第六节酸性蛋白酶生产工艺 07040642 47 李继江 1 蛋白酶、蛋白类酶、酸性蛋白酶 1.1 蛋白酶的定义 蛋白酶是催化肽键水解的一类酶，它可迅速水解蛋白质为胨、肽类，广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。同时大多数微生物蛋白酶都是胞外酶。 1.2 微生物蛋白酶分类 微生物蛋白酶按其作用的最适pH可分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶三类。 碱性蛋白酶为透明褐色液体，能与水混溶，最适温度50~60℃，最适pH8.5。 中性蛋白酶为金属酶，褐色颗粒或液体，易溶于水，最适温度45~55℃，最适pH5.5~7.5。 酸性蛋白酶为近乎白色至浅黄色无定型粉末或液体，易溶于水，最适温度45℃，最适pH2.5。 1.3 蛋白类酶 蛋白类酶主要是指由蛋白质组成的酶（P酶）；而主要由核糖核酸组成的酶称为核酸类酶（R酶）。 蛋白类酶分为氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、合成酶（或称连接酶）。 1.4 酶的生产方法 酶的生产方法主要有：提取分离法、生物合成法、化学合成法。 酶的微生物合成法主要有：液体深层发酵、固体培养发酵、固定化细胞培养、固定化原生质发酵。 酸性蛋白酶用微生物发酵法生产，采用液体深层发酵。 液体深层发酵是指液体培养基在发酵罐中灭菌冷却后，接入产酶细胞，一定条件下发酵，适用于微生物细胞、动植物细胞的培养。具有机械化程度高、技术管理严格、酶产率高、质量稳定，产品回收率高的特点，是目前酶发酵的主要方式。 1.5 酸性蛋白酶制剂的性能 1.5.1 酸性蛋白酶的作用机理 酶是一种蛋白质，它是活细胞产生的生物催化剂，生物体的新陈代谢活动都离不开酶的作用。酶的种类很多，酸性蛋白酶是水解酶类的一种，能够在微酸环境下（pH2．5～4．0）
当前位置：生物帮 > 实验技巧 > 生物化学技术 > 正文 蛋白酶及蛋白酶抑制剂大全 日期：2012-06-13 来源：互联网 标签： 相关专题：解析蛋白酶活性测定聚焦蛋白酶研究新进展 摘要: 破碎细胞提取蛋白质的同时可释放出蛋白酶，这些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白质不被降解。在蛋白质提取过程中，需要加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白水解。以下列举了5种常用的蛋白酶抑制剂和他们各自的作用特点，因为各种蛋白酶对不同蛋白质的敏感性各不相同，因此需要调整各种蛋白酶的浓度 恩必美生物新一轮2-5折生物试剂大促销！ Ibidi细胞灌流培养系统-模拟血管血液流动状态下的细胞培养系统 广州赛诚生物基因表达调控专题 蛋白酶抑制剂 破碎细胞提取蛋白质的同时可释放出蛋白酶，这些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白质不被降解。在蛋白质提取过程中，需要加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白水解。以下列举了5种常用的蛋白酶抑制剂和他们各自的作用特点，因为各种蛋白酶对不同蛋白质的敏感性各不相同，因此需要调整各种蛋白酶的浓度。由于蛋白酶抑制剂在液体中的溶解度极低，尤其应注意在缓冲液中加人蛋白酶抑制剂时应充分混匀以减少蛋白酶抑制剂的沉淀。在宝灵曼公司的目录上可查到更完整的蛋白酶和蛋白酶抑制剂表。 常用抑制剂 PMSF 1)抑制丝氨酸蛋白酶(如胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶，凝血酶)和巯基蛋白酶(如木瓜蛋白酶); 2)10mg/ml溶于异丙醇中; 3)在室温下可保存一年; 4)工作浓度:17~174ug/ml(0.1~1.0mmol/L); 5)在水液体溶液中不稳定，必须在每一分离和纯化步骤中加入新鲜的PMSF。 EDTA 1)抑制金属蛋白水解酶; 2)0.5mol/L水溶液，pH8~9;
组织及血液酸性磷酸酶（ACP）活性检测试剂盒说明书可见分光光度法 注意：正式测定前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 货号：BC2130 规格：50T/24S 产品内容： 提取液：液体30mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。 试剂二：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。 试剂三：液体30mL×1瓶，4℃避光保存，变成蓝绿色不能使用。 标准品：液体1mL×1支，2μmol/mL酚标准液，4℃保存。临用前蒸馏水稀释至0.5μmol/mL备用。产品说明： ACP在酸性条件下催化磷酸单酯水解称无机磷酸，常见于巨噬细胞的溶酶体内。ACP常用于前列腺癌的辅助诊断。 在酸性环境中，ACP催化磷酸苯二钠水解生成苯酚，苯酚与4-氨基安替比林和铁氰化钾反应生成红色亚醌衍生物，在510nm有特征光吸收；通过测定510nm吸光度增加速率，来计算ACP活性。 试验中所需的仪器和试剂： 可见分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、冰和蒸馏水。 操作步骤： 一、粗酶液提取： 称取约0.1g组织，加提取液1mL充分研磨，4℃、10000rpm离心10min，取上清液待测。血液可直接用于测定，如果浓度高的话，用提取液稀释。 二、测定步骤： 1.分光光度计预热30min以上，调节波长到510nm，蒸馏水调零。 2.试剂一置于37℃水浴中预热30min以上。
