酶工程复习资料 第一章 绪论
一、酶
是具有生物催化功能的生物大分子。按照分子中起催化作用的主要组分的不同，自然界中天然存在的酶可分为蛋白类酶（P 酶）和核酸类酶（R 酶）两大类。
二、酶工程
酶的生产、改性与应用的技术过程称为酶工程。
三、核酸类酶的分类
根据酶催化反应的类型，可以将R 酶分为：剪切酶、剪接酶和多功能酶。
四、酶的活力测定
1）酶活力：是指在一定条件下，酶所催化的反应初速度。在外界条件相同的情况下，反应速度越大，意味着酶活力越高。 2）酶活力单位
酶活力的高低是以酶活力的单位数来表示的。 1961年国际生物化学与分子生物学联合会规定：在特定条件下（温度可采用25℃，pH 等条件均采用最适条件），每1分钟催化1μmol 的底物转化为产物的酶量定义为1个酶活力单位（IU ）。
另一个国际常用酶活力单位是卡特（kat ）。即在特定条件下，每秒催化1摩尔底物转化为产物的酶量定义为1卡特。1kat=6×10^7IU 3）酶的转换数与催化周期
酶的转换数（Kcat ）：又称摩尔催化活性，是指每个酶分子每分钟催化底物转化的分子数。即每摩尔酶每分钟催化底物转化为产物的摩尔数，是酶催化效率的一个指标。
转换数的倒数称为酶的催化周期。指酶进行一次催化所需的时间。
五、固定化酶的活力测定
1）与游离酶活力测定的差异
2）酶结合效率与酶活力回收率的测定
①酶结合效率：又称酶的固定化率，是指酶和载体结合的百分率。
②酶活力回收率：是指固定化酶的总活力与用于固定化的总酶活力的百分率。
六、酶的生产
1）酶的生产：是指通过人工操作而获得所需的酶的技术过程。 2）酶的生产方法：提前分离法、生物合成法（最主要生产方法）、化学合成法。
%
100-?=
加入的总酶活力未结合的酶活力
加入的总酶活力酶结合效率%
100?=
用于固定化的总酶活力
固定化酶活力
酶活力回收率
第二章微生物发酵
一、酶的发酵生产
1）酶的发酵生产：经过预先设计，通过人工操作，利用为生物的生命活动获得所需酶的技术过程。
酶的发酵生产是当今大多数酶生产的主要方法。
2）优良的产酶微生物具备的条件（特点）：
①酶的产量高；②产酶稳定性好；
③容易培养和管理；④利用酶的分离纯化；⑤安全可靠、无毒性。
3）分类（根据微生物的培养方式的不同）：
①固体培养发酵
②液体深层发酵——目前酶生产的主要方式
③固定化微生物细胞发酵
④固定化微生物原生质体发酵
二、酶的生物合成
1）定义：指细胞内RNA和蛋白质的合成过程。
2）酶生物合成的调节：
组成型酶：在细胞中的量比较恒定，环境因素对酶的合成速率影响不大。
适应型酶：在细胞中的含量变化很大，其合成速率明显受到环境因素的影响。
转录水平的调节对酶的生物合成是最重要的调节。
三、酶生物合成的模型
①同步合成型（A）：又称生长偶联型,是指酶合成与细胞生长同步进行，当细胞生长进入对数生长期时，酶也大量合成；当细胞进入稳定期时,酶的合成也停止。
②延续合成型(B)：酶的合成伴随着细胞生长而开始，但在细胞生长进入稳定期后,酶的合成仍将延续较长一段时间。
③中期合成型(C)：酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而在细胞生长进入稳定期后,酶的合成也终止。
④滞后合成型(D)：只有当细胞生长进入稳定期后才开始酶的合成并大量积累(图)。
2）总结：①影响酶生物合成模式的因素主要是mRNA 和培养基中存在的阻遏物。
②在酶的工业生产中，为了提高酶产率和缩短发酵周期，最理想的酶合成模式是延续合成型；对于其它类型的酶,要在菌种选育和工艺条件上加以调节； 同步合成型：尽量提高mRNA 的稳定性，如降低发酵温度; 滞后合成型：尽量减少阻遏物；
中期合成型：要从提高mRNA 稳定性和解除阻遏两方面进行。
四、产酶微生物的特点
1）酶的产量高； 2）容易培养和管理； 3）产酶的稳定性好； 4）利于酶的分离纯化； 5）安全可靠，无毒性。
五、溶解氧的调节方法
1）调节通气量； 2）调节氧的分压； 3）调节气液接触时间； 4）调节气液接触面积； 5）改变培养液的性质。
六、提高酶产量的措施
①添加诱导物（酶的作用底物、酶的催化反应产物、作用底物的类似物） ②降低阻遏物浓度 ③添加表面活性剂
④添加产酶促进剂
七、发酵动力学
1）定义：是研究发酵过程中细胞生长速率、产物生成速率、基质消耗速率以及环境因素对这些速率的影响规律的学科。包括：细胞生长动力学、产物生成动力学和基质消耗动力学 2）细胞生长动力学
在连续发酵过程中，细胞生长动力学方程为：
D 为稀释率，即单位时间内流加的培养液与发酵液体积之比，单位为1/h 。
3）D 与μm 的关系：（μ比生长速率）
①μ>D 时，dx/dt > 0，发酵液中细胞浓度不断增加； ②μ=D 时，dx/dt = 0，细胞浓度保持恒定； ③μ ④但当D =μm 时，细胞浓度趋于0，因此，必须控制适当的D 。 ⑤D=0时，为分批发酵 X D DX S K SX dt dX s m )(-=-+=μμ 4）将莫诺德方程改写成倒数形式： （注意虚线） 5）产物生成动力学（产酶动力学） 产酶速率与细胞比生长速率、细胞浓度以及细胞产酶模式有关。 X——细胞生长速率 α——与生长偶联的产酶比系数（IU/g） β——非生长偶联的比产酶速率(IU/g?h) E——发酵液中酶浓度（IU/L）。 判断产酶类型： m m s S K μ μ μ 1 1 + = ()X dt dE R E ? + = =β αμ 八、固定化微生物细胞发酵产酶 1）固定化细胞：又称为固定化活细胞或固定化增殖细胞，指采用各种方法固定在载体上，在一定的空间范围内进行生长、繁殖和新陈代谢的细胞。 2）固定化细胞产酶的特点: （1）提高产酶率 （2）可反复使用或连续使用较长时间 （3）基因工程菌的质粒稳定，不易丢失 （4）发酵稳定性好 （5）缩短发酵周期，提高设备利用率 （6）产品容易分离纯化 （7）适用于胞外酶等胞外产物的生产 3）固定化细胞发酵的工艺条件与前述游离细胞的工艺条件基本相同。需要注意以下几点： ①固定化细胞的预培养 ②溶解氧的供给——关键限制性因素 ③温度的控制：适应范围较宽 ④培养基组分的控制：考虑特殊性因素 第三章动植物细胞培养产酶 一、动物细胞培养 1）方式：悬浮培养、贴壁培养、微载体培养（固定化细胞培养）。 ①悬浮培养——血液、淋巴组织的细胞、肿瘤和杂交瘤细胞 ②贴璧培养——淋巴组织以外的组织、器官中的细胞 2）目的：获得疫苗、激素、多肽药物、单克隆抗体、酶、皮肤等人体组织、器官等功能性蛋白质。 二、植物细胞培养 1）方式：固体培养、液体浅层培养、液体悬浮培养（次级代谢物的生产过程中常用）。 2）目的：用于生产色素、药物、香精、酶等次级代谢物。 三、植物细胞培养的特点：（与直接提取分离相比较而言）： ①提高产率； ②缩短周期； ③易于管理、减轻劳动强度； ④提高产品质量。 四、植物细胞培养的工艺流程： ①外植体的选择与处理； ②植物细胞的获取； ③细胞悬浮培养； ④分离纯化，得到产物。 五、植物细胞培养的培养基与微生物培养基的差别： ①植物细胞生长和代谢需要大量的无机盐； ②植物细胞需要多种维生素和植物生长激素； ③植物细胞的氮源为无机氮源； ④植物细胞一般以蔗糖为碳源，浓度一般为2%—5% 六、动物细胞培养的特点（稍微了解） ①生长缓慢 ②培养中需防止微生物的污染 ③根据细胞的来源选择适当的培养方式 ④培养基成份复杂，成本较高 ⑤原代细胞培养50代后会退化死亡 ⑥动物细胞没有细胞壁，显得十分脆弱，必须小心地控制温度、pH值、渗透压以及溶解氧等外界条件。 七、工艺控制中的几点不同 ①培养基中必须添加氨基酸 ②温度要求严格 一般控制在36.5℃，允许波动为0.25 ℃ ③pH调节的缓冲体系 CO2与NaHCO3系统HEPES系统 ④渗透压的调节 等渗状态 第四章酶的提取与分离纯化 一、酶的提取与分离纯化技术过程 过程：细胞破碎、提取、离心分离、过滤与膜分离、沉淀分离、层析分离、电泳分离、萃取分离、浓缩、干燥、结晶等。 二、细胞破碎方法及其原理 分类原理方法 机械破碎通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。捣碎法 研磨法 匀浆法 物理破碎通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。温度差破碎法压力差破碎法超声波破碎法 化学破碎通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎有机溶剂： 甲苯、丙酮 丁醇、氯仿 表面活性剂： Triton、Tween 酶促破碎通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎自溶法 外加酶制剂法 三、提取 1）酶的提取是指在一定条件下，用适当的溶剂和溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程，也称为酶的抽提。 