌属和巨形菌属 第三节丙酸杆菌属、放线菌属、双歧杆菌属、真杆菌
几种曲霉得形态特征 常见曲霉菌鉴定: 菌落:菌落生长速度,表面质地、颜色、形态与气味等。其中颜色就是曲霉菌分类得依据之一 ②分生孢子头:分生孢子头得形状、颜色与大小。分生孢子头由顶囊、瓶梗、梗基与分生孢子链组成,为曲霉得特征性结构 ③分生孢子梗或分生孢子柄:注意分生孢子梗得长短、颜色、表面粗糙或光滑、就是否有隔等 ④具有性生殖得曲霉能产生闭囊壳:为封闭式得薄壁子囊果,含子囊与子囊孢子; ⑤足细胞,也为曲霉得特征性结构、 曲霉菌得结构 1、烟曲霉菌 在SDＡ培养基上菌落生长快,棉花样,开始为白色,2~3天后转为绿色,数日后变为深绿色,呈粉末状、分生孢子头得顶囊烧瓶状,小梗单层,排列成木栅状,布满顶囊表面3/4,顶端有链形分生孢子,分生孢子球形,有小棘,绿色 烟曲霉菌菌落 ２、黄曲霉菌 在SDA培养基上菌落生长快,黄色,表面粉末状、分生孢子头顶囊球形或近球形,小梗双层,第一层长,布满顶囊表面,呈放射状排列,黄色,顶端有链形孢子
黄曲霉菌菌落 黄曲霉菌分生孢子头 ３、土曲霉菌 在ＳＤA培养基上菌落生长快,小,圆形,淡褐色或褐色、分生孢子头得顶囊半球形,小梗双层,第一层短,第二层长,呈放射状排列,分布顶囊表面２/3,顶端有链形孢子
土曲霉菌落 下列图片为分生孢子头
?4、黑曲霉菌 在SDA培养基上菌落生长快,表面黑色,粉末状。分生孢子头得顶囊球形或近球形,小梗双层,第一层粗大,第二层短小,呈放射状排列,布满整个顶囊,黑色,顶端有链形孢子 黑曲霉菌落 黑曲霉分生孢子头
5、杂色曲霉菌 在SDＡ培养基上菌落生长慢,菌落圆形紧密,绒毛状,羊毛状,颜色有数环,从青绿到红绿。分生孢子头得顶囊近球形,小梗双层,第一层长,第二层短,呈放射状排列,布满顶囊4/５,顶端有链形孢子 杂色曲霉菌菌落 杂色曲霉菌分生孢子头
1.2.1 形态学特征 按照东秀珠和蔡妙英编《常见细菌系统鉴定手册》（1999），中科院微生物所编著《一般细菌常用鉴定方法》（1978）的方法进行鉴定。芽孢杆菌属鉴定到种，参照了蔡妙英等译《芽孢杆菌属》（1980）的方法。 （1）革兰氏染色：挑选少许菌苔，涂布于干净玻片的蒸馏水中，风干固定，结晶紫染色（结晶紫2g，草酸铵0.8g，95%乙醇20 ml，加水至100 ml）1min，水洗后碘液（碘1g，碘化钾2g，水300 ml）作用1min，水洗，脱色，用番红O 液染3min，水洗，风干，光学显微镜观察。 （2）鞭毛染色：将16~24h菌龄的菌苔在载玻片上的水滴中轻蘸几下，将玻片倾斜，使菌液缓慢流到另一端，然后平放在空气中干燥。干燥后滴甲液（丹宁酸5g，FeCl3 1.5g，15%福尔马林2ml，1%NaOH 1ml，蒸馏水100 ml）染6~10min，水洗，干燥后，用乙液（2%AgNO3溶液）加热复染30min，蒸馏水冲洗，干燥，镜检，菌体为深褐色，鞭毛为褐色。 （3）运动性：半固体琼脂穿刺法，将菌种接在可使鉴定菌生长良好的培养基中，其中含0.3~0.6%的琼脂。适温培养，运动性可用透射光目测，如生长菌只生长在穿刺线上，边缘十分清晰，则表明鉴定菌无运动性；如生长菌由穿刺线向四周呈云雾状扩散，其边缘呈云雾状，则表示鉴定菌有运动性。 （4）芽孢染色：孔雀绿染色法。按革兰氏染色涂片后，用饱和的孔雀绿水溶液（约7.6%）染20 min，水冲洗后在用0.5%番红O复染20~30s，水洗，吸干，镜检。芽孢呈绿色，菌体和芽孢囊呈微红色。 （5）抗酸染色：常规涂片，石碳酸复红（10%碱性复红乙醇饱和液10 ml，5%石碳酸水溶液100 ml）加热染色5 min，倾去染液用酸性乙醇脱色，吕氏美蓝（2%亚甲基蓝乙醇饱和液30 ml，0.01%KOH 100 ml。）复染2min，水洗，吸干，镜检。 （6）荚膜染色：在载片一端滴一滴无菌水，取少许菌苔在水滴中制成悬液。取一滴墨汁与菌悬液混合，并用另一载片之一端将此水滴在载片上刮成薄膜风干。用纯甲醇固定1min，加0.5%番红O液数滴滴于涂片上，冲去残余甲醇，并染30s，然后倾去染液，立即吸干，镜检。 1.2.2 培养及生理特性 （1）菌落形态：用划线法将菌种接在平板培养基上，适温培养1~2d，出现单菌落开始观察，包括形状和大小，边缘，表面，隆起形状，透明度，菌落和培养基的颜色等。 （2）生长温度和耐热性：将菌种转接到几支试管中，分别在不同温度下培养，每处理2管，目测生长情况。
不常见细菌的快速鉴别方法 一. 不常见革兰阴性菌 1. 布氏杆菌属 布氏杆菌属是一类革兰阴性细小杆菌，牛、羊、猪等动物最易感染。人类接触带菌动物或食用病畜及其乳制品，均可被感染。布氏杆菌病广泛分布世界各地，我国部分地区曾有流行。布氏杆菌属分为羊、牛、猪、鼠、绵羊及犬布氏杆菌6个种，20个生物型。中国流行的主要是羊、牛、猪三种布氏杆菌，其中以羊布氏杆菌病最为多见。 布氏杆菌属细菌为非抗酸性，无芽胞，无荚膜，无鞭毛，呈球杆状(见图1)。血琼脂(BAP)上为透明或半透明、光滑且有光泽菌落。此细菌不在麦康凯琼脂上生长。布氏杆菌属细菌尿素阳性，触酶、氧化酶阳性，而吲哚阴性。由于该菌属细菌具有强的传染性，因此一旦怀疑应送往LRN B级参考实验室进行确认。 2. 空肠弯曲菌 空肠弯曲菌是一种人畜共患病病原菌，可以引起人和动物发生多种疾病，并且是一种食物源性病原菌，认为是引起全世界人类细菌性腹泻的主要原因。其致病因素包括粘附、侵袭、产生毒素和分子模拟机制等四个方面，通过分子模拟机制可以引起最严重的并发症一格林一巴利综合征。空肠弯曲菌可以通过产生细胞紧张性肠毒素、细胞毒素和细胞致死性膨胀毒素而致病。空肠弯曲菌对红霉素、新霉素、庆大霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素等抗生素敏感，但近年发现了不少耐药菌株及多重耐药性菌株。 空肠弯曲菌菌体轻度弯曲似逗点状(见图2)。菌体一端或两端有鞭毛，运动活泼，在暗视野镜下观察似飞蝇。有荚膜，不形成芽胞。微需氧菌，在含2.5～5%氧和10% CO2的环境中生长最好，在正常大气或无氧环境中均不能生长，最适温度为37～42℃。本菌在普通培养基上难以生长，在凝固血清和血琼脂培养基上培养36小时可见无色半透明毛玻璃样小菌落，单个菌落呈中心凸起，周边不规则，无溶血现象。空肠弯曲生化反应不活泼，不发酵糖类，不分解尿素。可还原硝酸盐，氧化酶和触酶为阳性。能产生微量或不产生硫化氢，甲基红和v-p试验阴性，枸椽酸盐培养基中不生长,在弯曲菌中马尿酸呈阳性反应具有重要鉴定价值。
