系统说明书
PT4085-1 (PR013451)
Cat. No. 630490
Published February 2010
“Mate & Plate?”文库构建系统说明书
目录
I. 介绍&操作流程 (4)
II. 组份列表 (5)
III. 附加产品推荐 (7)
IV. 缩写列表 (8)
V. 宿主菌株信息 (9)
VI. 对照实验 (10)
A. 总论 (10)
B. 操作:对照同源重组克隆的实验操作 (10)
VII. cDNA文库构建 (11)
A. 操作:第一链cDNA合成 (11)
B. 操作:长距离PCR (LD-PCR)扩增cDNA (13)
C. 操作: CHROMA SPIN? TE-400 纯化ds cDNA (14)
VIII. 双杂交文库构建 (16)
A. 酵母双杂交文库构建&筛选总论 (16)
B. 操作:制作Mate & Plate文库 (16)
IX. 参考文献 (18)
X. 疑难解答指南 (19)
附录A: 文库滴度测定 (24)
附录B: 质粒信息 (22)
附录C: 酵母生长培养基&补充物 (23)
附录D: SMART? 技术概述 (25)
Protocol No. https://www.doczj.com/doc/d017009922.html, A Clontech Laboratories, Inc. Version No. PR013451 Takara Bio Company
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“Mate & Plate?”文库构建系统说明书
目录，续
图表
Figure 1.利用酵母的生物学知识构建Mate & Plate文库 (4)
Figure 2. Mate & Plate文库构建概述 (11)
Figure 3. SMART cDNA合成高质量cDNA (14)
Figure4. CHROMA SPIN纯化柱和收集管 (15)
Figure 5. pGADT7-Rec 载体图谱和克隆位点 (22)
Table I:酵母宿主菌株的基因型 (9)
Table II:根据不同SD培养基的表型测试 (9)
Table III: RNA起始量和PCR最优循环数的相关性分析 (13)
Table IV:酵母培养基套装2&酵母培养基套装2Plus的各组份 (23)
Table V: Matchmaker黄金酵母操作用独立包装的酵母培养基 (23)
Table VI:酵母双杂交筛选用的附加培养基&培养基补充物 (24)
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A Clontech Laboratories, https://www.doczj.com/doc/d017009922.html, Protocol No. PT4085-1 Takara Bio Company Version No.PR013451
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“Mate & Plate?”文库构建系统说明书
1.介绍&操作流程
酵母双杂交系统主要是从prey文库中筛选与已知蛋白（bait）有相互作用的蛋白（prey）。鉴于传统文库构建费时费力，Clontech公司研发了Mate & Plate? 文库（可
以使用SMART技术自己构建酵母prey文库，也可购买预制的酵母prey文库制品）。
在合适的基本选择培养基上，将酵母prey文库与bait菌株通过简单的共培养即可筛
选出与已知蛋白相互作用的prey蛋白。使用“Mate & Plate?” 酵母文库构建系统(Cat.
No. 630490) 可以助你运用简单的方法构建高效的“Mate & Plate 酵母文库”，原理是利
用啤酒的同源重组机制(Figure 1)，在Y187的酵母菌完成载体的重组，无需使用大肠
杆菌克隆、扩增和筛选文库。本系统利用SMART? cDNA 合成技术，能够从低至100ng
的总RNA起始cDNA文库的构建(详见附录D，SMART技术概述)。
Figure 1. 使用酵母生物学构建Mate & Plate 酵母文库。Mate & Plate 文库构建是在酵
母中进行的，借助生物体自身的同源重组功能将cDNA克隆到pGADT7-Rec中。首先，
使用SMART cDNA 合成技术合成含有与pGADT7-Rec 载体末端同源的cDNA，然后，
将cDNA和pGADT7-Rec 转入Y187中，通过同源重组构建AD文库，最后将所有克隆
收集并分装成1ml的文库用于双杂交筛选。
关于本试剂盒的说明书
本试剂盒的说明书介绍了怎样构建您自己的文库和分装文库。关于文库筛选的更多操作细节，请参见Matchmaker黄金酵母双杂交说明书(PT4084-1) ，网址：
https://www.doczj.com/doc/d017009922.html,。Matchmaker黄金酵母双杂交系统以编号630489单独销售。
Matchmaker 文库构建概述
文库构建过程包括以下步骤(详见Figure 1)：
? Step 1. 利用SMART? 技术合成cDNA。
? Step 2. 将cDNA和线性化的pGADT7-Rec 载体共转化酵母菌株Y187，然后在SD/–Leu
固体培养基上培养Y187。
? Step 3. 培养4–5 d，然后将所有的酵母克隆收集到营养丰富的液体培养基中。
? Step 4. 平均分成2份，然后冻存。
? Step 5. 使用单独的1 ml文库筛选[详见Matchmaker 黄金酵母双杂交系统]。Protocol No. https://www.doczj.com/doc/d017009922.html, A Clontech Laboratories, Inc. Version No. PR013451 Takara Bio Company
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“Mate & Plate?”文库构建系统说明书
II.组份列表
“Mate & Plate” 文库构建说明书(Cat. No. 630490)
本试剂盒包含构建5个AD酵母文库的足够试剂（组份列表如下）。
将袋装的酵母培养基,去离子H2O, CHROMA SPIN?纯化柱, NaCl 溶液, NaOAc, LiAc, PEG,
TE 缓冲液, 和YPD Plus 培养基放置于室温保存。
将酵母菌株，对照Poly A+ RNA和SMART III Oligo 置于–70℃保存。
将其他所有试剂置于-20℃保存。
第一链cDNA合成
? 10 μl SMART III Oligo
(10 μM; 5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCGGG-3’)
注意: SMART III Oligo是经过修饰的。
? 10 μl CDS III 引物
(10 μM; 5’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30VN-3’)*
? 10 μl CDS III/6 引物
(10 μM; 5’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-NNNNNN-3’)
注意: N = A, G, C, or T; V = A, G, or C
? 10 μl SMART MMLV反转录酶(200 U/μl)
? 7 μl RNaseH
? 300 μl5X 第一链缓冲液
? 165 μl DTT (100 mM)
? 5 μl 对照Poly A+ RNA (小鼠肝脏; 1 μg/μl)
? 50 μl dNTP Mix (10 mM each)
cDNA 扩增
? 50 μl 5’ PCR 引物
(10 μM; 5’-TTCCACCCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGG-3’)
?50 μl 3’ PCR 引物
(10 μM; 5’-GTATCGATGCCCACCCTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACA-3’)
? 500 μl溶解液
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“Mate & Plate?”文库构建系统说明书
II．组份列表，续
cDNA 纯化
? 10CHROMA SPIN+TE-400 纯化柱
? 300 μl 醋酸钠(3 M)
酵母双杂交文库构建
? 25 μg pGADT7-Rec克隆载体(SmaI-linearized; 500 ng/μl)
? 20 μl SV40大T PCR片段(25 ng/μl)
? 0.5 ml Y187 酵母菌株
? 50 ml NaCl 溶液(0.9%)
? “Mate & Plate” 文库构建说明书(PT4085-1)
? pGADT7-Rec载体信息(PT3530-5)
随附袋装酵母培养基
? 1 x 0.5 L YPDA 液体培养基
? 1 x 0.5 L YPDA 固体完全培养基
? 1 x 0.5 L SD/–Leu 固体筛选培养基
Yeastmaker? 酵母转化系统2 (也可单独购买Cat No. 630439)
? 50 ml 1 M LiAc (10X)
? 50 ml 10X TE 缓冲液
? 50 ml YPD Plus 液体完全培养基
? 20 μl pGBT9 (0.1 μg/μl; 阳性对照质粒)
? 2 x 1 ml Yeastmaker 载运DNA（鲑鱼精DNA）, 变性的(10 mg/ml)
? 2 x 50 ml 50% PEG 3350
? Yeastmaker 酵母转化系统2说明书(PT1172-1)
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III.附加推荐产品
Advantage? 2 聚合酶混合物(100 rxns) (Cat. No. 639201)
附加试剂盒
? Yeastmaker 酵母转化系统2 (本试剂盒包含，详见Section II; 也可单独购买Cat. No.