2）酶的提取方法： 提取方法使用的溶剂或溶液提取对象 盐溶液提取0.02～0.5mol/L的盐溶 液用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶 酸溶液提取PH2～6的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且稳 定性较好的酶 碱溶液提取PH8～12的水溶液用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定 性较好的酶 有机溶剂提取可与水混溶的有机溶剂用于提取那些与脂质结合牢固或含有较 多非极性基团的酶 3）影响提取的主要因素 ①温度：0~10℃ ②pH：4~6 ③提取液体积：提取液总量一般为原料体积的3~5倍，最好分几次提取。 四、沉淀分离 1）沉淀分离：是通过改变某些条件或添加某些物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其他溶质分离的几乎过程。 2）沉淀分离是酶的分离纯化过程中经常采用的方法。 3）沉淀分离方法 沉淀分离方法 分 离 原 理 盐析沉淀法 利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离 等电点沉淀法 利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH 值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离 有机溶剂沉淀法 利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机 溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离 复合沉淀法 在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离 选择性变性沉淀法 选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀，而不影响所需的酶，从而使酶与杂质分离 4）两种盐析方法： ①Ks 分段盐析：在一定的温度和PH 条件下（β为常数），通过改变离子强度使不同的酶或蛋白质分离的方法称为Ks 分段盐析。 ②β分段盐析：而在一定的盐和离子强度的条件下（KsI 为常数） ，通过改变温度和PH ，使不同的酶和蛋白质分离的方法称为β分段盐析。 五、离心分离 1）离心分离：是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小和不同密度的物质分开的技术。是最常用的一种方法。 在离心分离时，要根据预分离物质以及杂质的颗粒大小、密度及特性的不同，选择合适的离心机、离心方法和离心条件。 2）离心条件的确定 离心力与转速的换算： 其中：n 为离心机每分钟转数 （r/min ）； r 为旋转半径（cm ）； Fc 为离心力； Fg 为地心引力; RCF 为相对离心力，即离心力F 的大小相当于地球引力（重力常数g ）的多少倍。 r F F RCF g C ???== -25n 1012.1 六、过滤与膜分离 1）过滤：借助于过滤解质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。包括膜过滤和非膜过滤。 非膜过滤：采用高分子膜以外的物质作为过滤介质（包括粗滤与微滤）。 膜过滤：采用各种高分子膜为过滤介质（包括超滤与渗透）。 2）膜分离技术 ①加压膜分离；②电场膜分离；③扩散膜分离 七、层析分离 1）层析技术，亦称色谱技术，是一种物理的分离方法。它是利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为固定的(称为固定相)，另一个相则流过此固定相(称为流动相)并使各组分以不同速度移动，从而达到分离的目的。 2）层析分离方法 层析方法分离原理 吸附层析利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异 分配层析利用各组分在两相中分配系数的不同 离子交换层析利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同 凝胶层析利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同 亲和层析利用生物分子与配基之间所具有的专而又可逆的亲和力，使分子分离纯化层析聚焦将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析的特性结合在一起，实现组分分离 八、电泳分离 1）电泳（electrophoresis, EP）：指带电粒子在电场中向着与其所带电荷性质相反的电极方向移动的过程。 2）分类：按支持体的不同可分为：纸电泳、薄层电泳、薄膜电泳、凝胶电泳、自由电泳和等电聚焦电泳。 3）颗粒在电场中的移动速度主要决定于其本身所带的净电荷量，同时受颗粒形状和颗粒大小的影响，还受到电场强度、溶液PH、离子强度及支持体的特性等外界条件的影响。（电渗：在电场中，溶液对于固体支持物的相对移动） 颗粒在电场中的移动速度的影响因素：电场强度、溶液PH、溶液的离子强度以及电渗。 九、萃取分离 1）萃取分离：利用溶质在互不相溶的两相之间分配系数的不同而使溶质得到纯化或浓缩的方法。 2）分类按两相的组成不同分为4类：有机溶剂萃取、双水相萃取、超临界萃取、反胶束萃取。 3）双水相萃取：两相分别为互不相溶的两个水相。利用溶质在两个互不相溶的水相中的溶解度不同而达到分离。 双水相体系：两种不同水溶性聚合物浓度达到一定值时，体系会自然地分成互不相容的两相，构成双水相体系。 过程中的关键是：制备好双水相系统（选择好适宜的溶质、配置好溶液的浓度和两种溶液的比例） 十、超临界萃取 1）超临界萃取：又称为超临界流体萃取，是利用欲分离物质与杂质在超临界流体中的溶解度不同而达到分离的一种萃取技术。 2）超临界流体(SCF)是指在临界温度和临界压力以上的流体。高于临界温度和临界压力而接近临界点的状态称为超临界状态。 3）超临界流体的特点： ①物理特性和传质特性通常介于液体和气体之间，适于作为萃取溶剂。 ②具有和液体同样的溶解能力。 ③密度比气体大，与液体较为接近，因此具有很高的萃取速度。 ④随着温度和压力的变化，其对物质的萃取具有选择性，萃取后易分离。 ⑤其黏度低于液体，接近气体，有利于气体扩散。 ⑥不同物质有不同溶解度，易于分离。 十一、反胶束溶液 反胶束溶液是透明的、热力学稳定的系统。反胶束(reversed micelle)是表面活性剂分散于连续有机相中一种自发形成的纳米级的聚集体，所以表面活性剂是反胶束溶液形成的关键。 反胶束萃取是利用反胶束将酶或其他蛋白质从混合液中萃取出来的一种分离纯化技术。 （正）胶束 反胶束 形成 表面活性剂溶于水，使其浓度超过临界胶束浓度。 表面活性剂溶于非极性溶剂，使其浓度超过临界胶束浓度。 构造 表面活性剂极性基团在外，非极性基团在内，形成非极性核心。 表面活性剂非极性基团在外，极性基团在内，形成极性核心，溶于水后，形成水池（ water pool ）。 功能 溶解非极性物质 溶解极性物质 十二、结晶 1）结晶（Crystallization）是指物质以晶体的状态从蒸汽或溶液中析出的过程。结晶既是酶是否纯净的标志（只有同类分子才能形成晶体），也是一种酶和杂蛋白分离的方法。 2）结晶的条件： 酶在结晶前，酶液必须经过纯化达到一定的纯度，通常酶的纯度应在50％以上方能进行结晶。 十三、浓缩与干燥 1）浓缩：从低浓度酶液中除去部分水或其他溶剂而成为高浓度酶液的过程。 2）干燥：是将固体、半固体或浓缩液中的水分或其他溶剂除去一部分，以获得含水分较少的固体物质的过程。 常用干燥方法：真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥、气流干燥、吸附干燥。 第五章酶分子的修饰 一、酶分子修饰 1）定义：通过各种方法使酶分子的结构发生某些变化，从而改变酶的催化特性的技术过程。 2）修饰方法： ⑴酶的表面化学修饰 ①大分子修饰（大分子结合修饰）：是目前应用最广的酶分子修饰方法。 1）修饰剂： 聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐（dextran）、肝素（heparin）、蔗糖聚合物（Ficoll）等。 修饰方法：修饰前活化，然后在一定条件下与酶分子共价结合。 2）应用： 如：PEG－超氧化物歧化酶（SOD） PEG－溶血类蛋白质（链激酶、尿激酶等） PEG－天门冬酰胺酶（ASNase） 消除了抗原性；延长了酶在体内的半衰期 又如：用Dextran修饰-淀粉酶，－淀粉酶，胰蛋白酶、过氧化氢酶，提高了酶的热稳定性。 ②小分子修饰（酶蛋白侧链基团修饰） 1）定义：通过选择性的试剂或亲和标记试剂与酶分子侧链上特定的功能基团发生化学反应。2）侧链基团：组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。