试剂名称（μL）测定管对照管空白管标准管蒸馏水--100- 0.5μmol/mL标准品---100 上清液100--- 试剂一200200200200 试剂二200200200200 混匀后置于37℃水浴中保温15min 试剂三600600600600 上清液-100--混匀后于510nm测定吸光度，分别记为A测定管、A对照管、A空白管、A标准管。 三、ACP活性计算： 1.按蛋白浓度计算 活性单位定义：37℃中每毫克蛋白每分钟催化产生1μmol酚为一个酶活力单位。 ACP(U/mg prot)=[C标准品×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×V样]÷(Cpr×V样)÷T =0.033×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷Cpr 2.按样本鲜重计算 活性单位定义：37℃中每克组织每分钟催化产生1μmol酚为一个酶活力单位。 ACP(U/g鲜重)=[C标准品×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×V样]÷(W÷V提取×V样)÷T =0.033×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷W 3.按血液体积计算 活性单位定义：37℃中每毫升血液每分钟催化产生1μmol酚为一个酶活力单位。 ACP(U/mL)=[C标准品×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×V样]÷V样÷T =0.033×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管) C标准品：标准品浓度，0.5μmol/mL；V样：加入反应体系中上清液体积，0.1mL； T：反应时间，15min；V提取：加入提取液体积，1mL； W：样本鲜重，g。
酸性蛋白酶与碱性蛋白酶生产工艺的不同之处？ 酸性蛋白酶是一种在酸性环境下（pH 2.5-4.0）催化蛋白酶水解的酶制剂，适用于酸性介质中水解动植物蛋白质。可用于毛皮软化，酒精发酵，啤酒、果酒澄清，动植物蛋白质水解营养液，羊毛染色，废胶片回收，饲料添加剂等等。本品在酸性条件下有利于皮纤维松散，且软化液可连续使用，是当前理想的毛皮软化酶制剂；在酒精发酵中，添加酸性蛋白酶，能有效水解原料中的蛋白质，破坏原料颗粒粒间细胞壁的结构，有利于糖化酶的作用，使原料中可利用碳源增加，从而可提高原料出酒率；另一方面，蛋白质的水解提高了醪液中α-氨基态氮的含量，促进酵母菌的生长与繁殖，提高发酵速度，从而缩短发酵周期和提高发酵设备的生产能力。 碱性蛋白酶碱性蛋白酶是在碱性条件下水解蛋白质肽键的酶类,是一类非常重要的工业用酶,最早发现于猪胰脏。碱性蛋白酶广泛存在于动、植物及微生物中。微生物蛋白酶均为胞外酶,不仅具有动植物蛋白酶所具有的全部特性,还有下游技术处理相对简单、价格低廉、来源广、菌体易于培养、产量高、高产菌株选育简单、快速、易于实现工业化生产等诸多优点。1945年瑞士M等在地衣芽孢杆菌中发现了微生物碱性蛋白酶。 碱性蛋白酶是由细菌原生质体诱变选育出的地衣芽孢杆菌 2709，经深层发酵、提取及精制而成的一种蛋白水解酶，其主要酶成分为地衣芽孢杆菌蛋白酶，是一种丝氨酸型的内切蛋白酶，它能水解蛋白质分子肽链生成多肽或氨基酸，具有较强的分解蛋白质的能力，广泛应用
于食品、医疗、酿造、洗涤、丝绸、制革等行业。 1、碱性蛋白酶是一种无毒、无副作用的蛋白质，属于丝氨酸型内切蛋白酶，应用在食品行业可水解蛋白质分子肽链生成多肽或氨基酸，形成具有独特风味的蛋白质水解液。 2、碱性蛋白酶成功应用于洗涤剂用酶工业，可添加在普通洗衣粉、浓缩洗衣粉和液体洗涤剂当中，既可用于家庭洗衣，也可用于工业洗衣，可以有效的去除血渍、蛋类、乳制品、或肉汁、菜汁等蛋白类的污渍，另外也可作为医用试剂酶清洗生化仪器等。 3、在生物技术领域，碱性蛋白酶可作为工具酶用于核酸纯化过程中的蛋白质（包括核酸酶类）去除，而对DNA无降解作用，避免对DNA 完整性的破坏。 酸性蛋白酶如何灭活第一种方法几乎所有酶都适用，就是加热。第二种，既然是酸性酶，加入强碱应该也是可以的。 酸性蛋白酶产生菌的筛选方法？酸性蛋白酶是一种能在酸性环境下水解蛋白质的酶类，其最适作用pH值为2.5-5.0。由于酸性蛋白酶具有较好的耐酸性，因此被广泛地应用于食品、医药、轻工、皮革工艺以及饲料加工工业中。目前用于工业化生产的酸性蛋白酶大多为霉菌酸性蛋白酶，此类酶的最适作用pH值为3.0左右，当pH值升高时，酸性蛋白酶的酶活会明显降低，且此类酶不耐热，当温度达到50℃以上时很不稳定，从而限制了酸性蛋白酶的应用范围。因此，本研究以开发耐温偏酸性蛋白酶为目标，进行了以下几方面的研究：(1)偏酸性蛋白酶产生菌的分离筛选。 (2)偏酸性蛋白酶粗酶酶学性
血清同型半胱氨酸与胱蛋白酶抑制剂C在老年高血压患者中的检测 意义 摘要目的分析老年高血压患者血清同型半胱氨酸（Hcy）与胱蛋白酶抑制剂C（Cyst C）检测水平的临床意义。方法70例老年高血压患者作为观察组，75例健康体检者作为对照组，比较两组研究对象的Hcy、Cyst C表达水平。结果观察组Hcy、Cyst C水平均高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论Hcy、Cyst C水平可作为诊断老年高血压的标准之一，且高Cyst C水平可作为早期肾损害的指标之一。 