006111 7 栏目中药药物评价>>非临床安全性和有效性评价 标题银屑病药效学动物模型及其在中药新药研究中应用的思考 作者韩玲 部门 正文内容 审评一部韩玲 摘要：本文综述了银屑病药效学动物模型的进展，对治疗银屑病中药新药 药效学研究方面存在的问题进行了分析，提出了应结合银屑病发病机制的 研究进展完善药效学方法学研究的建议。 银屑病是一种慢性复发性皮肤病，其发病机制复杂，至今尚未明了。可能是一种具有基因遗传特性的疾病，也与感染、内分泌机能障碍、免疫功 能紊乱等有关。中医学认为以风湿毒邪内侵为标，血虚、血燥为根源，血 热、血虚、血瘀是本病的基本病机，故清热解毒、凉血、活血化瘀、祛风 除湿成为治疗本病的基本法。 银屑病的组织病理学主要表现为角质形成细胞过度增生、炎症细胞聚集和真皮乳头部血管增生扩张三大特征，从而出现角化过度、角化不全、颗 粒层消失、棘细胞层增厚等。尽管许多不同的动物模型能复制银屑病的某 个方面的病理特征，并能解释部分病因，但长期以来仍缺乏一种能够研究 所有有关的潜在因素的动物模型。即-缺乏理想的动物模型。 一、银屑病药效学动物模型 银屑病动物模型是根据银屑病的特征，人为建立的一种与之相似的模型。 有人总结了银屑病动物模型的建立过程，包括以下4个不断完善的阶段： 1．诱发性动物模型 该模型是通过工方法在动物，如豚鼠、大鼠等皮肤上诱发银屑病样增生。
其方法包括紫外线照射、化学刺激剂外涂或药物外涂、缺乏必须脂肪酸的饲料喂养等。这些方法均为过度增殖模型，可引起表皮增生加快。但这些方法仅是针对表皮损伤的一种迟发反应，持续时间较短。 如缺乏必须脂肪酸饲料喂养的大鼠模型，因缺乏必须脂肪酸，故可使大鼠皮肤逐渐出现角化过度、棘层肥厚、基底细胞有丝分裂加快，DNA合成增加等变化，表皮细胞呈慢性增生状态，与药物诱发的急性表皮增生相比，其与银屑病更为相似。 如心得安诱导银屑病动物模型，是利用心得安特有的药理作用，即心得安可阻断角阮细胞的β-肾上腺能受体而降低了细胞内cAMP水平所致。应用后可出现动物表皮角化过度、角化不全和棘层肥厚等类似银屑病的组织病理改变，其皮损并非是刺激性皮炎。黄畋[1]和Gaylarde[2]等分别用心得安成功地在豚鼠背部和耳部皮肤上制备了银屑病样皮肤模型，并发现药物可抑制其所致的表皮异常角化与增殖、角化不全等。 已有研究[3-4]发现IL-20是与银屑病密切相关的细胞因子，在体外可明显促进角质形成细胞增殖；IL-20的转基因鼠可出现皮损，其组织病理学改变与人类银屑病有相似之处；此外，IL-20受体在银屑病皮损处有高表达。有人在心得安造模的基础上，利用原位杂交等方法检测了动物皮损中IL-20 及角蛋白的K14,K16，K17表达水平的变化情况，发现正常皮肤IL-20的表达仅限于基底层，且为低表达，但模型动物皮损中基底层及棘层均有高表达，且显著高于正常组。应用IL-20反义寡核苷酸外涂皮肤后，可使其明显好转。也观察到皮损中角蛋白K14,K16表达水平明显增高。提示心得安所致的豚鼠银屑病样动物模型不仅在组织病理学，而且在分子水平上与人类银屑病皮损一致。从而在分子水平上证实了此动物模型的可行性。 上述这些方法的优点是可在短时间内复制出某些方面与银屑病相似的动物模型，方法简便、易行、重复性较好，可用于表皮增殖动力学、药物筛选等研究，但这些模型只是模拟了银屑病中的部分组织病理特征，在许多方面与诱发或自然产生的疾病毕竟存在差异。 2．裸鼠-皮损移植模型 该模型是将银屑病人皮损组织移植到裸鼠背部。其具体方法是，选择经组织学证实，2周内未经任何治疗的寻常型银屑病患者的典型皮损，麻醉后取全层皮肤，裸鼠背部麻醉后切除部分圆形皮肤至肌肉筋膜，将皮损间段缝合到移植点。因裸鼠是先天性无胸腺小鼠，其免疫缺陷，在一定情况
免疫细胞的观察与小鼠脾脏淋巴细胞的提取 一、实验目的 1、明确各免疫器官分布与形态结构，能熟练找到各免疫器官，弄清中枢免疫器官与外周免疫器官的区别与联系。 2、掌握密度梯度离心法分离小鼠脾脏淋巴细胞的方法，熟悉脾脏淋巴细胞的形态与功能。 二、实验原理 脾脏是外周免疫器官之一，是人体最大的淋巴器官。它生在腹腔左上方，质地比较脆，容易外伤。一般来讲，脾脏有三大功能： 首先它是人体的“血库”，当人体休息、安静时，它贮存血液，当处于运动、失血、缺氧等应激状态时，它又将血液排送到血循环中，以增加血容量； 其次，脾脏犹如一台“过滤器”，当血液中出现病菌、抗原、异物、原虫时，脾脏中的巨噬细胞、淋巴细胞就会将其吃掉； 此外，脾脏还可以制造免疫球蛋白、补体等免疫物质，发挥免疫作用。脾是血循环中重要的滤过器，能清除血液中的异物、病菌以及衰老死亡的细胞，特别是红细胞和血小板。因此，脾功能亢进时可能会引起红细胞及血小板的减少。脾脏还有产生淋巴细胞的功能。 我们利用小鼠来观察脾脏的淋巴细胞。 小鼠淋巴细胞的比重为1.088，利用比重为1.088的淋巴细胞分离液，将脾细胞悬液置于分离液上层，通过梯度离心的方法，在分离液与脾细胞悬液交界液面处分离得到脾脏淋巴细胞。 三、实验器材 KM种小鼠，PBS缓冲液，淋巴细胞分离液，200目不锈钢网，解剖器械 四、实验步骤 1、杀死老鼠，取出小鼠的脾脏，在pbs缓冲液中冲洗干净。 2、将小鼠脾脏至于200目铜网中，铜网绑定在烧杯上面，剪碎、碾磨，边碾磨边加PBS 冲洗，制得脾细胞悬液。 3、将制得的脾细胞悬液转移到10ml的离心管中，1000r/min 5min离心洗涤，倒掉上清，加入5mlPBS再离心洗涤一次。 4、加入5mlPBS将洗涤的脾脏细胞吹散、悬浮，缓慢加入淋巴细胞分离液上层，细胞悬液与分离液体体积比为1:1。 5、2000r/min离心30min。 6、小心吸取中间层细胞，1000r/min 5min离心洗涤两次。 7、将制得的淋巴细胞滴于玻片，镜检。