630439)
? 酵母质粒简便提取试剂盒(50次; Cat. No. 630467)
酵母铺板用工具
?酵母铺板用的工具包括无菌的玻璃棒、弯曲的巴氏移液管或5mm的玻璃珠(每
100mm的板使用5–7个玻璃珠，或每150mm的板使用15–20个玻璃珠)。
各种试剂&培养基
? 3 M 乙酸钠, pH 5.3
? 冰乙醇(95–100%)
? YPDA/25% 甘油(冻存液;详见附录C, Section C)
酵母文库构建用酵母培养基的简便装(详见附录C)
? YPDA 液体培养基(10 x 0.5L) Cat. No. 630306
? YPDA 固体培养基(10 x 0.5L) Cat. No. 630307
? SD/-Leu 固体培养基(10 x 0.5L) Cat. No. 630311
酵母双杂交筛选用酵母培养基
[可参考Matchmaker 黄金酵母双杂交系统使用说明书(PT4084-1)]
Table IV (附录C中)列出了酵母培养基套装(Cat. No. 630494)和酵母培养基plus套装(Cat.
No. 630495)中的各组份。这些培养基套装是专门用于Matchmaker? 黄金酵母双杂交
系统的简便箔袋装的预混培养基。酵母培养基plus套装还包括有酵母双杂交筛选的
ABA和X-a-Gal成份。Table V (附录C)中有单独10袋培养基为一个包装的采购信息。
Table VI (附录C)中有额外所需的培养基准备说明和AureobasidinA 和X-a-Gal的单独购
买信息。
此外，当在进行双杂交筛选培养酵母时，请参考以下：
? SD培养基(综合培养基) 是基本培养基，它是用于培养啤酒酵母的常规培养基。SD
基础培养基包含培养酵母细胞的全部营养成份(包括碳源和氮源)，向SD 基础培养基
中加入必须氨基酸就构成了SD基本培养基。Clontech 提供SD培养基的预混的简便包
装。一些特殊基本培养基的选择取决于选择的质粒/激活报告基因。
? SD/–Leu 缺陷培养基用于筛选prey文库。SD/–Leu缺陷培养基包括所除亮氨酸
（白氨酸）以外的所有的必需氨基酸。含有Matchmaker prey质粒的细胞能够在
SD/–Leu缺陷培养基上生长，因为pGADT7-Rec 能够编码LEU2 亮氨酸生物合成基因。
能够合成亮氨酸供细胞生长所需。
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IV.缩写词列表
AD融合文库cDNA文库(例如Mate & Plate文库) 构建在激活域（AD）载体中，
插入序列所编码的蛋白是融合在Gal4 AD 蛋白的3’末端的。
AD/质粒文库质粒可以编码Gal4 转录激活域和文库cDNA的融合蛋白。
AD/文库包含Gal4转录激活域蛋白和cDNA文库蛋白的融合蛋白。
AD 载体编码酵母Gal4转录激活域蛋白的载体
酵母菌株表现型
Ade–, or His–, or 需要在含有腺嘌呤(Ade), 组氨酸(His)、亮氨酸(Leu), 色氨酸的培
Leu–, or Trp–养基上生长。也就是说缺陷这些必需营养成分的一种或几种。
LacZ+ 表达LacZ 报告基因; 也就是对?-半乳糖(?-gal)显阳性。
Mel1+ 表达MEL1 报告基因; 也就是对α-半乳糖(α-gal)显阳性。
各种酵母培养基
SD 基本培养基的, 酵母的组合培养基，由氮源、碳源, (蔗糖，除非
特别强调使用别的碳源), 和DO 补充物。
DO Dropout (补充物或者溶液); 由多种特殊的氨基酸混合而成用于
SD基本培养基的配制。DO溶液是缺少一种或几种营养物
质用于筛选转化后的酵母。例如，SD/–Leu 缺少亮氨酸。
YPDA YPD完全培养基包含腺嘌呤(1X浓度= 120μg/ml)
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V.宿主菌株信息
Table I和II表示了Y187菌株的表现型和基因型。关于Y187菌株的生长及maintenance ，
请查询Matchmaker 的使用手册（https://www.doczj.com/doc/d017009922.html,），还有酵母菌遗传性和分子生物
学指南(Guthrie & Fink,1991)。
a 基因GAL1, GAL2, 和MEL1 位于激活序列(UASs)的上游，被Gal4 BD识别并结合。选
择标记基因trp1, his3, gal4, 和gal80 突变体都被删除了；基因leu2-3, 112是双突变体。
b LacZ 报告基因已经通过同源重组的方式进入了ura3-52突变体酵母基因组中。所以，
重组子可以在SD/–Ura的培养基上进行筛选。
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VI.对照实验
请在开始实验前仔细阅读整个操作！
使用以下操作在酵母中利用同源重组的方式进行克隆。
A.总论
熟悉酵母菌体内介导的同源重组克隆方法和操作。此外，本试剂盒还提供了用于双杂筛选的阳性对照菌株。
B. Protocol: Control for Homologous Recombination-Mediated Cloning Protocol
1. 材料
? Yeastmaker酵母转化系统2 (包含于本系统,或者可以单独购买Cat. No. 630439)
? Y187 Yeast Strain
? pGADT7-Rec 克隆载体(SmaI-linearized; 500 ng/μl)
? SV40 大-T PCR 片段(25 ng/μl)
? SD/–Leu固体筛选培养基
2. 准备
? 感受态酵母菌株Y187
? SD/-Leu 固体培养基(5 x 100 mm 板; 详见附录C).
3. 将以下DNA样本分别混合于2个无菌的离心管中，并转化Y187感受态细胞：
? 1 μl pGADT7-Rec (SmaI Linearized)
? 1 μl pGADT7-Rec (SmaI Linearized) + 3 μl S V40大T PCR 片段(25 ng/μl)
4. 各100 μl的1/10 稀释液和100 μl的a 1/100 稀释液分别铺板于SD/-Leu 固体培养
基上。
5. 30°C，孵育3d–5d。
预期结果: 共转化pGADT7-Rec 和SV40大T PCR 片段的克隆数是空载体的10倍多。
也就是说，大于90% 克隆都包含同源重组后的pGADT7-T对照质粒。
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“Mate & Plate?”文库构建系统说明书VII.cDNA文库构建
请在开始实验前仔细阅读整体操作！
第一链cDNA合成的细节操作(Section A), 长距离PCR (LD-PCR) (Section B)扩增
ds cDNA, 还有使用CHRO MA SPIN TE-400纯化柱纯化ds cDNA (Section C)。
使用clontech简单高效的SMART?技术合成cDNA，详见Appendix D.
Figure 2. Mate & Plate 文库构建流程SMART cDNA 合成技术可产生与pGADT7-Rec 载体末端同源的cDNA。
A. 操作: 第一链cDNA的合成
强烈建议使用小鼠肝脏mRNA做cDNA合成的对照组。对照实验可以检验组份是否工作良好，并且还可以给实验组dscDNA的产量和大小范围提供参考。
重要: 不要扩大任何体系。所有列出来的体系中的组份用量都是经过优化的。
cDNA整个合成过程包括三步：
?第一链cDNA的合成
? 长距离PCR（LD-PCR）扩增双链cDNA
? CHROMA SPIN TE-400柱子纯化ds cDNA
在如下的操作中，您可以选择使用oligo-dT (CDSIII) 或随机引物(CDSIII/6)来合成第一链
cDNA。引物不同反应条件略有不同（Step6）。
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“Mate & Plate?”文库构建系统说明书
VII．cDNA文库构建，续
1.准备: 高质量的Poly A 或者总RNA
注意: 推荐使用NucleoSpinR RNAII 试剂盒(Cat. Nos. 740955.20, 740955.50 &
740955.250) 纯化总RNA。推荐NucleoTrap mRNA 试剂盒(Cat. Nos. 740655 & 740656)
纯化mRNA。国内客户可在市场上选择其他合适的纯化产品。
2. 在微量离心管中混匀以下试剂：
1–2 μl RNA 样本(0.025–1.0 μg poly A+ 或0.10–2.0 μg 总RNA)
1.0 μl CDS III or CDSIII/6 引物
1–2 μl 去离子水(补齐体系到4.0 μl)
4.0 μl 总体积
注意: 在做对照实验时，请使用1 μl *1 μg+ 的对照总RNA. CDSIII = Oligo-dT 引物
CDSIII/6 =随机引物
3. 72°C ，孵育2 min。
4. 冰上冷却2 min，然后14000rpm，10sec，瞬时离心。
5. 混合以下试剂，将混合液加入Step4中的经过变性且结合有引物的RNA样本中，
轻拍混匀。
2.0 μl 5X First-Strand 缓冲液
1.0 μl DTT (100 mM)
1.0 μl dNTP 混合物(10 mM )
1.0 μl SMART MMLV 反转录酶
9.0 μl 总体积
6. 只有使用随机引物(CDSIII/6)实验才进行此步骤[如果采用Oligo-dT (CDSIII)请忽略此
步骤，直接进行Step7] 25°C ，10 min，室温孵育。
7. 42°，10 min，孵育。
注意: 孵育在热盖的PCR仪中进行。若用非热盖的PCR仪或水浴，请在反应管中加
入一滴矿物油来避免水分蒸发。
8. 加入1 μl SMART III-modified oligo，混匀，42°C ，1 hr孵育。
9. 75°C ，10 min终止第一链合成反应。
10. 室温冷却，加入1 μl RNA酶H (2个单位).