关键词老年高血压；同型半胱氨酸；胱蛋白酶抑制剂C；临床意义 Detection significance of serum homocysteine and cystatin C in senile hypertension patients YANG Fang. Shangqiu City the First People’s Hospital，Shangqiu 476000，China 【Abstract】Objective To analyze clinical significance of serum homocysteine （Hcy）and cystatin C （Cyst C）detection for senile hypertension patients. Methods There were 70 senile hypertension patients as observation group，and 75 healthy people as control group. Their Hcy and Cyst C levels were compared. Results The observation group had higher Hcy and Cyst C levels than the control group，and their differences had statistical significance （P＜0.05）. Conclusion Hcy and Cyst C levels can be used as one of the diagnosis standards for senile hypertension. Moreover，high Hcy and Cyst C levels is one of the indexes for early renal damage. 【Key words】Senile Hypertension；Homocysteine；Cystatin C；Clinical significance 随着现代人们物质生活水平越来越高，其生活方式也发生了明显变化，高血压、糖尿病及其相关心血管疾病的发生几率越来越高。尤其我国进入老龄化，老年高血压患者日益增多，高血压病程较长，影响患者的生活质量，因此，及早诊断及治疗高血压具有重要意义。本文为了探讨老年高血压患者血清Hcy、CystC水平检测的意义，现报告如下。 1 资料与方法 1. 1 一般资料选取本院2013年1月～2015年1月收治的70例老年高血压患者（观察组）均符合高血压疾病诊断标准，其中男42例，女28例，年龄62～80岁，平均年龄（66.12±6.4）岁。选取同期75例健康体检者（对照组），男40例，女35例，年龄63～81岁，平均年龄（67.52±5.7）岁。均排除继发性高血压疾病、肾功能不全、急性感染者，均了解研究相关情况，并签署知情同意书。两组研究对象一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可
植物根系酸性磷酸酶活性测定 1原理 该方法以对硝基苯磷酸二钠（即P-NPP）为底物，该底物在土壤酸性磷酸酶的催化 下水解生成黄色的对硝基苯酚（即p-NP），该黄色溶液在410nm处有最大吸收光值，根_ 据对硝基苯酚的生成数量与黄色溶液的吸光度呈正比来进行定量分析，以此来反映土壤 酸性磷酸酶的活性。酶活性是以单位时间内单位重量鲜根或单株根系水解p-NPP生成的 对硝基苯酚（p-NP）的量来表示（⑷h-1 g-1鲜根或口 g -1/i株）。 2?测定方法 1）称取（1.2 ±.1） g鲜根，加入8mL 0.2mol/L醋酸钠缓冲液（pH 5.8）,然后进行冰浴研磨，双层纱布过滤，12000 r/min离心15min，静置。 2）取上清液1mL于15mL离心管中，加入 2mL 0.05mol/L对硝基苯磷酸二钠（醋酸钠缓冲液配制），摇匀后加盖，于 37C水浴30min。 3）水浴后加入 2mL 0.5mol/L CaCI 2及2mL 2mol/L NaOH 以终止反应，摇匀。 4） 2500r/min离心5min，取上清液于15mL离心管中，4000r/min下再离心5min。 5）取上清液在410nm波长比色，并记录吸光值 A410。 3?标准曲线的制作 1 ）取13支15mL离心管，按顺序编号，并按表 1加入试剂 表1对硝基苯酚标准曲线配制表
2）混匀后，在2500r/min下离心5min ,再在4000r/min下离心5min以0号作为对照， 在410nm波长下测光吸收值，并记录光吸收值A410。 3）以吸光值为横坐标、对硝基苯酚的含量为纵坐标计算直线回归方程y=a+bx及相关系数R,即对硝基苯酚含量n（ mol） a b A410。 4?计算方法 根系酸性磷酸酶活性是以单位时间内单位重量鲜根或单株根系水解p-NPP生成的对 硝基苯酚（p-NP）的量来表示（° h-1 g-1鲜根或口 g心株）。 即根系酸性磷酸酶活性（g h 1 g 1鲜根）n M 稀释倍数/（W t） 式中：n—标准曲线上查得样品中对硝基苯酚的浓度（卩mo）; M —对硝基苯酚的相对分子质量（139.11g/mol）; t —反应时间（h）; W—样品鲜重（g）。 稀释倍数一8 a.醋酸盐缓冲液（pH=5.0 ） A: 0.2mol/L 醋酸溶液（11.5mL，稀释至1000mL ） B: 0.2mol/L 醋酸钠溶液（16.4g C z H s O z Na 或27.2g C z H s O z Na - 3出0 定容至1000mL ） 14.8ml A + 35.2ml B 混合即得
土壤酸性磷酸酶活性测定 土壤有机磷转化受多种因子制约，尤其是磷酸酶的参与，可加速有机磷的脱磷速度。在pH 4-9 的土壤中均有磷酸酶。积累的磷酸酶对土壤磷素的有效性具有重要作用。研究证明，磷酸酶与土壤碳、氮含量呈正相关，与有效磷含量及pH也有关。磷酸酶活性是评价土壤磷素生物转化方向的强度的指标。 磷酸苯二钠比色法 1.试剂配制 （1）0.5%磷酸苯二钠（用缓冲液配制）。 （2）pH5醋酸盐缓冲液。 a.醋酸盐缓冲液（pH=5.0） A：0.2mol/L 醋酸溶液（11.5mL，稀释至1000mL） B：0.2mol/L 醋酸钠溶液（16.4g C2H3O2Na 或27.2g C2H3O2Na·3H2O 定容至1000mL） 14.8ml A + 35.2ml B混合即得 （3）氯代二溴对苯醌亚胺试剂：取0.125g 2,6-二溴苯醌氯酰亚胺，用10ml 96%乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用。 （4）酚的标准溶液： 酚原液——取1g重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至1L，贮于棕色瓶中。 酚工作液——取10ml 酚原液稀释至1L（每毫升含0.01mg酚）。 （5）甲苯。 （6）0.3%硫酸铝溶液。 标准曲线绘制：取1、3、5、7、9、11、13ml 酚工作液，置于50ml容量瓶中，每瓶加入5ml 缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，30min后比色测定。以吸光度为横坐标，浓度为纵坐标（mg）绘成标准曲线。 2.操作步骤 称5g风干土置于200ml三角瓶中，加2.5ml 甲苯，轻摇15min后，加入20ml 0.5%磷酸苯二钠（用醋酸盐缓冲液配制），仔细摇匀后放入恒温箱，在37℃下培养24h后于培养液中加100ml 0.3%硫酸铝溶液并过滤。 吸取3ml 滤液于50ml 容量瓶中，然后按绘制标准曲线所述方法显色。用硼酸缓冲液时，呈现蓝色，在分光光度计上于660nm 处比色。 3.结果计算 磷酸酶活性，以24h后1g土壤中释出的酚的毫克数表示。 酚（mg）=a*8 式中a—从标准曲线上查得的酚毫克数 8—换算成1g 土的系数
半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的临床应用 摘要：半胱氨酸蛋白酶抑制剂C（cystatin C）是半胱氨酸蛋白酶抑制剂超家族的成员之一，由机体所有有核细胞产生，产生速率稳定，可用于评价肾小球滤过率(GFR)。它能敏感反映早期肾功能损害，可用于肾脏透析、糖尿病肾病、肾移植和肿瘤患者肾功能的监控。 关键词：半胱氨酸蛋白酶抑制剂；肾小球滤过率；肌酐 半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(cystatin C)，又称为胱抑素C、γ-微球蛋白，属于半胱氨酸蛋白酶抑制剂超家族的成员之一，自从1985年以来，cystatin C已被视为检测肾功能的良好标志物，由于其不受许多生理病理因素的影响，同肾小球滤过率(GFR)的其他标志物相比具有众多优越性。cystatin C在一系列生理病理过程中也发挥着作用，有重要的临床意义。本文对其临床应用作一综述。 1 cystatin C的生物学特性 1.1 结构和基因半胱氨酸蛋白酶是一种淀粉生成酶，主要存在于小动脉壁，产生淀粉样物质。而cystatin C是半胱氨酸蛋白酶的细胞外抑制剂，在cystatin 中含量最为丰富，并对细胞内蛋白的转换起作用。cystatin C又称γ-微量蛋白( γ-trace)或后γ-球蛋白(post-γ-globulin)，它是由120个氨基酸构成的非糖基化的碱性蛋白，相对分子质量低(13．26×1 03)[1]，与木瓜蛋白酶、二肽酶、组织蛋白酶有很高的亲和力[2]。编码cystatin C的基因位于染色体20pl1，长约4．3kb，包括3个外显子和2个内含子。研究表明cystatin C基因属于管家基因[3]，但是与含有CAAT盒的经典看家基因有所不同，它的启动子在转录区域没有CAAT盒，存在GGGCGG区带和富含AT序列[4]，所含GATAAA位点与转录因子结合位点2D相似，同时也是转录因子AP一2(activator protein 一2，激活蛋白)和MEP一1(metal element protein一1金属组成蛋白一1)的结合位点[5]。cystatin C在合成过程中先形成具有26个氨基酸的前体蛋白，进而形成包括120个氨基酸的一条多肽链，分子内由二硫键连接。 1.2 生成、分布和分泌由机体所有有核细胞产生，产生速率比肌酐稳定[4]。
2.1土壤酸性磷酸酶活性测定 土壤酸性磷酸酶活性测定 土壤有机磷转化受多种因子制约，尤其是磷酸酶的参与，可加速有机磷的脱磷速度。在pH 4-9 的土壤中均有磷酸酶。积累的磷酸酶对土壤磷素的有效性具有重要作用。研究证明，磷酸酶与土壤碳、氮含量呈正相关，与有效磷含量及pH也有关。磷酸酶活性是评价土壤磷素生物转化方向的强度的指标。 磷酸苯二钠比色法 1.试剂配制 （1）0.5%磷酸苯二钠（用缓冲液配制）。 （2）pH5醋酸盐缓冲液。 a.醋酸盐缓冲液（pH=5.0） A：0.2mol/L 醋酸溶液（11.5mL，稀释至1000mL） B：0.2mol/L 醋酸钠溶液（16.4g C2H3O2Na 或27.2g C2H3O2Na·3H2O 定容至1000mL） 14.8ml A + 35.2ml B混合即得 （3）氯代二溴对苯醌亚胺试剂：取0.125g 2,6-二溴苯醌氯酰亚胺，用10ml 96%乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用。 （4）酚的标准溶液： 酚原液——取1g重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至1L，贮于棕色瓶中。 酚工作液——取10ml 酚原液稀释至1L（每毫升含0.01mg酚）。 （5）甲苯。 （6）0.3%硫酸铝溶液。 标准曲线绘制：取1、3、5、7、9、11、13ml 酚工作液，置于50ml容量瓶中，每瓶加入5ml 缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，30min后比色测定。以吸光度为横坐标，浓度为纵坐标（mg）绘成标准曲线。 2.操作步骤 称5g风干土置于200ml三角瓶中，加2.5ml 甲苯，轻摇15min后，加入20ml 0.5%磷酸苯二钠（用醋酸盐缓冲液配制），仔细摇匀后放入恒温箱，在37℃下培养24h后于培养液中加100ml 0.3%硫酸铝溶液并过滤。 吸取3ml 滤液于50ml 容量瓶中，然后按绘制标准曲线所述方法显色。用硼酸缓冲液时，呈现蓝色，在分光光度计上于660nm 处比色。 3.结果计算 磷酸酶活性，以24h后1g土壤中释出的酚的毫克数表示。 酚（mg）=a*8 式中a—从标准曲线上查得的酚毫克数 8—换算成1g 土的系数 1 / 1
