微生物实验教案
第一部分基础性实验
实验一显微镜油镜的使用和细菌形态的观察
一、实验目的
以染色玻片及活菌为例，熟练掌握显微镜油镜的使用方法。
二、显微镜油镜使用的原理
1普通光学显微镜的基本构造
（1）光学部分: 接目镜、接物镜、照明装置(聚光镜、虹彩光圈、反光镜等)。它使检视物放大, 造成物象。（2）机械部分: 镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、载物台转移器、粗调节器、细调节器等部件。它起着支持、调节、固定等作用。2显微镜的放大倍数和分辨率（1）放大倍数=接物镜放大倍数×接目镜放大倍数
（2）显微镜的分辨率：表示显微镜辨析物体（两端）两点之间距离的能力，可用公式表示为：
D=λ/2n·sin(α/2 )
式中D：物镜分辨出物体两点间的最短距离。
λ：可见光的波长（平均0.55μm）
n: 物镜和被检标本间介质的折射率。
a：镜口角（即入射角）。3油镜使用的原理
油镜，即油浸接物镜。当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。三、实验材料
1显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、盖玻片、接种环、酒精灯等。
2细菌三种形态的玻片染色标本。
3培养12-18h的枯草芽孢杆菌。四、实验方法与步骤
1染色细菌玻片的油镜观查
（1）用前检查：零件是否齐全，镜头是否清洁。
（2）调节光亮度。
（3）低倍镜观察：先粗调再微调至物象清晰。
（4）转入中倍、高倍观察，每一不只需调微调旋纽即可看到清晰的物象。
（5）油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，旋转转换器，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。
（6）绘出所观察到的细菌形态图像。
（7）、换片：另换新片观察，必须从（3）步开始操作。
（8）、用后复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去油镜头上的香柏油，然后再用擦镜纸沾取少量二甲苯擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯，后将镜体全部复原。
2、活菌制片观察
取一张干净的载玻片，在其中央滴上一滴干净的蒸馏水，取培养12-18h的枯草芽孢杆菌一小环，在水滴上反复涂抹至菌体充分分散，盖上盖玻片，用吸水纸吸去多余的水分，按照油镜的使用步骤，观察草芽孢杆菌形态，边观察边绘图。
五、实验报告
油镜使用的原理
六、思考题
1油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应特别注意些什么？
2使用油镜时，为什么必须用镜头油？
3镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是直接用高倍镜或油镜观察？
七、实验注意事项
1不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。
2镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度。
3观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。
4观察时，两眼睁开，养成两眼能够轮换观察的习惯，以免眼睛疲劳，并且能够在左眼观察时，右眼注视绘图。
5拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿。
6显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀镜片。
实验二细菌的简单染色和革兰氏染色
一、实验目的
1学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的简单染色方法及革兰氏染色。
2了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。
二、实验原理
1 简单染色的原理
大多数微生物细胞质是带负电荷，简单染色时采用已知的、带正电荷的碱性染料。染料适用于热固定的涂片，染料与菌体细胞质黏附使菌体着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明对比。
2 革兰氏染色的原理
革兰氏阳性菌的细胞壁主要有肽聚糖形成的网状结构组成，在染色过程中，当用95%乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，细胞壁的通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞壁内而不易脱色，因此呈蓝紫色。革兰氏阴性菌的细胞壁中肽聚糖含量低，脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物容易被乙醇抽提出来而脱色，然后又被染上了复染剂的颜色，因此呈现红色。
三、实验材料
1大肠杆菌24h的斜面培养物。
2葡萄球菌24h的斜面培养物。
3简单染色液（美蓝染色液、黑色素液或炭素墨水）
4革兰氏染色液（结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石碳酸复红）
5载玻片、盖玻片、接种环、镊子、酒精灯、火柴、玻璃铅笔、蒸馏水等。
6显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸等。
四、实验方法和步骤
附表1细菌染色法分类
附表2 微生物染色常用染料
A酸性染料：如酸性复红、刚果红、伊红、藻红、苯胺黑等。
B碱性染料：一般有碱性复红、中性红、孔雀绿、番红、结晶紫、美兰、甲基紫等，细菌易被碱性染料染色。
C中性（复合）染料：如伊红、美兰等，Wright染料和Gimsa染料等（常用于细胞核染色）。D单纯染色：这类染料物，不溶于水，但溶于脂肪溶剂中，如苏丹类（Sudan b）的染料1、简单染色
(1) 涂片:取两块干净的载玻片，各滴一小滴生理盐水于载玻片中央，用无菌操作分别挑取金黄色葡萄球菌和大肠杆菌于二载玻片的水滴中（每一种菌制一片），调匀并涂成薄膜。注意滴生理盐水时不宜过多，涂片必须均匀。
(2) 干燥：自然气干或酒精灯高处微微加热。
(3) 固定:于火焰上通过2—3次。
(4) 染色：在整个涂面上滴加齐氏石炭酸复红，染色１分钟。
（5）水洗：倾去染液，用自来水细流冲洗至流下的水中无染料颜色为止。
（6）干燥：空气中自然干燥或在酒精灯高处微微加热。
（7）镜检：在油镜下观察细菌形态。
2革兰氏染色
（1）涂片。
（2）初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。
（3）媒染：先用新配的卢哥氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。
（4）脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约30秒，后立即用流水冲洗。
（5）复染：滴加番红染色液，染1分钟，水洗后用吸水纸吸干。
（6）镜检：观察染色结果。
五、实验报告
1 革兰氏染色的基本原理和意义
2 革兰氏染色成败的关键
六、思考题
1根据实验体会，你认为制备染色标本时，应注意哪些事项？
2制片为什么要完全干燥后才能用油镜观察？
3做革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？其染色成败的关键一步是什么？
4当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠?