主要有：氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪唑基。 3）侧链基团修饰剂：采用的各种小分子化合物。20种不同氨基酸的侧链基团中只有极性氨基酸的侧链易被修饰，它们一般具有亲核性。 ③交联修饰（交联法） 用双功能基团试剂(如戊二醛)，与酶分子内不同肽链部分共价交联，使酶分子空间构象更加稳定。 ④固定化修饰（共价偶联法） 通过酶表面的酸性或碱性残基，将酶共价连接到惰性载体上，由于酶所处的微环境 发生改变，使酶的最适pH、最适温度和稳定性发生改变。 ⑵酶分子内部修饰 ①蛋白主链修饰（肽链有限水解修饰） 在肽链的限定位点进行水解，使酶的空间结构发生某些精细的变化，从而改变酶的催化特性的方法。（名解） ②氨基酸置换修饰 将肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸，引起酶蛋白空间构象的改变，从而改变酶的某些特性和功能的方法。 通过两个途径实现：化学修饰法：由于可用试剂的限制，获得的种类少。 蛋白质工程：利用基因操纵技术。 ③金属离子置换修饰 改变酶分子中所含的金属离子，使酶的特性和功能发生改变的方法。 二、为什么要进行酶分子的修饰？ 1)酶在细胞外稳定性差； 2)酶活性不够高； 3)具有抗原性。 三、酶化学修饰的目的： ①研究酶的结构与功能的关系。（50年代末） ②人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用范围。（70年代末之后） 1）提高酶的生物活性（酶活力）。 2）增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）。 3）消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能力）。 4）产生新的催化能力。 第六章酶、细胞、源生质体的固定化 一、为什么固定化酶？ ①酶的使用中有很多问题： ②酶的催化效率不够高； ③酶的稳定性差； ④酶的一次性使用； ⑤产物的分离纯化较难。 二、几个概念 1）酶的固定化：采用各种方法，将酶固定在水不溶性的载体上，制备成固定化酶的过程。 2）固定化酶(immobilized enzyme)：固定在载体上并在一定空间范围内进行催化反应的酶。 3）固定化细胞通常只能用于胞外酶等胞外产物的生产。 三、酶的固定化方法 吸附法、结合法、交联法、包埋法、热处理法。 四、固定化酶的特性 ①酶的稳定性： 酶的耐热性、对变性剂、抑制剂、蛋白酶的抵抗力增加。 ②酶的最适温度 最适温度与酶稳定性有关。 多数酶固定化后热稳定性上升，最适温度也上升（有例外）。 ③酶的最适pH 带负电荷载体：最适pH 向碱性偏移。 带正电荷载体：最适pH 向酸性偏移。 影响固定化酶最适pH因素有两个：载体的带电性质、酶催化反应的产物性质。 ④底物特异性 催化速度与底物分子质量的大小有关。大分子底物的催化速度降低，小分子底物影响较小或不受影响。 五、固定化酶的应用 ①氨基酰化酶——世界上第一种工业化生产的固定化酶。 ②葡萄糖异构酶——世界上生产规模最大，应用最为成功的一种固定化酶。 ③青霉素酰化酶——医药工业上广泛应用的一种固定化酶。 ④葡萄糖氧化酶——1967年Updike等采用酶的固定化技术，将葡萄糖氧化酶固定在疏水膜上，然后再和氧电极结合，组装成了世界上第一个生物传感器——葡萄糖氧化酶电极。 六、细胞固定化 1）细胞固定化：通过各种方法将细胞与水不溶性的载体结合，制备固定化细胞的过程。2）固定化细胞：固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞。 3）固定化方法：1）吸附法；2）包埋法（与酶固定化方法的不同） 七、固定化动物细胞的特点： ①提高细胞存活率 ②提高产率 ③可以反复使用或连续使用很长时间 ④易于与产物分开，利于产物分离纯化 固定化原生质体的制备只要包括原生质体的制备和原生质体固定化两个阶段。 原生质体固定化一般采用网格包埋法（即凝胶包埋法） 第七章酶非水相催化 一、酶的非水相催化 1）定义：通过改变介质反应，影响酶的表面结构和活性中心，从而改进酶的催化特性。 2）酶非水相催化的主要内容： ①有机介质中的酶催化 ②气相介质中的酶催化 ③超临界流体介质中的酶催化 ④离子液介质中的酶催化 二、水对有机介质中酶催化的影响 1）必需水：维持酶分子完整的空间构象所必需的最低水量称为必需水。 2）最适水含量：在酶催化反应速度达到最大时的水含量称为最适水含量。 3）水活度：是指体系中水的逸度与纯水逸度之比。通常可用体系中水的蒸汽压与相同条件下纯水的蒸汽压之比表示。反应体系的水活度在0.5~0.6之间。 三、有机溶剂对有机介质中酶催化的影响 1）有机溶剂的选择：有机溶剂极性的强弱用系数lgP表示。P是指溶剂在正辛烷与水两相中的分配系数。通常选用2≤lgP≤5的溶剂作为催化反应介质。 四、对映体选择 酶的对映体选择性又称为立体选择性或立体异构专一性，是酶在对称的外消旋化合物中识别一种异构体的能力大小的指标。 立体选择系数（K LD），立体选择系数越大，表明酶的对映体选择性越强。 五、pH特性 1）pH印记或pH记忆：在有机介质反应中，酶所处的pH环境与酶在冻干或吸附到载体上之前所使用的缓冲液pH相同。 六、有机介质中酶催化反应的类型： 非水相催化反应的类型 合成反应 转移反应 醇解反应 氨解反应 异构反应 氧化还原反应 裂合反应水相催化反应的类型氧化还原反应 转移反应 裂合反应 异构反应 连接或合成反应 水解反应 第八章酶的定向进化 一、几个概念 1）定向进化：是指模拟自然进化过程，进行人工随机突变，并在特定的环境条件下进行选择，使进化朝着人们所需方向发展的技术过程。 2）酶分子定向进化：简称酶定向进化，是模拟自然进化过程（随机突变和自然选择），在体外进行酶基因的人工随机突变，建议突变基因文库，在人工控制条件下，定向选择得到具有优良催化特性的酶的突变体的技术过程。 3）酶定向进化的第一步是在体外人为地进行基因的随机突变，以获得丰富多样的突变基因。体外随机突变的技术有：易错PCR技术、DNA重排技术、基因家族重排技术等。 二、酶定向进化的特点： ①适应面广；②目的性强；③效果显著 三、酶定向进化的应用 ①提高酶的催化效率；②增加酶的稳定性；③改变酶的底物特异性 第九章酶反应器 一、酶反应器 1）酶反应器(Enzyme reactor)以游离酶或固定化酶、固定化细胞作为生物催化剂，进行催化反应的容器及其附属设备。 2）酶反应器类型（了解最大的特点及适用的酶） 反应器类型适用的操作方式适用的酶特点 搅拌罐式反应器分批：BSTR 连续：CSTR 分批式, 流加分批式 连续式 游离酶、 固定化酶 反应比较完全，反应条件容易调节控制。 填充床式反应器（PBR）连续式固定化酶密度大，可以提高酶催化反应的速度。在工 业生产中普遍使用。 流化床反应器（FBR）分批式 流加分批式 连续式 固定化酶流化床反应器混合均匀，传质和传热效果好， 温度和pH值的调节控制比较容易，不易堵塞， 对粘度较大反应液也可进行催化反应。 鼓泡式反应器（BCR）分批式 流加分批式 连续式 游离酶 固定化酶 鼓泡式反应器的结构简单，操作容易，剪切 力小，混合效果好，传质、传热效率高,适合 于有气体参与的反应。在鼓泡时所耗压降较 大。 膜反应器（MR）连续式游离酶 固定化酶 利于连续化生产，但清洗比较困难 喷射式反应器连续式游离酶通入高压喷射蒸汽，实现酶与底物的混合， 进行高温短时催化反应，适用于某些耐高温 酶的反应 3）酶反应器的选择 （一）根据酶的应用形式选择反应器 （二）根据酶反应动力学选择反应器 （三）根据底物或产物的理化性质选择反应器 分子量；溶解度；气体、固体、液体存在形式；尽可能的简单成本低 （四）应用的可塑性及成本 CSTR 类型的反应器应用的可塑性较大，结构简单，成本也较低 （五）酶的稳定性 固定化酶在反应器中催化活性的损失可能有如下三种原因： ①酶本身失效；②酶从载体上脱落；③载体肢解。 在各种类型的反应器中，CSTR 最易引起这类损失。 综上所述，酶反应器的选择没有一个简单的法则或标准可以遵循， 必须根据具体情况进 酶与底物的 混合程度 底物浓度对酶 反应速度的影响 酶催化作用的 温度条件 反应产物对酶的 反馈抑制作用 改进搅拌方式， 提高混合效果 选用流动或分批 加入产物的反应器，控制底物浓度在一定的范围 尽量将产物与酶分离， 或降低产物浓度。 耐受高温的酶 可选用喷射式反应器 主 要 因 素 酶反应器 可用于游离酶的反应器 可用于固化酶的反应器 搅拌式反应器 搅拌式反应器 填充床式反应器 流化床式反应器 鼓泡式反应器 鼓泡式反应器 膜反应器 膜反应器 喷射式反应器 最常用 有气体参加 能耐受较高剪切力 耐高温酶 高成本的酶 机械强度较高 酶颗粒不能太大，有强度 小分子产物抑制作用抑制 有气体参加 行全面的分析和衡量。 二、酶反应器设计 1）进行酶反应器的设计的目的是希望能够设计出生产成本低、产品的质量和产量达到要求的高效低耗的酶反应器。 