细菌鉴定中常用的生理生化反应 录入时间:2009-8-13 15:12:12 来源：中国生命科技论坛 1、实验原理 （1）细菌生化试验 各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养基质的分解能力也不一样，因而代谢产物或多或少地各有区别，可供鉴别细菌之用。用生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌的生化反应。 （2）糖（醇）类发酵试验 不同的细菌含有发酵不同糖（醇）的酶，因而发酵糖（醇）的能力各不相同。其产生的代谢产物亦不相同，如有的产酸产气，有的产酸不产气。酸的产生可利用指示剂来判定。在配制培养基时预先加入溟甲酚紫［P HS . 2 （黄色）一6 . 8 （紫色）] ，当发酵产酸时，可使培养基由紫色变为黄色。气体产生可由发酵管中倒置的杜氏小管中有无气泡来证明。 （3）甲基红（Methylred ）试验（该试验简称MR 试验） 很多细菌，如大肠杆菌等分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸再被分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的pH 降低到4 . 2 以下，这时若加甲基红指示剂呈现红色。因甲基红指示剂变色范围是pH4 . 4 （红色）一pH6 . 2 （黄色）。若某些细菌如产气杆菌，分解葡萄糖产生丙酮酸，但很快将丙酮酸脱梭，转化成醇等物，则培养基的pH 仍在6 . 2 以上，故此时加入甲基红指示剂，呈现黄色。 （4）大分子物质代谢实验． 靛基质（口引睬）试验 某些细菌，如大肠杆菌，能分解蛋白质中的色氨酸，产生靛基质（叫睬），靛基质与对二甲基氨基苯甲醛结合，形成玫瑰色靛基质（红色化合物）。 硫化氢试验 某些细菌能分解含硫的氨基酸（肌氨酸、半肌氨酸等），产生硫化氢，硫化氢与培养基中的铅盐或铁盐，形成黑色沉淀硫化铅或硫化铁。为硫化氢试验阳性，可借以鉴别细菌。 明胶液化实验 某些细菌具有胶原酶，使明胶被分解，失去凝固能力，呈现液体状态，是为阳性。淀粉水解试验（在紫外诱变中做，本实验不做） 细菌对大分子的淀粉不能直接利用，须靠产生的胞外酶（淀粉酶）将淀粉水解为小分子糊精或进一步水解为葡萄糖（或麦芽糖），再被细菌吸收利用，细菌水解淀粉的过程可通过底物的变化来证明，即用碘测定不再产生蓝色。 （5）有机酸盐及氨盐利用试验 柠檬酸盐利用试验 柠檬酸盐培养基系一综合性培养基，其中柠檬酸钠为碳的唯一来源。而磷酸二氢按是氮的唯一来源。有的细菌如产气杆菌，能利用柠檬酸钠为碳源，因此能在柠檬酸盐培养基上生长，并分解柠檬酸盐后产生碳酸盐，使培养基变为碱性。此时培养基中的溟廖香草酚蓝指示剂由绿色变为深蓝色。不能利用柠檬酸盐为碳源的细菌，在该培养基上不生长，培养基不变色。 2、实验仪器，材料和用具 （1）实验仪器 37OC 恒温培养箱、20OC 恒温培养箱（室温代替）。 （2）微生物材料 大肠杆菌、变形杆菌、枯草杆菌、产气杆菌这四种菌种的斜面各1 支。 （3）试剂
常见霉菌毒素的种类及危害分析 霉菌毒素是一些霉菌在基质上生长繁殖过程中产生的有毒次级代谢产物。霉菌产毒仅限于少数产毒霉菌的部分菌株。不同的霉菌可产生同一种霉菌毒素，而一种霉菌可产生几种霉菌毒素。 霉菌根据生长条件划分为田间霉菌和仓储霉菌两种。田间霉菌是指镰孢菌属、青霉菌属和麦角菌属等野外菌株，这类霉菌通常是谷物在生长过程中就已感染。仓储霉菌主要是指饲料或原料在储存过程中产生的霉菌，以曲霉菌属为主。 黄曲霉毒素 黄曲霉毒素主要是曲霉菌产生的，其他曲菌、放线菌、镰孢霉菌和青霉菌也能产生黄曲霉毒素。所有动物均对黄曲霉毒素敏感，不过不同动物的敏感性差异较大。在家畜中以仔猪最为敏感。低浓度的黄曲霉毒素污染导致采食量下降、饲料转化率降低和引起机体的免疫抑制。母猪饲喂黄曲霉毒素污染严重的饲料，毒素会通过母乳传播而造成仔猪生长迟缓甚至死亡。此外，黄曲霉毒素还会干扰肝脏的解毒功能以及损害免疫系统。 赭曲霉毒素 赭曲霉毒素是由赭曲霉菌等所产生的一种毒素，分为A、B两种类型。赭曲霉毒素A的毒性较大，主要侵害猪的肾脏和肝脏。赭曲霉毒素可以造成猪的精神沉郁，食欲减退，体重下降，消化功能紊乱，肠炎，甚至腹泻，脱水多尿，伴随蛋白尿和糖尿。妊娠母畜子宫黏膜出血，往往发生流产。中毒后的病理变化以肾脏为主，可见肾脏肥大，呈灰白色，表面凹凸不平，有小泡，肾实质坏死，肾皮质间隙细胞纤维化;近曲小管功能退化，肾小管通透性变差，浓缩能力下降。 呕吐毒素 呕吐毒素属于单端孢霉烯族化合物，主要由禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌等镰刀菌产生。其危害主要是造成猪只的呕吐，同时降低采食量。呕吐毒素也属于一种很强的免疫抑制剂，它在猪体内可以抑制蛋白质的合成，对快速生长的组织(如皮肤和黏膜)和免疫器官均可产生影响，降低猪群的抵抗力。 玉米赤霉烯酮 玉米赤霉烯酮(F2毒素)由禾谷镰孢霉菌产生，是具有类似雌激素作用的霉菌毒素，临床症状因感染剂量和年龄不同而异。玉米赤霉烯酮对猪影响最大的部位是生殖系统。较低的浓度会诱发女性化现象，较高浓度会干扰排卵、受孕、植入及胚胎的发育。可造成后备母猪或小母猪出现假发情和阴道脱垂或脱肛。该毒素会造成怀孕母猪的流产和死胎、初生仔猪出现八字腿及外阴部肿胀。 T-2毒素