实验三细菌的鞭毛染色及其运动观察
一、实验目的
1学习并掌握细菌鞭毛染色的基本方法及观察细菌鞭毛的着生情况。
2用压滴法观察细菌的运动
3用悬滴法观察细菌的运动
二、实验原理
鞭毛是细菌的运动“器官”，一般细菌的鞭毛都非常纤细，其直径为0.01-0.02μm，在普通光学显微镜的分辨力限度以外，故需要用特殊的鞭毛染色法，才能看到。鞭毛染色是借媒染剂和染色剂的沉淀作用，使染料堆积在鞭毛上，以加粗鞭毛的直径，同时使鞭毛着色，
在普通光学显微镜下能够看到。
三、实验材料
1 菌种：普通变形杆菌斜面菌种
2 鞭毛染色液：A液，B液。
3 0.01％的美蓝水溶液、无菌水，凹玻片、载玻片，盖玻片、香柏油、镊子、酒精灯、擦镜纸、二甲苯、吸水纸等。
四、实验方法
(一) 细菌鞭毛染色
1制片：在载玻片的一端滴一滴蒸馏水，用接种环挑取少许备用的菌苔，最好从菌落的边缘取菌苔，在载玻片的水滴中轻沾几下。将载玻片稍倾斜，使菌液随水滴缓慢流到另一端，然后平放在空气中干燥。
2染色：涂片干燥后滴加A液染3-5分钟，用蒸馏水冲洗，或将残水沥干或用B液冲去残水（注意：一定要充分洗净A液后再加B液，否则背景很脏）。洗净A液滴加B液后，将玻片在酒精灯上稍加热，使其微冒蒸汽且不干，一般染30-60秒钟。然后用蒸馏水冲洗，自然干燥。
3镜检：镜检时，如未见鞭毛，应在整个涂片上多找几个视野，有时只在部分涂片上染出鞭毛。菌体为深褐色，鞭毛为褐色。
注意点：染色成功的关键主要决定于：(a)菌种活化的情况，即要连续移种几次；(b)菌龄要合适，一般在幼龄时鞭毛情况最好，易于染色；(c) 新鲜的染色液。（d）制片时不能加热固定
（二）细菌运动的观察
1 压滴法
(1) 制备菌液：从幼龄普通变形菌斜面上，挑数环菌放入装有1-2mL无菌水的试管中，制成轻度混浊的菌悬液。
(2) 取2-3环稀释菌液于洁净载玻片个央，再加入一环0.01％的美蓝水溶液，混匀。
(3) 用镊子夹一洁净的盖玻片，先使其一边接触菌液，然后慢慢地放下盖玻片，这样可防止产生气泡。
(4) 镜检：将光线适当调暗，先用低倍镜找到观察部位，再用高倍镜观察。要区分细菌鞭毛运动和布朗运动，后者只是在原处左右摆动，细菌细胞间有明显位移者，才能判定为有运动性。
2 悬滴法
(1) 取洁净盖玻片，在四周涂少许凡士林。
(2) 在盖玻片中央滴一小滴菌液
(3) 将凹玻片的凹窝向下，使凹窝中心对准盖玻片中央的菌液，轻轻地盖在盖玻片上，使凹玻片与盖玻片粘在一起(注意液滴不得与凹玻片接触)。
(4) 小心将玻片翻转过来，使菌液正好悬在窝的中央。再用火柴棒轻压盖玻片四周使封闭，以防菌液干燥。
(5) 镜检：将光线适当调暗，先用低倍镜找到悬滴的边缘后，再将菌液移至视野中央，换用高倍镜观察，注意细菌是如何运动的，它与分子布朗运动的不同。
五、实验结果和报告
1绘出你所观察到的细菌的形态及鞭毛着生情况。
2试描述你所观察的细菌有无运动性，是如何运动的？
六、思考题
1制片时为什么不能加热固定？
2没有鞭毛的活细菌在光学显微镜下完全不动吗？真实地记录你观察到的现象，并进行解释。
3鞭毛染色的菌种为什么要先连续传几代，并且要采用幼龄菌种?
4根据你的实验体会，哪些因素影响鞭毛染色的效果?如何控制?
5试设计—实验，如何鉴别某种细菌是否能运功，是否有鞭毛，其鞭毛的着生位置。
实验四细菌的芽孢、荚膜染色
一、实验目的
1掌握细菌的芽孢染色法。
2掌握细菌的荚膜染色法。
二、实验材料
1 枯草芽抱杆菌、褐球固氮菌的斜面菌种。
2 二甲苯、香柏油、蒸馏水、5％孔雀绿水溶液、0.5％沙黄水溶液(或0.05％碱性复红)、绘图墨水(用滤纸过滤后备用)、95％乙醇、石炭酸复红染液。
3显微镜、接种环、酒精灯、载玻片、盖玻片、小试管(1x6.5cm)、烧杯(300mL)、滴管、试管夹、擦镜纸、吸水纸。
三、实验方法和步骤
（一）芽孢染色法
1方法1
(1) 取37℃培养18-24h的枯草芽孢杆菌作涂片，并干燥，固定。
(2) 于载片上滴入3-5滴5％孔雀绿水溶液。
(3) 用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热，自载玻片上出现蒸汽时，开始计算时
间约4-5min。加热过程中切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料。
(4) 倾去染液，待玻片冷却后，用自来水冲洗至孔雀绿不再褪色为止。
(5) 用0．5％沙黄水溶液(或0.05％碱性复红)复染1min，水洗。
(6) 制片干燥后用油镜观察。芽孢呈绿色，菌体红色。
2 方法2
(1) 加1-2滴自来水于小试管中，用接种环从斜面上挑取2-3环培养18-24h的枯草芽
孢杆菌菌苔于试管中，并充分混匀打散，制成浓稠的菌液。
(2) 加5％孔雀绿水溶液2-3滴于小试管中，用接种环搅拌使染料与菌液充分混合。
(3)将此试管浸于沸水浴(烧杯)中，加热15-20min。
(4)用接种环从试管底部挑数环菌于洁净的载玻片上，并涂成薄膜，将涂片通过微火
3次固定。
(5)水洗，至流出的水中无孔雀绿颜色为止。
(6)加沙黄水溶液，染2-3min后，倾去染液，不用水洗，直接用吸水纸吸干。
(7)干燥后用油镜观察。芽孢绿色，菌体红色。
(二)荚膜染色法
1石炭酸复红染色
（1）取培养了72h的褐球固氮菌制成涂片，自然干燥(不可用火焰烘干)。
(2)滴入1-2滴95％乙醇固定(不可加热固定)。
(3)加石炭酸复红染液染色1-2min，水洗，自然干燥。
(4)在载玻片一端加一滴墨汁，另取一张边缘光滑的载玻片与墨汁接触，涂成均匀的
薄层，自然干燥。
中国海洋大学本科生课程大纲 课程属性：公共基础/通识教育/学科基础/专业知识/工作技能，课程性质：必修、选修 一、课程介绍 1.课程描述： 随着各种环境问题的日趋严重，微生物实验技术在环境领域得到广泛应用和迅速发展，为人们改造环境和保护环境提供重要的技术手段。本课程以环境工程领域常用的微生物实验技术的教学为主要内容，并以具体的环境问题为依托，使学生掌握专业知识在实践中的应用，提升学生的实践技能。 Microbiology experimental technology has been widely used and rapidly developed in the environmental field with the increasingly serious environmental problems. It plays an important role in transforming the environment and protecting the environment. The main teaching contents of the course are the common microbiology experimental technologies in various environmental issues. The course will enable students to master the professional skills. 2.设计思路： 本课程主要学习和掌握环境领域常用的微生物实验技术，了解其在环境保护和环境改造过程中的实践应用及其重要作用。课程内容的设置注重实用性和可操作性，分为基础实验部分和综合实验部分。基础实验部分以常用微生物实验技术的学习为重点，并注重实验内容的系统性和连贯性；综合实验部分以具体环境问题为依托，进行微生物实 - 7 -