氧化苦参碱对银屑病样小鼠模型氧化应 激的拮抗作用 (作者：___________ 单位： __________ 邮编：____________) 【摘要】目的研究氧化苦参碱对银屑病样小鼠模型氧化应激的拮抗作用，探讨其防治银屑病的机制。方法采用注射雌激素刺 激小鼠阴道上皮组织增生的方法复制银屑病小鼠动物模型，同时给予 不同剂量的氧化苦参碱干预，实验10d后，取小鼠血清测定超氧化物歧化酶(SOD)总抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)谷光甘肽(GSH) 及一氧化氮(NO)水平的含量，并观察氧化苦参碱对小鼠阴道上皮细胞有丝分裂的影响。结果氧化苦参碱80、40和20mg? kg-1均可抑制小鼠阴道上皮的有丝分裂(P0.01);氧化苦参碱80mg - kg-1可升高雌激素周期小鼠血清SOD和T-AOC的含量(P0.05，P0.01)，降低MDA GSH和NC含量(P0.01);氧化苦参碱40mg?kg-1可降低雌激素周期小鼠血清MDA和NC 含量(P0.05，P0.01)。结论氧化苦参碱对实验性银屑病具有保护作用，该作用可能与其抑制表皮细胞增殖并降低血清 MDA GSH及NO含量，升高SOD和T-AOC的含量有关。 【关键词】氧化苦参碱；银屑病;有丝分裂指数；超氧化物歧化酶；丙
二醛;谷光甘肽 氧化苦参碱（Oxymatrine , OMT是苦豆子生物碱的一种，具有抗炎、抗增殖、改善机体免疫功能等作用［1］。银屑病（psoriasis）是一种以皮肤组织为主要病理改变的慢性炎症性皮肤病。近年来研究表明，银 屑病患者体内释放大量的超氧阴离子自由基，对生物膜的结构造成广 泛损伤，引起皮肤炎症的发生［2-3］。作者通过给小鼠注射己烯雌酚的方法复制银屑病样小鼠模型［4］，观察氧化苦参碱对银屑病小鼠血清超氧化物歧化酶（SOD）总抗氧化能力（T-AOC）、丙二醛（MDA）谷光甘肽（GSH）及一氧化氮（NO）水平及阴道上皮组织细胞有丝分裂的影响，探讨了其防治银屑病的机制。 1材料与方法 1.1实验材料 1.1.1实验动物昆明种雌性小鼠，体重18?22g，宁夏医科大 学实验动物中心提供，合格证SYXK （宁2005- 0001）。 1.1.2药品氧化苦参碱（宁夏制药厂，批号64041201）;甲氨蝶呤（Methotrexate ，MTX浙江海正药业股份有限公司，批号080903A）; 己烯雌酚（Diethylstilbestrol ，DES上海通用药业股份有限公司，批号090203）;秋水仙碱（Colchicin ，CLC昆明制药厂，批号841201）。 1.1.3 试剂和主要仪器SOD MDA GSH T-AOC和NO测试盒（南 京建成生物工程研究所，批号20091115）;752N紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）。
小鼠脾脏单个核细胞分离及细胞计数 实验时间：____________ 实验地点：_____________ 实验人：__________________ 1实验原理 小鼠脾脏位于上腹部左后侧，体积较大，长条形，属于外周免疫器官。 外周血中淋巴细胞可经再循环驻如脾脏等外周免疫器官的特定区域，所以富含各 类免疫细胞。 免疫细胞的分离：采用红细胞裂解法，是根据细胞对渗透压变化的敏感度。 红细胞由于细胞结构较为简单，仅有细胞膜结构，对于膨胀的耐受能力较差，因此绝大部分就会涨破，受到破坏。是一种比较温和的去除红细胞最简便易行的方法。 2实验材料： 1）健康小鼠 2）手术器械（剪刀、镊子）、解剖板 3）70汇醇 4）PBS缓冲液、红细胞裂解液（ACK 5）0.2%台盼蓝 6）细胞计数板、计数器 7）离心机 8）显微镜 3实验方法： 3.1取小鼠脾脏 将小鼠颈椎脱位处死，用酒精消毒。 用剪刀剪开背部皮肤，再找到脾脏，用镊子夹出脾脏并剪除周围组织。 3.2制备单个核细胞悬液
将取出的脾脏置于盛有3mlPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套中，用 针芯轻轻碾压使得单个核细胞悬浮于平皿中。 吸取平皿中细胞悬液置于刻度离心管（15ml）中，以1500rpm离心10min, 弃去上清液，加入ASK至2-3ml，轻轻吹打混匀并放置2min,以破坏红细胞。然后加入PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心10min。 弃去上清液，用PBS缓冲液定容至2ml，吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞悬液。3.3 计算细胞浓度 稀释十倍，随机选取一个大方格计数 细胞计数为324个，计算细胞浓度为324X 104X 10=3.24 X 107/ml 3.4 计算细胞活力 在总计为324个细胞中计数，死亡细胞有16 个，计算细胞活力为： 324- 16/324 X 100%=95.1% 在理论范围之内 4 实验结果 4.1 研磨脾脏得到细胞悬液 本实验中将小鼠的脾脏放入尼龙指套内，置于少量PBS液中缓慢研磨，获得细胞悬液。实验中，我们发现尼龙指套不能滤去所有结缔组织，操作中会有结为絮状团块的结缔组织。这些结缔组织在离心后会和细胞绞缠在一起，去除十分麻烦，而且会损失细胞。应该在离心之前尽早用吸管吹打后小心弃去（这样损失的细胞比较少，造成较小的误差）。 研磨脾脏时的力度、时间、温度都会影响细胞的活性。所以应置于冰上快速、轻柔地研磨，置于液体中避免干磨。我们在实验室室温下碾磨，造成细胞破碎较多，影响最终实验结果。 4.2 白细胞计数