菌种鉴定的分子生物学方法 ——16S rDNA测序鉴定菌种 一．原理 细菌中包括有三种核糖体RNA，分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA。5S rRNA虽易分析，但核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA含有的核苷酸数几乎是16S rRNA的两倍，分析较困难。而16S rRNA相对分子量适中，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16S rRNA作为序列分析对象对微生物进行测序分析。16S rRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16S rDNA，rRNA基因由保守区和可变区组成。在细菌的16SrDNA中有多个区段保守性，根据这些保守区可以设计出细菌通用物，可以扩增出所有细菌的16SrDNA片段，并且这些引物仅对细菌是特异性的，也就是说这些引物不会与非细菌的DNA互补，而细菌的16S rDNA可变区的差异可以用来区分不同的菌。因此，16SrDNA可以作为细菌群落结构分析最常用的系统进化标记分子。随着核酸测序技术的发展，越来越多的微生物的16S rDNA序列被测定并收入国际基因数据库中，只要将基因序列放入基因数据库进行对比，便可快速的鉴定所测定的细菌种属，这样用16Sr DNA作目的序列进行微生物群落结构分析更为快捷方便。二．技术路线 该方法包括细菌基因组DNA提取、16S rDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA 测序、序列比对等步骤。具体技术路线如下： 三．方法步骤 （一）细菌基因组DNA提取（酶解法） 1. 挑取单菌落接种到10 mL LB培养基中37℃振荡过夜培养。
常见细菌种属鉴定 摘要：【目的】了解细菌生理生化反应原理，掌握细菌鉴定中常见的生理生化反应方法。分析不同细菌对不同含碳、含氮化合物的分解利用情况。研究细菌在不同培养基的不同生长现象及其代谢产物在鉴别细菌中的意义。【原理】各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养基质的分解能力也不一样，因而代谢产物存在差别。以此用生理生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌的生理生化反应。关键词：微生物；细菌；种属；鉴定 Common bacterial species identification Abstract: [ Objective ] to understand bacterial physiological and biochemical reaction principle, master the identification of bacteria commonly found in the physiological and biochemical reaction method. Analysis of different bacteria on different carbon, nitrogen containing compounds are decomposed using the situation. Studies on bacteria in different culture medium with different growth phenomenon and its metabolites in bacterial identification and significance of. [ principle ] various bacteria with enzyme system is endless and same, on nutrition matrix decomposition ability is different, so the metabolite differences. By physiological and biochemical test methods for detection of bacteria on a variety of substrate metabolis m and its metabolites, thus differentiating bacterial species, known as bacterial physiological and biochemical reaction. Key words: microbe; bacteria; species identification 前言 在所有生活细胞中存在的全部生物化学反应称之为代谢。代谢的过程主要是酶促反应过程。具有酶功能的蛋白质多数在细胞内，称为胞内酶（endoenzymes）。许多细菌产生胞外酶（exoenzymes），这些酶从细胞中释放出来，以催化细胞外的反应。各种微生物在代谢类型上表现出很大的差异，如表现在对大分子糖类和蛋白质的分解能力以及分解代谢的最终产物的不同，反映出它们具有不同的酶系和不同的生理特性，这些特性可被用作为细菌鉴定和分类的内容。 在这部分实验中，通过细菌对大分子物质的水解、糖发酵实验、鉴定肠道菌的不同生理生化反应等几个试验，来证明不同细菌生理生化功能的多样性。 1 .材料和方法 1.1实验器材 1.1.1菌种 枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、普通变形杆菌； 1.1.2培养基 固体淀粉培养基、葡萄糖发酵培养基、乳糖发酵培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基等； 1.1.3试剂和溶液 甲基红，Lugol’s碘液，40%的KOH，5%的a-萘酚溶液； 1.1.4仪器或其他用具 无菌培养皿，无菌试管，杜氏小管，记号笔，移液管及无菌枪头，棉塞，皮筋，报纸，培养箱等。