11. 37°，20 min，孵育。
12. 继续进行LD-PCR 扩增(Section VII.B)。
注意:若现在不立即进行后续实验，请将第一链合成反应管保存于–20°C冰箱，最长
可保存3个月。
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“Mate & Plate?”文库构建系统说明书VII．cDNA文库构建，续
B. 操作: 使用长距离PCR (LD-PCR)扩增ds cDNA
Table III 表示第一链合成反应中不同RNA使用量对应于不同的PCR循环数。尽量使用
最小的循环数来得到3-6ug的ds cDNA。Table III 中最优的循环数取决于对照小鼠肝脏
RNA的起始量。最优循环数随着模板量的不同而变化。这个程序是经过优化适用于
1. 准备:
? 第一链cDNA (Section VII.A)
? 预热的PCR仪
2. 建立两管100ul的扩增体系，一个是实验组，另一个是对照组：
2 μl 第一链cDNA (Section VII.A)
70 μl 蒸馏水
10 μl 10X Advantage? 2 PCR缓冲液
2 μl 50X dNTP 混合物
2 μl 5’PCR引物
2 μl 3’ PCR引物
10 μl10X溶解液
2 μl 50X Advantage 2聚合酶混合物
100 μl总体积
3. 扩增程序:
? 95°C 30 sec
? x Cycles a
95°C 10 sec
68°C 6 min b
? 68°C 5min
a 参考Table III设定PCR循环数。
b 扩增程序每过一个循环时延伸时间增加5 sec。例如，在第二轮循环中，延伸时间
应该是6min 和5sec，如此叠加。
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VII．cDNA文库构建，续
4. 使用0.25 μg 的1kbladder DNA分子量标记在1.2%的琼脂糖/ EtBr 胶上对每个样品
的7 μl PCR产物进行分析。Figure 3表明，小鼠肝脏Poly A+ RNA 样本经过柱纯化后的
跑胶结果。
注意:如果实验样本没有出现图中所示的结果，请参考疑难解答指南(Section X)。
5. 柱纯化(Section VII.C)后，将ds cDNA保存于–20°C待用。
Figure 3.SMART技术合成高质量的cDNA。分别以1μg小鼠肝脏mRNA或无模板(分别阳性对照和阴性对照)为
起始材料利用“Mate & Plate”系统合成得到Oligo dT-primed cDNAs 。Advantage R 2 聚合酶混合物进行LD PCR扩
展(扩展2管)，CHROMA SPIN+TE-400 纯化柱纯化PCR产物。1% 琼脂糖胶分析cDNA。结果显示cDNA的大小
范围为300 bp- 6 kb。Lanes M: 1 kb marker。Lane 1: 未纯化的阴性对照。Lane 2: 未纯化的阳性对照。Lane 3:
纯化后的阴性对照。Lane 4: 纯化后的阳性对照。Lane 4 表明：与Lane2相比，经过CHROMA SPIN+TE-400 纯
化柱分选后，小于400bp的cDNA富集较少。
C. 操作: CHROMA SPIN?+TE-400纯化柱纯化ds cDNA
在如下的操作中，使用CHROMA SPIN TE-400 纯化柱分选分子量大于200bp的DNA。
CHROMA SPIN 纯化柱是预装柱纯化原理是基于DNA分子的大小。分子量比树脂孔径
大的片段不能进入树脂膜，离心的过程中这些分子的片段会迅速地穿过膜，而小片段
分子则被留在了树脂膜中。关于CHROMA SPIN 纯化柱的更多信息，请登录：
https://www.doczj.com/doc/d017009922.html,，参考CHROMA SPIN纯化柱说明书(PT1300-1) 。
1. 准备:
? LD-PCR 扩增ds cDNA (Section VII.B; 若没有得到至少3 μg的ds cDNA，请使用更多的
循环数重新做LD-PCR扩增。)
? 醋酸钠(3 M)
? 冰乙醇(95–100%)
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VII．cDNA文库构建，续
2. 每93ul的cDNA样品使用一个CHROMA SPIN TE-400 纯化柱(参见Figure 4)。
? 颠倒纯化柱数次，重悬胶基质，直至均匀。
? 移除顶端帽子。
? 掰断柱底部的break away。
? 将柱放置在2ml 的收集管(已提供)中。
注意: 构建一个文库需要消耗2个纯化柱。
Figure 4. CHROMA SPIN纯化柱和收集管。注意有2ml的收集管替代尖底的1.5ml的
离心管来收集纯化后的DNA，这样可以使样本流入相对较窄的区域利于处理。然而，
2ml的收集管可以用来清除平衡缓冲液。
4.700 rpm，5 min离心，丢弃收集管和平衡液，之后让matrix半干。
注意:推荐使用悬挂转子或水平转子。角转子很可能导致样本从柱的侧面流下，而不
是经过胶基质，造成纯化不一致。
4. 将将离心柱放在另第二个收集管中，然后，向胶基质平坦的表面上方加入93ul的
样本。
注意:切勿让样本从纯化柱内壁流入。
5. 700 rpm，5 min离心，样本便流到了收集管中。
6. 将两次的纯化样本收集到一个离心管中，并用乙醇进行沉淀cDNA：
?加入1/10体积的3 M 醋酸钠。
? 加入2.5倍体积的冰乙醇(95–100%)。
?–20°C ，1 hr放置沉淀。
? 14,000 ，室温离心20 min 。
? 弃上清。
? 14,000 rpm瞬时离心，去除残留的上清液。
? 空气干燥10 min。
7. 20 μl 去离子水重悬cDNA。重悬后的cDNA用于酵母文库构建。(Section VIII).