2）步骤： ①确定反应器的类型 ②确定酶反应器的制造材料 ③进行热量衡算 ④进行物料衡算 三、酶反应器操作条件的确定及其调控 ①反应温度的确定与调控:循环水流控制温度在一定范围内 ②pH值的确定与调控:加入稀酸或稀碱控制pH在一定范围内 ③底物浓度的确定与调控:反应过程中，添加一定的底物，保持一定浓度的底物 ④酶浓度的确定与调控:从成本和失活的半衰期考虑酶浓度 ⑤搅拌速度的确定与调控:适当的搅拌速度既不会破坏酶的结构也不影响混合程度 ⑥流动速度的确定与调控:适宜的流动速度和流动状态，使反映液混合均匀 四、酶反应器操作的注意事项 ①保持酶反应器的操作稳定性 ②防止酶的变性失活 ③防止微生物的污染——主要措施： 1)保证生产环境的清洁、卫生，要求符合必要的卫生条件； 2)反应器在使用前后，都要进行清洗和适当的消毒处理； 3)在反应器的操作过程中，要严格管理、经常检测、避免污染； 4)可以加入适当的抗生素等物质，抑制微生物生长，但对酶反应没有影响。 第一章 1.酶工程：是生物工程的重要组成部分，是随着酶学研究迅速发展，特别是酶的推广应用，使酶学和工程学相互渗透、结合、发展而成的一门新的技术科学，是酶学、微生物学的基本原理与化学工程有机结合而产生的边缘科学技术。 2.化学酶工程：指自然酶、化学修饰酶、固定化酶及化学人工酶的研究和应用 3.生物酶工程：是酶学和以基因重组技术为主的现代分子生物学技术结合的产物，亦称高级酶工程。 4.酶工程的组成部分？ 答：酶工程主要指自然酶和工程酶（经化学修饰、基因工程、蛋白质工程改造的酶）在国民经济各个领域中的应用。内容包括：酶的产生；酶的分离纯化；酶的改造；生物反应器。5.酶的结构特点？ 答：虽然少数有催化活性的RNA分子已经鉴定，但几乎所有的酶都是蛋白质，因而酶必然具有蛋白质四级结构形式。其中一级结构是指具有一定氨基酸顺序的多肽链的共价骨架；二级结构为在一级结构中相近的氨基酸残基间由氢键的相互作用而形成的带有螺旋、折叠、转角、卷曲等细微结构；三级结构系在二级结构基础上进一步进行分子盘区以形成包括主侧链的专一性三维排列；四级结构是指低聚蛋白中各折叠多肽链在空间的专一性三维排列。具有低聚蛋白结构的酶（寡聚酶）必须具有正确的四级结构才有活性。具有活性的酶都是球蛋白，即被广泛折叠、结构紧密的多肽链，其氨基酸亲水基团在外表，而疏水基团向内。 6.酶活性中心：是酶结合底物和将底物转化为产物的区域，通常是整个酶分子中相当小的一部分，它是由在线性多肽链中可能相隔很远的氨基酸残基形成的三维实体。 7.酶作用机制有哪几种学说？ 答：锁和钥匙模型、诱导契合模型 8.酶催化活力的影响因素？ 答：底物浓度、酶浓度、温度、pH等。 9.酶的分离纯化的初步分离纯化的步骤？ 答：（一）材料的选择和细胞抽提液的制备 1.材料的选择：目的蛋白含量要高，而且容易获得 2.细胞破碎方法及细胞抽提液的制备。为了确保可溶性细胞成分全部抽提出来，应当使用类似于生理条件下的缓冲液。动物组织和器官要尽可能除去结缔组织和脂肪、切碎后放人捣碎机中。完全破碎酵母和细菌细胞。 3.膜蛋白的释放:膜蛋白存在于细胞膜或有关细胞器的膜上。按其所在位置大体可分为外周 蛋白和固有蛋白两种类型 4.胞外酶的分离:胞外酶是在微生物发酵时分泌到发酵液中的。发酵后可通过离心或过滤将菌体从发酵液中分离弃去，所得发酵清液通常要适当浓缩，然后再作进一步纯化。目前常用的浓缩方法是超滤法。 （二）蛋白质的浓缩和脱盐 浓缩方法主要有：沉淀法、吸附法、干胶吸附法、渗透浓缩法、超滤浓缩法 第一章 习题: 1、根据分子中起催化作用得主要组分得不同,酶可以分为_______与_______两大类别。 2、核酸类酶分子中起催化作用得主要组分就是________,蛋白类酶分子中起催化作用得主要组分就是___________。 3、进行分子内催化得核酸类酶可以分为_______,_______。 4、酶活力就是_____得量度指标;酶得比活力就是__________得量度指标;酶转换数就是________得量度指标。 5、某酶得分类编号就是EC2、2、1、10,其中EC就是指_______。此酶属于_______类型。 6、醇脱氢酶参与得反应表明无氧气参与( ) 7、酶工程就是_____________得技术过程。 8、酶得转换数就是指 A、酶催化底物转化为产物得数量 B、每个酶分子催化底物转化为产物得分子数 C、每个酶分子每分钟催化底物转化为产物得分子数 D、每摩尔酶催化底物转化为产物得分子数 9、酶得改性就是指____________________________、 第二章 1、名词解释 转录、组成型酶、酶得反馈阻遏、分解代谢物阻遏、生长偶联型 2、微生物产酶模式可以分为同步合成型________、中期合成型、________。 3、可以通过添加( )使分解代谢物阻遏作用解除。 A、诱导物 B 激活剂C、cAMP D、ATP 4、在酶发酵过程中添加表面活性剂可以 A、诱导酶得生物合成 B、阻遏酶得生物合成 C、提高酶活力 D、提高细胞通透性 5、为什么滞后合成型得酶要在细胞生长一段时间甚至进入平衡期以后才开始合成？ 6、操纵子就是由_________、_______与启动基因组成得。 7______________与______就是影响酶生物合成模式得主要因素。 8、RNA前体得加工就是指____________ ?6、从如下实验方法与结果分析酶生物合成得调节作用。 实验方法:将大肠杆菌细胞接种于营养肉汤培养基中,于37°C振荡培养,当OD550为0、3时,经培养液分装到4个小三角瓶中,每瓶17ml培养液。于4个三角瓶分别添加 (A)3ml无菌水 (B)1ml乳糖溶液(0、1mol/L)与2ml无菌水 (C)1ml乳糖溶液(0、1mol/L)、1ml葡萄糖溶液(0、1mol/L)与1ml无菌水 (D) 1ml乳糖溶液(0、1mol/L)、1ml葡萄糖溶液(0、1mol/L)与1mlcAMP钠盐溶液 ?然后在相同得条件下于37°C振荡培养2h,分别取样测定β半乳糖苷酶得活力。 ?实验结果(A)与(C)瓶得β半乳糖苷酶得活力为0,(B)瓶与(D)瓶β半乳糖苷 第二章基因工程工具酶 第—节限制性核酸内切酶 第二节DNA连接酶 第三节DNA聚合酶 第四节末端脱氧核苷酸转移酶 第五节核酸酶 第六节核酸外切酶 第七节碱性磷酸酶 第八节T4噬菌体多核苷酸激酶 第—节限制性核酸内切酶 1、宿主的限制和修饰现象 2、限制性核酸内切酶的类型 3、限制性核酸内切酶的命名 4、Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特性 4.1识别位点的长度识别靶序列长度4、5、6 bp居多，也有识别7、 8bp的 4.2 识别序列结构：回文对称 4.3 切割位置：（1）内部（大多数）；（2）两端（3）同裂酶与同尾酶 4.4 Ⅱ型限制性核酸内切酶不具有甲基化功能 4.5 Ⅱ型内切酶可以对单链DNA的切割 4.6 星号活性(star activity) （1）星活性产生的原因 （2）抑制星星活性的条件(措施) 5、Ⅱ型限制性核酸内切酶的酶切反应 5.1 标准酶解体系的建立 5.2 酶切反应的基本步骤 5.3 终止反应常用方法： （1）加EDTA：（2）加SDS（3）加热：（4）其它 5.4 多酶联合酶解策略： （1）对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切 （2）对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法 5.5 DNA分子酶切常用缓冲液 5.6 内切酶对DNA分子的不完全酶解 5.7 内切酶酶解反应中的注意事项 6、影响限制性核酸内切酶活性的因素 6.1. DNA的纯度 6.2 DNA的甲基化程度 6.3 酶切消化反应温度 6.4 缓冲液(Buffer) 6.5 DNA分子的构型 6.6 反应时间 6.7 酶量使用 第二节DNA连接酶 1、DNA连接酶的发现 2、概念及其特点 3、DNA连接酶的种类 ?大肠杆菌连接酶：只能连接粘性末端。 ?T4噬菌体的连接酶：不但能连接粘性末端，还能连接平末端。 ?T4噬菌体RNA连接酶：催化单链DNA或RNA的5’磷酸与相邻的3’羟基共价连接。 4、DNA连接酶的反应体系 共三套 《酶工程》试题一： 一、是非题（每题1分，共10分） 1、酶是具有生物催化特性的特殊蛋白质。（） 2、酶的分类与命名的基础是酶的专一性。（） 3、酶活力是指在一定条件下酶所催化的反应速度，反应速度越大，意味着酶活力越高。（） 4、液体深层发酵是目前酶发酵生产的主要方式。（） 5、培养基中的碳源，其唯一作用是能够向细胞提供碳素化合物的营养物质。（） 6、膜分离过程中，膜的作用是选择性地让小于其孔径的物质颗粒成分或分子通过，而把大于其孔径的颗粒截留。（） 7、在酶与底物、酶与竞争性抑制剂、酶与辅酶之间都是互配的分子对，在酶的亲和层析分离中，可把分子对中的任何一方作为固定相。（） 8、角叉菜胶也是一种凝胶，在酶工程中常用于凝胶层析分离纯化酶。（） 9、α－淀粉酶在一定条件下可使淀粉液化，但不称为糊精化酶。