菌种鉴定常见问题解答 1.菌种鉴定的方法和步骤是什么？ 菌种鉴定一般就只要提取基因组DNA，然后PCR扩增16srDNA片段，上GeneBank或者Eztaxon对比即可。一般序列相似度在97%以上就可以认为是同种细菌（当然也有例外，DNA序列仅仅是一个参考指标）。 -----消息来源：百度问答 . 2. 微生物的菌种鉴定可以鉴定到“株”一级吗？ 如果你的菌株是自然界中分离得到，就只能鉴定到种，不能鉴定到株，因为多多少少和其他株系的细菌有区别，即便你做了一些特征的鉴定，发现和某一株细菌一模一样，你也没有理由说你的细菌就是那一株细菌，因为你不可能把所有的特征都做完，株和株之间的关系就相当于不同的人之间的关系，世界上不可能有完全相同的两个人。除非你知道你的细菌本来就是某一株细菌扩增出来的（而且要保证没有变异，否则就是一个新株），可是这样就没必要鉴定了。 -----消息来源：百度问答 3．为什么鉴定出来的菌种跟我想象的相差太大？ 答：我们菌种鉴定使用PCR直接扩增的方法，即以客户提供的菌株为模版直接进行PCR扩增，中间不经过传代培养，因此不会引入新的污染，如果出现结果不一致的情况，一般有以下原因导致： 1、您提供的样品未经过三次分离纯化，含有其他杂菌； 2、您提供样品的真实情况确认如此。 建议您提供三次纯化的菌株重新进行鉴定。 4．为什么有时会出现PCR扩增不出的现象； 答：扩增不出的原因主要有以下几种： 1、您提供的菌种从严格意义上讲不是细菌或者真菌，或者是信息有误； 2、您提供的菌种为革兰氏阳性菌，由于细胞壁较厚，采用常规方法不能有效地破壁； 3、培养基或菌体中表达产物含有抑制PCR产物的组份。 对于第二种或第三种情况需要提供基因组DNA。 5．PCR扩增直接测序为什么会出现套峰的现象； 答：1、测序结果个别碱基出现N，是由细菌rDNA多态性造成，对菌种鉴定没有无影响； 2、所有测序反应均出现大面积套峰，是由于您提供的样品模版不纯造成的。这种情况需要重新纯化菌种。 6．PCR产物克隆测序为什么会出现结果分离的现象？ 答：我们以菌种为模版直接进行PCR扩增，然后对PCR产物进行克隆测序，如果出现2种或以上的测序结果，说明您提供的模版不单一，即菌种不纯，含有其他杂菌，这种情况建议您将菌种重新进行三次以上纯化。 7．菌种鉴定可以鉴定到种吗？ 答：利用rRNA的保守区域进行鉴定只是菌种鉴定的一个分子生物学指标，通过鉴定结果可以了解未知菌株和NCBI公布序列的哪个种属比较接近。
曲霉菌的鉴定与应用 发表时间：2010-07-15T14:38:22.890Z 来源：《中外健康文摘》2010年第10期供稿作者：柴淼潘宇罗晓慧袁国明[导读] 这种营养菌丝与组织结合非常牢固，因此在留取标本时，一定要嘱咐病人要用力咳痰并要咳到带盖的容器中。柴淼潘宇罗晓慧袁国明（黑龙江省哈尔滨市第一医院黑龙江哈尔滨 150000） 【中图分类号】R563 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085 (2010)10-0046-02 曲霉菌以腐物寄生的形式广泛存在于自然界中，为条件致病菌。引起人类感染的约20多种，常见的有8种。烟曲霉菌、黄曲霉菌是引起肺曲霉病最重要的两个菌种。近几年，由于广谱抗生素的广泛使用及联合使用是造成肺曲霉病的重要原因之一。特别是2008年以来，肺曲霉病的发病率突然在全国范围内迅速上升。临床上治疗时机的延误是造成死亡的主要原因。对于曲霉病的诊断，找到病原体为金标准。检验科微生物工作者如何配合临床应对这种突如其来的事件，迅速制定和建立实验室的快速检测方法成为当务之急。多年培养出的应急意识及工作经验，使我们在短时间内迅速制定出了曲霉菌实验室快速鉴定的最有效、最可靠的检测方法。 1 方法 1.1标本留取真菌的菌丝分为两种：一种为气中菌丝，另一种叫营养菌丝。这种营养菌丝与组织结合非常牢固，因此在留取标本时，一定要嘱咐病人要用力咳痰并要咳到带盖的容器中。 1.2培养曲霉菌的培养一般接种在沙保弱培养基中，但实践经验告诉我们，接种在血平板中最好。因为在血平板中培养18～24小时后生长出的菌落会产生特殊的颜色，它是鉴别曲霉菌的重要特征之一。如，曲霉菌的菌落为灰绿色，黄曲霉菌的菌落呈棕黄色，菌落的背面还可见到皱褶。 1.3涂片由于营养菌丝与组织粘膜结合牢固，直接留取痰液涂片检查很难查到。即使找到了也只是一些子囊及壳细胞，而被误认为是酵母菌。这也是造成临床治疗延误的重要原因，因此涂片检查应在培养后进行，挑取菌落时一定是刮取而不是沾取，染色后应先用低倍镜找视野（即蒲公英花样结构），再换油镜观察。各种曲霉菌有它特有的形态特点。 正确留取标本是曲霉菌能够检出的前提条件，培养选择血平板是24小时内出现典型曲霉菌菌落的保障，镜下查到完整曲霉菌结构是一步鉴定到种的关键。掌握了这三个方面，实验室查到病原体就有了可靠的依据。 