注意: 这时候应该可以得到2–5 μg 的ds cDNA。
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VIII．酵母双杂交文库构建
A.酵母双杂交文库构建&筛选总论
在使用“Mate & Plate”酵母双杂交文库构建的操作前，请咨询阅读每个操作细节！
下面有2种方法构建和筛选Matchmaker 酵母双杂交文库。
1.推荐操作
? 将Mate & Plate文库构建到Y187中(详见section VIII.B, 下面)，并通过酵母接合的方
式对文库进行筛选[详见Matchmaker黄金酵母双杂交系统说明书T (PT4084-1)]。接
合的方法非常简单—只需将1ml的Mate & Plate文库与浓缩的bait 培养液过夜培养，
然后铺板SD-Leu/-Trp/X-a-Gal/AbA筛选培养基。
? 接合方式的文库筛选操作详见Matchmaker黄金酵母双杂交系统说明书(PT4084-1)
（https://www.doczj.com/doc/d017009922.html,）。
2.可选操作
? 文库构建和筛选可以通过Bait和Prey共转化的方式实现。根据Section VII中的操作
合成ds cDNA ，然后将ds cDNA和bait同时转化Y2HGold感受态细胞。请访问
https://www.doczj.com/doc/d017009922.html,获取操作步骤。
推荐操作的优势在于可使用冻存的文库筛选多个baits；可选操作步骤不产生冻存文库，
它是一个快速的过程。若您不需要多次筛选文库，可选操作是一个很好的选择。
B. 操作: 建立Mate & Plate 文库
1．准备:
? 参考Yeastmaker 酵母转化系统2操作步骤制备Y187感受态细胞。
? 20 μl ds cDNA (Section VII)— ds cDNA 的量在2–5 ug。
? SD 固体培养基（Appendix C)
–– SD/–Leu固体培养基(100 x 150 mm板)
–– SD/–Leu 固体培养基(5–10 x 100 mm板)
? YPDA/25%甘油(冷冻剂; 详见Appendix C, Section C)
注意: 卡那霉素硫酸盐应以50ug/ml的浓度加入到酵母培养基中来抑制培养
基中细菌污染。(详见Appendix C, Section D)。
?无菌的玻璃珠(5 mm)
2.遵循酵母转化系统2中文库规模酵母转化操作向Y187感受态中共转化下列组份
? 20 μl ds cDNA (Section VII)— ds cDNA 2–5 μg
? 6 μl pGADT7-Rec (0.5 μg/μl))
3.按照转化操作的Step2，将转化后的酵母细胞重悬于15 ml 0.9% (w/v) NaCl中。Protocol No. https://www.doczj.com/doc/d017009922.html, A Clontech Laboratories, Inc. Version No. PR013451 Takara Bio Company
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“Mate & Plate?”文库构建系统说明书
VIII.酵母双杂交文库构建，续
4. 将100 μl of 1/10 、1/100稀释液分别铺板于SD/–Leu 100 mm 固体培养基上，
30°C ，孵育3d–4d；确定文库的库容。
参见Section X来提高转化效率。
独立克隆数= No. of cfu/ml on SD/–Leu x 重悬液体积(15ml)
? 这个值标示转化效率。
? 若建立2 x107 库容的文库，那么在1/100稀释板上应当有133个独立克隆
? 若这时候有1 x107 个独立克隆子，那么可以直接进行Step6。
? 若这时候没有1 x107个独立克隆子，请参考Section X 提高转化效率和cDNA的质量。
5. 将剩下的悬浮液铺板于150 mm SD/–Leu选择培养基上。
? 每板150 μl 悬浮液，约使用100 板
? 30°C 孵育3d-4d
6. 收获Step5中的转化子：
a. 4°C ，3–4 hr冷却培养板。
b. 加入5 ml 的冻存液。
c. 使用无菌的玻璃珠将板中的菌落分离下来（缓缓地摇晃培养板，玻璃珠均匀地滚动
于培养基表面将分离菌落，分离后的菌落溶于冻融液中）。
d.将所有的液体收集于无菌的单管中。(收集后的体积要达到0.5 L)。
e.用血球计数板来计算细胞密度。若细胞密度小于<2 x 107 /ml，离心来减少悬浮液的
体积。
f. 将文库1 ml分装几管待短期使用，剩下的50ml分装待长期使用。-80℃贮存。
7. 依照Matchmaker 黄金酵母双杂交系统说明书(PT4084-1)的操作对1ml单管文库
进行筛选。
注意: 当复苏贮存文库时，每次务必重新计算文库的滴度，确保文库滴度大于1x107
cfu/ml。
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A Clontech Laboratories, https://www.doczj.com/doc/d017009922.html, Protocol No. PT4085-1 Takara Bio Company Version No.PR013451
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“Mate & Plate?”文库构建系统说明书
IX.参考文献
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Fields & Sternglanz, 1994; Fritz & Green, 1992; Guarente, 1993; Hopkin, 1996; Luban & Goff, 1995; McNabb & Guarente, 1996;
Mendelsohn & Brent, 1994.
? An extensive list of Matchmaker System citations can be obtained from our website (https://www.doczj.com/doc/d017009922.html,).
? For additional two-hybrid references, see the Golemis lab Web Site (https://www.doczj.com/doc/d017009922.html,:80/research/labs/golemis) or use MedLine
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Protocol No. https://www.doczj.com/doc/d017009922.html, A Clontech Laboratories, Inc. Version No. PR013451 Takara Bio Company
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“Mate & Plate?”文库构建系统说明书X.疑难解答指南
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A Clontech Laboratories, https://www.doczj.com/doc/d017009922.html, Protocol No. PT4085-1 Takara Bio Company Version No.PR013451
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“Mate & Plate?”文库构建系统说明书
X．疑难解答指南，续
Protocol No. https://www.doczj.com/doc/d017009922.html, A Clontech Laboratories, Inc. Version No. PR013451 Takara Bio Company
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目录 （一）介绍 4 （二）试剂盒物品清单 7 （三）额外附加物品列表9 （四）酵母菌株11 （五）酵母载体14 （六）方法简述：单杂交文库的构建和筛选16 方法简述：双杂交文库的构建和筛选17 （七）构建用于酵母单杂交的报告质粒载体18 （八）构建用于酵母双杂交的DNA-BD融合载体19 （九）构建生成cDNA文库21 （十）构建和筛选酵母单杂交和双杂交文库（简述）27 （十一）酵母单杂交文库的构建和筛选28 （十二）酵母双杂交文库的构建和筛选30 方法A:通过酵母配对（Yeast Mating）来筛选目的蛋白30 方法B:通过共转化的方法筛选目的蛋白35 （十三）分析阳性相互作用结果38 （十四）问题解决指南44 （十五）参考文献47 （十六）相关产品50 附录A: 双链 cDNA合成的典型结果51 附录B: 酵母感受态的制备—LiAc 法52 附录C：单杂交对照载体信息53 附录D：双杂对照载体信息54 表格列表 Table I． BD Matchmaker酵母菌株的基因型11 Table II． BD Matchmaker酵母菌株的表型11 Table III．单杂交系统的载体14 Table IV．双杂交系统的载体15 Table V．各BD-Matchmaker DNA-BD 载体的比较19 Table VI． RNA起始浓度和PCR扩增循环数之间的关系24 Table VII．单杂交共转化的对照实验的设置29 Table VIII．单杂共转化对照实验：期望的结果29 Table IX．双杂交转化的对照实验的设置33 Table X．双杂交配对筛选的对照实验的设置 Table XI．双杂交共转化的对照实验的设置 Table XII．双杂交共转化的对照实验：期望的结果 Table XIII．用于PCR筛选菌落的Assembling Master Mixs