实验一光学显微镜----油镜的使用 一、实验目的 1 复习显微镜低倍镜和高倍镜的使用技术 2 了解油浸系物镜的基本原理，掌握油浸系物镜的使用方法。 二、实验材料和用具 细菌三型的染色装片、香柏油、二甲苯、显微镜、擦镜纸。 三、操作步骤 (一)观察前的准备 1．将显微镜置于平稳的实验台上。 2．调节光源。 (二)低倍镜观察染色装片 首先上升镜简，将枯草芽孢杆菌染色装片置于载物台上，用标本夹夹住，将观察位置移至物镜正下方，物镜降至距装片0.5cm处，适当缩小光圈然后两眼从目镜观察，转动粗调节器使物镜逐渐上升(或使镜台下降)至发现物像时，改用细调节器调节到物像清楚为止。移动装片，把合适的观察部位移至视野中心。 (三)高倍镜观察 眼睛离开目镜从侧面观察，旋转转换器，将高倍镜转至正下方，注意避免镜头与玻片相懂。再由目镜观察，仔细调节光圈，使光线的明亮度适宜。用细调节器校正焦距使物镜清晰为止。将最适宜观察部位移至视野中心，绘图。不要移动装片位置，准备用油镜观察。 (四)油镜观察 1．提起镜筒约2cm，将油镜转至正下方。在玻片标本的镜检部位(镜头的正下方)滴一滴香柏油。 2．从侧面注视，小心慢慢降下镜筒，使油镜浸在油中至油圈不扩大为止，镜头几乎与装片接触，但不可压及装片，以免压碎玻片，损坏镜头。 3．将光线调亮，左眼从目镜观察，用粗调节器将镜筒徐徐上升(切忌反方向旋转)，当视野中有物像出现时，再用细调节器校正焦距。如因镜头下降未到位或镜头上升太快末找到物像，必须再从侧面观察，将油镜降下，重复操作直至物像看清为止。仔细观察并绘图。 4．再次观察提起镜筒，换上金黄色葡萄球菌染色装片，依次用低倍镜、高倍镜和油镜观察，绘图。重复观察时可比第一次少加香柏油。 (五)镜检完毕后的工作 1．移开物镜镜头。2．取出装片。 3．清洁油镜。4．擦净显微镜，将各部分还原。 四、注意事项 1．使用油镜必须按先用低倍镜和高倍镜观察，再用油镜观察。 2．下降镜头时，一定要从侧面注视，切忌用眼睛对着目镜，边观察边下降镜头的错误操作，以免压碎玻片而损坏镜头。 3．使用二甲苯擦镜头时，注意二甲苯不能过多，以防溶解固定透镜的树脂。 4．注意保持显微镜的洁净，对金属部分要用软布擦拭，擦镜头必须用擦镜纸，切勿用手或用普通布、纸等，以免损坏镜头。 五、实验报告 1．绘制油镜下的细菌三型图。 2．使用油镜应特别注意哪些问题？ 3．当物镜从低倍镜转到高倍镜和油镜时，对照明度有何要求？应如何调节？
实验一食品中细菌总数的检验 一、实验目的要求 1、了解细菌总数检验的意义。 2、掌握样品稀释处理的方法和菌落总数计数的方法 3、掌握国标法测定菌落总数的方法和技能 4、熟练无菌操作技术。 二、原理 菌落总数是指食品经过处理，在一定条件下培养后，所得1g或1ml检样中所含细菌菌落总数。菌落总数主要作为判别食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。 菌落总数并不表示样品中实际存在的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。 三、试剂和仪器 （一）最先准备的器材（清洗、烘干、包扎、灭菌） 规格名称数量用途 1、500ml广口瓶1个稀释样品 2、500ml三角瓶1个配制生理盐水 3、250ml三角瓶2个配制营养琼脂 4、18×180mm试管3支稀释样品 5、1ml移液管 5 支 6、直径为90mm平皿10套倒营养平板 7、250ml量筒1支 8、玻璃珠：直径约5mm （二）应灭菌、消毒的器材 剪刀1把不锈钢药匙1把称量纸：适量 酒精消毒的器材：吸耳球1个，滴管胶头4只，开瓶器
（三）应制备的培养基 培养基总量所用容器 1、0.85%NaCl生理盐水1瓶300ml/瓶500ml三角瓶 2、平板计数琼脂（PCA）培养基：2瓶100ml/瓶250ml三角瓶 四、实验内容 （一）、基本操作过程： 样品称量→→样品稀释→→倾注平皿→→培养48小时→→计数报告。 （二）、样品的稀释（样品的处理） 样品：袋装乳粉 外包装消毒→→无菌称样品25g→→加无菌生理盐水→→加盖振荡摇均匀 1、用75%酒精棉球擦拭消毒袋口，用无菌剪刀开封取样。称取检样25g，放入装有适量玻璃珠的灭菌广口瓶子中，然后用225mL温热的灭菌生理盐水徐徐加入（先加入少量生理盐水将乳粉调成糊状，再全部加入，以免奶粉结团），采用振摇法（用力快速振摇50次,振幅不小于40cm）振摇均匀，即为1:10的稀释液。固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以8000~10000r/min的速度处理1min，制成1：10的均匀稀释液。 2、用1ml灭菌吸管，吸取1∶10稀释液1ml，注入含有9ml灭菌生理盐水的试管内，振摇试管混合均匀，制成1∶100稀释液。 3、另取1ml灭菌吸管，按上项操作顺序作10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用另一支1ml灭菌吸管。 4、根据对检样污染情况的估计，选择2～3个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的稀释液1ml于灭菌平皿内，每个稀释度做2个平皿。 5、用1ml生理盐水作空白对照试验，做2个平皿。 注意： ①吸管尖端不要触及瓶口或试管口外部，也不得触及管内稀释液。 ②吸管插入检样液内取样稀释时，插入深度要达2.5cm以上,调整时应使管尖与容器内壁紧贴。 ③进行稀释时，应使吸管内的液体沿管壁小心流加入，以免增加检液。 ④每递增稀释一次，即换用一支1ml灭菌吸管。
实验一光学显微镜的使用及微生物形态的观察、 大小的测定和计数 一、实验目的 １、掌握光学显微镜的结构、原理，学习显微镜的操作方法和保养 2、观察细菌、真菌、原生动物的标本装片,学会绘制生物图 3、掌握使用测微尺测量微生物大小的方法 ４、了解血球计数板的结构，掌握使用和计算方法 二、实验器材 １、显微镜 ２、微生物标本装片 ３、目、物镜测微尺 ４、血球计数板 ５、酵母菌液或霉菌孢子液 6、载波片、盖波片、烧杯、滴管、擦镜纸、香柏油、二甲苯等 三、显微镜的构造、原理及使用方法 1、构造 现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜,由机械装置和光学系统两大部分组成。机械装置包括镜筒、转换器、载物台、镜臂、镜座、调节器;光学系统包括目镜、物镜、聚光器、电光源。显微镜的总放大倍数为目镜和物镜的放大倍数的乘积。 ２、操作 在目镜保持不变的情况下,使用不同放大倍数的物镜所能达到的分辨率及放大率都是不同的。一般情况下,特别是初学者，进行显微观察时应遵循从低倍镜到高倍镜再到油镜的观察程序,因为低倍数物镜视野相对大,易发现目标及确定检查的位置。 四、微生物大小的测量原理和方法 微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，由于菌体很小,只能在显微镜下来测量。用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和物镜测微尺。 1、目镜测微尺(图1-1）是一块圆形玻片,在玻片中央把5ｍｍ长度刻成5０等分，或把1０mm长度刻成100等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上（此处正好与物镜放大的中 --
-- 间像重叠)来测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同,目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用物镜测微尺校正，以求出在一定放大倍数下,目镜测微尺每小格所代表的相对长度。 2、物镜测微尺(图１-２）是中央部分刻有精确等分线的载 玻片,一般将lmm 等分为100格,每格长ｌ０μm （即0.0ｌmm), 是专门用来校正目镜测微尺的。校正时，将物镜测微尺放在载 物台上,由于物镜测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经 过物镜和目镜的两次放大成象进入视野,即物镜测微尺随着显 微镜总放大倍数的放大而放大，因此从物镜测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小,所以用物镜测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的长度,然后移去物镜测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物大小。 3、目镜测微尺的校正 把目镜的上透镜旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上，把物镜测微尺置于载物台上，刻度朝上。