酶作用机理和调节 一、选择题 ⒈关于酶活性中心的描述，哪一项正确？（） A、所有的酶都有活性中心； B、所有酶的活性中心都含有辅酶； C、酶的必须基团都位于酶的活性中心内； D、所有的抑制剂都是由于作用于酶的活性中心； E、所有酶的活性中心都含有金属离子 ⒉酶分子中使底物转变为产物的基团是指：（） A、结合基团； B、催化基团； C、疏水基团； D、酸性基团； E、碱性基团
⒊酶原的激活是由于：（） A、氢键断裂，改变酶分子构象； B、酶蛋白和辅助因子结合； C、酶蛋白进行化学修饰； D、亚基解聚或亚基聚合； E、切割肽键，酶分子构象改变 ⒋同工酶是指（） A、辅酶相同的酶； B、活性中心的必需基团相同的酶； C、功能相同而分子结构不同的酶； D、功能和性质都相同的酶； E、功能不同而酶分子结构相似的酶 ⒌有关别构酶的结构特点，哪一项不正确？（） A、有多个亚基； B、有与底物结合的部位； C、有与调节物结合的部位； D、催化部位和别
构部位都位于同一亚基上；E、催化部位与别构部位既可以处于同一亚基也可以处于不同亚基上。 ⒍属于酶的可逆性共价修饰，哪项是正确的？ A、别构调节； B、竞争性抑制； C、酶原激活； D、酶蛋白和辅基结合； E、酶的丝氨酸羟基磷酸化 ⒎溶菌酶在催化反应时，下列因素中除哪个外，均与酶的高效率有关？（） A、底物形变； B、广义酸碱共同催化； C、临近效应与轨道定向； D、共价催化； E、无法确定 ⒏对具有正协同效应的酶，其反应速度为最大反应速度0.9时底物浓度（[S]0.9）与最大反应
旗开得胜速度为0.1时的底物浓度（[S]0.1）二者的比值[S]0.9/[S]0.1应该为（） A、＞81； B、=81； C、＜81； D、无法确定 ⒐以Hill系数判断，则具负协同效应的别构酶（） A、n＞1； B、n=1； C、n＜1； D、n≥1； E、n≤1
实验九酸性磷酸（酯）酶活性测定1．目的要求 掌握酸性磷酸（酯）酶活性测定的原理和方法。 2．方法原理 酸性磷酸（酯）酶是一种存在于生物体内水解有机磷酸酯键的酶。以对硝基酚磷酸钠作为底物，在酸性磷酸酯酶的作用下，在碱性条件下水解生成黄色的对硝基酚，可用分光光度计进行比色测定。它们在各类种子中普遍存在，且含量较多，在萌发前期，随着种子的萌发进程活性增加，通常酸性磷酸酶活性与种子活力呈正比。 3．主要实验仪器及材料 干种子或吸胀种子、电子天平、分光光度计、恒温水浴箱、带塞刻度试管、小烧杯、研钵、塑料管、剪刀。 4．掌握要点 掌握常用的测定酸性磷酸（酯）酶活性的方法——对硝基酚磷酸钠法。 5．实验内容 （1）酶液提取。称取1g样品，用5mL研磨缓冲液在研钵中冰浴研磨成浆，再用5mL 研磨缓冲液冲洗，转移至离心管中，在20000rpm下离心10min。吸出上清液，即为酶粗提液。可放在冰箱中储存备用。 （2）活力测定。取酶液0.1—1mL（视酶含量多少而定），加水至1mL，然后加入缓冲液1mL和对硝基酚磷酸钠溶液0.1mL。空白对照用1mL研磨缓冲液代替酶制剂。充分混匀后，放在30℃恒温箱中保温10min，时而摇动。10min后，加入1m0.5mol/LNaOH溶液，充分混合，终止反应，并使对硝基酚呈黄色。在400nm波长下测吸光度A。 （3）计算酶活性，以每毫克种子每分钟水解底物的nmol数表示。 酶活性nmol/min.mg= ） （ ） （ 试样的 g W V V A ? ? ? min 10 1 1.3 019 .0 式中0.019为pH=14时，对硝基酚的μmol吸光系数，即对硝基酚的浓度为1mol/L时，其A=0.019； 3.1为0.0031×1000，反应混合液的体积为3.1，将μmol化为nmol乘上1000； V为酶制剂总体积； V1为每次用酶体积。
丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究进展 梁化亮 （生物与食品工程学院，江苏常熟 215500） Progress on antimicrobial peptide [摘要]蛋白酶抑制剂（PIs）是一类能抑制蛋白酶水解酶的催化活性的蛋白或多肽，广泛存在于生物体内，在许多生命活动过程中发挥必不可少的作用。根据活性位点氨基酸种类不同可将蛋白酶抑制剂分为四大类型:丝氨酸蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂、天冬氨酸蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶抑制剂。其中尤以丝氨酸蛋白酶及其抑制剂在体内一些重要生理活动中起关键性的调控作用。其能对蛋白酶活性进行精确调控，包括分子间蛋白降解，转录，细胞周期，细胞侵入，血液凝固，细胞凋亡，纤维蛋白溶解作用，补体激活中所起的作用。 [关键词]丝氨酸蛋白酶抑制剂分类临床应用防御
1 丝氨酸蛋白酶抑制剂 免疫系统是由组织，细胞，效应分子构成，并逐渐进化形成用于阻挠病原微生物的侵入攻击，限制它们扩散进入宿主内环境。这其中起到主要作用的是宿主产生的蛋白酶抑制剂，广泛存在于生物体内的蛋白酶抑制剂在机体内与相应的蛋白酶形成一个动态的系统，在生物体系以及一系列的生理过程中起着调控作用[1]，是生物体内免疫系统的重要组成部分。它不仅能使侵入体内的蛋白酶失活并且能将其清除，使附着在宿主表面的病原细菌无法附着生存。其中丝氨酸蛋白酶及其抑制剂在体内一些重要生理活动中起关键性的调控作用[2]。 丝氨酸蛋白酶抑制剂（serine protease inhibitor）泛指具有抑制丝氨酸蛋白酶水解活性的一类物质，广泛存在于动物、植物、微生物体中[3]。在动物体中，丝氨酸蛋白酶抑制剂是维持体内环境稳定的重要因素，一旦平衡失调即导致多种疾病，任何影响其活性的因素也会造成严重的病理性疾病。它们最基本的功能是防止不必要的蛋白水解，调节丝氨酸蛋白酶的水解平衡。