2 结论 为什么肺曲霉菌病比以往以8倍的速度上升，最重要的原因就是抗生素的广泛使用和联合应用后细菌，甚至是正常菌群被抑制或杀死使真菌得以生长繁殖导致菌群失调，造成真菌感染。许多抗生素对人体中的白细胞有抑制和杀灭作用。中性粒细胞可组织曲霉菌菌丝的形成，单核细胞则主要影响分生孢子，中性粒细胞和吞噬细胞功能的降低及数量的减少，加大了曲霉菌感染的风险。曲霉菌的检测以找到病原体为金标准，美国国家免疫变态感染疾病学提供IPA诊断标准是组织病理学检查检到曲霉菌菌丝。侵袭性操作，如：纤支镜、经皮肺穿、开胸手术等方法，所取组织培养阳性。国内目前实验室对曲霉菌检测的标准没有报道，临床发表文章普遍认为曲霉菌的分离难度大，培养时间长（需一周）。PCR检测为曲霉菌的最佳选择，实际上这种方法是不值得提倡的，其原因是曲霉菌广泛分布在自然界中，空气中也存在。实验室不是在真空中，假阳性不可避免。PCR对曲霉菌基因片段的扩增加大了对环境污染的危险性。由于过去IPA的诊断较晚，治疗困难，病死率极高，未经治疗几乎100%死亡，仅部分免疫损害因素消除的患者可以存活。在肝脏、骨髓移植和严重的白细胞减少的患者中，至临床出现症状到死亡一般仅10～14天，故治疗成功的关键在于早期诊断，尽早应用合理的抗真菌药物。 作为微生物室工作者，今后的工作会更复杂、更艰难，应对更艰巨的挑战是我们应该承担的责任和义务。
常见霉菌的代表属 （一）根霉（Rhizopus) 分类：与毛霉同属接合菌纲毛霉目。 分布:分布于土壤、空气中，常见于淀粉食品上，可引起霉腐变质和水果、蔬菜的腐烂。 形态特征： 很多特征与毛霉相似，菌丝也为白色、无隔多核的单细胞真菌，多呈絮状。——与毛霉主要区别在于根霉有假根和匍匐枝，与假根相对处向上生出孢囊梗。孢子囊梗与囊轴相连处有囊托，无囊领。 繁殖：无性繁殖产孢囊孢子，有性繁殖产生接合孢子。根霉的孢子囊和孢囊孢子多为黑色或褐色，有的颜色较浅。 代表种：米根霉（R.oryzae) 黑根霉(R.nigrican)等。 应用：①根霉能产生一些酶类，如淀粉酶、果胶酶、脂肪酶等，是生产这些酶类的菌种。在酿酒工业上常用做糖化菌。 ②有些根霉还能产生乳酸、延胡索酸等有机酸。③有的也可用于甾体转化。 （二）毛霉（Mucor) 分类地位 分布 形态特征 繁殖方式 代表种—总状毛霉、高大毛霉、 鲁氏毛霉、梨形毛霉 应用 在分类系统中属于接合菌纲、毛霉目。 分布:广泛分布于土壤、空气中，也常见于水果、蔬菜、各类淀粉食物、谷物上，引起霉腐变质。 形态特征：菌丝发达、繁密；白色无隔多核，为单细胞真菌。 形态特征：毛霉的孢子囊梗有单生的，也有分枝的。 分枝有单轴、假轴两种类型。 毛霉的菌丝多为白色，孢子囊黑色或褐色，孢子囊孢子大部分无色或浅兰色，因种而异。繁殖：可形成孢囊孢子、厚垣孢子、接合孢子。 无性繁殖： 孢子囊梗直接从菌丝体上发出，单生或分枝，顶端产生膨大的孢子囊，孢子囊为球形，囊壁上常有针状的草酸钙结晶。在囊轴与孢子囊梗相连处无囊托，但孢子囊壁破裂时，留有残迹—囊领。 经济价值：蛋白酶、淀粉酶、 有机酸、甾体转化 毛霉的应用：
临床标本细菌培养鉴定常见的个疑问
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问题1:如何正确应用药物敏感结果? 正确运用药敏试验结果应考虑以下3个方面: 首先要确定病原菌，如未找到真正的致病菌，药敏实验不但不能指导用药甚至可能误导临床； 重视耐药监测，这是经验用药的一个重要的参考； 考虑到药敏试验的局限性:体外报告敏感的药物体内治疗不一定有效，而体外报告耐药的药物体内治疗不一定无效。 问题２:是否MIC越低的药物越好？ 不一定。因为不同药物对同种细菌，同一药物对不同细菌的折点均可不同，并且若细菌产生某些特殊耐药机制时，即使体外敏感也应报耐药，另外尚需考虑药动学和耐受性。因此，不能单纯比较MIC值而认为ＭＩＣ越低的药物就一定越好。ＭＩC只表示一种药物对某一株细菌抗菌作用的强弱，MIC越低（离中介值越远)说明该药物对相应的病原菌的作用越强。只能比较同一种药对同一株菌，若MIC值升高，可认为其耐药性提高。 问题３：是否所有报告的细菌均为病原菌? 不一定。原因如下: 所报告细菌为污染菌或定植菌，细菌培养结果的临床意义大小与所取标本有关。如为血液等无菌标本则临床意义较大，但即使血培养阳性也可能为污染菌。某些标本易受污染如痰标本易于受咽喉部携带菌的污染,尿培养易受下尿道、尿道口寄居菌污染。 可能为应用抗菌药后的菌群交替或菌群失调。特别是原为复数菌感染时,针对优势菌治疗一段时间后可能非优势上升为优势菌，或广谱抗菌药治疗后可能
出现真菌感染。 有2种以上病原菌时因生长速度不同、营养要求不同，培养结果不能真实反映病原菌的种类、数量。 问题4:为什么有时痰涂片结果与痰培养结果不一致？ 由于痰标本进行培养和涂片时选取的部位不一致; 某些快生长菌所占比例并不多，但由于生长速度快、营养要求低,能在培养过程中迅速变为优势菌而掩盖其他菌的生长； 标本从采集到接种的时间过长,造成部分苛养菌死亡，在涂片中看到的只是菌的残骸而非活菌。 问题５:我们想用的药物在药敏试验中没有做? 1.天然耐药 ２.可能是药物的敏感性被其他药物所预报 问题6：为什么有的菌报告很多种药物,有的仅报告几种药物? 报告的药物种类根据细菌种类的不同而有所不同，如铜绿假单胞菌报告的药物较多,而嗜麦芽窄食单胞菌报告的药敏较少。 问题７:是否能将所用的药都做药敏试验? 1．没有必要:通过耐药机制和标志性药物可以预测其他抗菌药物的敏感性 2.没有可能:不是所用药物都可以做药敏试验(需要药物在体外稳定,需要有操作标准和解释标准） 问题8:选择药敏报告敏感的药物,为什么临床治疗无效？ ①体外药敏试验只能预测体内治疗效果,并不等同；一般来说，耐药＝治疗无效;敏感≠治疗有效；