2.1.1酵母双杂交 2.1.1.1Gateway入门克隆 设计Gateway引物时，在上游引物的5'端加上B1序列：GGGG-ACA-AGT-TT G-TAC -AAA-AAA-GCA-GGC-TNN-，下游引物的5'端加上B2序列：GGGG-ACC-ACT-TT G-T AC-AAG-AAA-GCT-GGG-TN-。其中，5'-GGGG序列是保护碱基，防止引物的重要部分被降解，下划线加粗的部分是在整个的Gateway克隆中可以保存下来的序列，3'端的碱基N是为了保证经过入门载体构建目的载体时阅读框的正确性，一般建议为C。 通过PCR扩增获得带有att B位点的基因片段，扩增体系和条件见3.2.2.2，其中将退火温度改为65℃。获得扩增产物后对其进行回收纯化，测定纯化后DNA 的质量和浓度后进行下一步的BP反应，反应体系如下： att B-PCR产物（≥10 ng/μL）1-7μL pDONR221 (150 ng/μL)1μL TE buffer, pH 8.0 补足8μL 将上述混合物加入离心管中，加入2μL BP反应酶，加入之前需将其在涡旋仪上轻轻振荡两次，所有组分混匀离心后，25℃反应1h，加入1μL蛋白酶K后，混匀离心，37℃反应10min终止BP反应，将BP反应产物参照3.2.2.6进行转化，由于pDONR221载体为Kan抗性，所以选用含有50μg/mL Kan抗生素的LB平板进行阳性克隆筛选，参照3.2.2.7检测阳性克隆，然后根据3.2.2.8中的方法提取重组质粒，测定质量和浓度后送至测序公司进行测序。 进行BP反应时，需注意以下几项： (1)对于BP反应来说，最高效的是采用线性的att B-PCR产物和超螺旋的att P 入门载体； (2)为了提高BP反应的效率，可以将建议的25℃反应1h适当延长至4-6h，可 以将效率提高2-3倍，或者延长至过夜反应，可以将效率提高5-10倍，对 于长片段克隆来讲，适当的延长反应时间是非常必要的； (3)提高体系中PCR产物的量可以增加反应效率，但每10μL体系中PCR产物 最好不要超过250ng。 2.1.1.2诱饵载体构建 重组的入门载体测序正确后，通过LR反应来构建酵母双杂交的诱饵载体，LR反应体系如下： 入门载体(50-150 ng)1-7μL pDEST32 (150 ng/μL)1μL TE buffer, pH 8.0 补足8μL
酵母双杂交系统 1．原理 酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始过程的认识。研究发现，许多真核生物的转录激活因子都是由两个可以分开的、功能上相互独立的 结构域(domain)组成的。例如，酵母的转录激活因子GAL4，在N端有一个由147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD)，C端有一个由113 个氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)。GAL4分子的DNA结合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)结合，而 转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。但是，单独的DNA结合域不 能激活基因转录，单独的转录激活域也不能激活UAS的下游基因，它们之间只 有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。 2．试验流程 酵母双杂交系统正是利用了GAL4的功能特点，通过两个杂交蛋白在酵母细 胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来捕获新的蛋白质，其大致步骤为: 2．1、视已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait)，将其与DNA结合域融合，构建 成诱饵质粒。 2．2、将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活域融合，构建成文库质粒。2．3、将这两个质粒共转化于酵母细胞中。 2．4、酵母细胞中，已分离的DNA结合域和转录激活域不会相互作用，但诱 饵蛋白若能与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用，则可激活报告基因的转录；反之，则不能。利用4种报告基因的表达，便可捕捉到新的蛋白质。 3．特点 优点 蛋白--蛋白相互作用是细胞进行一切代谢活动的基础。酵母双杂交系统的建立 为研究这一问题提供了有利的手段和方法。 缺点 尽管该系统己被证实为一种非常有效的方法，但它也有自身的缺点和问题。1、它并非对所有蛋白质都适用，这是由其原理所决定的。双杂交系统要求两种杂 交体蛋白都是融合蛋白，都必须能进入细胞核内。因为融合蛋白相互作用激活 报告基因转录是在细胞核内发生的。2、假阳性的发生较为频繁。所谓假阳性，即指未能与诱饵蛋白发生作用而被误认为是阳性反应的蛋白。而且部分假阳性 原因不清，可能与酵母中其他蛋白质的作用有关。3、在酵母菌株中大量表达外源蛋白将产生毒性作用，从而影响菌株生长和报告基因的表达。 使用酵母双杂交技术应注意的问题 真正明了酵母双杂交技术的主要原理及筛选方法是进行酵母双杂交实验的前提，构建成功的诱饵质粒及大量的材料准备是进行酵母双杂交实验的保证。只 有明了双杂交的原理，才有可能设计实验进程、才能有目的的进行材料准备， 并能对实验结果作出预测与分析，尤其要对具体实验中各种选择性压力培养基 的使用目的要十分清楚。大量的材料准备、较长的实验流程是酵母双杂交有别
各种SD培养基： 1)SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000 ml)（？ “四缺”） 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的） ; 葡萄糖20g (即2%) 2)SD/-leu/-trp/-his (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g. (即2%) 3)SD/-leu/-trp (1000 ml) （？“二缺”） 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）; 葡萄糖 20g (即2%) 4)SD/-leu (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g (即2%) 5)SD/-trp (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.74g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g (即2%) 注意：YNB有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。我们这用的是含硫酸铵的。（买来就加进去了的）。如果不含硫酸铵，那么要在终浓度0.17%的YNB中再加入0.5%的硫酸铵，即最终在1000 ml溶液中加入总量为6.7g的YNB与硫酸铵。 实际配制的方法是： 1.配制40%的葡萄糖贮存液（贮存在4℃），过滤除菌，待高压灭菌的溶液温度降至55℃ 以下时，再将50ml葡萄糖贮存液加入。（李博士经验这一步不高压，过滤即可使用）2.酵母氮源6.7g，加DO supplement 在920ml水中溶解，调PH至5.8（李博士的经验大 约加10M NaOH 200ul即可），之后补水至950 ml。 3.高压完后待温度降至55℃以下，加入50 ml40%葡萄糖。
酵母双杂交系统原理 酵母双杂交系统(Yeast Two-hybrid System)由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域: DNA 结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含DNA-activating domain的载体。上述二类载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequence)，而GAL4-ad没有。因此，在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。 双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: 〈1〉易于转化、便于回收扩增质粒。〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA－结合结构域(如GAL4-bd，LexA-bd)；另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad，VP16)。激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中，蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达(如lacZ)，从而可分析蛋白间的结合作用。 酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高度敏感性。主要是由于：①采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。②信号测定是在自然平衡浓度条件下进行，而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤，降低了信号强度。③杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强，后者又与启动子DNA结合，此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。④通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。同时，酵母表型，X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感。 酵母双杂交筛选原理 双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。80年代的工作表明, 转录激活因子在结构上是组件式的(modular), 即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成, 其中有DNA结合结构域(DNA binding domain, 简称为DB，？BD)和转录激活结构域(activation domain, 简称为AD), 它们是转录激活因子发挥功能所必需的。单独的DB虽然能和启动子结合, 但是不能激活转录。而不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。如酵母细胞的Gal4蛋白的DB与大肠杆菌的一个酸性激活结构域B42融合得到的杂合蛋白仍然可结合到Gal4结合位点并激活转录。 Fields等人的工作标志双杂交系统的正式建立。他们以与调控SUC2基因有关的两个蛋白质Snf1和Snf2为模型, 将前者与Gal4的DB结构域融合, 另外一个与Gal4的AD结构域的酸性区域融合。由DB和AD形成的融合蛋白现在一般分别称之为“诱饵”(bait)和“猎物”或靶蛋白(prey or target protein)。如果在Snf1和Snf2之间存在相互作用, 那么分别位于这两个融合蛋白上的DB和AD就能重新形成有活性的转录激活因子, 从而激活相应基因的转