作为调控物，丝氨酸蛋白酶抑制剂参与机体免疫反应，对生物体内的血液凝固、补体形成、纤溶、蛋白质折叠、细胞迁移、细胞分化、细胞基质重建、激素形成、激素转运、细胞内蛋白水解、血压调节、肿瘤抑制以及病毒或寄生虫致病性的形成等许多重要的生化反应和生理功能有重要的影响[4]。鉴于其重要的生理功能，丝氨酸蛋白酶抑制剂一直倍受研究者的关注，目前已分离得到多种天然丝氨酸蛋白酶抑制剂，同时如何将其更好地应用于食品、医药领域也成为近来研究热点。 1.1 丝氨酸蛋白酶抑制剂分类 目前，典型的丝氨酸蛋白酶抑制剂基于其序列、拓扑结构及功能的相似性，至少可分为18个家族[5]，如表1－1所示。不同家族抑制剂的空间结构也不同。通常这类抑制剂是β片层或混合了α螺旋和β片层的蛋白质，也可能是α螺旋或富含二硫键的不规则蛋白质。但它们都拥有规范的反应活性位点环的构象，从而使这些非相关的蛋白质具有相似的生物学功能[6]。因此典型的丝氨酸蛋白酶抑制剂最明确最广泛地代表了蛋白质的趋同进化。 1.2 Serpins Serpins是一类分子量较大的丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族，氨基酸残基数为
酸性磷酸酶的临床意义 酸性磷酸酶是一种广泛存在于人体组织内的一种物质，主要存在于细胞和体液里面，血液里面的酸性磷酸酶，主要来源于前列腺，来源于血小板，白细胞等，其中在前列腺里面，含量是最丰富的。在日常的医疗检查当中，通过对酸性磷酸酶的检查，能够取得前列腺癌的辅助诊断的作用，另外对于血液病、骨类疾病也有一定的诊断的作用和效果。 ★临床意义 正常人血清中的酸性磷酸酶来源于骨、肝、肾、脾、胰等组织，故不论男女老幼，其含量大致相同。而前列腺患者以及出现肝炎、甲状旁腺机能亢进、红血球病变等疾病时，血清中酸性磷酸酶的活力都会升高。为了鉴别血清中增加的酸性磷酸酶是来自前列腺还是来自其他器官，必须加以区别。为此可进一步采用某些抑制剂进行选择性抑制作用。例如：乙醇和酒石酸对前列腺酸性磷酸酶有显着的抑制作用，而对红血球酸性磷酸酶的抑制作用较弱。
ACP测定主要用于前列腺癌的辅助诊断。 (1)前列腺癌：尤其是转移癌ACP明显升高。PAP对前列腺癌的诊断较ACP敏感，二者对晚期前列腺的诊断、疗效观察及预后监测价值更大。 (2)血液病：粒细胞白血病、高雪病、尼曼匹克病、原发性血小板减少性紫癜、溶血性贫血等ACP活性亦增高。 (3)非恶性前列腺疾病：前列腺炎、前列腺肥大、前列腺梗死等ACP活性也增高。 (4)骨疾病：变形性骨炎、成骨不全、软骨病、骨肉瘤、多发性骨髓瘤及某些非前列腺恶性肿瘤的骨转移，ACP活性也可升高。 (5)其他：甲状腺功能亢进，急、慢性肾炎、尿潴留等ACP
活性可增高。 正常男性血清中酸性磷酸酶1/3～1/2来自于前列腺，女性血清中的酸性磷酸酶主要来自肝脏、红细胞和血小板。酸性磷酸酶有20种同工酶，临床测定的同工酶大致为两大类：一类是前列腺酸性磷酸酶；另一类是非前列腺酸性磷酸酶。酸性磷酸酶测定主要用于前列腺癌的辅助诊断。
YR-ACPro 酸性蛋白酶 ◇产品概述： 蛋白质由氨基酸组成，是自然界中发现的最复杂的有机化合物之一。由盐酸和蛋白酶分解成易被高等动物的肠道和微生物有机体的细胞膜吸收的氨基酸。 包括人类在内的每种动物，必须要有足够的蛋白质来维持自身生长，来生成每个细胞所必需的氨基酸，一些特种蛋白质还是某些特殊细胞、腺体分泌物、酶和激素的功能性组成元素。 蛋白酶是指一些有催化功能的酶，能够水解（断裂）蛋白质，因此也被称为蛋白水解酶。蛋白水解酶在许多的生理和病理过程中发挥着重要作用，在食品和乳品加工业也有着广泛应用。 本产品是一种酸性蛋白酶制剂，在酸性条件下具有较高活性，由酸性蛋白酶高产菌株——曲霉菌（Aspergillus）深层发酵而成。它广泛应用于饲料、纺织、废水处理和果汁提纯方面。 ◇工作机理： 蛋白水解酶制剂本产品能在酸性条件下水解蛋白质食品中的缩氨酸键，释放氨基酸或者多肽。在酒精、葡萄酒、果汁、啤酒、黄油和酱油生产中，添加酸性蛋白酶可澄清发酵液中的雾气。酵母在发酵阶段的生长可以通过悬浮蛋白质转化的氨基酸来加以促进，从而加速发酵并提高产量。 ◇产品特性： 本产品能够产生最大活性的pH范围是2.5-6.0，最适pH值是3.5；温度范围是10-50℃（50-122°F），最适温度是50℃。 ◇产品规格： 产品为固体：酶活力为 10，000 U/g） 酶活力单位定义: 温度为40℃，pH3.0条件下，1分钟内释放1ug酪氨酸所需要的酶量。 ◇使用说明： 用作饲料添加剂时，本产品的添加量为5-10U/g。 在酿造业使用时，本产品的添加比例为5U/g。 ◇产品包装及储存： 本产品的包装规格为25kg/箱。也可根据客户需求提供大小不等的包装。
半胱氨酸蛋白酶抑制剂与恶性肿瘤的研究进展 何 娟△(综述),冯震博※(审校) (广西医科大学病理学教研室,南宁530021) 中图分类号:R979.1 文献标识码:A 文章编号:100622084(2010)0320374203 摘要:半胱氨酸蛋白酶抑制剂超家族成员作为一种肿瘤标志物,对于组织细胞具有重要的调节与保护功能,对于肿瘤的生长、浸润和转移起重要作用,同时在肿瘤的诊断和预后方面也有意义。但是,研究表明半胱氨酸蛋白酶抑制剂在不同类别的肿瘤组织中的表达情况各不相同,对于预后的提示作用也因具体类别而定。其具体作用机制尚不明确。现就半胱氨酸蛋白酶抑制剂与恶性肿瘤的关系予以综述。 关键词:半胱氨酸蛋白酶抑制剂;恶性肿瘤;进展 Research Progress of Cyst a ti n and M a li gnan t Tu m or HE Juan,FEN G Zhen2bo.