利用ITS进行菌种鉴定是目前较多采用的方法。ITS是内源转录间隔区（In ternally Tran scribed Spacer）的英文缩写,位于rRNA 编码基因18S,5. 8S和28S之间的小基因片段。其优点有：具有高拷贝数,整个序列的长度在600?800 bp,利用rDNA通用引物能够很容易被扩增出来；同时包含保守与变异序列，能根据保守序列中的变异位点设计特殊引物进行特异性扩增比较，rRNA基因（rDNA）在微生物的鉴定应用中，具有检测微生物种水平的多态性特征。这些rDNA高度保守地分布在染色体的不同位置，在每个单倍染色体基因组中的拷贝数超过200个，这使得保守区域能够很容易被扩增出来。每个重复的rDNA序列的存在方式为由一前一后的18S rDNA小亚基单元（SSU）, 5.8S rDNA, 28S rDNA大亚基单元（LSU）组成，已设计出通用引物来扩增ITS序列分析相关真菌种水平之间的差异。本研究通过丝状真菌ITS保守序列的扩增, 同源序列的对比分析，结合传统鉴定方法，对从土壤中分离筛选的一株丝状真菌进行了分析鉴定，并对鉴定结果和方法进行了比较分析。种内变异还显示在rDNA基因间内转录间隔区I和U （分别为ITS I和ITS H）的片段大小上。ITS 区在核糖DNA中进化较快，可在同一属间甚至群体间发生变化。其中ITS U区在种间变异性较高（22%），种内变异性较低（V 3%）。选择的两对引物均以ITS区的序列为靶目标，其中引物①（ITS1和ITS4）扩增的是ITS I区、5.8SrDNA 和ITS U 区的基因序列，可以鉴别出念珠菌属的3个菌种；引物②（ITS4和ITS86）扩增的是5.8S rDNA和28S rDNA之间的ITS H区的保守顺序，可以鉴别出念珠菌属的7个菌种。因而笔者更推荐采用引物②，它不仅有很强的通用性，能识别更多菌种，而且具有更高的属种特异性。 ns r nsn
细菌生化试验 1、实验原理 （1）细菌生化试验 各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养基质的分解能力也不一样，因而代谢产物或多或少地各有区别，可供鉴别细菌之用。用生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌的生化反应。 （2）糖（醇）类发酵试验 不同的细菌含有发酵不同糖（醇）的酶，因而发酵糖（醇）的能力各不相同。其产生的代谢产物亦不相同，如有的产酸产气，有的产酸不产气。酸的产生可利用指示剂来判定。在配制培养基时预先加入溟甲酚紫［P HS . 2 （黄色）一6 . 8 （紫色）] ，当发酵产酸时，可使培养基由紫色变为黄色。气体产生可由发酵管中倒置的杜氏小管中有无气泡来证明。 （3）甲基红（Methylred ）试验（该试验简称MR 试验） 很多细菌，如大肠杆菌等分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸再被分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的pH 降低到4 . 2 以下，这时若加甲基红指示剂呈现红色。因甲基红指示剂变色范围是pH4 . 4 （红色）一pH6 . 2 （黄色）。若某些细菌如产气杆菌，分解葡萄糖产生丙酮酸，但很快将丙酮酸脱梭，转化成醇等物，则培养基的pH 仍在6 . 2 以上，故此时加入甲基红指示剂，呈现黄色。 （4）大分子物质代谢实验． 靛基质（口引睬）试验 某些细菌，如大肠杆菌，能分解蛋白质中的色氨酸，产生靛基质（叫睬），靛基质与对二甲基氨基苯甲醛结合，形成玫瑰色靛基质（红色化合物）。 硫化氢试验 某些细菌能分解含硫的氨基酸（肌氨酸、半肌氨酸等），产生硫化氢，硫化氢与培养基中的铅盐或铁盐，形成黑色沉淀硫化铅或硫化铁。为硫化氢试验阳性，可借以鉴别细菌。 明胶液化实验 某些细菌具有胶原酶，使明胶被分解，失去凝固能力，呈现液体状态，是为阳性。淀粉水解试验（在紫外诱变中做，本实验不做） 细菌对大分子的淀粉不能直接利用，须靠产生的胞外酶（淀粉酶）将淀粉水解为小分子糊精或进一步水解
菌种鉴定的几方面特征 1、个体形态：镜检细胞形状、大小、排列，革兰氏染色反应，运动性，鞭毛位置、数目，芽孢有无、形状和部位，荚膜，细胞内含物；放线菌和真菌的菌丝结构，孢子丝、孢子囊或孢子穗的形状和结构，孢子的形状、大小、颜色及表面特征等。 2、培养特征：①在固体培养基平板上的菌落和斜面上的菌苔性状（形状、光泽、透明度、颜色、质地等）。 ②在半固体培养基中穿刺接种培养的生长情况。③在液体培养基中混浊程度，液面有无菌膜、菌环，管底有无絮状沉淀，培养液颜色等。3、生理生化特征：生理生化特征与微生物的酶和调节蛋白的本质和活性直接相关，酶及蛋白质都是基因产物，所以对微生物生理生化特征的比较也是对微生物基因组的间接比较，加上测定生理生化特征比直接分析基因组要容易得多，因此生理生化特征对于微生物的系统分类仍然是有意义的。4、血清学试验与噬菌体分型。5、氨基酸顺序和蛋白质分析。 6、核酸的碱基组成【(G+C)%】 7、核酸的分子杂交。 营养缺陷型的应用 从自然界分离到的微生物在其发生突变前的原始菌株，称为野生型菌株。野生型菌株经过人工诱变或自然突变失去合成某种营养（氨基酸、维生素、核酸等）的能力，只有在基本培养基中补充所缺乏的营养因子才能生长，称为营养缺陷型。营养缺陷型菌株的筛选，在生产实践和基础理论中都有着重要的意义。生产实践中，营养缺陷型可用于工业微生物育种，协助解除代谢反馈调控机制，从而达到大量积累终产物的目的；也可将营养缺陷型菌株作为生产菌种杂交、重组育种时的遗传标记。在基础理论中，营养缺陷型不仅被广泛应用于阐明微生物代谢途径上，而且在遗传学上具有特殊的地位。