发布日期20061110 栏目化药药物评价>>非临床安全性和有效性评价 标题银屑病药效学模型及结果评价-姚治孙涛 作者姚治孙涛 部门 正文内容审评三部姚治、孙涛 摘要：近来国内创新性的抗银屑病药物的申报呈上升趋势，但由于银屑病发病机制不完全清楚，现有药效学模型与 临床的相关性尚存在一定问题，给研究和评价带来一定困难。本文整理总结了现有的一些抗银屑病体内外药效学模 型和试验方法，并对其结果的评价价值做了一定探讨。希望对相关研究和评价提供参考。 关键词：银屑病、药效学、评价 银屑病是以表皮角质形成细胞过度增殖和分化不全、真皮浅层微血管扩张并伴有炎症反应为病理特征的表皮角化性皮肤病，其发病机制迄今尚未完全清楚。综合近年来的研究报道，关于银屑病发病的新概念认为：银屑病是多基 因遗传背景下T细胞失常的免疫性疾病，表皮过度增殖与分化异常和炎症等疾病现象涉及到细胞和分子水平的异常 调控，后者是指在银屑病中异常表达的免疫分子、细胞因子、炎症介质和调节分子。国外文献报导ET-1(内皮素1)、 sE-selectin（可溶性选择素E）、sIL-2R（可溶性白介素2受体）、IL-6（白介素6）、IL-8（白介素8）、CD4+/CD8+ 等与银屑病有关。 下面简要介绍一下几种与银屑病有关的体内外药效学试验模型及结果评价： 一、体内试验 表皮细胞增殖过快和角化不全是银屑病的基本病理特点，小鼠尾部鳞片的表皮缺乏颗粒层的形成，雌激素周期的小鼠阴道上皮细胞增殖活跃，上皮细胞转换加快，均与人银屑病表皮病理特征相似。药物如能抑制小鼠阴道上皮有 丝分裂和促进鼠尾颗粒层形成，就可能具有抗银屑病作用。下面两种方法是被广泛使用的较为经典的银屑病药效学 模型： 1、对小鼠阴道上皮细胞有丝分裂的影响试验 雌性小鼠预先注射雌激素（如乙烯雌酚）数日，使其处于雌激素生理周期。阴道给予药物数日，末次给药后腹腔注射秋水仙碱以终止细胞分裂。取小鼠阴道组织，固定，染色，观察阴道上皮细胞的有丝分裂指数。常以甲氨蝶呤 为阳性对照。 若试验结果表明药物有抑制阴道上皮细胞的有丝分裂的作用，则可提示对银屑病的疗效。 2、对小鼠尾鳞片表皮细胞生成的影响试验 取小鼠，将试验药物直接在尾部外涂给药一定时段(一般为2周)，取尾根部皮肤，固定，染色，测量鼠尾表皮厚度和颗粒形成情况。 若试验结果表明药物有促进鼠尾颗粒层形成作用，则可提示对银屑病的疗效。 3、对盐酸普奈洛尔所致豚鼠耳部皮肤银屑样皮损的影响 采用盐酸普奈洛尔乳剂型搽剂（5％）连续涂抹豚鼠两侧耳廓皮肤，每日2次，连续2周后取少量豚鼠的两侧耳廓皮肤，固定，染色，光镜观察评价造模质量。于耳廓皮肤涂抹给药，每日2次，连续2周。同法观察耳部皮肤的角 化层、颗粒层、棘细胞层、基底细胞层及固有层的变化情况，并测定表皮厚度。
顾名思义，肿瘤细胞免疫治疗就是调动人体强大的免疫系统来对抗癌症的治疗方法。那么，人体免疫系统有何强大之处?其对抗肿瘤的原理是什么呢?本期专题将对此做一个简单的解读。 人体免疫系统的基石是细胞，而人体本身就是由各种细胞组成的名副其实的细胞王国，在这个王国里，免疫系统是最忠实的守护神。它有着庞大的防御工事和数量众多的军队，这套防御系统成功地抵御了外敌的入侵，镇压了内部的叛变分子，如果没有他们的出色工作，细胞王国将不能正常运转，感染、癌症将会使这个王国覆灭。 细胞王国的防御工事中最重要的部分是皮肤，完整的皮肤保护了王国绝大多数的边境不受外敌侵犯，而在与外界相通的各个通商口岸，我们也是层层设防。我们口腔中的唾液，含有一种溶菌酶，可以高效地分解细菌;我们的胃酸几乎可以”酸死”食物中的绝大多数微生物，当然也会有漏网之鱼和对强酸有抵抗力的致病菌，如胃中的幽门螺旋杆菌可以在胃酸中闲庭信步(这家伙据科学家说是引起胃炎的祸首);我们的鼻毛虽然不雅，却交织成一张大网，兜住了大部分的灰尘和大点的细菌;呼吸道中覆盖的恶心的黏液可以粘住绝大多数的入侵者，然后通过擤鼻涕和吐痰将它们扫地出门(当然，还通过打喷嚏将敌人吹走)。 对付普通敌人，免疫细胞大军只需派出队伍里的基层士兵 以上说的是细胞王国的强大边境防线，虽然阵地工事建得是固若金汤，拒外来之敌于千里之外，但俗话说得好，”明枪易躲，暗箭难防”，对于出现在人体内部的敌人，如细菌、病毒，这道防线可以说是形同虚设。别忘了免疫系统还有着一支庞大而高效的军队(免疫细胞)，这支军队不仅数量超卓，而且种类繁多，士兵各司其职，战争来临时紧密联系、相互配合，拳头握在一起，把敌人打得落花流水。 免疫细胞大军大部分时间呆在血液中(它们就是我们常说的白细胞)，它们和负责传送氧气的红细胞、负责止血的血小板都来源于骨髓造血干细胞。如果细胞王国安定团结，这些造血干细胞就大多会成长为红细胞，负责传送氧气，只保持一小部分的白细胞维持战斗力;如果细胞王国面临外敌入侵，那骨髓就马上开足马力大量生成造血干细胞，而且这些”儿童”大部分会成长为战士，白细胞数量在短期内大增，全国进入备战状态。 对付普通敌人(如异物、细菌)，免疫细胞大军只需派出队伍里的基层士兵即可搞定，比如中性粒细胞一般与细菌死磕，多数与细菌同归于尽，我们伤口化脓感染的脓液，其实主要就由中性粒细胞的尸体组成。巨噬细胞可将来犯之敌一口吞掉，并将敌人的情报上报上级，这样下次再看到同样的敌人就可以直接消灭。再难对付点的敌人可以由B细胞产生的抗体来消灭，这些抗体像精确制导的”导弹”一样一对一的消灭敌人，极为高效。 对付狡诈多变、凶残暴戾的癌细胞则需要出动精英部队