先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清物镜测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与物镜测微尺的刻度平行，移动推动器,使两尺重叠,再使两尺的“０”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度（图1－３)，计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和物镜测微尺的格数。因为物镜测微尺的刻度每格长l0μｍ，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度。 例如目镜测微尺５小格正好与物镜测微尺5小格重叠，已知物镜测微尺每小格为ｌ0μm ，则目镜测微尺上每小格长度为=5×10μm/５=1０μm 用同法分别校正在高倍镜下和油镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。 由于不同显微镜及附件的放大倍数不同,因此校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件(特定的物镜、目镜、镜筒长度）进行，而且只能在特定的情况下重复使用,当更换不同放大倍数的目镜或物镜时,必须重新校正目镜测微尺每一格所代表的长度。 4、细胞大小的测定 移去物镜测微尺,换上待测菌体的装片，先在低倍镜下找到目的物,然后在高倍镜下用目镜测微尺来测量菌体的长，宽各占几格（不足一格的部分估计到小数点后一位数）。测出的格数乘上目镜测微尺每格的校正值,即等于该菌的长和宽。 结果计算： 长μm=平均格数×校正值 宽μｍ＝平均格数×校正值 大小表示: 宽μm ×长μｍ 五、微生物细胞数量的测定原理和方法 1、血球计数板是一块特制的厚型载玻片,载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半,每个半边上面各有一个计数区(图1-4），计数区 图1-1 目镜测微尺 图1-2 物镜测微尺 图1-3 目、物镜测微尺的校正 图1-4 血球计数板
环境工程微生物学讲义 本课程是环境学院各专业学生的专业基础课；与另一门课《环境微生物学实验》相结合，构成一个完 整的体系；本课程强调每个学生要动手，通过实验，加深对讲课内容的理解和记忆；本课程内容分两大部分：一是微生物学的基础知识；二是微生物学在环境领域中的应用。 绪论 主要内容： 环境微生物学的研究对象和任务研究对象研究任务微生物学概述微生物的定义微生物的特点原核微生物与真核微生物微生物的命名与分类第一节环境工程微生物学的研究对象和任务一、环境微生物学的研究对象定义：环境微生物学是研究与环境领域（包括环境工程、给水排水工程）有关的微生物及其生命活动 规律。?其内容包括：微生物个体形态、群体形态；细胞结构功能、生理特性、生长繁殖、遗传变异 等；微生物与环境的关系（尤其是微生物与污染环境之间的关系）；微生物对物质的转化分解作用（特 别是应用微生物来处理各种污染物质，如废水、废气和固体废弃物）。二、环境工程微生物学的研究任务 总的归纳起来有两大方面的任务： （1）防止或消除有害微生物 （2）充分利用有益的微生物资源 三、微生物在环境污染治理（水处理）中的应用
１）在环境监测方面（水污染的监测） 利用在环境中生存的生物的种类、数量、活性等特征，来判断环境状况的好坏。这些生物称为指示生 物。 生物监测的优缺点： 生物监测的主要优越性： (a)长期性——汇集了生物在整个生活时期中环境因素改变的情况，可以反映 当地的环境变化； (b)综合性——能反映环境诸因子、多成分对生物有机体综合作用的结果； (c)直观性——直接把污染物与其毒性联系起来； (d)灵敏性——有时甚至具有比精密仪器更高的灵敏性，有助于提早发现环境 污染。生物监测的主要缺点： (a)定量化程度不够； (b)需要一定的专业知识和经验。 ２）在环境治理方面 包括水、大气、固体废弃物处理方面其中特别在水处理方面，有着大量成功应用的例子。 第二节微生物概述一、微生物的定义 微生物是指所有形体微小，用肉眼无法看到，须借助于显微镜才能看见的，单细胞或个体结构简单的 多细胞，或无细胞结构的低等生物的统称。 Too small to be seen with naked eyes 二、微生物的特点
课程编号： 《微生物学实验》教学大纲 学时数：108讲课：108 学制：四年制本科 适合专业：生物科学相关专业 一、本课程的性质和任务 （一）课程的性质： 微生物学实验主要任务是使学生掌握研究与应用微生物的主要方法与技术，包括经典的、常规的、以及现代的方法与技术，使学生具有适应于从事相关学科的基础理论研究与实际生产应用的微生物学实验技能。提高学生分析问题和解决问题的能力。根据本学科的特点，逐步使学生认识微生物的基本特性，比较它们与其它生物的相似和不同之处，知道如何研究微生物以及对研究中所出现的问题点样分析，并加以解决。 （二）课程的任务： 微生物学实验是生物学重要的基础课之一，要求学生熟悉微生物学方法与技术，掌握无菌操作技能和建立无菌概念是微生物学实验中最重要的内容，重点掌握最基本的无菌操作技能，如接种、纯培养、计数等。 二、本课程与其他课程的联系： 1. 通过教师示范、讲解与学生实际操作相结合方法，使学生牢固树立无菌概念，掌握显微镜的使用、生物染色技术、形态学观察的方法、微生物计数、培养基的配置和灭菌方法、微生物分离、纯化等基本操作技能，基本了解常用的仪器设备的基本原理、构造、使用方法及使用中的注意事项，树立严谨求实的科学态度，提高观察、分析问题和解决问题的能力，培养勤俭节约、爱护公物和相互协作的优良作风。 2. 本实验课内容包括验证性实验、综合性实验两个部分。验证性实验主要
通过光学显微镜镜检观察方法进行教学，综合实验在教师指导下学生根据所掌握的理论基础和实验技能，由学生自己动手完成。实验过程要求学生仔细观察实验现象，完整记录原始实验数据、结果，分析实验现象并认真填写实验报告。 三、教学内容 （一）实验一实验室安全教育与微生物学实验室常用的器皿 目的要求 掌握实验室安全规则，了解微生物学实验所用的器皿，因其大多要进行消毒、灭菌和用来培养微生物，因此了解其质量、洗涤和包装方法的要求。 实验内容 一、器皿的种类、要求与应用： 1、试管 大试管(约18mm×180mm) :可装倒平板用的培养基；可作制备斜面用；装液体培养基用于微生物的振荡培养 中试管[(13～15)mm×(100～150)mm]: 装液体培养基培养细菌或做斜面用；用于细菌、霉菌、病毒等的稀释和血清学试验。 小试管[(10～12)mm×100mm]:一般用于糖发酵或血清学试验，和其它需要节省材料的试验。 2、容量瓶 主要用于准确配制一定浓度的溶液，它是一种细长颈、梨形的平底玻璃瓶，配有磨口塞，瓶颈上刻有标线。 3、量筒 用来量取液体体积的一种玻璃仪器，外壁上有刻度。常用量筒的规格有5ml、10ml、25ml、50ml、100ml、250ml等。 4、三角瓶 用来装无菌水、培养基和振荡培养微生物等。 5、烧杯 呈圆柱形，顶部的一侧开有一个槽口，便于倾倒液体，有些烧杯外壁标有刻度，可以粗略地估计烧杯中液体的体积，这种烧杯叫印标烧杯，也叫刻度烧杯，其分度并不十分精确，允许误差一般在±5%。 6、烧瓶 通常具有圆肚细颈的外观，因瓶口很窄，不适用玻璃棒搅拌，若需要搅拌时，
实验九黄豆酱的制作 一、黄豆酱的制备 （一）实验目的 （1）学会如何利用霉菌进行发酵食品制备。 （2）掌握米曲霉在豆酱制备过程中所起的作用。 （3）掌握豆酱制备过程米曲霉的变化。 （4）了解豆酱制备过程中常见的异常现象。 （二）实验原理 黄豆酱在发酵过程中起主要作用的是曲霉菌。自然发酵酱曲中每克干曲的细菌总数超过106个,占分离出微生物总数的38.46%,酵母菌占分离出微生物总数的12.09%,霉菌占分离出微生物总数的49.45%。 （三）实验材料及容器 1、黄豆、面粉。黄豆400g，要求无半粒、烂粒等，面粉250g，黄豆与面粉比例8：5。 3、制曲匾一个。 4、纱布1-2块。 5、酱坛一个。 6、粗粒盐： 96g。 （三）主要步骤要求 主要分两个主要步骤，即： 1.制曲 1）黄豆处理：将浸泡好的400g黄豆,滤干水后，用纱布包住放入高压锅中，在121℃的条件下蒸煮20-30分钟（由于时间问题我们并未做这一步