在遗传规律中的转化、转导、原生质体融合、质粒和转座因子等的研究中，营养缺陷型是最常用的标记菌种。代谢调控的类型 1、初级代谢的调节控制：虽然代谢调节方式很多，由于微生物细胞体内的所有生化反应都是在酶的催化下进行的，因此，对酶的调节控制是最主要、最有效的调控方式。它包括两个方面，一是调节酶的合成量（反馈阻遏），二是调节现成酶分子的催化活力（反馈抑制）。两者密切配合和协调，以达到最佳的调节效果。①酶合成的调节：酶合成的调节是一种通过调节酶的合成量进而调节代谢速度的调节机制，这是一种在基因水平上（在原核生物中主要在转录水平上）的代谢调节。凡能促进酶生物合成的调节，称为诱导，而能阻碍酶生物合成的调节，则称为阻遏。 ②酶活性的调节：酶活性调节是以酶分子的结构为基础的，在酶分子水平上的一种代谢调节。它是通过改变现成的酶分子活性来调节新陈代谢的速率，包括酶活性的激活和抑制两个方面。2、次级代谢的调节控制：①次级代谢产物的诱导调节②次级代谢产物碳源分解调节③次级代谢产物氮源分解调节④次级代谢反馈调节⑤磷酸盐调节⑥细胞膜透性的调节原生质体的制备方法 制备大量具有活性的原生质体是微生物原生质体融合育种的前提。为制备原生质体，必须有效地除去细胞壁。去壁的方法有三种：⑴机械法⑵非酶分离法⑶酶法。采用前两种方法制备的原生质体效果差，活性低。酶法分离原生质体的方法：首先选择原始亲株，经过遗传标记筛选，得到直接亲本，采用培养皿平板玻璃纸或摇瓶振荡法培养，取年轻的菌体转入到高渗溶液中，加入有关水解酶，在一定条件下（温度、pH值等）酶解细胞壁。酶解后释放的原生质体和残存菌丝片断的混合液经过滤，除去大部分菌丝碎片。滤液进一步低速离心10min，洗涤后弃去上清液，沉淀悬浮于同一种高渗溶液中，即可得到纯化的原生质体。 融合体的鉴定 融合体中除重组体外，还有异核体或部分结合子、杂合二倍体或杂合系，这些都会在平板上形成菌落，检出融合体的方法有多种，在育种工作中可根据实验目的和微生物不同加以选择，下面是在原生质体融合育种中经常采用的。⑴利用营养缺陷型标记选择融合体，其检出设计的原则是在分离的培养基上只有融合体生长而不能让双亲本原生质体形成菌落。融合的双亲带有不同营养缺陷型标记，原生质体融合处理后的混合物直接分离到基本培养基上就可检出融合体。⑵利用抗药性选择融合体，微生物的抗药性是菌种的重要特性，是由遗传物质决定的。不同种的微生物对某一种药物的抗性存在差异，利用这种特性也可用于融合体筛选。 ⑶利用荧光染色法选择融合体，荧光染色法是事先使双亲染色体而携带不同荧光色素标记，然后在显微操作器和荧光显微镜下，挑取同时带有双亲原生质体荧光标记的融合体，直接分离到再生培养基上再生，最后得到融合体。⑷钝化选择法，用灭活原生质体和具活性原生质体融合（营养缺陷型），由于灭活亲株原生质体和营养缺陷型亲株原生质体在基本培养基上都不能生长，只有融合体才能形成菌落。 菌种选育的方法和特点 1、诱变育种：微生物的诱变育种，是以人工诱变手段诱发微生物基因突变，改变遗传结构和功能，通过筛选，从多种多样的变异体中筛选出产量高、性状优良的突变株，并且找出发挥这个变株最佳培养基和培养条件，使其在最适的环境条件下合成有效产物。基因突变是微生物变异的主要源泉。人工诱变又是加速基因突变的重要手段。以人工诱发突变为基础的微生物诱变育种，具有速度快、收效大、方法简单等优点，它是菌种选育的一个重要途径。 2、杂交育种：微生物杂交的本质是基因重组，优点：第一，通过具有不同遗传性状菌株的杂交，使遗传物质进行交换和重新组合，改变亲株的遗传物质基础，扩大变异范围，使两亲株的优良性状集中于重组体内，获得新品种。第二，通过杂交后获得具有新遗传特性的重组体，不仅可克服因长期诱变造成的生活力下降，代谢缓慢等缺陷，也可以提高对诱变剂的敏感性，降低对诱变剂的“疲劳” 效应。第三，通过杂交可以总结遗传物质的转移和传递规律，丰富并促 进遗传学理论的发展。3、基因工程育种：与传统育种方法不同的是， 基因工程育种不但可以完全突破物种间的障碍，实现真正意义上的远缘 杂交。而且这种远缘既可跨越微生物之间的种属障碍，还可实现动物、 植物、微生物之间的杂交。广义的基因工程育种包括所有利用DNA重 组技术将外源基因导入到微生物细胞，使后者获得前者的某些优良性状 或者利用后者作为表达场所来生产目的产物。由于微生物是单细胞，且 结构简单，是基因工程理想的表达载体。所以许许多多来自于不同界的 物种（人体、动物、植物、微生物等）的基因都被成功地克隆到微生物 细胞中并获得表达。 诱变育种的方法和优缺点 诱变育种具有方法简单、投资少、收获大等优点，但它最大缺点是缺乏 定向性。在诱变育种过程中应注意出发菌株、诱变剂及诱变剂量的选择、 诱变处理方式方法的应用，以及结合有效的筛选方法等来弥补不足，以 提高诱变育种的效率。诱变育种的步骤和方法包括：出发菌株的选择， 单孢子（或单细胞）菌悬液的制备，诱变剂及诱变剂量的选择，诱变的 处理方法，以及纯化分离等。1.出发菌株要求：⑴对诱变因素敏感的菌 株；⑵选择具备一定生产能力，并且在生产过程中经过自然选育的菌株； ⑶采用具有有利性状的菌株，如生长速度快、营养要求低以及产孢子早 而多的菌株；⑷选择纯种作出发菌株；⑸选择出发菌株应考虑其稳定性； ⑹选择出发菌株的其他因素；2.出发菌株的纯化：确定诱变出发菌株之 后，就要进行纯化，通过菌种纯化分离，从单菌落中挑选所需要的优良 菌株，与具有其他性状的菌株分离开来，从中获得遗传性状基本一致的， 并且稳定的变种。纯种分离方法，常用划线分离法和稀释分离法。 3. 单孢子（或单细胞）悬液的制备：在诱变育种中，所处理的细胞必须 是单细胞、均匀的悬液状态。这是因为，一方面分散状态的细胞可以均 匀地接触诱变剂，另一方面又可避免长出不纯菌落。