【引文格式】黄钟洲，陈小彦，徐敏，等．咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠模型的组织学及免疫学特征初步探究［J］．皮肤性病诊疗学杂志，2019，26（2）：61－66．DOI：10．3969/j．issn．1674－8468．2019．02．001． 通信作者：郭庆，E-mail：guoqingzsy@163．com ·论著· 咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠模型的组织学及免疫学特征初步探究 黄钟洲，陈小彦，徐敏，艾雪忱，唐增奇，郭庆 （中山大学孙逸仙纪念医院皮肤科，广东广州510120） ［摘要］目的：研究咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠模型的皮肤组织学及免疫学特征。方法：将20只BALB/c小鼠随机分为造模组和对照组，每组10只。所有小鼠背部剃毛后，造模组小鼠于背部皮肤及单侧耳部每日涂抹共计62.5mg的5%咪喹莫特乳膏1次，连续7d，空白组小鼠涂抹等量凡士林。每日记录小鼠PASI评分及耳部厚度，并于末次涂药24h后处死，取背部皮肤进行多聚甲醛固定，行HE 染色及Ki-67免疫组化分析。取脾脏称重，以流式细胞术检测脾脏中的Th细胞亚群。结果：造模组小鼠于第二天逐渐出现红斑、鳞屑、皮肤增厚及耳部肿胀，其PASI评分随造模时间延长而增加。造模组小鼠皮损出现银屑病样病理改变，其表皮厚度明显增加（t=15.12，P＜0.001），且Ki-67阳性率明显上升，每个高倍镜视野下阳性细胞数目明显增加（t=10.50，P＜0．001）。造模组小鼠脾脏重量和细胞计数较对照组明显增加，且Th1、Th17细胞亚群的比例及绝对计数较对照组明显上升（P值均＜0.05），Th2细胞比例及计数无明显变化（P值均＞0．05）。结论：咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠模型可较好地模拟寻常型银屑病的临床、组织病理和免疫学特征，是一种有效的银屑病模型。 ［关键词］银屑病动物模型；咪喹莫特；Ki-67；Th1细胞；Th17细胞 ［中图分类号］Ｒ758.63［文献标识码］A DOI：10．3969/j．issn．1674－8468．2019．02．001 Histopathologic and immunological features of Imiquimod induced psoriatic mouse model HUANG Zhong-zhou，CHEN Xiao-yan，XU Min，AI Xue-chen，TANG Zeng-qi，GUO Qing （Department of Dermatology，Sun Yat-sen Memorial Hospital，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510120，China） Corresponding author：GUO Qing，E-mail：guoqingzsy@163．com ［Abstract］Objective：To investigate the dermatopathologic and immunological features of Imi-quimod induced psoriatic mice model．Methods：Twenty BALB/c mice were grouped in IMQ-mod-el group and control group randomly，each had10mice．The IMQ-model mice received a daily top-ical dose of62.5mg of IMQ cream（5%）on the shaved back and left ear for7consecutive days．The control group mice were treated similarly with vaseline．The Psoriasis Area and Severity Index score and thickness of left ear were measured daily．The dorsal skin samples were evaluated using H＆E section and immunohistochemistry test of Ki-67．The spleens were weighed and the spleno-cyte were counted．Flow cytometry was used for detection of T-helper-cell subsets．Ｒesults：Ery-thema，scaling，skin thickening and ear swelling appeared on day2and deteriorated gradually．The cumulative score kept increasing by day7．Histologically，the skin of IMQ-model mice showed 16 皮肤性病诊疗学杂志2019年4月第26卷第2期