第四章基因文库构建及酵母双杂交技术 1 基因组文库的构建 基因组文库（genomic library）将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。 理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。 1. 1构建基因文库的载体选用 载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。
第四章基因文库构建及酵母双杂交技术1.1.1对载体的要求：载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。 1.1.2目前常用的载体： 载体系列（容量为24 kp ）、cosmid载体（容量为50 kb ）、YAC（容量为1 Mb ）、BAC （容量为300 kb） 1.2 基因文库构建的一般步骤 1.2.1染色体DNA大片段的制备：断点完全随机，片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法，使用物理切割法或不完全酶切法。 1.2.2载体与基因组DNA大片段的连接：直接连接、人工接头或同聚物加尾。
噬菌体载体构建基因组文库
第四章基因文库构建及酵母双杂交技术2 cDNA文库的构建 cDNA克隆的基本过程是通过一系列，酶酶催作用，使poly(A) mRNA转变成双链cDNA群体并插入到适当的载体分子上，转化大肠杆菌寄主细胞，构建包含所有基因编码序列的cDNA基因文库。 2.1高质量mRNA的制备 应用Promega PolyAT tract mRNA Isolation System 分离Poly(A)RNA。将Biotinylated Oligo(dT)引物与细胞总RNA共温育，加入与微磁球相连的Streptavidin，用磁场吸附与PMP相连的SA-Biotinylated Oligo(dT)-mRNA。
（酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中） 概念： 1. 次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/bait plasmid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（AD fusion library）转化进去。优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。 2. 共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。优点：比次序转化更容易操作。 pGBKT7----的选择物是：kanamycin（卡那霉素）？ pGADT7----的选择物是：ampicillin (氨苄西林) ？ 各种SD培养基： 1) SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000 ml)（？“四缺”） 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的）; 葡萄糖 20g (即2%) 2) SD/-leu/-trp/-his (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g. (即2%) 3) SD/-leu/-trp (1000 ml) （？“二缺”） 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）; 葡萄糖 20g (即2%) 4) SD/-leu (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的）
模块七蛋白质之间的相互作用 1.实验目的 本实验以重组质粒和酵母细胞为材料, 学习检测蛋白质相互作用的基本原理和 技术方法。主要介绍酵母双杂交的基本原理与操作技术 ; 让学生了解和掌握酵母双 杂交系统的应用 ; 掌握酵母感受态的制备的基本原理和主要的操作步骤。 2.实验原理 1989 年Fields 和Song 等人根据当时人们对真核生物转录起始过程调控的认 识(即细胞内基因转录的起始需要转录激活因子的参与,提出并建立了酵母双杂交系 统。该系统作为发现和研究活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平 台 ,近几年得到了广泛的运用和发展。 相比于其它蛋白质筛选系统,酵母双杂交系统具有以下优点:(1 检测在真核活细 胞内进行 ,在一定程度上代表细胞内的真实情况。(2 作用信号是在融合基因表达后, 在细胞内重建转录因子的作用而给出的 ,省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。(3 检测结果是基因表达产物的积累效应,因而可检测存在于蛋白质之间的微弱或暂时的相互 作用。(4 酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA 文库 ,能分析细胞质、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能蛋白。(5 通过mRNA 产生多种稳定的酶使信号放大。同时,酵母表型、X-Gal 及 HIS3 蛋白表达等检测方法均很敏感。 酵母双杂交系统也具有一定的局限性。首先 , 经典的双杂交系统分析蛋白间的 相互作用定位于细胞核内,因而限制了该系统对某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白 的研究。酵母双杂交系统的另一个局限性是“假阳性”。在酵母双杂交系统建立的 初期阶段 ,由于仅仅采用β-半乳糖苷酶这一单一的报告基因体系,这种报告基因的表 达往往不能十分严谨地被控制,因此容易产生假阳性。由于某些蛋白本身具有激活 转录的功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用, 使DNA 结合结构域融合蛋白在 无特异激活结构域的情况下也可被激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白
4月4日划线配培养基TE/LIAC PEG/LIAC 配置培养基（YPD YPDA）取酵母细胞划线30°生长3天。 需要用品：三角瓶灭菌封口膜酵母提取物蛋白胨 注：以下所有涉及菌的操作均需在超净台中完成。 4月6号星期三 （1）选择2-3mm的单克隆（枪头吸取）放入3-5ml的YPDA液体培养基，30°摇菌200rpm，8h 7号下午开始，过夜培养，次日若菌液浓度达到标准，可先置于4度冰箱保存。 需要用品：200ul灭菌枪头、50ml三角瓶、YPDA液体培养基、摇床。 4月7号星期四 （2）吸取2.5-10ul酵母培养液，加入25mlYPDA液体培养基，摇菌16-20h直到OD值0.15-0.3。 下午4点开始8号8点结束 Tips：由于第一次活化的菌夜浓度不一，此处建议设置梯度，分别取2.5、5、10 ul酵母培养液，加入25ml YPDA液体培养基（转化5个以下质粒的话，25ml菌量就够后续使用）。 4月8号星期五 （3）将菌液转移至灭菌的50ml离心管中，用天平配平后，室温下700g离心5分钟。 （4）弃掉上清，加入50ml新鲜的YPDA液体重悬菌体（由于离心转速较低，沉淀易悬起来，故倒掉上清液时要小心操作）。 （5）30°震荡培养，直到OD值达到0.4-0.5 （3-5h）。8号8点开始下午一点结束进行以下操作之前，配置好TE/LiAc溶液，并准备好冰浴。 （6）将上述菌液转移至一个灭菌的50ml离心管中，用天平配平后，室温下700g离心5分钟。（7）弃掉上清，用30ml无菌水重悬菌体（小心操作）。 （8）再次用天平配平后，室温下700g离心5分钟，弃去上清，加入1.5ml 1.1xTE/LIAC重悬菌体。（9）将上述溶液转移到灭菌的1.5mlEP管中，高速离心15s。 （10）弃去上清，加入600ul 1.1x TE/LIAC，感受态细胞制备完成，置于冰上待用。 需要物品：50ml灭菌离心管、50ml 三角瓶、1.5ml EP管、5ml灭菌枪头、1ml灭菌枪头、灭菌ddH2O、YPDA液体培养基、1.1x TE/LIAC。 1.1x TE/LIAC10ML 10xTE 1.1ml 10xliac 1.1ml Dh2O8.8ml
4月4日划线配培养基 TE/LIAC PEG/LIAC 配置培养基（YPD YPDA）取酵母细胞划线 30°生长3天。 需要用品：三角瓶灭菌封口膜酵母提取物蛋白胨 注：以下所有涉及菌的操作均需在超净台中完成。 4月6号星期三 （1）选择2-3mm的单克隆（枪头吸取）放入3-5ml的YPDA液体培养基，30°摇菌200rpm，8h 7号下午开始，过夜培养，次日若菌液浓度达到标准，可先置于4度冰箱保存。 需要用品：200ul灭菌枪头、50ml三角瓶、YPDA液体培养基、摇床。 4月7号星期四 （2）吸取2.5-10ul酵母培养液，加入25ml YPDA液体培养基，摇菌16-20h直到OD值0.15-0.3。 下午4点开始 8号 8点结束 Tips：由于第一次活化的菌夜浓度不一，此处建议设置梯度，分别取2.5、5、10 ul酵母培养液，加入25ml YPDA液体培养基（转化5个以下质粒的话，25ml菌量就够后续使用）。 4月8号星期五 （3）将菌液转移至灭菌的50ml离心管中，用天平配平后，室温下700g离心5分钟。 （4）弃掉上清，加入50ml新鲜的YPDA液体重悬菌体（由于离心转速较低，沉淀易悬起来，故倒掉上清液时要小心操作）。 （5）30°震荡培养，直到OD值达到0.4-0.5 （3-5h）。8号 8点开始下午一点结束进行以下操作之前，配置好TE/LiAc溶液，并准备好冰浴。 （6）将上述菌液转移至一个灭菌的50ml离心管中，用天平配平后，室温下700g离心5分钟。（7）弃掉上清，用30ml无菌水重悬菌体（小心操作）。 （8）再次用天平配平后，室温下700g离心5分钟，弃去上清，加入1.5ml 1.1xTE/LIAC重悬菌体。（9）将上述溶液转移到灭菌的1.5ml EP管中，高速离心15s。 （10）弃去上清，加入600ul 1.1x TE/LIAC，感受态细胞制备完成，置于冰上待用。 需要物品：50ml 灭菌离心管、50ml 三角瓶、1.5ml EP管、5ml灭菌枪头、1ml灭菌枪头、灭菌ddH2O、YPDA液体培养基、1.1x TE/LIAC。 1.1x TE/LIAC 10ML 10xTE 1.1ml 10xliac 1.1ml Dh2O 8.8ml