骤）。等黄豆冷却到45℃左右，放在盆子里。 2）接种：向黄豆加入三分之二的面粉，拌匀，用剩下三分之一的面粉混3.5g的曲精，接着把面粉和曲精全部混进黄豆中，拌匀，制成曲，将曲放入曲匾，用纱布盖好，放入室内常温培养。 3）培养：在常温下培养1天后，均匀地翻曲。然后继续在常温下培养1天，进行第二次翻曲，再培养1天，做第三次翻曲，可得初态的酱曲。 2.曲料发酵 1）把成熟的酱曲放进酱坛中，加入600ml 70℃的12%食盐水，然后搅拌，加盖，放在常温下培养。培养两天后，再加入200ml 12%的食盐水。（四）结果要求 1、制曲结果 1）每组每天两次来实验室观察曲的变化，详细记录并拍照（时间与变化要 对应记录，并写在报告中由于时间和实验室的原因，我们没有进行这一步骤） 2）对制好的曲进行感官评价。 注：事先对制曲变化及曲的质量提前查资料。 2、下酱发酵 2）发酵过程的现象，感官变化记录。 3）产品灭菌条件或若想制备配方豆酱如加辣椒等都可自查资料。 4）感观指标：色泽：红褐色或棕褐色，有光泽不发乌。 香气：具体黄豆酱特有的香气和酯香气，无其他不良气味。 滋味：鲜美、咸淡适口、味柔醇厚，无苦、酸、涩、焦糊等味道 体态：鲜艳有色泽，表面无白点，有豆瓣，稀稠适度。 结果记录表：
食品微生物学实验技术思考题答案 1. 用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片和镜头之间加滴什么油?起什么作用？ 答：应该先用擦镜纸将镜头擦干净,以防上次实验的污染.操作时,先低倍再高倍.用完要擦掉油.加香柏油,作用是增加折光率,也就是增加了显微镜的分辨率.油的折光率和分辨率成反比(有公式),同时与波长成正比. 2. 列表比较低倍镜、高倍镜及油镜各方面的差异。为什么在使用高倍镜及油镜时应特别注意避免粗调节器的误操作答：使用高倍镜和油镜时镜头距离标本较近，而粗调节器的调节幅度较大，粗调节器的误操作会使镜头大幅度向标本移动，很容易损坏标本和镜头。一般先用低倍镜找到物象后换到高倍镜，就只需要用细调节器了。 3. 什么是物镜的同焦现象？它在显微镜观察中有什么意义？ 答：在一般情况下，当物像在一种物镜中已清晰聚焦后，转动物镜转换器将其他物镜转到工作位置进行观察时，物像将保持基本准焦的状态，这种现象称为物镜的同焦。利用这种同焦现象，可以保证在使用高倍镜或油镜等放大倍数高、工作距离短的物镜时仅用细调节器即可对物像清晰聚焦，从而避免由于使用粗调节器时可能的误操作而损坏镜头或载玻片。 4. 影响显微镜分辨率的因素有哪些？ 答：物镜的NA 值（物镜的数值孔径）与照明光源的波长 5. 根据你的实验体会,谈谈应如何根据所观察微生物的大小,选择不同的物镜进行有效地观察 答：细菌用油镜，真菌用高倍镜。都是先用低倍镜找到目标后，再用高倍镜调到合适的视野和合适的清晰度。 答：放线菌、酵母菌、多细胞真菌相对较大，用放大40 倍的物镜就可以看了，细菌小，要用放大1000 倍的物镜看，感觉还很小。病毒那就要用电子显微镜看了。 6. 哪些环节会影响革兰色染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？ 答：涂片环节、加热固定环节、脱色环节；其中最关键的环节是脱色环节 7. 进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题? 答：着色不均，染色效果不好。阴性阳性不明显分不太清楚,问题是：不便于显微镜下观察是阳性菌还是阴性菌 8. 革兰氏染色时，初染前能加碘液吗?乙醇脱色后复染之前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色? 答：不可以。因为碘与染料会结合成大分子，使得染料分子不能穿过细胞的细胞壁，对
实验三环境微生物的检测 一、实验目的 1.了解周围环境中微生物的分布情况。 2.懂得无菌操作在微生物实验中的重要性。 3.了解四大类微生物的菌落特征。 二、实验原理 在我们周围的环境中存在着种类繁多的、数量庞大的微生物。土壤、江河湖海、尘埃、空气、各种物体的表面以及人和动物体的口腔、呼吸道、消化道等都存在着各种微生物。由于它们体积微小，人们用肉眼无法观察到它们个体的存在。但是只要稍加留意，我们就可以在发霉的面包、朽木上看到某些微生物群体。这些现象表明，自然界只要有微生物可以利用的物质和环境条件，微生物就可以在其上生长繁殖。据此，我们在实验室里就可以用培养基来培养微生物。 培养基是用人工配制的、适合微生物生长繁殖和产生代谢产物用的混合养料。其中含有微生物所需要的六大营养要素：碳源、氮源、无机盐、生长因子、气体和水分。此外，根据不同的微生物的要求，在配制培养基时还需用酸液或碱液调节至适宜的pH。配制好的培养基必须进行灭菌。所谓灭菌是指采用各类的物理或化学因素，使物体内外的所有微生物丧失其生长繁殖能力的措施。经过灭菌后的物体是无菌的。消毒是与灭菌完全不同的概念，它是指用较温和的物理因素杀死物体表面和内部病原微生物的一种常用的卫生措施。 灭菌的方法较多，广泛使用的是高温灭菌，其中最常用的是高压蒸汽灭菌法。此法是把待灭菌的物品放在一个可密闭的加压蒸汽灭菌锅中进行的。在1.05kg/cm2的蒸汽压力下，温度可达121℃。一般只要维持15~20min，就可杀死一切微生物的营养体和它们的各种孢子。 微生物的接种技术是生物科学研究中的一项最基本操作技术。为了确保纯种不被杂菌污染，在整个接种过程中，必须进行严格的无菌操作。在实验过程中必须牢固树立无菌概念，经常保持实验台及周围环境的清洁，严格无菌操作，避免杂菌的污染，这是保证实验成功的必要条件。
20 -20 学年第学期 食品微生物检验学（适合食品质量与安全、食品科学与工程专业使用） 实验 学院： 专业： 年级： 姓名： 任课教师： 教师所在单位： 河北农业大学食品科技学院 2010-05-05制 实验须知
食品微生物检验学（本科）实践教学的目的是：使学生掌握食品微生物检验的最基本的操作技能；了解食品微生物检验学的基本知识；加深理解课堂讲授的某些食品微生物检验学理论知识。同时，通过实验，培养学生观察、思考、分析问题和解决问题的能力；实事求是、严肃认真的科学态度以及勤俭节约、爱护公物的良好作风。 为了上好食品微生物检验学实验课，并保证安全，特提出如下注意事项： 1、每次实验前必须对实验内容进行充分预习，以了解实验的目的、原理和方法，做到心中有数，思路清楚。 2、认真及时做好实验记录，对于当时不能得到结果而需要连续观察的实验，则需记下每次观察的现象和结果，以便分析。 3、实验室内应保持整洁、勿高声谈话和随便走动，保持室内安静。 4、实验时小心仔细，全部操作应严格按操作规程进行，万一遇有盛菌试管或瓶不慎打破、皮肤破伤或菌液吸入口中等意外情况发生时，应立即报告指导教师，及时处理，切勿隐瞒。 5、实验过程中，切勿使酒精、乙醚、丙酮等易燃药品接近火焰。如遇火险，应先关掉火源，再用湿布或沙土掩盖灭火。必要时用灭火机。 6、使用显微镜或其他贵重仪器时，要求细心操作，特别爱护。对消耗材料和药品等要力求节约，用毕后仍放回原处。 7、每次实验完毕后，必须把所用仪器抹净放妥，将实验室收拾整齐。擦净桌面，如有菌液污染桌面或其他地方时，可用3%来苏尔液或5%石炭酸液覆盖其上半小时后擦去。如系芽孢杆菌，应适当延长消毒时间：凡带菌之工具(如吸管、玻璃刮捧等)在洗涤前须浸泡在3%来苏尔液中进行消毒： 8、每次实验需进行培养的材科，应标明自己的组别及处理方法，放于教师指定的地点进行培养：实验室中的菌种和物品等，未经教师许可，不得携出室外： 9、每次实验的结果,应以实事求是的科学态度填入报告表格中，力求简明准确，并连同思考题及时汇交教师批阅： 10、离实验室前应将手洗净，注意关闭门窗、灯、火、煤气等。