小鼠免疫 免疫是单抗制备过程中的重要环节之一。即用目的抗原免疫小鼠，抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B 淋巴细胞。 一、血清效价的影响因素 小鼠免疫效价的高低直接影响单抗的制备。单抗免疫程序不同，包括免疫用的动物，抗原的性质、抗原量、免疫途径、免疫间隔时间、是否应用佐剂均会影响免疫效果。 二、免疫材料 1．免疫用的动物 抗原与免疫动物种属差异越远越好，小鼠、大鼠、亚美尼亚仓鼠和兔中分离的淋巴细胞的杂交瘤技术已经很成熟。小鼠是极好的免疫接种对象，原因是：1）小鼠易操作；2）多个纯系株易得到且价格合理；3）有很多试剂可用以检测鼠源免疫球蛋白；4）小鼠对外来蛋白质能产生良好的免疫应答；5）小鼠淋巴细胞能够和多种鼠源骨髓瘤细胞系发生有效融合。 2．免疫原（抗原） 颗粒性抗原：颗粒性抗原免疫原性强，如肿瘤细胞、淋巴细胞、?细菌等可作为抗原，不加佐剂直接进行免疫，就可获得较好的免疫效果。 可溶性抗原：因其免疫原性较弱，一般要加佐剂，如系半抗原，?应先制备成人工免疫原，再加佐剂。 免疫原的形式会影响宿主体液免疫产生的抗体谱，因此选择免疫原制备抗体时应该考虑到所制备抗体的最终用途，并应该根据其用途决定何种方法筛选抗体
更合适。一般认为，影响免疫血清中lg亚类谱的因素主要包括免疫原、接种途径、佐剂和动物遗传背景等。且主要由初次基础免疫所决定，加强免疫的作用主要是提高特异性抗体的滴度。 3．佐剂 目的：1）增强抗原对机体的免疫原性；2）增强抗体的产生能力；3）为制备出高效价的免疫血清；4）增强可溶性抗原的免疫原性；5）在某种情况下，改变Ag免疫应答类型；6）延长抗原在免疫动物的时间；7）改变抗原的分布；8）增强共刺激信号和激活免疫系统而刺激淋巴细胞增殖。 种类：氢氧化铝佐剂、明矾佐剂（常用于肌肉、皮下注射）、弗氏佐剂。 弗氏佐剂是最主要的免疫佐剂，热处理杀死的分歧杆菌可以引起炎症反应，募集淋巴细胞到抗原沉积部位，但若重复刺激可导致肉芽肿的形成，故不能重复使用。 三、免疫策略 1．免疫途径 途径的选择取决于抗原的生物学特性和理化特性。有静脉注射、腹腔注射、肌肉注射、皮内注射、脾内注射、皮下注射、淋巴结注射等。 脾内免疫会产生IgM 类抗体，分泌该类抗体的杂交瘤细胞株相对IgG 类较不稳定，且IgM 类抗体的一些性质测定会有困难，一般不建议使用。脾内免疫操作困难，实验动物极易死亡，所以也不常用此种方法。 一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射0.1ml左右。 2．免疫方案 典型的免疫策略依赖于抗原的反复刺激，以增强特异性免疫应答并使其成熟。
#免疫学技术与方法# 人源化S CI D小鼠模型的建立及其鉴定① 席泓周桓朱一蓓戴继鸿於葛华胡玉敏张学光(苏州大学医学生物技术研究所,苏州215007) 中国图书分类号R392111文献标识码A文章编号1000-484X(2006)05-0459-04 [摘要]目的:探讨在SCID小鼠体内移植人免疫细胞,建立人源化SCID小鼠模型及其特性鉴定。方法:SCID小鼠腹腔注射环磷酰胺(CTX)抑制骨髓造血,连续4天后,通过腹腔注射移植人外周血单个核细胞(PB M C)。4、8和12周后分别取小鼠外周血、脾脏、肝脏。荧光显微镜下观察SC ID小鼠外周血中人CD3+、CD19+细胞;流式细胞仪测定全血中人CD3+、CD19+细胞百分率;免疫组织化学分析SC I D小鼠肝脏和脾脏中人CD3+、CD19+细胞;EL IS A检测SC I D小鼠血清中人免疫球蛋白含量。结果:(1)SCID小鼠移植人外周血单个核细胞4、8和12周后在小鼠外周血中通过荧光显微镜下可观察到人CD3+、CD19+细胞,4周后流式细胞仪测得小鼠外周血单个核细胞中人CD19+、CD3+细胞百分率分别为1016%、3117%;(2)免疫组织化学结果显示在小鼠脾脏中存在人CD3+、CD19+细胞;(3)移植人外周血单个核细胞4、8和12周后EL IS A测得小鼠血清中人免疫球蛋白的含量分别为390、1100和1040L g/m l。结论:成功地在SCID小鼠体内建立了人免疫系统。 [关键词]SCID;免疫系统;外周血单个核细胞;淋巴细胞 E stablish m ent and i dentificati on of hu manized S C I D m ouse m odel X I H ong,Z HOUH uan,Z H U Yi-B ei,DAI J i-H ong,YU G e-H ua,H U Yu-M i n,Z HANG X ue-Guang.B iotechnolo gy Institute of Suzhou University,Suzhou215007,China [Abstract]O bjective:T o establi sh and i den tif y hu m an ized-SCID m ouse model(hu-SC I D).M e thods:SCID mouse w as treated by CTX t o i nh i b i t the he m ocytopo iesis.W ith successi ve4-day i n j ection,hu m an periphera l b l ood m ononuc l ea r ce lls(PB M C)w ere en-g ra fted i n t o SC I D mouse t hrough i ntraper itonea l i n jecti on.A fter4,8and12w eeks of eng ra ft m ent,per i pheral blood,spleen and liver ti ssues of eng rafted SC I D m ouse w ere harvested.H u m an CD3+,CD19+ce lls i n periphera l blood w ere ana l y zed by i n florescence m-i