（） 10、酶法产生饴糖使用α－淀粉酶和葡萄糖异构酶协同作用。（） 二、填空题（每空1分，共28分） 1、日本称为“酵素”的东西，中文称为__________,英文则为__________,是库尼（Kuhne）于1878年首先使用的。其实它存在于生物体的__________与__________。 2、1926年，萨姆纳（Sumner）首先制得__________酶结晶，并指出__________是蛋白质。他因这一杰出贡献，获1947年度诺贝尔化学奖。 3、目前我国广泛使用的高产糖比酶优良菌株菌号为__________,高产液化酶优良菌株菌号为___________。在微生物分类上，前者属于__________菌，后者属于__________菌。 4、1960年，查柯柏（Jacob）和莫洛德（Monod）提出了操纵子学说，认为DNA分子中，与酶生物合成有关的基因有四种，即操纵基因、调节基因、__________基因和__________基因。 5、1961年，国际酶委会规定的酶活力单位为：在特定的条件下（25oC，PH及底物浓度为最适宜）__________,催化__________的底物转化为产物的__________为一个国际单位，即1IU。 6、酶分子修饰的主要目的是改进酶的性能，即提高酶的__________、减少__________，增加__________。 7、酶的生产方法有___________，___________和____________。 8、借助__________使__________发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。 9、酶的分离纯化方法中，根据目的酶与杂质分子大小差别有__________法，__________法和__________法三种。 10、由于各种分子形成结晶条件的不同，也由于变性的蛋白质和酶不能形成结晶，因此酶结晶既是__________，也是__________。 三、名词术语的解释与区别（每组6分，共30分） 1、酶生物合成中的转录与翻译 2、诱导与阻遏 3、酶回收率与酶纯化比（纯度提高比） 4、酶的变性与酶的失活 湖北大学 酶工程实验 （0818800193）实验教学大纲 （第2版） 生命科学学院 生化教研室 2014年7月 前言 课程名称：酶工程实验实验学时：16学时 适用专业：生物工程课程性质：必修 一、实验课程简介 酶工程是生物工程的主要内容之一，是现代酶学和生物工程学相互结合而发展起来的一门新的技术学科。它将酶学、微生物学的基本原理与化工、发酵等工程技术有机结合起来，并随着酶学研究的迅速发展，特别是酶的广泛应用而在国民生产生活中日益发挥着越来越重要的作用。酶工程实验课是生物工程等本科实验教学的一个重要组成部分，通过实验教学可以加强学生对酶工程基本知识和基本理论的理解，掌握现代酶学与相关技术的有关的基本的实验原理与技能。在实验过程中要求学生自己动手，分析思考并完成实验报告。酶工程实验性质有基础性、综合性、设计（创新）性三层次。 二、课程目的 本实验课程主要根据酶工程的三大块内容即酶的生产、酶的改性与酶的应用来设计安排实验，通过这些实验内容，使学生深入理解酶工程课程的基本知识；巩固和加深所学的基本理论；掌握酶工程中基本的操作技能。同时，通过实验培养学生独立观察、思考和分析问题、解决问题和提出问题的能力，养成实事求是、严肃认真的科学态度，以及敢于创新的开拓精神；并在实验中进一步提高学生的科学素养。 三、考核方式及成绩评定标准 考核内容包括实验过程中的操作情况，实验记录及结果的准确性，实验报告的书写及结果分析，思考题的回答情况，仪器设备的使用情况及遵守实验室规章制度的情况等，根据这些方面进行成绩评判和记录，综合给出实验总成绩。 四、实验指导书及主要参考书 1．魏群：生物工程技术实验指导，高等教育出版社，2002年8月。 2．禹邦超：酶工程（附实验），华中师范大学出版社，2007年8月 五、实验项目 蛋白质酶工程，课堂提问整理 第一章 1、酶：酶是生物体内进行新陈代谢不可缺少的受多种因素调节控制的具有催化能力的生物催化剂。 2、酶工程的研究主要分为三个部分：酶的生产，酶的改性，酶的应用 3、蛋白类酶可以分为六大类，分别是（如图） 4、酶的命名有两种方法：系统名（包括所有底物的名称和反应类型）、 惯用名（只取一个较重要的底物名称和反应类型） 判断： （1）寡聚酶：由几个或多个亚基组成，亚基牢固地联在一起，单个 亚基没有催化活性。亚基之间以非共价键结合。（√） （2）酶活力指在一定条件下酶所催化的反应速度，反应速度越大， 意味着酶活力越高。（×） （3）青霉素酰化酶不但能催化青霉素侧链的水解作用，而且也能催化逆反应。（√） （4）不同细胞最适PH不同，细胞产酶的最适PH与生长最适PH往往有所不同，同一种细胞，生产不同酶的最适PH不同。（√） 5、酶的必需基团包括：（如图） 6、酶的专一性：指酶对底物及其催化反应的严格选择性。（可分为结 构专一性和立体异构专一性） 7、温度对酶的双重影响：温度升高，酶促反应速度升高；由于酶的本质是蛋白质，温度升高，可引起酶的变性，从而反应速度降低。 8、最适温度：酶促反应速度最快时的环境温度。 9、最适PH:酶催化活性最大时的环境pH。 10、酶促反应速度：在适宜的反应条件下，用单位时间内底物的消耗或产物的生成量来表示。 11、酶活力测定的一般步骤：(P8 )1. 根据酶催化的专一性，选择适宜的底物，并配制成一定浓度的底物溶液。 2. 根据酶的动力学性质，确定酶催化反应的温度、pH、底物浓度、激活剂浓度等反应条件。 3. 在一定的条件下，将一定量的酶液和底物溶液混合均匀，适时记下反应开始的时间。 4. 反应到一定的时间，取出适量的反应液，运用各种生化检测技术，测定产物的生成量或底物的减少量。 PS:酶的活力的国际单位是IU 12、酶工程：是酶的生产与应用的技术过程，主要任务是通过预先设计，经过人工操作，获得所需的酶，并通过各种方法使酶充分发挥其催化功能。 第二章 1．酶的生产方法：提取分离法，生物合成法，化学合成法 2．遗传密码子的特点：连续性，简并性，普遍性与特殊性 3．酶的生物合成法根据使用的细胞不同分类：微生物发酵产酶，植物细胞培养产酶，动物细胞培养产酶 4．葡萄糖效应的概念：细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优先利用葡萄糖。待葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，产生了两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的“二次生长现象”，这一现象称葡萄糖效应。 产生的原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系的合成。 第一章绪论 问题：试述木瓜蛋白酶的生产方法？ 答：木瓜蛋白酶可以采用提取分离法、基因工程菌发酵法、植物细胞培养法等多种方法进行生产。 (1)提取分离法：从木瓜的果皮中获得木瓜乳汁，通过各种分离纯化技术获得木瓜蛋白酶。 (2)发酵法：通过DNA重组技术将木瓜蛋白酶的基因克隆到大肠杆菌等微生物中，获得基因工程菌，在通过基因工程菌发酵获得木瓜蛋白酶。 (3)植物细胞培养法：通过愈伤组织诱导获得木瓜细胞，在通过植物细胞培养获得木瓜蛋白酶。 第二章微生物发酵产酶 1、解释酶的发酵生产、酶的诱导、酶的反馈阻遏(产物阻遏)、分解代谢物阻遏。诱导物的种类？ 答：酶的发酵生产：利用微生物的生命活动获得所需的酶的技术过程； 酶的诱导：加进某些物质，使酶的生物合成开始或加速的现象，称为诱导作用； 产物阻遏（反馈阻遏）：指酶催化反应的产物或代谢途径的末端产物使该酶的生物合成受到阻遏的现象。 分解代谢物阻遏（营养源阻遏）：是指某些物质经过分解代谢产生的物质阻遏其他酶合成的现象。 诱导物的种类：诱导物一般是酶催化作用的底物或其底物类似物，有的也是反应产物。2、微生物产酶模式几种？特点？最理想的合成模式是什么？ 答：（1）同步合成型特点： a.发酵开始，细胞生长，酶也开始合成，说明不受分解代谢物和终产物阻遏。 b.生长至平衡期后，酶浓度不再增长，说明mRNA很不稳定。 （2）延续合成型特点： a.该类酶一般不受分解代谢产物阻遏和终产物阻遏。 b.该酶对应的mRNA是相当稳定的。 （3）中期合成型特点： a.该类酶的合成受分解代谢物阻遏和终产物阻遏。 b.该酶对应的mRNA不稳定。 （4）滞后合成型特点： a.该类酶受分解代谢物阻遏和终产物阻遏作用的影响，阻遏解除后，酶才大量合成。 b.该酶对应的mRNA稳定性高。 选择：在酶的工业生产中，为了提高酶产率和缩短发酵周期，最理想的合成模式是延续合成型。 3、可以添加什么解除分解代谢物阻遏？表面活性剂的作用？ 答：（1）一些酶的发酵生产时要控制容易降解物质的量或添加一定量的cAMP，均可减少或解除分解代谢物阻遏作用。 （2）表面活性剂的作用：增溶、乳化作用、润湿作用、助悬作用、起泡和消泡作用、消毒和杀菌剂。 