实验一显微镜的构造和使用方法 一、实验目的及要求 1. 了解显微镜的构造和性能 2. 掌握显微镜的正确使用和维护方法 二、原理 微生物最显著的特点是个体微小，必须借助显微镜才能观察它们的个体形态和细胞构造，熟悉显微镜和掌握其操作技术是研究微生物不可缺少的手段。本实验主要介绍目前微生物学研究中最常用的普通光学显微镜的结构和使用方法，目的在于使同学们通过本实验，对光学显微镜有比较全面的了解，并重点掌握明视野普通光学显微镜中油镜的使用。 三、显微镜的构造和性能 1. 构造（1）机械系统：镜座、镜臂、镜筒、转换器、载物台、 推进器、调节螺旋。 （2）光学系统：目镜、物镜、聚光器、反光镜、滤光片。 2. 性能（1）分辨力和数值孔径 分辨力用D表示，D=0.5×(λ/N.A) N.A=n×Sin(α/2) N.A为数值孔径；λ为入射光波长；n为介质折射率。α为镜口角。 （2）放大倍数 放大倍数= 物镜的放大倍数×目镜的放大倍数
四、实验器材 显微镜、标本、擦镜纸、香柏油、二甲苯 五、显微镜的使用方法 1、对光：光强时用平面镜，光弱时用凹面镜，视野明亮即可。 2、镜检：低倍镜——定位；高倍镜——观察；油镜——观察 3、镜检完毕后的工作：擦拭镜头（标本）等，还原显微镜，登记，洗手，离开。 4、总流程：安装—调光源—调目镜—调聚光器—镜检—擦镜头——复原—登记。 六、作业（可选） 1、哪些方法可以提高显微镜的分辨率？ 2、 2、为什么有时候在低倍镜下可看到的目标，换用高倍镜则无法看到？
实验二细菌、放线菌的形态观察 一、实验目的及要求 1. 掌握细菌的制片和染色技术 2. 掌握放线菌形态观察方法 3. 熟练油镜的使用方法 二、细菌染色的基本原理 1. 革兰氏染色 G＋与G－细胞壁结构不同，当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成兰紫色，碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫-碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用乙醇进行脱色时，G＋细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚，类脂含量低，乙醇脱色使肽聚糖的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在胞内，经脱色处理时，初染剂保留而呈现紫色。G－菌肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高, 乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，沙黄复染后呈红色。 2. 简单染色 细菌细胞小而透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色。细菌常用碱性染料来进行简单染色，这是因为在中性，碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，很容易使细菌结合使菌体着色，经染色
环境微生物学实验报告 一、实验目的 （1）了解普通光学显微镜的构造及原理，掌握显微镜的操作及保养方法。（2）观察、识别几种原核微生物。真核微生物的个体形态，学会生物图的绘制。 二、实验器皿与材料 （1）器皿：显微镜、擦镜纸、二甲苯。 （2）材料：示范片：细菌三形（球状、杆状、螺旋状）、弧状（硫酸盐还原菌）、丝状（浮游球衣菌等）、细菌鞭毛及细菌荚膜。放线菌、颤蓝细菌、微囊蓝细菌或念珠蓝细菌等。 三、实验步骤 （1）将标本片放在载物台上，使观察的目的物置于圆孔正中央。（2）将镜头换成低倍镜，将粗调节器向下旋转（或载物台向上旋转），眼睛注视物镜。当物镜的尖端距离载玻片约0.5cm 处时停止旋转。 （3）左眼对着目镜观察，将粗调节器向上旋转，如果见到目的物，但不十分清楚，可用细调节器调节，直至目的物清晰。此时找到目的物并移至中央。（4）换成高倍镜，观察目的物，旋转细调节钮，直至视野清晰。（5）观察示范片，绘出其形态图。 四、思考题 （1）使用油镜时，为什么要先用低倍镜观察？答：为了
找到目的物并移动到中央。 （2）要使视野明亮，除采用光源外，还可采取哪些措施？ 答：调大孔径光阑，调整光源。如果是用反光镜的显微镜，用凹面镜可使视野明亮。 五、生物图 实验二、微生物培养基的配制与灭菌 一、实验目的 （1）熟悉玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备工作。 （2）了解配置微生物培养基的基本原理，掌握配置、分装培养基的方法。（3）学会各类物品的包装、配置（稀释水等）和灭菌技术。 二、实验器皿与材料 （1）实验器皿：高压蒸汽灭菌器、干燥箱、煤气灯、培养皿、试管、刻度移液管、锥形瓶、烧杯、两桶、药物天平、玻璃棒、玻璃珠、石棉网、药匙、铁架、表面皿、pH试纸和棉花等。 （2）材料：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、NaOH和琼脂等。 三、实验原理 培养基是微生物生长的基质，是按照微生物营养、生长繁殖的需要，由碳、氢、氧、氮、磷、硫、钾、钠、钙、镁、铁及微量元素和水，按一定的体积分数配置而成。调整合适的pH，经高温灭菌后以备培养微生物之用。由于微生物种类及代谢类型
一、《食品微生物》教学内容 （一）目的和任务 1．教学的目的 学生在学习了解有关食品微生物基本理论知识（微生物的定义、微生物的分类、微生物的形态结构、微生物的生理生化特性等）的基础上，能熟练掌握微生物的显微镜观察技术、微生物培养基的制作技术和微生物的接种操作技术，进一步掌握利用微生物进行常见发酵食品生产的技术，并能有效进行发酵过程中的质量控制。 2．教学的要求 1）标准的校内小型生产型实训室，面积200㎡，并配备相应的配套设施设备。其中，包括：光学显微镜、不锈钢锅、水浴锅、超净工作台、杀菌锅、恒温培养箱、玻璃器皿（试管、三角瓶、培养皿、移液管等）。 2）配备一名实训指导教师。 3）相关教学软件、影像及图片资料。 4）铅笔、彩色染料笔、图画纸、坐标纸等 （二）实训所需设备设施及实验地点 1、校内生产型实训环境 标准的校内小型生产型实训室，面积200㎡，并配备相应的配套设施设备。其中，包括：光学显微镜、不锈钢锅、水浴锅、超净工作台、杀菌锅、恒温培养箱、玻璃器皿（试管、三角瓶、培养皿、移液管等）。 生产设备先进，配套良好，使用效率高，效果好。 2、校外实训基地： 千禾食品有限公司、苏东坡酒业有限公司、吉香居食品有限公司、蒙牛乳业眉山公司等。 （三）教学项目及学时分配 1
2 （四）考核方式及成绩评定 1、考核实行过程考核和结果考核相结合。其中过程考核占60%，包括平时表现和任务考核；结果考核占40%，主要是期末综合技能考核。 （五）教材及参考资料 1唐艳红，王海伟．《食品微生物》． 2.无锡轻工业学院编写：调味品酿造加工技术 二、附录
（一）《食品微生物》理论教学教案 1、《微生物概论》
实验一显微镜的使用及细菌的革兰氏染色 一、实验目的和内容 （一）实验目的 1. 复习显微镜低倍镜和高倍镜的使用技术，了解油浸系物镜的基本原理，掌握油镜的使用方法。 2. 初步掌握细菌涂片方法及革兰氏染色的步骤 （二）实验内容 1．学习油浸系物镜的使用方法。 2．制作细菌染色装片。 3．进行革兰氏染色法操作。 4．用油镜观察大肠杆菌和苏云金杆菌染色装片。 二、实验原理 （一）油镜的基本原理 普通光学显微镜包括低倍物镜、高倍物镜和油镜3种物镜。油镜是一种高倍放大的物镜，一般都刻有放大倍数，如95×、100×等。油镜头上常刻有OI（Oil，Immersion）或HI（Homogeneous immersion）字样，有的还刻有一圈红线或黑线标记，而且油镜的镜身较高倍镜和低倍镜为长。在低倍物镜、高倍物镜和油镜3种物镜中，油镜的放大倍数和数值孔径（numberal aperture）最大，而工作距离最短（图3-1）。 图1-1 显微镜物镜参数图 显微镜的分辨率是指显微镜能分辨出物体两点间最小距离（D）的能力。D值愈小表明分辨率愈高。D值与光线的波长（λ）成正比，与物镜的数值孔径（NA）成反比.