croscopy and FC M,hu m an CD3+,CD19+cells i n sp l een and li ver tiss ues w ere observed by i m m une hist o che m i stry,and human Ig G level i n SCID m ouse serum w as m easured by EL ISA.Resu lts:A fter eng raft m ent of4,8and12w eeks,hu m an CD3+,CD19+ce lls in SC I D pe ri phe ra l b l ood w ere i den tified by i nflorescence m icroscopy and the percents w ere31%and10%respecti ve l y by FC M analysis. A nd t hese ce lls cou l d be ev i denced a fter12w eeks l a ter.T hrough i m m une h istochem istry hu m an CD3+、CD19+ce lls w ere detected in m ouse spleen but not i n li ver tissue.F urt her m ore the ti te r of hu m an IgG i n mouse se ru m w as390,1100and1040L g/m l a t each ti m e po i nt respecti ve l y.Con clusion:O ur exper i m enta l res u lts de m onstrated that a bona fide hu m anized SC I D m ode lw as establi shed. [K ey words]SC I D;I mm une syste m;PB M C;l ymphocyte SC I D小鼠即重症联合免疫缺陷综合症(Severe co m b i n ed i m m une defic ient d isease)小鼠,1983年由美国学者Bos m a首先发现于C.B-17近交系的小鼠,是由于位于16染色体的单个隐性突变基因所致[1]。纯合SC I D基因突变导致淋巴细胞抗原受体基因VDJ编码顺序的重组酶活性异常,造成T、B淋巴细胞不能分化成功能性淋巴细胞。SC I D小鼠的所有T和B淋巴细胞功能测试均为阴性,对外源性抗原无细胞免疫及体液免疫应答,体内缺乏携带前 ①本课题为国家自然基金重点项目(30330540)和江苏省临床免疫 学重点实验室基金资助项目 作者简介:席泓(1973年-),女,博士; 指导教师及通讯作者:张学光(1951年-),男,教授,博士生导师,主 要从事肿瘤免疫研究,E-m ai:l s mbxu egz@pub- li c1.s https://www.doczj.com/doc/d113343807.html,。B细胞、B细胞和T细胞表面标志的细胞。但是,其非淋巴性造血细胞分化不受突变基因的影响,巨噬细胞、粒细胞、巨核细胞和红细胞等在数量和功能上均呈正常状态。鉴此SC I D小鼠缺乏免疫系统从而为免疫学研究提供了一个独特的动物模型,在移植免疫、自身免疫、感染性疾病、肿瘤免疫、肿瘤治疗的研究以及人源化单克隆抗体的研制中得到广泛应用[2-9]。本实验旨在SC I D体内建立人的免疫系统即人源化SC I D(hu m anized SC I D,hu-SI CD)小鼠模型,并对其免疫生物学特性进行初步的探讨。 1材料与方法 111动物SC I D小鼠,雌性,6~8周龄,购自中科院上海实验动物中心。于苏州大学生命科学院动物中心SPF实验室独立送风柜中(C I V-Ⅱ,苏州市冯氏实验动物设备有限公司)无菌饲养。对小鼠的实
勘误 DOI:10.13232/https://www.doczj.com/doc/d113343807.html,ki.jnju.2018.05.015 雷公藤内酯醇改善IMQ诱导的银屑病样小鼠模型症状的初步探究 南京大学学报，2018, 54(5), 992-1000 The symptomatic improvement of IMQ-induced psoriasiform mouse model after the treatment with triptolide Journal of Nanjing University, 2018, 54(5), 992-1000 图5 Triptolide抑制TNF-α和IL-17A的表达 A: IHC染色检测TNF- α和IL-17A表达水平（200X）。B: RT-PCR检测TNF- α的表达水平。C: RT-PCR检测IL-17A的表达水平( ***P < 0.001, **P < 0.01, *P < 0.05,mean ± SEM; n = 5) Fig.5 Triptolide inhibit the expression level of TNF- α and IL-17A A: IHC stain detect the expression level of TNF- α and IL-17A(200X). B: RT-PCR detect the mRNA expression level of TNF-α. C: RT-PCR detect the mRNA expression level of IL-17A ( ***P < 0.001, **P < 0.01, *P < 0.05,mean ± SEM; n = 5)