4、根据微生物培养方式不同，酶的发酵生产有几种类型？哪种是目前酶发酵生产的主要方式？按酶生物合成的速度把细胞中的酶分几类？酶的生物合成在转录水平的调节主要有哪三种模式？微生物细胞生长过程一般分为几个阶段？ 酶工程考试复习题及答案精编W O R D版 IBM system office room 【A0816H-A0912AAAHH-GX8Q8-GNTHHJ8】 酶工程考试复习题及答案 一、名词解释题 1.酶活力: 是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化 某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。2.酶的专一性:是指一种酶只能对一种底物或一类底物起催化作用，对其他底物无催化 作用的性质，一般又可分为绝对专一性和相对专一性。 3.酶的转换数:是指每个酶分子每分钟催化底物转化的分子数，即是每摩尔酶每分钟催化 底物转变为产物的摩尔数，是酶的一个指标。 4.酶的发酵生产:是指通过对某些特定微生物进行发酵培养后，利用微生物生长发酵过程 中特定的代谢反应生成生产所需要的酶，最后通过提取纯化过程得到酶制剂的过程称为酶的发酵生产。 5.酶的反馈阻遏: 6.细胞破碎:是指利用机械、物理、化学、酶解等方法，使目标细胞的细胞膜或细胞壁得 以破坏，细胞中的目标产物得以选择性或全部释放便于后续收集和分离的过程称为细胞破碎。 7.酶的提取: 是指在一定的条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂 中的过程，也称作酶的抽提，是酶分离纯化过程常用的手段之一。 8.沉淀分离:是通过改变某些条件，使溶液中某种溶质的溶解度降低，从溶液中沉淀析 出，而与其他溶质分离的方法，常用语酶的初步提取与分离。 9.层析分离: 亦称色谱分离，是一种利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各 组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为固定的(称为固定相)，另一个相则流过此固定相(称为流动相)并使各组分由于与固定相和流动相作用力的不同以不同速度移动，从而达到分离的物理分离方法。 10.凝胶层析: 又称为凝胶过滤，分子排阻层析，分子筛层析等。是指以各种多孔凝胶为 固定相，在流动相冲洗过程中混合物中所含各种组分的相对分子质量和分子大小不同，在固定相凝胶微孔中移动的距离不同，从而依次从层析柱中分离出来，达到物质分离的一种层析技术。 11.亲和层析: 是利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，将混合物装 入层析柱中利用流动相的冲洗作用和目标分子与固定相配基亲和作用力不同而使生物分子分离纯化的技术。 12.离心分离: 借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的 技术过程。 13.电泳:带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。利 用不同的物质其带电性质及其颗粒大小和形状不同，在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，故此可使它们分离，电泳技术是常用的分离技术之一。 14.萃取:是利用物质在两相中的溶解度不同而使其分离的技术。 15.双水相萃取:双水相是指某些高聚物之间或者高聚物与无机盐之间在水中以一定的浓度 混合而形各种不相溶的两水溶液相。由于溶质在这两相的分配系数的差异进行萃取的方法称为双水相萃取。 实验目的：①、了解掌握双酶法制备淀粉糖。 ②、掌握用3,5-二硝基水杨酸法测定葡萄糖含量的方法。 目前国内外淀粉糖的生产大都采用双酶法。双酶法生产淀粉糖是以淀粉为原料，先经α-淀粉酶液化成糊精，再用糖化酶催化生成淀粉糖浆。α-淀粉酶又称为液化型淀粉酶，它作用于淀粉时，随机地从淀粉分子内部切开α-1，4葡萄糖苷键，使淀粉水解成糊精和一些还原糖。糖化酶又称为葡萄糖淀粉酶，它作用于淀粉时，从淀粉分子的非还原端开始逐个地水解α-1，4葡萄糖苷键，生成葡萄糖和一些低聚糖。且糖化酶还有一定的水解α-1，6葡萄糖苷键和α-1，3葡萄糖苷键的能力。 1．仪器：恒温水浴器、烧杯、玻璃棒、天平、量筒及其他常规仪器用具。 2．试剂：生粉、α-淀粉酶、糖化酶、0。1mol/L HCI、无水CaCl2、。碘液、活性炭。1．液化： 取12g生粉，加150mL水配制成淀粉浆，加入0.1gCaCl2，2gα-淀粉酶，在75℃温度下保温45min，使淀粉液化成糊精。液化中可每隔3分钟搅拌一下, 每隔15分钟用碘反应检测，观察颜色变为褐色或棕色的情况，记录观察结果。45min后升温至100℃并保温10min。 2．糖化： 将液化淀粉液冷却至55℃～60℃，用0.1m1/LHCl调pH至4.5～5.0，加入0.5g糖化酶，将水浴槽温度升至60℃，保温糖化过夜，使糊精转变为葡萄糖和低聚糖(淀粉糖浆)。 3．脱色： 淀粉糖浆中加入1g活性炭，在80℃下搅拌15min后，抽滤，得浅黄色透明糖液。 4. 所得糖液中葡萄糖含量的测定。取1 m1滤液，加水稀释到10ml，用3,5-二硝基水杨酸法测定葡萄糖含量。 a=(0.406-0.0648)/0.5341=0.64 b=(0.395-0.0648)/0.5341=0.62 实验现象观察 1 6 7 思考题： 1液化时加入0.1gCaCl2的目的是什么？ 答：钙离子有提高热稳定性的作用。 2液化后冷却和调pH的目的是什么? 答：盐酸容易挥发，所以要冷却。 调ph是为了提供酶催化的环境。 酶工程期末复习 一、名词解释 1、酶工程：是酶的生产、改性与应用的技术过程。由酶学与化学工程技术、基因工程技术、微生物学技术相结合而产生的一门新的技术学科。 2、酶的化学修饰：通过化学基团的引入或除去，使蛋白质共价结构发生改变。 3、必需水：一般将维持酶分子完整空间构象所必需的最低水含量称为必需水。 4、抗体酶：具有催化活性的抗体，即抗体酶。 5、别构效应：调节物与酶分子的调节中心结合之后，引起酶分子构象发生变化，从而改变催化中心对底物的亲和力。这种影响被称为别构效应或变构效应。 6、别构酶：能发生别构效应的酶称为别构酶。 7、酶活力：又称酶活性，是指酶催化某一化学反应的能力。 8、比活力：也称为比活性，是指每毫克酶蛋白所具有的酶活力单位数，一般用IU/mg 蛋白质表示。 9、生物传感器：由生物识别单元和物理转换器相结合所构成的分析仪器。 10、蛋白质工程：是以创造性能更适用的蛋白质分子为目的，以结构生物学与生物信息学为基础，以基因重组技术为主要手段，对天然蛋白质分子的设计和改造。 11、酶反应器 12、固定化酶：固定在载体上并在一定空间范围内进行催化反应，可以反复、连续使用的酶。 13、水活度：是指在一定温度和压力下，反应体系中水的摩尔系数w χ与水活度系数w γ的乘积：w w w γχα=。 14、生物反应器：指有效利用生物反应机能的系统（场所）。 15、酶反应器：以酶或固定化酶作为催化剂进行酶促反应的装置称为酶反应器。 16、活化能：从初始反应物（初态）转化成活化状态（过渡态）所需的能量，称为活化能。 二、填空题 1、酶活力测定的方法有终止法和连续反应法。常用的方法有比色法、分光光度法、滴定法、量气法、同位素测定法、酶偶联分析。 2、酶固定化的方法有吸附法（物理吸附法、离子交换吸附法）、包埋法（网格包埋法、微囊型包埋法、脂质体包埋法）、共价结合（偶联）法、交联法。 3、酶活力是酶催化反应速率的指标，酶的比活力是酶制剂纯度的指标，酶的转换数是酶催化效率的指标。 4、细胞破碎的主要方法有机械法（珠磨法、高压匀浆法、超声波破碎法）、非机械法（物理法、化学法、酶法）。 5、有机溶剂的极性系数lgP 越小，表明其极性越强，对酶活性的影响越大。 6、lgP 越大，溶剂的疏水性越强；lgP 越小，溶剂的亲水性越强。 7、酶反应器的类型根据所使用的酶，分为溶液酶反应器、固定化酶反应器。 酶工程的知识点总结 课题3 探讨加酶洗衣粉的洗剂效果 一、实验原理 1．加酶洗衣粉是指含有酶制剂的洗衣粉，目前常用的酶制剂有四类：蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶，其中，应用最广泛、效果最明显的是碱性蛋白酶和碱性脂肪酶。b5E2RGbCAP 2．碱性蛋白酶能将血渍、奶渍等含有的大分子蛋白质水解成可溶性的氨基酸或小分子的肽， 使污迹从衣物上脱落。脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶也能分别将大分子的脂肪、淀粉和纤维素水解为小分子物质，使洗衣粉具有更好的去污能力。p1EanqFDPw 3．在本课题中，我们主要探究有关加酶洗衣粉的三个问题：一是普通洗衣粉和加酶洗衣粉 对衣物污渍的洗涤效果有什么不同；二是在什么温度下使用加酶洗衣粉效果最好，三是添加不同种类的酶的的洗衣粉，其洗剂效果有哪些区别。