从上式可看出，缩短光波长和增大数值孔径都可提高分辨率。数值孔径指光线投射到物镜上的最大角度（称镜口角，α）的一半正弦与介质折射率（n）的乘积。影响数值孔径大小的因数，一是镜口角，二是介质的折射率。 当镜与装片之间的介质为空气时，由于空气（n＝1.0）与玻璃（n＝1.52）的折射率不同，光线会发生折射，不仅使进入物镜的光线减少，降低了视野的照明度，而且会减少镜口角。当以香柏油（n＝1.515）为介质时，由于它的折射率与玻璃相近，光线经过载玻片后可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射，不仅增加了视野的照明废，更重要的是通过增加数值孔径提高分辨率，因而可以使物像明亮清晰。 （二）革兰氏染色 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain Gram创立的，是细菌学中最重要的鉴别染色法，其原理是利用细菌的细胞壁组成成分和结构的不同。
微生物实验教案 实验一显微镜油镜的使用和细菌形态的观察 一、实验目的 以染色玻片为例，熟练掌握显微镜油镜的使用方法。 二、实验原理 1显微镜油镜使用的原理 （1）光学部分 : 接目镜、接物镜、照明装置 ( 聚光镜、虹彩光圈、反光镜等 ) 。它使检视物放大 , 造成物象。（ 2）机械部分 : 镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、载物台转 移器、粗调节器、细调节器等部件。它起着支持、调节、固定等作用。 2 显微镜的放大倍数和分辨 率（ 1）放大倍数 =接物镜放大倍数×接目镜放大倍数 （2）显微镜的分辨率：表示显微镜辨析物体（两端）两点之间距离的能力，可用公 式表示为： D=λ /2n ·sin(α/2 ) 式中 D：物镜分辨出物体两点间的最短距离。 λ：可见光的波长（平均0.55 μ m） n:物镜和被检标本间介质的折射率。 a：镜口角（即入射角）。 3 油镜使用的原理 油镜，即油浸接物镜。当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。三、实验材料1显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、载玻片、盖玻片、接种环、镊子、酒 精灯、火柴、玻璃铅笔、蒸馏水等。 2枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的玻片染色标本。 四、实验方法与步骤 （1）用前检查：零件是否齐全，镜头是否清洁。 （ 2）调节光亮度。 （ 3）低倍镜观察：先粗调再微调至物象清晰。 （ 4）转入中倍、高倍观察，每一不只需调微调旋纽即可看到清晰的物象。 （ 5）油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，旋转转换器，在标本中央滴一滴香柏油， 使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。 （ 6）绘出所观察到的细菌形态图像。 （ 7）、换片：另换新片观察，必须从（3）步开始操作。
《食品微生物学》实验教学大纲 课程名称食品微生物学 课程编码1002527032 课程类别专业课 所属学科预防医学（食品卫生） 实验总学时40 开课学期春季 开课单位流行病教研室 一．制定实验教学大纲的依据 依据郑州粮食学院教材《食品微生物学》教学大纲自编。 二．本课程实验教学在人材培养实验能力中的地位和作用 本课程实验教学可使学生掌握食品中微生物的各项检测技术，是应用性较强的重要的实验课程。通过实验课的学习，可使学生为将来所从事的食品卫生检测和食品卫生监督奠定牢固的基础。 三．本课程实验教学应达到的基本要求 ⒈掌握常用培养基配制技术，了解各种消毒灭菌方法。 ⒉掌握食品中细菌活菌计数方法及原则。 ⒊掌握食品卫生指标菌检测技术。 ⒋熟悉各种食品检样的采样方法。 ⒌掌握食品检样中致病菌或条件致病菌的检测方法。 四．学时、教学文件及教学形式 学时总学时80学时，实验教学40学时，实验教学占总学时的50%。 教学文件郑州粮食学院主编《食品微生物学》教材自编实习指导。实验报告学生自拟 教学形式验证性实验 五．实验成绩评定 实验成绩占本门课程10%，现场考核实际操作能力
六．实验项目、适用专业及学时分配 序号实验项目学时适用专业（食品卫 生方向） 1 食品中（饮料、牛 奶等）菌落总数的测定4 必修 2 食品中（饮料、牛 奶等）大肠菌群的测定6 必修 3 食品中沙门菌的 检验 6 必修 4 食品中副溶血弧 菌的检验 8 必修 5 食品中蜡样芽胞 杆菌的检验 8 必修6 食品中常见产毒 霉菌的检验 8 必修
卫生微生物实验室实验教学项目表 课程名称：食品微生物学 课程编码：1002527032 实验课开课学期：春季学期 开课单位：公共卫生学院流行病学教研室 实验依据：专业自编教学大纲 成绩考核：考试 实验项目的内容及要求：
微生物学实验报告 (格式标准) (生命科学专业) 教师:黎勇 目录索引 实验一油镜的使用与细菌的简单染色法 3 实验二细菌的革氏染色与芽孢染色 5 实验三常用培养基的配制7 实验四酵母菌霉菌的形态结构观察及酵母死活细胞的鉴别8 实验五、微生物大小的测定与显微计数10 实验六环境中微生物的检测与分离纯化11 实验七细菌鉴定中常用的生理生化反应12 实验八(综合实验)化能异养微生物的分离与纯化13 课程名称: 微生物学实验班级:化生系生命科学本科 实验日期: 指导教师:黎勇 实验一油镜的使用与细菌的简单染色法 〔目的要求〕学习并熟练掌握油镜的使用技术;观察细菌的基本形态;学习观察细菌的运动性的基本方法。 〔基本原理〕 1、 N·A=n·sinα 2、 D=λ/2N、A 3、目镜可提高放大倍数,但有效放大率取决于镜口率。已经分辨的物体不放大瞧不清,未分辨物放得再大也瞧不清。 4、用悬滴法或凹玻片法观察细菌的运动性时,可以通过真运动能定向地由一处快速运动来区别于颗粒的布朗运动。 〔器材用具〕显微镜、载玻片、凹玻片、盖玻片、接种环、香柏油、二甲苯、凡士林、吸水纸、擦镜纸;细菌、放线菌等固定装片;培养18小时左右的B、subtilis、 S、arueus 菌斜面培养物;无菌水、生理盐水。 〔方法步骤〕: (一) 油镜的使用 镜检装片在中倍(或高倍镜)下找到目的物,并使位于视野正中聚光镜上升到最高位置,虹彩光圈开到最大,镜头转开成八字形在玻片的镜检部位(光斑处)滴一滴香柏油油镜转入正下方侧视小心上升载物台(缩短镜头与装片距离,镜头浸入油中,至油圈不扩大为止镜头几与装片接触) 粗调器徐徐下降载物台(密切注视视野,当捕捉到物像时,立即用细调器校正) 仔细观察并绘图 取出装片,清洗油镜:擦镜纸拭去镜头上的香柏油擦镜纸沾少许二甲苯擦去残留(用手指辅助,迅速拭擦一、二次) 用清洁擦镜纸仔细擦干二甲苯(2-3次)。 (二) 细菌的简单染色法:涂片干燥火焰固定染色水洗干燥油镜观察 (三) 细菌运动性的观察取洁净盖玻片,四周涂上凡士林滴加一小滴菌悬液凹玻片的凹窝向下盖于盖玻片上翻转观察 〔结果分析〕 1、画一圆圈表示视野,选取所观察的微生物绘图,注意特殊结构、形状与排列。(描绘时按视野实际大小5－10倍绘制)