4.诱变剂及诱变剂 量：凡能诱发生物基因突变，并且突变频率远远超过自发突变率的物理 因子或化学物质，称为诱变剂。它们包括物理诱变剂、化学诱变剂和生 物诱变剂三大类。诱变的最适剂量，应该使所希望得到的突变株在存活 群体中占有最大的比例，这样可以减少以后的筛选工作量。5.诱变的处 理方法：⑴单因子处理⑵复合因子处理①两个以上因子同时处理②不同 诱变剂交替处理③同一种诱变剂连续重复使用④紫外线光复活交替处 理。 反馈阻遏和反馈抑制的原理 反馈阻遏：主要是通过终产物与阻遏蛋白的亲和力的改变，使阻遏蛋 白与操纵基因结合，不能合成mRNA，从而达到对整个反应过程进行调 节的目的。反馈抑制：主要的作用方式在于末端产物对反应途径中调 节酶的抑制。受反馈抑制的调节酶一般都是变构酶，酶活力调控的实质 就是变构酶的变构调节。变构酶分子具有两个和低分子物质结合位点， 一个是与底物结合的催化中心（活性中心），另一个可与调节因子（又 称效应物）相结合的调节中心（变构中心）。当效应物与调节中心结合 后，可引起酶蛋白分子发生构象变化，从而引起酶的活性中心对底物的 亲和力和催化能力的改变，阻碍了酶和它的底物的结合，促进或抑制了 酶活力，使整个代谢途径的快、慢受到调节，称这种现象为变构效应。 抗反馈调节菌株的筛选 抗反馈调节突变株是一种解除合成代谢反馈调节机制的突变型菌株。其 特点是所需产物不断积累，不会因其浓度超量而终止生产，如果由于结 构基因突变而使变构酶成为不能和代谢终产物相结合的，便是失去了反 馈抑制的突变，称为“抗反馈突变型”，若是由于调节基因突变引起调节 蛋白不能和代谢终产物相结合而失去阻遏作用的，称为“抗阻遏突变 型”。操纵基因突变也能造成抗阻遏作用，产生类似于组成型突变的现 象。其方法是把结构类似物作为筛选的遗传标记。通常是把结构类似物 和培养基混合制成平板，诱变后菌体分离其上，经培养，那些被解除反 馈调节的突变株可以选择性地生长，并在细胞内合成相应的氨基酸。变 株的菌落在生长过程把氨基酸分泌到培养基中，促使菌落周围敏感菌的 生长，形成一个混淆的增殖圈，挑取增殖圈大而明显的菌落，进一步试 验复证。 建库前的菌种的检定（大肠杆菌表达的工程菌菌种） 1、划种LB琼脂平板，应呈典型大肠杆菌集落形态，无其他杂菌生长， 2、涂片革兰氏染色，在光学显微镜下观察为典型的革兰氏阴性杆菌， 3、对抗生素的抗性，应与原始菌种相符，大多数为抗氨卡青霉素， 4、 电镜检查，应为典型大肠杆菌形态，无支原体、病毒样颗粒及其他微生 物污染。5、生化反应，应符合大肠杆菌生物学性状，6目的产物表达 量，在摇床中培养应不低于原始菌种的表达量，7、表达产物的类型， 用免疫学或合适方法证明型别无误，8、质粒检查，质粒的酶切图谱应 与原始质粒相符。 微生物细胞的破碎方法 化学法：1、自溶法，细胞膜结构在一定的条件下，由于细胞自体的各 种水解酶如蛋白酶、酯酶等的酶解作用而发生溶解，2、表面活性剂处 理法，常用十二烷基硫酸钠等阴离子表面活性剂，3、脂溶性溶剂处理 法：用丙酮、氯仿、甲苯等溶解细胞的脂蛋白，4、用低渗溶液，如氨 水、稀盐及含有少量有机溶剂的水溶液处理，是细胞膜胀破。物理法： 1机械磨碎法，2、加压破碎法，在55Mpa的高压下，急速喷射撞击挤 压。3超声破碎法，4反复冻融法。生物学的方法主要是采用酶解法 生物产品浓缩和干燥的方法 浓缩：1、减压干燥浓缩法，是通过降低液面的压力使液体沸点降低， 减压的真空度越高，沸点降得越低，蒸发越快。此法适用于一些不耐热 的生物大分子及生物制品的浓缩。2、吸收法，是通过一种吸收剂直接 吸收除去溶液中溶剂分子，是溶液浓缩的方法。使用的吸收剂必须与溶 液不起化学反应，对生物大分子不起吸附租用，易与溶液分开，吸收剂 除去溶剂后能反复使用（常用的是聚乙二醇）3、超滤法，是使用一种 特制的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方法。通过超滤 法，蛋白质和酶的稀释液一般可浓缩到10%~50%浓度，回收率高达90%。 应用超滤法关键是在于滤膜的选择。干燥：1，真空干燥，适用于不耐 高温、易氧化的物质的干燥和保存，其原理与减压浓缩相同，真空度越 高，沸点降得越低，蒸发越快。2、冷冻真空干燥，又称为升华干燥， 除利用真空干燥的原理外，同时增加了温度因素。在相同压力下，水蒸 汽压力随温度的下降而下降，故在低温低压下，冰很容易升华为气体。 基因工程产品一般需检测的指标 1、鉴别试验， 2、外观，冷冻干燥制品应为白色薄壳疏松体。加入标量 蒸馏水后应迅速溶解为澄明液体，不得含有肉眼可见的不溶物，3、化 学检定4、pH值5、水分，一般冷冻干燥生物制品应不高于3%，6、效 价测定7、无菌试验8、异常毒性试验9、蛋白质含量，一般用Lowry法 测定10、比活性11、纯度，根据要求用电泳法和高效液相色谱法等12、 分子量，一般用还原型SDS—PAGA法13、外源性DNA法残留量，一般 用固相斑点杂交法，以地高辛标记的核酸探针法测定14、IgG残留量15、 宿主蛋白残量，一般用酶联免疫法测定16、残余抗生素活性17、细菌内 毒素含量18、等电点19、紫外光谱扫描20、肽图21、N—末端氨基酸序 列。 菌种衰退的原因，防止措施和保存方法 原因：1、基因突变－－主要原因：有关基因发生负突变导致菌种衰退， 表型延迟造成菌种衰退，质粒脱落导致菌种衰退，2、连续传代－－加 速衰退，3、不适宜的培养和保藏条件－－加速衰退。防止措施：控制 传代次数，菌种经常纯化，创造良好的培养条件，利用不易衰退的细胞 移种传代，采用有效的菌种保藏方法，讲究菌种选育技术。保存方法： 斜面低温保藏法，石蜡油封藏法，砂土管保藏法，麸皮保藏法，甘油悬 液保藏法，冷冻真空干燥保藏法，液氮超低温保藏法，宿主保藏法