(D epart m ent of Pathol2 ogy of Guangxi M edical U niversity,N anning530021,China) Abstract:Cystatin is a superfa m ily.A s a tu mormarker,theirme mbers p lay an i m portant r ole in tissue and cell on the functi on of regulati on and p r otecti on,and in tu mor gr o wth,invasi on and metastasis.And they are hel pful f or tu mor diagnosis and pr ognosis as well.But researchers sho w that cystatin of different kinds of tu mors ex p ress different a mount and the i m plicati ons for p r ognosis are als o different.But the mechanis m of its molecu2 lar interacti on re mains uncertainly.This article revie ws cystatin on the relati onshi p with malignant tumors. Key words:Cystatin;Malignant tumors;Pr ogress 恶性肿瘤是严重威胁人类生命健康的一大类疾 病,大多数患者的恶性肿瘤被发现时已到中晚期,治 疗效果非常不理想。早期发现和诊断,是提高恶性 肿瘤治疗效果的重要手段之一。半胱氨酸蛋白酶抑 制剂(cystatins,CSTs)能抑制细胞内外的半胱氨酸蛋 白酶,在肿瘤的生长、血管生成、浸润和转移起重要 作用,可作为肿瘤诊断和预后估计的标志物。目前, 在这个家族中,研究最多也较为清楚的有成员A、B、 C和M等[1],现就近年来其在恶性肿瘤研究的进展 综述如下。 1 结构特点 cystatins最早是由Anastasi等[2]等采用亲和层 析的方法首次在鸡蛋清中分离得到的对半胱氨酸蛋 白酶有抑制作用的一种蛋白质,作为一个半胱氨酸 蛋白酶抑制剂的超家族,依据其分子结构主要分成 三大类:①胞内cystatin也称stefis,包括A和B2个 成员;②分泌型cystatins,包含有C、D、E/M、F、G、S、 Sv和S A等成员;③血浆中的激肽原,包含低分子质 量和高分子质量激肽原。其超家族的成员中都至少 包含一个cystatin结构域,典型的cystatin结构域由大 约100个氨基酸多肽组成,其折叠成5股反平行的p 折叠,部分环绕中心形成一个螺旋结构。p折叠末端 的两侧具有3个疏水性的区域(甘氨酸211,脯氨酸2 105和色氨酸2106),共同构成了一个楔形结构,与半 胱氨酸蛋白酶的活性部位互补,从而发挥抑制 作用[3]。 2 作用机制及功能 Cystatin通过与半胱氨酸蛋白酶即组织蛋白酶 (cathep sin)形成高亲和性复合物以调控靶酶的功能。Cathep sin是一种重要间质组织蛋白酶,其家族成员有B、H、L、V等,属于木瓜蛋白酶家族,在肿瘤中,能松弛与溶解癌周围的间质组织,影响细胞外基质的重建,从而促进肿瘤细胞的迁移、浸润、血管生成和转移,造成癌症 患者预后不良,并使手术切除肿瘤后早期复发。cys2 tatin与半胱氨酸蛋白酶结合,主要阻止半胱氨酸蛋白酶对细胞外基质的水解作用,从而抑制癌细胞的侵袭与转移[4]。因为细胞外基质是阻止肿瘤侵袭与转移的天然屏障,癌细胞可产生多种水解酶降解细胞外基质(如基质金属蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶等),便于癌细胞的侵袭与转移,而半胱氨酸蛋白酶抑制剂则阻止这种降解作用,限制癌细胞的扩散[5]。3 不同亚型与肿瘤的关系 3.1 cystatin A 人的cystatin A基因位于3q21染色体,有3个外显子和2个内含子。Cystatin A是天然的抗氧化剂,由98个氨基酸组成的单链酸性蛋白,相对分子质量为12×103。与其家族成员一样,可以可逆性和竞争性地抑制半胱氨酸蛋白酶[6]。 cystatin A在上皮和淋巴组织中高表达,这里的高表达与恶性肿瘤的进展成负相关[7],即体内有高水平cystatin A的恶性肿瘤患者病程进展较慢,这可能是因为cystatin A的表达增加可降低癌症相关的蛋白酶主要是cathep sin B的活性。Str ojan等[8、9]研究头颈部癌发现,高浓度cystatin A可防止手术后肿瘤复发,cystatin A蛋白下调则头颈部癌发展,所以cystatin A在肿瘤中的表达水平被视为患者预后好的标志。Str ojni等[10]等发现,脑的恶性肿瘤中cystatin A水平低,cathep sin B高水平者恶性程度高。W erle等[11]发现,在肺非小细胞癌中cystatin A水平显著升高组,患者存活率高。 但是,在乳腺癌患者体内检查得出不同情况: cystatin A在乳腺癌中的高表达与肿瘤的恶性程度和
货号：MS2900 规格：100管/96样土壤酸性磷酸酶（Solid-acid phosphatase，S-ACP）活性测定试剂盒 微量法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 测定意义： 土壤磷酸酶是一类催化土壤有机磷矿化的酶，其活性的高低直接影响着土壤中有机磷的分解转化及其生物有效性，是评价土壤磷素生物转化方向与强度的指标。土壤磷酸酶受到土壤碳、氮含量、有效磷含量和pH显著影响，根据最适pH范围，通常分为酸性、中性和碱性三种类型。 测定原理： 酸性环境中，S-ACP催化磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸氢二钠，通过测定酚的生成量即可计算出S-ACP活性。 自备实验用品及仪器： 可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、台式离心机、37℃恒温培养箱、分析天平、可调式移液器、冰、蒸馏水、乙醇和甲苯。 