DXDiTa9E3d 二、实验步骤 1探究用加酶洗衣粉与普通洗衣粉洗涤的效果的不同 ①在2个编号的烧杯里，分别注入500mL清水。②取2块大小相等的白棉布，用滴管在每 块白布上分别滴上等量的墨水，分别放入烧杯里，用玻璃棒搅拌。③将2个烧杯分别放入同等温度的温水中，保温5分钟。④称取5克加酶洗衣粉和5克普通洗衣粉2份，分别放入2个烧杯中，用玻璃棒均匀搅拌。保温10分钟。⑤观察并记录2个烧杯中的洗涤效果RTCrpUDGiT 2探究用加酶洗衣粉洗涤的最佳温度条件 ①在3个编号的烧杯里，分别注入500mL清水。②取3块大小相等的白棉布，用滴管在每 块白布上分别滴上一滴食用油、鸡血、牛奶，分别放入烧杯里，用玻璃棒搅拌。③将3个烧杯分别放入50摄氏度的热水、沸水和冰块中，保温5分钟。④称取5克加酶洗衣粉3份，分别放入3个烧杯中，用玻璃棒均匀搅拌。保温10分钟。⑤观察并记录3个烧杯中的洗涤效果。3探究不同种类的加酶洗衣粉洗涤的效果5PCzVD7HxA 污染物蛋白酶洗衣粉脂肪酶洗衣粉复合酶洗衣粉普通洗衣粉 油渍 汗渍 血渍 观察并记录四种洗衣粉分别洗涤三种污染的洗涤效果。三、注意事项 1．变量的分析和控制 影响加酶洗衣粉洗涤效果的因素有水温、水量、水质、洗衣粉的用量，衣物的质料、大 小及浸泡时间和洗涤的时间等。在这些因素中，水温是我们要研究的对象，而其他因素应在实验中保持不变。选择什么样的水温进行实验需要实验者根据当地一年中的实际气温变化来 确定水温，通常情况下，冬季、春季、秋季和夏季可分别选取 5 ℃、15 ℃、25 ℃和35 ℃的水温，因为这4个水温是比较符合实际情况的，对现实也有指导意义。jLBHrnAILg 2．洗涤方式和材料的选择。 在洗涤方式中有机洗和手洗两种方式，应考虑其中哪一种比较科学？哪一种更有利于控 制变量？再有，洗衣机又可以分为半自动和全自动两种，相比之下，采用全自动洗衣机比较好，并且应该尽量使用同一型号小容量的洗衣机，其机械搅拌作用相同。关于洗涤材料的选择也有一些讲究。用衣物作实验材料并不理想，这是因为作为实验材料的衣物，其大小、颜 色、洁净程度等应该完全一致，而这并不容易做到；此外，人为地在衣物上增加污物，如血 渍、油渍等，也令人难以接受。因此，选用布料作为实验材料比较可行。在作对照实验时， 酶:是由活细胞产生的，在细胞内、外一定条件下都能起催化作用的具有高效率和高度专一性的一类特殊蛋白质或核酸，酶能在机体内十分温和的条件下高效率地起催化作用，使得生物体内的各种物质处于不断的新陈代谢中。 酶工程:酶的生产与应用的技术过程,是酶学基本原理与化学工程相结合而形成的一门新兴的技术科学.研究酶制剂大规模生产及应用所涉及的理论与技术方法. 酶的应用:通过酶的催化作用获得人们所需的物质或除去不良物质,或许所需信息的技术过程. 酶的提取:又称酶的抽提,指在一定的条件下用适当的溶剂或溶液处理含酶物料,使酶充分溶解到溶剂或溶液中的技术过程. 膜分离:又称膜过滤.采用各种高分子膜为过滤介质,将不同大小,不同形状的物质分离的技术过程. 凝胶层析:又称凝胶过滤,分子筛层析等.指以各种多孔凝胶为固定相,利用流动相中所含各种组分的相对分子质量的不同而达到物质分离的一种层析技术. 超临界萃取:又称超临界流体萃取,是利用预分离物质与杂志在超临界流体中的溶解度不同而达到的分离的一种萃取技术. 酶固定化:采用各种方法,将酶与水不溶性的载体结合,制备固定化酶的过程. 固定化酶:用物理,化学等方法将水溶性的酶固定到特定的载体上使之成为水不溶性的酶. 非水相催化:酶在非水介质中的催化作用称为酶的非水相催化. 水活度:用体系中水的蒸汽压和相同条件下纯水的蒸汽压之比表示.水活度与溶剂的极性大小关系不大，所以采用水活度作为参数来研究有机介质中水对酶催化作用的影响更为准确. 必需水:紧紧吸附在酶分子表面维持酶活化性所必需的最少水量. 反胶束体系:反胶束是在大量水不相混溶的有机溶剂中,含有少量的水溶液,加入表面活性剂后形成油包水的微小液滴. 胶束体系:胶束是在大量水溶液中含有少量与水相不相混溶的有机溶剂,加入便面活性剂后形成水包油的微小液滴. 酶分子修饰:通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变,从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰. 酶反应器:酶作为催化剂进行反应所需的装置称为酶反应器. 喷射式反应器：利用高压蒸汽的喷射作用实现酶与底物的混合是进行高温短时催化反应的一种反应器. 酶活力单位:是表示酶活力大小的尺度;1个酶活力单位是指在特定条件(25℃,其它为最适条件)下,在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量. 《酶工程》复习 一、名词解释…………………………………………… 1 酶工程：又称酶技术，是酶制剂的大规模生产和应用的技术，包括化学酶工程和生物酶工程。 2酶的诱导：由于加进某种物质，使酶的生物合成开始或者加速进行，称为酶的生物合成的诱导作用。 3 微滤：以压力差为推动力，截留水中粒径在0.02~ 10m之间的颗粒物的膜分离技术。 4固定化酶：通过物理的或化学的方法，将酶固定在载体上，能使酶发挥催化作用的酶。 5酶的非水相催化：通过改变反应介质，影响酶的表面结构和活性中心，从而改变酶的催化特性。 6 原生质体：脱去细胞壁的植物、真菌或细菌细胞。 7超滤：超滤是采用中空纤维过滤新技术，配合三级预处理过滤清除自来水中杂质；超滤微孔小于0.01微米，能彻底滤除水中的细菌、铁锈、胶体等有害物质，保留水中原有的微量元素和矿物质。 8 固体发酵：固态发酵是指没有或几乎没有自由水存在下，在有一定湿度的水下溶性固态基质中，用一种或多种微生物的一个生物反应过程。 二、填空题………………………………………………. 1酶的分类（氧化还原酶）、（转移酶）、（水解酶）、（裂合酶）、（异构酶）、（合成酶）。 2酶活力是（酶催化速度）的量度指标，酶的比活力是（酶纯度）的量度指标，酶转换数是（酶催化效率）的量度指标。 3微生物产酶模式可以分为同步合成型，（延续合成型），中期合成型，（滞后合成型）四种。 4动物细胞培养主要用于生产疫苗、激素、单克隆抗体、多肽因子、酶等（功能性蛋白质）。 5细胞破碎的主要方法有机械破碎法、物理破碎法、（化学破碎法）、（酶促破碎法）。 6有机溶剂的极性系数lgP越小，表明其极性（越强），对酶活性的影响（越大）。 7通常酶的固定化方法有：吸附法、包埋法、结合法、交联法、热处理法。 第二章基因工程中常用的工具酶 限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。 §2-1 核酸内切限制酶 定义：核酸内切限制酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。 到目前为止已经从许多种不同的微生物中分离出了2300种以上不同的核酸内切限制酶。核酸内切限制酶的发现及其生物功能（图） 一、限制修饰系统的种类（图） 二、限制性内切酶的定义、命名 1. 定义：广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指II型限制酶。 2. 命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。 例如：Hin dⅢ前三个字母来自于菌种名称H. influenzae，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。 Eco RI—Escherichia coli RI Hin dⅢ—Haemophilus influensae d Ⅲ Sac I (II)—Streptomyces achromagenes I (Ⅱ) 三、Ⅰ型和Ⅲ型核酸内切限制酶的缺点 a.Ⅰ型核酸内切限制酶虽然能够识别DNA分子中的特定序列，但它们的切割作用却是 随机的，在距特异性位点至少1000bp的地方可以随机地切割DNA分子，因此这类酶在基因克隆中显然是没有用处的。——远距离随机切割 b. Ⅲ型核酸内切限制酶大约从距离识别序列25bp处切割DNA分子。——远距离定点 切割 c.Ⅰ型核酸内切限制酶和Ⅲ型核酸内切限制酶，在切割反应过程中，都会沿着DNA分 子移动，因此是一种需要能量的过程。——需要能量的反应 d.Ⅰ型和Ⅲ型核酸内切限制酶，一般都是大型的多亚基的复合物，既具有内切酶活性， 又具有甲基化酶活性。——内切酶活性和甲基化酶活性 四、Ⅱ型核酸内切限制酶的特点 (1)基本特点： ①在双链DNA分子上有一个特殊的靶子序列，即所谓的识别序列，并由此切割DNA 分子形成链的断裂；——识别序列 ②2个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对的；——单链切割 年级2001 专业生物技术 一名词解释（每题3分，共计30分） 1.酶工程 2.自杀性底物 3.别构酶 4.诱导酶 5.Mol催化活性 6.