小鼠巨噬细胞功能的检测 伍国强 （兰州大学草业学院兰州730020） 摘要：本实验用CFA免疫小鼠后，检测小鼠腹腔巨噬细胞的数目以及用中性红检测巨噬细胞的吞噬能力。结果表明，免疫小鼠的腹腔巨噬细胞的数目和吞噬能力均有所提高。 关键词：巨噬细胞；功能；检测 1 前言 巨噬细胞是一种多功能免疫细胞,在机体的特异性和非特异性免疫反应中发挥重要功能。主要作用有：（1）吞噬杀伤作用：直接吞噬、调理吞噬作用。（2）抗原提呈作用：即外来的抗原性异物通过巨噬细胞的捕获、加工和处理后，与胞内合成的MHC-1/II类分子形成抗原肽－MHC分子复合物，并被呈递到细胞膜表面，被TCR 识别的作用。具有此作用的细胞叫抗原呈递细胞（antigen presenting cell,APC)。此外，巨噬细胞表面还表达多种共刺激分子，如B7、ICAM-1、LFA-1,3等分别与T细胞上的CD28、LFA -1(CD11)、LFA-2(CD2)等相互作用，为T细胞的活化提供第二信号。（3）抗肿瘤作用：Mφ被某些细胞因子如IFN-γ激活后能有效杀伤肿瘤等靶细胞，其吞噬杀菌能力也显著提高。（4）分泌生物活性介质，产生免疫应答和其它免疫效应：如 IL-1,12、IFN、TNF、PGE等;以及某些补体成份和凝血因子、组织修复因子等。为了检测巨噬细胞的吞噬功能，我们用CFA免疫的小白鼠作为实验材料检测其腹腔巨噬细胞吞噬中性红的作用。 2 材料与方法 2．1 材料 2．1．1 药品：生理盐水、0.6%环磷酰胺、Hank’s溶液、1640培养基、细胞裂解液、中性红等。 2．1．2 仪器：血球计数板、细胞培养箱、分光光度计等。 2．1．3 动物：小白鼠2只，由兰大医学院动物实验中心提供。 2.2、方法 2．2．1 小鼠腹腔巨噬细胞制备取小白鼠2只，分为对照组和实验组，对照组注射0.1ml生理盐水，试验组注射0.1mlcFA。48小时后，小鼠眼眶放血，断颈处死。腹腔注射3ml预冷的生理盐水。吸取腹腔渗出液5ml离心管（冰浴）。1600rpm离心10 分钟，弃上清，4℃生理盐水定容至5ml。血球计数板镜下巨噬细胞计数。用生理盐水调mΦ浓度为1×106，取4ml 1600rpm 离心10分钟，弃上清加4ml 1640定悬。将mΦ加入24孔板，每组4孔，每孔1ml。37℃，5%CO2细胞培养箱贴壁培养纯化2小时。2．2．2 巨噬细胞吞噬中性红试验将贴壁纯化好的mΦ弃1640培养液，对照孔加0.5ml生理盐水，其余每孔加0.5ml0.075%中性红,继续培养1小时。倾去上清液,用温PBS 洗细胞3 次,每孔加入细胞溶解液(为体积分数50 %的乙酸和体积分数50 %的无水乙醇) 2ml ,室温下放置30分钟,待细胞溶解后,即用分光光度计测定OD值。以OD 值表示巨噬细胞功能的强弱。 3 结果与讨论表：mΦ的浓度及吸光值 mΦ细胞个数mΦ浓度 （个/ml) 0D值 对照组256 6.4×105 0.252 试验组2176 5.44×106 0.283 3．1 免疫小鼠腹腔巨噬细胞浓度从上表可以看出，用cFA免疫的小鼠腹腔巨噬
2008年2月 第16卷 第1期 中国实验动物学报 ACT A LABORAT ORIUM ANI M A LIS SCIE NTIA SINICA February,2008 V ol.16 N o.1 研究进展 银屑病动物模型 袁媛1,朱健平1,陈系古2 (11广东医学院药理学教研室,湛江 524023;21中山大学实验动物中心,广州 510080) 【摘要】 银屑病是一种长期困扰人类的疾病,具有病程长、易复发、难治愈的特点,其病因及发病机制至今尚未完全清楚。银屑病动物模型的建立对揭示该病遗传背景、发病机制及开发新药等都有极大的促进作用。因此,国内外学者在该领域进行了大量的研究。本文就银屑病动物模型的研究状况作一综述。 【关键词】 银屑病;动物模型 【中图分类号】R394111 【文献标识码】A 【文章编号】100524847(2008)0120070204 Animal Models of Psoriasis Y UAN Y uan1,ZH U Jian2ping1,CHE N X i2gu2 (11Department of Pharmacology,G uangdong Medical C ollege,Zhanjiang524023,China; 21Experimental Animal Center of Sun Y an2Sen University,G uangzhou510080) 【Abstract】 Ps oriasis is a comm on chronic relapsing disease ass ociated with profound im paired quality of life.Until now, the fundamental pathophysiology of the disease still has not been fully elucidated.The establishment of appropriate animal m odels of ps oriasis will be helpful to reveal the genetic background and pathogenesis of this disease,and can prom ote the development of new drugs.Recently,many scientists have been w orking a lot on researches in the field.This review summarized the recent findings about animal m odels of ps oriasis. 