酵母双杂交的优势及关键点 分子生物学研究尤其是人类基因组计划的迅速发展，为适应对众多基因或蛋白进行功能研究的发展趋势，已出现了很多新技术，酵母双杂交就是其中的一种。酵母双杂交可以简要概括为：基因转录所需的转录因子的两个结构域在两个互作蛋白的吸引下位置靠近，诱导了基因的表达。 蛋白的酵母双杂交实验是以酵母的遗传分析为基础，研究反式作用因子之间的相互作用，具有其独特优势。 1、融合体蛋白之间的相互作用是在真核酵母细胞内进行，蛋白质保持天然的折叠状态，蛋白质间相互作用将更接近于体内的真实水平。 2、双杂交系统的敏感度非常高，蛋白质之间结合常数低至1mmol/L时都可以被侦测。 3、在筛选文库时，双杂交系统能够得到编码互作蛋白的基因序列，省略了其它体外检测蛋白互作方法所必须的蛋白抽提、纯化等繁琐步骤。 经典的酵母双杂交技术的建立的主要关键点在于酵母双杂系统的转录因子和报道株。 一、转录因子 典型的转录因子含有DNA结合区 (DNA-binding domain)、转录调控区 (activation domain)、寡聚化位点(oligomerization site) 以及核定位信号 (nuclear localization signal) 等功能区域。DNA结合区带共性的结构主要有：1）HTH 和 HLH 结构：由两段α-螺旋夹一段β-折叠构成，α-螺旋与β-折叠之间通过β-转角或成环连接，即螺旋-转角-螺旋结构和螺旋-环-螺旋结构。2）锌指结构：多见于 TFIII A 和类固醇激素受体中，由一段富含半胱氨酸的多肽链构成。每四个半光氨酸残基或组氨酸残基螯合一分子 Zn2+，其余约 12-13个残基则呈指样突出，刚好能嵌入 DNA 双螺旋的大沟中而与之相结合。3）亮氨酸拉链结构：多见于真核生物 DNA 结合蛋白的 C 端，与癌基因表达调控有关。由两段α - 螺旋平行排列构成，其α - 螺旋中存在每隔 7 个残基规律性排列的亮氨酸残基，亮氨酸侧链交替排列而呈拉链状，两条肽链呈钳状与 DNA 相结合。 1、酵母双杂系统的转录因子 酵母双杂交技术的建立要归功于Fields对酵母转录因子GAL4的研究，GAL4包括两个彼此分离的结构域.。位于N端1-147位氨基酸残基区段的DNA结合域（DNA binding domain，DNA-BD）和位于C端768-881 位氨基酸残基区段的转录激活域（Activation domain,AD)。DNA-BD能够识别位于GAL4效应基因（GAL4-responsivegene）的上游激活序列(Upstream activating sequence,UAS)，并与之结合。而AD则是通过与转录机构
蛋白的酵母双杂交实验 ——以钓饵蛋白筛选cDNA 文库研究蛋白相互作用 第一部分 系统简介 1. 实验原理 蛋白的酵母双杂交实验是以酵母的遗传分析为基础，研究反式作用因子之间的相互作用 对真核基因转录调控影响的实验。很早就已知道，转录活化蛋白可以和DNA 上特异的序列结合而启动相应基因的转录反应。这种DNA 结合与转录激活的功能是由转录活化蛋白上两个相互独立的结构域即DNA 结合结构域(Binding Domain, BD)和转录活化结构域(Activation Domain, AD)分别来完成的，并且这两个结构域对于基因的转录活化都是必须的。目前酵母双杂交实验采用的系统有LexA 系统和Gal4系统两种。在LexA 系统中，DNA 结合结构域由一个完整的原核蛋白LexA 构成，转录活化结构域则由一个88个氨基酸的酸性的大肠杆菌多肽B42构成，它在酵母中可以活化基因的转录; 在 Gal4系统中，BD 和AD 分别由Gal4蛋白上不同的两个结构域(1-147aa 与768-881aa)构成。在利用GAL4系统筛选cDNA 文库或研究蛋白间的相互作用时，DNA 结合结构域与靶蛋白即“诱饵”相结合，转录活化结构域与文库蛋白或要验证的蛋白相结合。一般情况下，单独的BD 可以与GAL4上游活化序列（GAL UAS ）结合但不能引起转录，单独的AD 则不能与GAL UAS 结合，只有当BD 与AD 分别表达的融合蛋白由于相互作用而导致两者在空间上相互靠近时，BD 与AD 才能与GAL UAS 结合并且引起报道基因的转录。在BD 与AD 要导入的酵母菌AH109中，通过基因工程的方法在GAL4 UASs 和启动子的下游构建了3个报道基因——ADE2，HIS3，MEL1（或LacZ ），因此可以通过营养缺陷筛选和酵母菌表型的改变来筛选或验证两个蛋白之间是否存在相互作用。GAL4系统的原理如图所示： 图一：酵母双杂交系统工作原理 Kan r Amp r pGBKT7-bait pACT2-cDNA
酵母双杂交的原理 Fields 与Song于1989年首先创立。典型的真核生长转录因子（如GAL4），都含有二个不同的结构域: DNA结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。 酵母双杂交的应用 1研究已知蛋白质与蛋白质间的相互作用2确定蛋白质功能区：对基因进行系列突变，通过检测其蛋白质相互作用的变化，确定功能区3确定未知蛋白质间的相互作用：从cDNA文库中与已知蛋白结合的未知蛋白，将cDNA与AD结合，已知蛋白与BD结合，检测报告基因的转录4确定基因治疗中多肽药物的作用机理： 酵母双杂交系统优点 （1）快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用及分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码基因。（2）作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤（3）检测在活细胞内进行，可以在一定程度上代表细胞内的真实情况（4）检测的结果可以是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。（5）酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。6双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，优点： 根据兴趣蛋白的基因序列即可筛选与其作用的目的蛋白。蛋白质在真核细胞内，处于天然状态，蛋白质之间的相互作用符合细胞内情况，即使是两种蛋白质的瞬时结合也可被检测出来。可以直接获得目的蛋白的基因序列，从而可以初步判断目的蛋白的结构和功能。 酵母双杂交系统局限性 1许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等，这些反应在核内无法进行。2有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助，这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。3酵母双杂交系统的一个重要的问题是“假阳性”。4某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用，使DNA结合结构域杂交蛋白在无特异激活结构域的情况下可激活转录。5某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域，能与其他蛋白形成稳定的复合物，从而引起报告基因的表达，产生"假阳性"结果。局限性： ?表达的外源蛋白均为融合蛋白，可能与天然状态不符，造成结果的不准确 ?本身就具有转录激活活性的兴趣蛋白不适合于该系统 ?不能定位于核内的兴趣蛋白不适合于该系统 ?需要翻译后修饰的蛋白不适合该系统 LexA酵母双杂交实验的基本流程 1. 将报告基因p8op-LacZ转化酵母EGY48菌株，用培养基SD/-Ura筛选 2. 同时构建或扩增DNA文库，并纯化足够的质粒以转化酵母细胞 3. 构建DNA-BD/靶蛋白质粒pLexA-X，作为钓饵(bait) 4. 将上述钓饵质粒pLexA-X转化EGY48(p8op-LacZ)细胞株，用SD/-His/-Ura 筛选；并用固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-His/-Ura检测此DNA-BD/靶蛋白是否具有直接激活报告基因的活性，以及对酵母细胞是否具有杀伤毒性4-1. 如果pLexA-X 能够自动激活报告基因，则设法去除其激活活性部位、或者将LacZ报告基因整合入基因组，减少半乳糖苷酶的信号作用4-2. 如果pLexA-X虽然不会自动激活报告基因，但对酵母宿主细胞有毒性，则需要与纯化的文库DNA同时转化酵母 5. 如果pLexA-X既不会自动激活报告基因，也不具有毒性，则可以与纯化的文库DNA同时、或顺序转化酵母细胞，并检测质粒转化效率。 5-1. 用SD/-His/-Trp/-Ura培养基选择阳性共转化子，并扩增，使宿主细胞中的质粒在诱导前达到最大拷贝数5-2. 上述重组子转至含X-gal的固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu，观察LacZ及Leu报告基因的表达情形，蓝色克隆即为阳性。白色克隆为假阳性，说明Leu虽有表达，但半乳糖苷酶无表达。5-3. 同时用LacZ、Leu两个报告基因的目的，是为了尽可能消除实验的假阳性误差，譬如：AD融合蛋白不与目标蛋
