酶法制备生物柴油
摘要：生物柴油是一种对环境友好的可再生能源，酶法制备生物柴油比化学法对环境更有无法比拟的优越性。本文对目前脂肪酶催化酯交换合成生物柴油的工艺概况和酶法
制备生物柴油的研究进展以及现有工艺中存在的问题进行了综述，同时展望了酶法
催化合成生物柴油的前景。
关键词:生物柴油；脂肪酶；酯交换反应
随着世界范围内能源短缺和环境优化的需要，生物柴油(脂肪酸单酯)的应用成为关注和研究的热点。生物柴油是一种以动植物油脂为原料，经过酯交换反应(碱、酸或酶催化)加工而成的清洁可再生的脂肪酸甲酯或乙酯燃料。它是优质的石油柴油代用品，是典型的“绿色能源”和“可再生能源”[1]。生物柴油的制备可采用多种方法，酶催化法便为其中一种。酶法制备生物柴油是指用动植物油脂和短链醇通过脂肪酶进行转酯化反应，制备相应的脂肪酸甲酯或乙酯。与酸或者碱催化法制备生物柴油相比，生物酶法因其反应条件温和、醇用量相对较小、产物易分离及无污染物排放等优点而日益受到人们的青睐[2]。现开发的固定化脂肪酶催化剂不仅容易与产品分离，而且可以重复使用，降低了生产成本。废弃的酶还可以生物降解掉，工业化生产中也不会产生废水，因而受到了越来越多研究者的关注。本文就酶法制备生物柴油的一般工艺,酶法制备生物柴油的研究进展，以及现有制备工艺中存在的问题，发展前景等几个方面进行了综述。
1 酶法制备生物柴油的工艺概况
酶法合成生物柴油是指用动植物油脂和短链醇通过脂肪酶进行转酯化反应，制备相应的脂肪酸甲酯或乙酯。脂肪酶是一类可以催化甘油三酯合成和分解的酶的总称，它同时还可以催化酯交换反应，广泛分布于动物、植物和微生物的组织和器官中。工业化的脂肪酶主要有动物脂肪酶和微生物脂肪酶。其中微生物脂肪酶种类较多，如酵母脂肪酶、根霉脂肪酶、曲霉脂肪酶、毛霉脂肪酶、猪胰脂肪酶[3]等，一般通过发酵法生产，且已有部分实现了商品化。
2 酶法制备生物柴油的研究进展
2．1 游离脂肪酶法
游离脂肪酶在反应体系中分散不均、容易结块，且稳定性差，在温度、pH值和无机离子等外界因素的影响下容易变性失活，使得酯化反应速率慢。酶与底物反应结束后，即使酶仍旧具有较高活力，也难于回收利用，造成很大程度上的资
源浪费，增加了生产成本，因此游离脂肪酶法已很少使用。
2．2 固定化酶催化工艺条件的研究
酶的固定化技术是解决酶的再利用问题以及提高酶的活性及稳定性的有效方法之一。固定化酶能够重复使用，从而可大大降低生产成本，广泛应运于生物柴油的生产。目前，酶法制备生物柴油一般使用固定化脂酶间歇催化油脂合成生物柴油。但是不同的固定方法、载体、反应介质体系、酰基受体及添加策略等均对酶活力、酶对甲醇的耐受性起到显著的影响。
2.2.1 固定化方法
酶固定化方法很多，主要有吸附法，共价结合法，诱导法和微胶囊法。以物理吸附法固定酶仍是最常用的方法。该法简单易行且成本低廉，固定化载体易得。且此法中，载体与酶间靠氢键，范德华力以及疏水作用力等相互结合。无论是在水溶液还是非水体系，脂肪酶均能有效的催化甘油三酸酯的转酯反应，并且能被多种不同载体成功固定。高阳等[4]以大孔树脂吸附固定酵母脂肪酶，所得固定化酶连续反应19批以后转化率仍保持为70.2％。Hong yan Zeng[5]等以Mg–Al水滑石吸附固定酿酒酵母脂肪酶，所得固定化酶催化菜籽油的酯转换率可达96％。