微生物检验定义：应用微生物学的理论与方法，研究外界环境和食品中微生物的种类、数量、性质、活动规律及其对人和动物健康的影响。特点：研究对象及范围广，涉及学科多样，实用性及应用性强，采用标准化。目的：为生产出安全、卫生、符合标准的食品提供科学依据。意义：是衡量食品卫生质量的重要指标之一，也是判定被检食品能否食用的科学依据之一。判断食品加工环境及食品卫生情况，能够对食品被细菌污染的程度作出正确的评价，为各项卫生管理工作提供科学依据，提供传染病和人类、动物的食物中毒的防治措施。以贯彻“预防为主”的卫生方针，可以有效地防止或者减少食物中毒和人畜共患病的发生，保障人民的身体健康；同时，它对提高产品质量，避免经济损失，保证出口等方面具有政治上和经济上的重大意义。检验的主要内容：生产环境、原辅料、加工运输、储藏、销售过程、成品。微生物指标：菌落总数、大肠菌群、致病菌。菌落总数定义：食品检样经过处理，在一定条件下培养后(如培基、温度、时间、pH、需氧性质等)所得1mL(g)检样中形成微生物菌落的总数。只包括一群在平板技术琼脂上生长发育的嗜中温需氧或兼性厌氧菌的菌落总数。菌落总数不等于细菌总数。菌落：单个微生物在适宜固体培养基表面或内部生长繁殖到一定程度，形成肉眼可见有一定细菌群落。意义：是判断食品卫生质量的是判断食品卫生质量的重要依据之一。反应食品新鲜度、被细菌污染程度、生产过程中是否变质、食品生产的一般卫生状况。多于10万个，足以引起食物中毒；人的感官能察觉食品因细菌的繁殖而发生变质时，细菌数约已达到106-107CFU/g (mL或cm2)。食品中菌落总数的测定对评定食品的新鲜度和卫生质量起一定的卫生指标作用，但还必须配合大肠菌群和病原菌项目的检验。菌落总数的测定方法GB/T 4789.2-2010：平板计数琼脂培养基、磷酸缓冲溶液、无菌生理盐水。菌落总数计算方法：N=ΣC/(n1+0.1n2)d。ΣC—所有符合计数要求的平板菌落数之和；n1—较低稀释度有效平板数；n2—较高稀释度有效平板数；d—较低稀释度的稀释倍数。致病菌：海产品以副溶血性弧菌；蛋与蛋制品以沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、变形杆菌；米、面类食品以蜡样芽胞杆菌、变形杆菌、霉菌；罐头食品以耐热性芽胞菌。指示菌定义：又称指标菌，是常规安全卫生监测中，可以用以指示检验样品卫生状况及安全性的指示性微生物。三种类型：第一类为了评价被检样品的一般卫生质量、污染程度以及安全性，最常用的是菌落总数、霉菌和酵母菌数；第二类粪便指标菌主要是大肠；第三类其他指示菌。微生物检验的发展：致病菌检测阶段、指示菌检测阶段、微生态制剂检测阶段(主要菌株的特性和数量成了20世纪末食品微生物检测重要内容)、现代基因工程菌和尚未能培养菌的检测。检验技术基础知识：美国食品及药物管理局(FDA)实验室操作规范(GLP)：实验室管理、人员管理、标准操作(SOP)、监督体制。原则：安全、质量、快速、可操作、经济。无菌室熏蒸消毒主要采用甲醛熏蒸消毒法：加热熏蒸、氧化熏蒸。无菌程度测定：平板法检验的一般程序：样品采集→1.样品保存→样品处理→菌落总数、大肠；2.选择参考菌群→检验前准备→致病菌→分离培养/增菌后分离培养→纯化→染色镜检、生化试验、血清学试验、动物实验；3.结果报告。采样的目的和意义：便于食品卫生质量监督管理；鉴别食品中是否存在有毒有害物质；为新产品、新资源利用、新食品化工产品、新工艺投产前进行卫生鉴定。样品种类：大样，一整批；中样，混合样200g；小样，即检样25g。采样步骤：调查、现场观察、确定采样方案、样品封存、开具采样证明。采样要求：严格遵守操作规程；样品要具有代表性；防止污染，防止变质、损坏、丢失；不得加入防腐剂、固定剂；要两人以上参加。取样方案：国际食品微生物学规范委员会(ICMSF)取样方案；美国FDA微生物学取样方案；世界粮农组织(FAO)取样方案；其他方案。ICMSF的取样方案：包括二级法及三级法，二级法只设有n、c及m值，三级法则有n、c、m及M值。M即附加条件后判定合格的菌数限量。原则：各种微生物本身对人的危害程度各有不同；食品经不同条件处理后，危害度变化情况：①降低危害度；②危害度未变；③增加危害度，来设定抽样方案并规定其不同采样数。I类危害：老人和婴幼儿食品及在食用前可能会增加危害的食品；Ⅱ类危害：立即食用的食品，在食用前危害基本不变；Ⅲ类危害：食用前经加热处理，危害减小的食品。 将检验指标对食品卫生的重要程度分成一般、中等和严重三档。n：系指同一批次产品应采集的样品件数；c：最大可允许超出m值的样品数；m：微生物指标可接受水平的限量值；M：微生物指标的最高安全限量值。二级抽样方案：只设合格判定标准m值，超过m值的，则为不合格品。美国FDA的取样方案：与ICMSF的取样方案基本一致，不同点的是严重指标菌所取的样品分别混合，混合的样品量最大不超过375g。样品的处理方法：液体样品；固体样品：捣碎均质法、剪碎振摇法、研磨法、整粒振摇法、胃蠕动均质法；冷冻样品。送检要求：快速运送不能超过3小时；路途远可在1~5℃低温运送；放污染、散漏、变质；填写检验申请单。样品的保留：阴性样品在发出报告可及时处理；阳性样品：在发出报告以后3天才能处理样品；进口食品的阳性样品：保留6个月才能处理。微生物检验不进行复检。 第三章、食品微生物检验基础 细菌学检验基础一、无菌技术：指在微生物实验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施。二、微生物的接种与分离技术：接种：将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。分离：倾注平板法、涂布平板法、平板划线法三、细菌的培养方法：温度和气体。方法：需氧培养法(需氧菌及兼性厌氧菌)；CO2培养法(布鲁杆菌、溶血链球菌等)；厌氧培养法四、细菌的生长现象：(一)固体培养基：营养琼脂平板(菌落透明度，形状，菌落大小，表面性质，边缘情况，颜色，质地，粘度，乳化性)鉴定培养基：①血平板：α溶血：在菌落周围出现狭窄的草绿色的半透明区域，而红细胞外形完整。β溶血：在菌落周围出现一个大小不一的完全透明清楚的宽带。γ溶血：看不到溶血带的溶血。双环：菌落周围完全溶解的晕圈外有一部分溶血的圆圈。②卵