模块七蛋白质之间的相互作用 1. 实验目的 本实验以重组质粒和酵母细胞为材料，学习检测蛋白质相互作用的基本原理和技术方法。主要介绍酵母双杂交的基本原理与操作技术；让学生了解和掌握酵母双杂交系统的应用；掌握酵母感受态的制备的基本原理和主要的操作步骤。 2. 实验原理 1989年Fields和Song等人根据当时人们对真核生物转录起始过程调控的认识（即细胞内基因转录的起始需要转录激活因子的参与），提出并建立了酵母双杂交系统。该系统作为发现和研究活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台，近几年得到了广泛的运用和发展。 相比于其它蛋白质筛选系统，酵母双杂交系统具有以下优点：（1）检测在真核活细胞内进行，在一定程度上代表细胞内的真实情况。（2）作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。（3）检测结果是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱或暂时的相互作用。（4）酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能分析细胞质、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能蛋白。（5）通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。同时，酵母表型、X-Gal 及HIS3 蛋白表达等检测方法均很敏感。 酵母双杂交系统也具有一定的局限性。首先，经典的双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，因而限制了该系统对某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白的研究。酵母双杂交系统的另一个局限性是“假阳性”。在酵母双杂交系统建立的初期阶段，由于仅仅采用β-半乳糖苷酶这一单一的报告基因体系，这种报告基因的表达往往不能十分严谨地被控制，因此容易产生假阳性。由于某些蛋白本身具有激活转录的功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用，使DNA结合结构域融合蛋白在无特异激活结构域的情况下也可被激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域，能与其他蛋白形成稳定的复合物，从而引起报告基因的表达，产生“假阳性”结果。产生“假阴性”结果的原因可能有许多蛋白质间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、磷酸化和二硫键形成，还有些蛋白的正确折叠和功能有赖于某些非酵母蛋白的辅助等。 现在的酵母双杂交系统大都采用多种报告基因，如AH109酵母株含有三类报告基因—ADE2、HIS3、MEL1/lacZ，这三类报告基因受控于三种完全不同、异源性的GAL4-反应元件和三类启动子元件-GAL1、GAL2以及MEL1（如图6-1-1）。通过这种方法就消除了两类最主要的假阳性，一类是融合蛋白可以直接与GAL4结合位点结合或者是在结合位点附近结合所带来的假阳性；另一类是融合蛋白和某种转录因子结合后再结合到特定的TA TA盒上所带来的假阳性。ADE2一种报告基因就已经能够提供较强的营养选择压力，这时选择性地使用HIS3报告基因，一来可以降低假阳性率；二来可以控制筛选的严格性（如果需要筛选与诱饵蛋白具有较强结合的蛋白，就可以同时使用ADE2、HIS3两种报告基因；如果只需要筛选与诱饵蛋白具有中等强度或较弱结合的蛋白，就可以使用ADE2或HIS3两者中的一种）。MEL1和lacZ分别编码α-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶，可以作用于相应的底物
1 pBait-AbAi载体的构建（酵母报道子的构建） 注：酵母报道子（pBait-AbAi）包含目的顺式作用元件的一个或多个拷贝，且插入到pAbAi载体AbAi r报告基因的上游。大量研究表明最有效的构建应包含目的DNA三个以上的首尾连接的拷贝。首尾连接的拷贝产生方式很多，但对于长度小于20 bp的调控元件，人工合成寡核苷酸是最方便可靠的途径。 （1）设计并合成包含目的序列的两条反向平行的寡核苷酸序列，且两端加上与pAbAi载体酶切产物一致的粘性末端（建议合成一个目的序列的突变序列作为对照，以排除可能的假阳性）。 （2）用TE buffer溶解寡核苷酸至终浓度100 μmol/L。 （3）将正向链和反向链按照1:1的比例混合（退火后的双链寡核苷酸最大浓度为50 μmol/L）。 （4）95 ?C保温30 s，去除二级结构。 （5）72 ?C保温2 min，37 ?C保温2 min，25 ?C保温2min。 注：缓慢退火，有助于双链寡核苷酸的形成。 （6）冰上放置。退火后的产物可贮存在-20 ?C冰箱备用。 （7）酶切1 μL pAbAi载体，用凝胶回收纯化或柱纯化的方式纯化酶切产物。 注：回收前，可用琼脂糖凝胶检测是否酶切完全。 （8）将退火后的寡核苷酸稀释100倍至终浓度为0.5 μmol/L。 （9）在连接反应管中加入如下成分： pAbAi载体（50 ng/μL） 1.0 μL annealed oligonucleotide （0.5 μmol/L） 1.0 μL 10×T4 DNA ligase buffer 1.5 μL BSA（10 mg/mL）0.5 μL Nuclease-free H2O 10.5 μL T4 DNA ligase （400 U/μL）0.5 μL 总体积15 μL 注：如果有必要，可用1 μL nuclease-free H2O代替寡核苷酸作为阴性对照。 （10）将反应体系室温放置连接3 h，转化E coli，采用常规方法检测阳性克隆。
LexA酵母双杂交系统简介 一、LexA酵母双杂交系统的设计原理 报告质粒p8op-LacZ的GAL4 UAS编码序列被完全去除，因此在缺乏LexA融合激活剂的情况下，报告基因LacZ的转录活性为零，该基因的筛选标志为URA3，可以作为有自主复制能力的质粒存在于酵母EGY48菌株中，也可以被整合到EGY48基因组DNA上。 质粒pLexA的筛选标志为HIS3，在双杂交系统中用于表达DNA-BD(202个氨基酸残基组成的LexA蛋白)与目标蛋白(钓饵，Bait)的融合蛋白，该融合体的表达受酵母强启动子ADH1的调控，选择与报告基因的操纵子LexA×8结合。 质粒pB42AD的筛选标志为TRP1，在其供外源基因插入的多克隆位点(EcoR I与Xho I)上游，含有SV40核定位(SV40 nuclear localization)、HA(血凝素)及AD(来自于的88个氨基酸残基组成的B42蛋白)等几种编码序列，共同组成可以启动报告基因转录表达的激活成份。在酵母EGY48的基因组中还整合有另一个报告基因Leu，它与LacZ报告基因具有相同的操纵子-LexA，但两者启动子不同。 根据双杂交系统的原理，如果某一复合物同时具有DNA-BD和AD的活性，即可激活报告基因的转录和表达。分别将待测蛋白X、Y的编码序列插入pLexA质粒载体和pB42AD质粒载体的多克隆位点中，然后共同转入含有报告基因的酵母菌株，如果蛋白X与Y能相互作用，则启动报告基因的转录和表达，通过检测报告基因的表达情况，就可以间接反映蛋白X、Y是否具有相互作用以及作用的强弱。 如果将蛋白Y换为取自组织或血液的cDNA文库，则可用X从该文库中筛选出能与其相互作用的蛋白，并且可以获得编码这些蛋白的cDNA。 二、商品化酵母双杂交系统的组成 1. 载体质粒：pLexA、pB42AD、p8op-LacZ、pB42AD-DNA文库 2. 酵母菌株：EGY48、EGY48（p8op-LacZ）、YM4271（EGY48的伴侣菌株） 3. 大肠杆菌菌株： KC8株 4. 对照质粒：
酵母双杂交系统的发展和应用 随着对多种重要生物的大规模基因组测序工作的完成，基因工程领域又迎来了一个新的时代---功能基因组时代。它的任务就是对基因组中包含的全部基因的功能加以认识。生物体系的运作与蛋白质之间的互相作用密不可分，例如：DNA合成、基因转录激活、蛋白质翻译、修饰和定位以及信息传导等重要的生物过程均涉及到蛋白质复合体的作用。能够发现和验证在生物体中相互作用的蛋白质与核酸、蛋白质与蛋白质是认识它们生物学功能的第一步。 酵母双杂交技术作为发现和研究在活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台，在近几年来得到了广泛运用。酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。大量的研究文献表明，酵母双杂交技术既可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作，也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互作。因此，它在许多的研究领域中有着广泛的应用。本文就酵母双杂交的技术平台和应用加以介绍。 酵母双杂交系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。反式转录激活因子，例如酵母转录因子GAL4在结构上是组件式的（modular），往往由两个或两个以上结构上可以分开，功能上相互独立的结构域（domain）构成，其中有DNA结合功能域(DNA binding domain,DNA-BD)和转录激活结构域（activation domain，DNA-AD）。这两个结合域将它们分开时仍分别具有功能，但不能激活转录，只有当被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的GAL4转录因子活性，并可激活上游激活序列（upstream activating sequence, UAS）的下游启动子，使启动子下游基因得到转录。 根据这个特性，将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质Bait protein的基因构建在同一个表达载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白BD-Bait protein。将编码AD的基因和cDNA文库的基因构建在AD-LIBRARY表达载体上。同时将上述两种载体转化改造后的酵母，这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生GAL4，又不能合成LEU、TRP、HIS、ADE，因此，酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长。当上述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的报告基因HIS、ADE、LACZ、MEL1，从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落。将阳性反应的酵母菌株中的AD-LIBRARY 载体提取分离出来，从而对载体中插入的文库基因进行测序和分析工作。在酵母双杂交的基础上，又发展出了 酵母单杂交、酵母三杂交和酵母的反向杂交技术。它们被分别用于核酸和文库蛋白之间的研究、三种不同蛋白之间的互作研究和两种蛋白相互作用的结构和位点。 基于酵母双杂交技术平台的特点，它已经被应用在许多研究工作当中。