近年来较好的脂肪酶固定化方法还有：采用超滤和交联法将脂肪酶固定于聚砜膜表面，将脂肪酶固定于PVA纳米纤维膜、聚氨酯泡沫[6]、甲基修饰的硅胶、壳聚糖纳米纤维膜、纤维素材料等。此外，因为必须对脂肪酶进行一定的分离提纯才能获得较高的固定化效率，使得固定化脂肪酶法的生产成本依然较高，限制了其在实际生产中的应用。
2.2.2 固定化载体的选用
用于酶固定化的载体应具有较强的机械强度及抗菌性，热力学性质稳定，化学耐受性好，具有化学实用性，且价廉易得，再生力强，产量高[5]。对酶的不同固定化单体已有广泛的研究，固定化载体的物理化学性质是影响固定化效率和固定化酶催化能力的重要因素。
徐伟[6]以磁性固体超强酸SO
2-4/TiO
2
-Fe
3
O
4
为非均相催化剂，以餐饮业废油脂为
原料与甲醇进行酯交换反应制备生物柴油。利用三因素一次回归正交设计实验方法，考察了反应温度、甲醇用量、催化剂用量对废油脂酯转化率的影响，确定了制备生物柴油的最佳反应条件；同时利用IR、XRD、SEM、EDS等对磁性固体超强酸
SO
2-4/TiO
2
-Fe
3
O
4
催化剂的结构进行了表征。研究表明：与传统的均相催化剂(H
2
SO
4
、
NaOH) 相比，磁性固体超强酸具有催化活性高、易于分离、可重复使用的特点，
是制备生物柴油的环境友好型固体酸催化剂。徐坚[7]等还利用醋酸纤维素/聚四氟乙烯复合膜中的微结构固定化脂肪酶。
2.2.2 常用的固定化介质
目前，酶法制备生物柴油常用的反应介质体系有两种：水溶液体系和有机溶剂体系。脂肪酶可以在疏水的界面进行活化，疏水底物、有机试剂等的存在可与酶活性中心周围的疏水域相互作用，从而暴露出活性中心使得酶活性增加。水充当着维持酶活性构象的“润滑剂”的作用，可使酶分子的柔性增加，因此水在反应体系中也是必不可少的。
在水溶液介质中酶分子表面更多亲水性强的残基暴露给介质，酶蛋白以一种紧密的构象存在，酶活性较低，产物的转化率也低。而在低极性的含水有机介质体系中，酶分子活性中心附近的疏水域更易与介质发生作用，通过所谓的“界面活化机理”，酶分子的空间构象以开放的形式存在，活性中心暴露出来十分利于催化反应的进行，从而酶的催化活力较高。故而，酶法制备生物柴油通常选择含有适宜水的有机反应介质体系。这种溶剂体系能使底物更好地溶解，与酶的接触面积增大，提高了底物和产物之间的传质，降低短链醇在底物中的浓度，在一定程度上减小甲醇和甘油对酶的副作用，从而降低其对酶蛋白的毒性，延长酶的使用寿命。但不同的酶对溶剂的依赖度不一样。
高阳[4]等研究了以大孔树脂在磷酸盐缓冲液和正庚烷等两种不同极性的固定
化介质中固定化的假丝酵母脂肪酶的酶活性，结果表明在正庚烷中不仅获得了较高的固定化效率(98.98%)，并且水解活力和表观酶活回收率分别提高了4.07和
3.43倍。利用磷酸盐缓冲液作介质固定化脂肪酶催化合成生物柴油，4 h内的转化率仅达20％，而利用正庚烷作介质固载酶生物柴油转化率可达70％，酶酯交换活力得到极大地提高。
2.2.3 常用的酰基受体及添加策略
酶法制备生物柴油一般采用以甲醇为酰基受体的醇解法，但高浓度的甲醇易使酶失活，且副产物甘油可聚集在固定化酶载体表面，对反应产生严重的副作用。反应中需通过分批添加甲醇及用有机溶剂洗涤除去固定化酶表面的甘油等方法来提高甲酯产率和酶的操作稳定性。近来大量研究表明，使用其他的酰基受体，如乙酸甲酯、乙酸乙酯及相应的酐等代替甲醇进行酶促酯交换反应不仅工艺简单，转化率高，而且大大提高了酶的操作稳定性，具有良好的工业应运前景。