离子交换层析 7.固定化酶 8.修饰酶 9.非水酶学 10.模拟酶 二填空题(每空1分,共计30分) 1.决定酶催化活性的因素有两个方面，一是，二是 。 2.求Km最常用的方法是。 3.多底物酶促反应的动力学机制可分为两大类，一类是，另一类是 。 4.可逆抑制作用可分为，，， 。 5.对生产酶的菌种来说，我们必须要考虑的条件有，一是看它是不是，二是能够利用廉价原料，发酵周期，产酶量，三是菌种不易，四是最好选用能产生酶的菌种，有利于酶的分离纯化，回收率高。 6.酶活力的测定方法可用反应法和反应法。 7.酶制剂有四种类型即酶制剂，酶制剂，酶制剂和 酶制剂。 8.通常酶的固定化方法有法，法，法， 法。 9.酶分子的体外改造包括酶的修饰和修饰。 10.模拟酶的两种类型是酶和酶。 11.抗体酶的制备方法有法和法。 三问答题(每题10分,共计40分) 1.固定化酶和游离酶相比，有何优缺点 2.写出三种分离纯化酶蛋白的方法，并简述其原理。 3.为什么酶制剂的生产主要以微生物为材料 4.下面是某人对酶测定的一些数据，据此求出该酶的最大反应速度和米氏常数。 10-6 10-6 10-5 10-5 10-5 10-4 10-4 10-2 酶工程试题（B） 一名词解释 1.抗体酶 2.酶反应器 3.模拟酶 4.产物抑制 5.稳定pH 6.产酶动力学 7.凝胶过滤 8.固定化酶 9.非水酶学 10.液体发酵法 二填空题(每空1分,共计30分) 值增加，其抑制剂属于抑制剂，Km不变，其抑制剂属于抑制剂，Km 减小，其抑制剂属于抑制剂。 2.菌种培养一般采用的方法有培养法和培养法。 3.菌种的优劣是影响产酶发酵的主要因素，除此之外发酵条件对菌种产酶也有很大的影响，发酵条件一般包括，，，， 和等。 4.打破酶合成调节机制限制的方有，，。 5.酶生物合成的模式分是，，， 。 6.根据酶和蛋白质在稳定性上的差异而建立的纯化方法有法，法和 法 7. 通常酶的固定化方法有法，法，法， 法。 8. 酶分子的体外改造包括酶的修饰和修饰。 9.酶与抗体的重要区别在于酶能够结合并稳定化学反应的，从而降低了底物分子的，而抗体结合的抗原只是一个态分子，所以没有催化能力 三问答题(每题10分,共计40分) 1.在生产实践中，对产酶菌有何要求 2.对酶进行化学修饰时，应考虑哪些因素 3.列出用共价结合法对酶进行固定化时酶蛋白上可和载体结合的功能团 4.某酶的初提取液经过一次纯化后，经测定得到下列数据，试计算比活力，回收率及纯化 倍数。 1、酶的固定化方法：吸附法、包埋法、共价结合法、热处理法 2、提取酶的有机溶剂有：甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、异丙醇、 3、酶生产的主要方式：固体发酵、液体深层通气发酵、固定化细胞或固定化原生质体发酵 4、酶的抽提剂有：稀酸、稀碱、稀盐、稀有机溶剂等 5、测定酶蛋白含量的方法： 凯氏定氮法、双缩尿法、Folin 酚法、紫外法、色素结合法、BCA法、胶体金测定法 6、影响酶活力的主要因素：温度、PH、底物浓度、酶浓度、抑制剂、激活剂 7、包埋固定化酶的凝胶有：聚丙烯酰胺、聚丙烯醇、光敏树脂、琼脂、明胶、海藻酸钙 8、酶的回收率：是指直接测定的固定化酶的活力占固定化之前的活力的百分比。 9、纯化倍数：就是经过纯化后得到的比活力与纯化前比活力之间的比值。 10、盐析的原理：蛋白质溶液在一定浓度范围内，加入无机盐，随着盐浓度增大，蛋白质的溶解度增大，但当盐浓度增到一定限度后，蛋白质将从溶液中析出。 11、在酶的反应过程中如何确保酶的最适反应温度和最适pH值。 保证最适温度的方法：通过发酵罐的热交换设施，控制冷源或热源流量；通过曲室的通风和加热设备控制。保证最适pH的方法：加酸或加碱，加碳源或氮源物质。 12、在发酵产酶过程中的准备工作： 收集筛选菌种，菌种保藏，细胞活化，扩大培养，培养基的配置，对发酵条件的控制。 13、为什么在测酶活实验中要连续不断的测酶活和酶蛋白含量 因为酶的活性会受温度和PH值的影响 14、终止酶反应的方法： 1、迅速升高温度； 2、加入强酸、强碱、尿素、乙醇等变性剂； 3、加入酶抑制剂； 4、调节反应液pH值。 15、固定化的优点： 1、可反复使用，稳定性高； 2、易与底物和产物分开，便于分离纯化； 3、可实现连续生产，提高效率。 16、培养基的成分：碳源、氮源、无机盐、生长因素、水。 17、菌种保藏方法： 1、斜面低温保藏法 2、液体石蜡油保藏法 3、砂土管保藏法 4、真空冷冻干燥法 5、液氮超低温保藏法。 18、发酵产酶的操作过程：配置培养基、分装、灭菌（112℃—115℃，20min）、孢子悬液（将无菌水加入斜面培养基）、接种、培养（32℃，180r/min，培养72h） 19、测定酶活的方法： 1、在一定时间内，让适量的底物与酶在最适合条件下； 2、加入酶抑制剂或升高温度等方法快速终止酶反应； 3、加一定量的显色剂与底物反应，测定液体的吸光度； 4、根据吸光度值计算出酶活 20、壳聚糖酶如何筛选：采用透明圈法，透明圈法直观、方便、根据壳聚糖不溶于水，以壳聚糖为唯一碳源，培养基浑浊。如果有该酶存在，即可降解壳聚糖为壳寡糖，壳寡糖容易被分解吸收，所以形成透明圈，从而可筛选出产生壳聚糖酶的菌株21、产壳聚糖酶初筛平板有什么现象，为什么 会出现透明圈，其原因是根据壳聚糖不溶于水，以壳聚糖为唯一碳源，培养基浑浊。如果有该酶存在，即可降解壳聚糖为壳寡糖，壳寡糖容易被分解吸收，所以形成透明圈 22、酶反应器： 分批式搅拌罐反应器、连续流搅拌罐反应器、填充床反应器、流化床反应器、模型反应器、鼓泡塔反应器 23、对产酶的菌种的要求是： 1、产酶量高；2、繁殖快，发酵周期短；3、产酶稳定性好，不易退化，不易被感染；4、能够利用廉价的原料，容易培养和管理；5、安全可靠，非致病菌。 24、在使用离心机时应注意事项 25、尿酶提取过程中为什么要在冰浴中进行 在冰浴中进行可以使尿酶处于低温条件下，低温能降低酶的活性，但不破坏酶的活性，在适合的温度下可恢复酶的活力 26、填充床的制备及应用的要点 装柱——平衡——应用——检测 装柱：均匀、无裂缝、无气泡、平整；平衡：1—2倍柱床体积缓冲液；应用：3%尿素溶液； 检测：定性：纳氏试剂（黄色或棕红色沉淀）——定量：取20ml流出液，用0.05mol/L标准HCL滴定（加2—3滴混合指示剂） 1、酶工程的定义，研究的主要内容 酶的生产、改性与应用的技术过程称为酶工程 研究的主要内容包括：微生物细胞发酵产酶，动植物细胞培养产酶，酶的提取与分离纯化，酶分子修饰，酶、细胞、原生质体固定化，酶非水相催化，酶定向进化，酶反应器和酶的应用等 酶工程的主要任务是经过预先设计，通过人工操作获得人们所需的酶，并通过各种方法使酶的催化特性得以改进，充分发挥其催化功能。 2、酶的基本特征，酶命名的方法有哪些，蛋白类酶的分类方法 基本特征：专一性强，催化效率高，作用条件温和等 每一种具体的酶都有其具体的推荐名和系统命名。推荐名是在惯用名称的基础上，加以选择和修改而成的。酶的推荐名由两部分组成，第一部分为底物名称，第二部分为催化反应的类型，后面加一个酶字，不管酶的催化是正反应还是逆反应，都用同一个名，如葡萄糖氧化酶，表明该酶的作用底物是葡萄糖催化反应类型是氧化反应。 酶的系统命名更加详细更准确地反映出该酶所催化的反应。系统命名包括了酶的作用底物酶作用的基团及催化反应的类型，如上述葡萄糖氧化酶的系统命名“β－D－葡萄糖：氧1-氧化还原酶”，表明该酶所催化的反应以β－D－葡萄糖为脱氢的供体，氧为氢受体，催化作用在第一个碳原子基团上进行，所催化反应属于氧化还原反应。 蛋白酶类的分类 1、按照酶催化作用的类型，将蛋白酶类分为六大类，氧化还原酶，转移酶，水 解酶裂合酶，异构酶，合成酶 2、每个大类中，按照酶作用的底物、化学键或者基团的不同，分为若干亚类 3、每一亚类再分为若干小类 4、每一小类包含若干个具体的酶、 3、酶的生产方法有哪些 酶的生产是指通过人工操作而获得所需的酶的技术过程 酶的生产方法分为提取分离法、生物合成法、化学合成法3种，其中提取分离法是最早采用并沿用至今的方法，生物合成法是20世纪50年代以来酶生产的主要方法，而化学合成法至今仍停留在实验室阶段 4、酶的生产合成调节理论，包括操纵子，诱导作用，阻遏作用 1、操纵子在原核基因组中,由几个功能相关的结构基因及其调控区组成的一个基因表达的协同单位. ①结构基因是决定某一多肽的DNA 模板，可根据其上的碱基顺序转录出相应的mRNA，然后再可通过核糖体转译出相应的酶 ②启动子：能被依赖于DNA的RNA聚合酶所识别的碱基顺序，是RNA聚合酶的结合部位和转录起点 ③操纵基因：位于启动基因和结构基因之间的一段碱基顺序，是阻遏蛋白的结合位点，能通过与阻遏物相结合来决定结构基因的转录是否能进行 ④调节基因：用于编码组成型调节蛋白的基因，一般远离操纵子,但在原核生物中,可以位于操纵子旁边,编码调节蛋白。 2、酶合成调节的类型：诱导和阻遏《酶工程》期末复习题整理#(精选.)
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