试剂组成和配制： 试剂一：液体×1瓶，4℃避光保存。 试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。用前加100mL蒸馏水充分溶解。 试剂三：液体×1瓶，4℃保存。 试剂四：粉剂×1支，4℃避光保存。临用前加576 μL无水乙醇（自备），24 μL蒸馏水充分溶解。（变褐色后不能再使用） 标准品：液体×1支，0.5μmol/mL苯酚标准液，4℃保存。 粗酶液提取： 称取风干混匀土壤约0.1g，加入50μL甲苯（自备），轻摇15min；加0.4 mL试剂一并且摇匀后，置于37℃恒温培养箱，开始计时，催化反应24h；到时后迅速加入1mL试剂二充分混匀，以终止酶催化的反应。8000g，25℃离心10min，取上清液置于冰上待测。 测定步骤： 1. 分光光度计/酶标仪预热30 min以上，调节波长到660 nm，蒸馏水调零。 2. 空白管：取微量玻璃比色皿/酶标板，加入10μL蒸馏水，20μL试剂三，4μL试剂四，充分混匀，显色后再加蒸馏水166μL，混匀后25℃静置30 min，于660 nm测定吸光度，记为A 空白管。 3. 标准管：取微量玻璃比色皿/酶标板，加入10μL标准液，20μL试剂三，4μL试剂四，充分混匀，显色后再加蒸馏水166μL，混匀后25℃静置30 min，于660 nm测定吸光度，记为A 标准管。 4. 测定管：取微量玻璃比色皿/酶标板，加入10μL上清液，20μL试剂三，4μL试剂四，充分混匀，显色后再加蒸馏水166μL，混匀后25℃静置30 min，于660 nm测定吸光度，记为A 测定管。 注意：空白管和标准管只需测定一次。 S-ACP活性计算公式： 第1页，共2页
血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的测定方法及临床应用年级：2006级预防1班学号：200609010125 姓名：彭秀 摘要：随着医学上对血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C 的深入研究，发现其不仅在肾脏疾病方面有临床价值，而且在肝脏疾病、糖尿病、肿瘤等方面也具有一定的价值。本文旨在研究血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的测定方法及临床应用。 关键词：血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C ；测定方法；临床应用 血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(Cys C)是一种非糖基化的碱性蛋白产物。Cys C由人体内的有核细胞产生，生产率稳定，不受个体肌肉量、性别、年龄、肾前因素和慢性炎症的影响。Cys C是人体内最重要的半胱氨酸蛋白酶抑制剂之一，是目前发现的对组织蛋白酶B 抑制作用最强的物质。随着科学研究，发现其不仅在肾脏疾病方面具有临床价值，而且还发现了它与肝脏疾病、糖尿病、肿瘤等具有一定的相关性。 1血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C测定方法 Cys C的测定方法很多，包括单向免疫扩散法、酶免疫测定法时间分辨荧光免疫法、放射免疫法、乳胶颗粒增强免疫比浊法等。目前，我国l}缶床实验室测定Cys C的方法主要有颗粒增强散射免疫比浊法(PENIA)和颗粒增强透射免疫比浊法(PETIA)2种。PETIA：将抗胱抑素C、IgG共价结合到均一的胶乳颗粒上，与抗原结合形成的免疫复合物被聚乙二醇一6000沉淀，在特定的波长处比浊，与同样处理的校准液比较，计算标本中胱抑素c的含量。此法反应时间短，精密度好，检测范围宽、黄疸、溶血和脂血标本均不受影响，是目前使用非常广泛的一种检测Cys C的方法。PENIA：将抗人胱抑素c的多克隆抗体标记在聚苯乙烯胶乳颗粒上，利用胶乳颗粒增强的免疫散射比浊法测定。此法优于PETIA法，反应时间短，精密度好，检测范围宽，不受血红蛋白、胆红素和甘油三酯、类风湿因子和骨髓瘤异常蛋白的影响。但试剂成本较高，需要特定的检测仪器。 2 血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C 临床应用 2．1 Cys C与肾移植 肾脏移植目前已成为治疗终末期肾病最有效的方法，因此肾脏移植手术后移植肾的功能监测成为f临床工作之重点。王盛华等人的研究发现，cvs c在肾移植后诊断急性排斥反应时明显优于血清肌酐，即Cvs C比Scr提前(2．7~1．8)d升高；与排斥前比较，Cys C升高148．9％，远高于Scr的43．9％。Le Bficon等也曾报道，Cys C在排斥时比Scr升高得更早、更明显，更有利于肾移植的临床监测。cvs c在肾移植术后诊断感染时虽然升高幅度与Scr 无明显差异，但比Scr早(4．4~1．5)d出现变化，有利于早期发现，这对肾移植患者来说有重大临床意义。 半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(Cystatin C，Cys C)为非糖基化蛋白质，分子量为13 kDa，等电点约为9．3由有核细胞产生。Cystatin C是半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族的成员之一，是一种低相对分子量的碱性非糖化蛋白质。Cystatin C几乎任何器官都能表达，广泛存在于各种组织的核细胞和体液中，脑积液中的浓度最高，尿中的浓度最低。Cystatin C能自由通过肾小球滤膜，并在近曲小管几乎完全被重吸收和降解，不再回到血液中，同时也无肾小管分泌。其重吸收后被完全分解代谢对肾小球滤过率有微小变化比较敏感。随着检测手段的不断完，cvstatin C作为肾脏早期损害的检测指标已越来越得到认可。它能激活中性粒细胞，