黄瑛[8]等探索了以乙酸甲酯作为酰基受体，固定化脂肪酶催化棉籽油酯交换制
备生物柴油的新工艺。研究结果表明，最佳酯交换条件为：脂肪酶Novozym 435加入量为棉籽油质量的30％，乙酸甲酯和棉籽油的摩尔比14∶1，反应温度40℃，反应时间14 h。在此条件下，精制棉籽油和粗制棉籽油的最高甲酯得率均可达到97％，且反应物乙酸甲酯和副产物三乙酸甘油酯均对脂肪酶无失活作用。该工艺有利于连续操作，脂肪酶反应40批次后的酶活没有显著变化，保持了良好的稳定性。陈志锋[9]等探讨了固定化脂肪酶Novozym 435催化高酸废油脂与乙酸甲酯酯交换生产生物柴油：反应24 h后甲酯产率为77.5％。但该值大大低于以精制玉米油为原料时的甲酯产率(86.2%)，故系统研究了反应体系中的水、游离脂肪酸和乙酸对反应的影响。发现乙酸甲酯与游离脂肪酸反应产生的副产物乙酸是导致甲酯产率显著下降的原因。在反应体系中添加适量(油重的10%)的有机碱三羟甲基氨基甲烷或三乙胺后，有效地提高了酶促高酸废油脂的酯交换反应速率和甲酯产率，使反应12 h 后的甲酯产率分别达到85.9％和80.8％。碱的加入还提高了酶的操作稳定性，添加有机碱三羟甲基氨基甲烷或三乙胺可使反应10批次后Novozym 435的相对酶活力分别由对照值86％提高到97％和93％。
2．3 全细胞固定法
全细胞固定化法是将产脂肪酶的微生物直接固定到支持物上，从而制备全细胞催化剂，这种方法比固定化酶更为简便、经济，而且固定化过程可在批量化发酵时同步完成。根据全细胞催化剂的发展历程和固定方法的差异，主要分为真菌全细胞催化剂、酵母全细胞催化剂、大肠杆菌全细胞催化剂三种。同时还发现利用不同的脂肪酸作为碳源，细胞膜的脂肪酸组成不同，细胞催化剂的催化活性和稳定性也不同，不饱和脂肪酸有利于提高细胞膜的通透性，使酶催化活性提高，而饱和脂肪酸有利于提高细胞的刚性，使酶稳定性提高。
李迅[10]等利用石油醚直接浸提法抽提得到含油率达到55.84％的麻疯树籽油作为原料，采用米根霉菌株和聚氨酯泡沫制备成固定化全细胞生物催化剂，通过对全细胞生物催化法制备生物柴油的主要工艺参数进行了优化，获得最佳工艺条件为：当甲酯化反应的醇油比为6：1，转酯化温度为35℃，转酯化体系中2％～20％质量分数的含水率，菌体量相当于油质量的4％，每12 h加入一次甲醇的条件下转酯化效果最好，甲酯得率达到82.29％。同时固定化全细胞生物催化剂的重复使用性达4次，具有较高的催化性能。
3 存在的问题和采取的措施
生物酶法具有条件温和、醇用量小、产品易于收集、无污染排放等优点，是
一种很有潜力的绿色生产方法。但生产中酶的成本过高、甲醇和甘油对酶的毒害作用这两大问题还未能得到根本性地解决，使得生物酶法一直不能在工业生产上得到推广应用。因此，开发价廉高效的酶催化剂以及优化生物柴油的生产工艺对生物柴油的酶法生产尤为迫切。近年来，国内的研究者也在不断寻求性能更优异的脂肪酶和提高转化率。
3.1 甲醇的积累毒害作用
酶法制备生物柴油的现有工艺中，由于甲醇的积累毒害作用，维持液体脂肪酶功能构象的氢键体系逐渐被破坏，酶活力随着反应时间的延长而降低或者消失。近来对其他的酰基受体，如乙酸甲酯、乙酸乙酯及相应的酐等进行了大量研究，表明使用这些酰基受体代替甲醇进行酶促酯交换反应不仅工艺简单，转化率高，而且大大提高了酶的操作稳定性，具有良好的工业应运前景。