【K ey w ords】 Ps oriasis;Animal m odels 银屑病俗称“牛皮癣”,是一种多诱因导致的皮肤慢性炎性病变,临床症状以皮疹上覆盖银白色鳞屑、剥开后有薄膜现象和点状出血为主要特征,部分患者伴有关节病变;病理学改变为皮肤角质细胞过度增生及分化不全、炎症细胞浸润、真皮血管扩张等[1]。银屑病属于高发病种,据不完全统计,全球范围内该病患者数量近2000万,国内已逾300万,且发病率近年来仍呈继续升高趋势[2,3]。银屑病治愈率低、易反复发作,严重影响了患者的生活质量[4]。迄今为止,银屑病的病因尚不完全清楚,根治性治疗仍是一个难题,这除了与其发病机制复杂有关外,理想的动物模型的缺乏也是制约对该病深入研究的一个重要原因。银屑病为人类特有性疾病,动物自然发生该病的病例罕见,因此,银屑病动物模型大多依赖人工构建。国内外学者在该领域做了大量工作,现就其研究状况做一综述。 1 生物医学型动物模型 利用部分动物的局部组织在特定情况下自行产生的类似银屑病的组织学变化作为动物模型,称为生物医学型动物模型。如鼠尾鳞片表皮天然缺乏颗粒层而呈现出角化不全的特征,可模拟银屑病角化不全的特点,Jarrett[5]和S pearman[6]最早利用此模型评价了药物促进颗粒层形成的作用,并认为药物如能促进鼠尾颗粒层形成,则可能具有抗银屑病作用。小鼠阴道上皮细胞可因雌激素刺激而发生周期性增殖活跃、上皮细胞转换加快等变化,若药物能抑制细胞过度增生,则认为该受试物对有丝分裂有抑制作用,可用于银屑病的治疗。Van[7]最早利用该模型评价了药物的抑制作用。 此类模型可部分模拟银屑病表皮动力学紊乱的特点,且经济易得,故作为筛选抗银屑病药物的常用模型沿用至今。 2 诱发性动物模型 该模型是通过人工方法在动物,如豚鼠、大鼠、裸鼠等皮肤上诱发银屑病样增生来建立。使用的方法包括紫外线照射、化学刺激剂或药物外涂等。Du[8]用紫外照射裸鼠后发现其表皮细胞更新加快,角化过度,与银屑病皮肤外观相似;G aylard[9]将普萘
1材料与方法 1. 1. 2 主要试剂环磷酰胺、RPMI 1640 培养 液( 含L-谷氨酰胺，)、Hanks 液( HyClone)、MTT 试剂、 PBS 缓冲溶液( pH 值7. 2 ～ 7. 4，HyClone)、丝裂霉素C、SA 缓冲液，绵羊红细胞，补体( 豚鼠血清)、都氏试剂、LDH 基质液、 P815 细胞( 购于协和医科大学基础医学细胞中心)、YAC-1 细 胞、FITC-Anti-CD3、PE-Anti-CD4、PerCP-Anti-CD8 荧光抗体)。 1. 2 动物与分组 Balb /C 小鼠90 只，雌性，6 ～ 8 周龄，体重18 ～ 22g。颗粒饲料，室温(22 ± 2)℃，湿度60% ～ 80% 。 动物在实验室条件下检疫1 周后，实验分为3 项处理进 行，(1) 处理一:测定动物体重、脾脏重量及系数;(2) 处理二: 测定NK 细胞活性，细胞毒性T 细胞活性;(3) 处理三:测定血 清半数溶血值。每项处理随机分为空白对照组、CTX-1 组和 CTX-2 组。 1. 3 实验方法和测定指标 1. 3. 1 剂量选择试验前经急性经口毒性试验确定CTX 的LD50为240mg / kg，以1 /4 LD50做为本试验中CTX-1 组的 CTX 剂量，即60 mg / kg 环磷酰胺，用蒸馏水配制，每日经口给予。CTX-2 组每日经口给予蒸馏水，试验结束前一天经腹腔 注射给予动物200 mg / kg 环磷酰胺［2，3］( 用蒸馏水配制)。另设空白对照组，蒸馏水代替受试物，每日经口给予。动物灌胃 容积为0. 3ml /10g，每周称量体重调整灌胃量，连续灌胃4 周 后测定各项免疫指标。 1. 3. 2 血液中T、B 淋巴细胞分类计数［4］动物处死前眼 眶内眦静脉取血，EDTA-K2抗凝，每只设定3 支流式试管进行 测定，每管加入50μl 抗凝血。分别在3 管中加入CD3 /CD19 ，CD3 /CD4 /CD8.不同荧光素标记的单克隆小鼠抗体。每管加 入2ml FACS 红细胞裂解液，室温下避光保存20min。1200r / min 离心5min，弃去上清液。每管再加入2ml PBS，1200r /min 离心5min，弃去上清液。加入0. 5ml PBS 混匀后上流式细胞仪进行检测。 1. 3. 3 细胞毒性T 淋巴细胞活性试验［5，6］ 1. 3. 3. 1 脾细胞悬液的制备( 效应细胞) 无菌取脾，用4 层 纱布将脾磨碎，制成单细胞悬液。用Hank＇s 液洗2 次，每次离 心10min(1000r /min)。弃上清将细胞浆弹起，加入0. 5ml 灭 菌水20s，裂解红细胞后再加入5ml Hank’s 液，混匀后1000r / min，10min 离心，用1ml 含10% 小牛血清的RPMI1640 完全培 养液重悬，调整细胞浓度为2 × 107 个/ml;加0. 5ml 此细胞悬 液于24 孔培养板，留一孔不加脾细胞作为对照孔。 1. 3. 3. 2 制备刺激细胞1000r /min，10min 离心处于对数生 长期的P815 细胞，用5ml DMEM 培养液悬浮P815 细胞于 15ml 离心管中，计数细胞。加入丝裂霉素C，相当于50μg / (2 ～ 5) × 107 个细胞。用锡纸包裹离心管以避光，在37℃水浴 30min。用Hank’s 液洗P815 细胞3 次，之后Hank’s 液悬浮