3.2 反应副产物
醇解法制备生物柴油时，醇解反应的副产物(甘油)容易吸附在固定化酶表面从而导致酶活性下降。很多学者对此进行了研究。吴虹[11]探讨了无溶剂系统中固定化脂肪酶Novozym 435催化餐饮业废油脂转酯生产生物柴油。发现反应副产物甘油可吸附在固定化酶载体表面，可采用丙酮洗涤除去甘油可提高酶的稳定性。在适宜的醇/油摩尔比、酶用量、反应温度和摇床转速下采用分步加入甲醇法，在反应进行到6和14 h时用丙酮除去酶表面的甘油，然后按醇/油摩尔比为1的比例加入甲醇继续反应，反应30 h后产物中的脂肪酸甲酯含量为88.6%。连续反应300 h后，酶活性基本没有下降。
除此之外，现研究开发了一些如乙酸甲酯的新型酰基受体制备生物柴油，可以有效避免这一副产物，也可选择可以溶解甘油的溶剂体系。丁荣[12]等以可以溶解甘油的氯化镁饱和溶液为反应体系，对采用固定化脂肪酶 Lipozyme TL IM催化光皮树油脂转化为生物柴油的工艺进行了研究。结果表明，采用氯化镁饱和溶液反应体系，在醇油摩尔比为3:1，摇床转速为150r/min，反应8h 时，生物柴油产率高达86.5%。与传统的三步甲醇醇解或者有机溶剂反应体系比较，采用的氯化镁饱和溶液体系的酶稳定性更好，反应效率更高，有效地解决了酶在甲醇中失活的问题，生产成本低，可成为生产生物柴油的新工艺。
3.3 传质阻力的影响
直接利用微生物胞内脂肪酶作为催化剂利于反应后产物的分离及细胞的回用，且成本较为低廉，但存在传质阻力的问题。因为在脂肪酶不泄漏到胞外的情
况下，反应底物需要通过细胞壁进入细胞内与酶结合，因此细胞的通透性是影响传质阻力的主要因素。
4 展望
随着能源危机和环境污染的加剧，开发绿色的可再生能源是人类摆脱此窘境的蹊径。生物酶法催化制备生物柴油反应条件温和，无污染物排放，符合绿色化学发展的方向，但脂肪酶生产成本高，酶易失活，使用寿命短等成为其产业化的瓶颈。
4.1高效廉价脂肪酶的开发
为了降低脂肪酶的使用价格，一些研究者致力于高效廉价的脂肪酶的研究，以降低酶法制备生物柴油的生产成本，努力实现酶法制备生物柴油的工业化生产。
4.1.1 微藻油脂
借助基因工程和遗传工程技术手段及光照培养技术，培养繁衍能力强、油脂含量高、生长周期短的工程微藻，降低微藻生物柴油生产成本，比植物油脂生产生物柴油更具有商业竞争力。
4.1.2 餐饮业废油脂
餐饮业废弃的食用油、地沟油、植物油脂加工后的油脚可作为制备生物柴油的原料。虽然原料成本低，但在这些原料中聚合物和游离脂肪酸含量高[13]，黏度高，进行转酯化反应前必须进行预处理，如用硅酸镁吸附除去游离脂肪酸等杂质[14]，否则易导致催化剂失活。故餐饮废油脂的处理也是亟待优化的技术。
4.2 固定化材料和固定化方法
在酶的固定化过程中，必须对脂肪酶进行一定的分离提纯才能获得较高的固定化效率，使得固定化脂肪酶法的生产成本依然较高，限制了其在实际生产中的应用。固定化脂肪酶生产生物柴油今后的研究重点，仍然在于寻找更好的固定化材料和固定化方法，进一步改善固定化酶的相对活力、热稳定性、低碳醇耐受性和催化底物适用范围等性能。
5 结语
酶法制备生物柴油为实现生物柴油工业化生产迈出了坚实的一步，但是用酶法制备来实现生物柴油工业化生产的实例仍然很少。这主要的原因是酶的价格昂贵、酶容易失活，活化效果好的固定化载体尚未找到。这都迫使研究者们对现有工艺进行改进，对高效廉价脂肪酶的开发做出不懈的努力。
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共三套 《酶工程》试题一： 一、是非题（每题1分，共10分） 1、酶是具有生物催化特性的特殊蛋白质。（） 2、酶的分类与命名的基础是酶的专一性。（） 3、酶活力是指在一定条件下酶所催化的反应速度，反应速度越大，意味着酶活力越高。（） 4、液体深层发酵是目前酶发酵生产的主要方式。（） 5、培养基中的碳源，其唯一作用是能够向细胞提供碳素化合物的营养物质。（） 6、膜分离过程中，膜的作用是选择性地让小于其孔径的物质颗粒成分或分子通过，而把大于其孔径的颗粒截留。（） 7、在酶与底物、酶与竞争性抑制剂、酶与辅酶之间都是互配的分子对，在酶的亲和层析分离中，可把分子对中的任何一方作为固定相。（） 8、角叉菜胶也是一种凝胶，在酶工程中常用于凝胶层析分离纯化酶。（） 9、α－淀粉酶在一定条件下可使淀粉液化，但不称为糊精化酶。（） 10、酶法产生饴糖使用α－淀粉酶和葡萄糖异构酶协同作用。（） 二、填空题（每空1分，共28分） 1、日本称为“酵素”的东西，中文称为__________,英文则为__________,是库尼（Kuhne）于1878年首先使用的。其实它存在于生物体的__________与__________。 2、1926年，萨姆纳（Sumner）首先制得__________酶结晶，并指出__________是蛋白质。他因这一杰出贡献，获1947年度诺贝尔化学奖。
3、目前我国广泛使用的高产糖比酶优良菌株菌号为__________,高产液化酶优良菌株菌号为___________。在微生物分类上，前者属于__________菌，后者属于__________菌。 4、1960年，查柯柏（Jacob）和莫洛德（Monod）提出了操纵子学说，认为DNA分子中，与酶生物合成有关的基因有四种，即操纵基因、调节基因、__________基因和__________基因。 5、1961年，国际酶委会规定的酶活力单位为：在特定的条件下（25oC，PH及底物浓度为最适宜）__________,催化__________的底物转化为产物的__________为一个国际单位，即1IU。 6、酶分子修饰的主要目的是改进酶的性能，即提高酶的__________、减少__________，增加__________。 7、酶的生产方法有___________，___________和____________。 8、借助__________使__________发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。 9、酶的分离纯化方法中，根据目的酶与杂质分子大小差别有__________法，__________法和__________法三种。 10、由于各种分子形成结晶条件的不同，也由于变性的蛋白质和酶不能形成结晶，因此酶结晶既是__________，也是__________。 三、名词术语的解释与区别（每组6分，共30分） 1、酶生物合成中的转录与翻译 2、诱导与阻遏 3、酶回收率与酶纯化比（纯度提高比） 4、酶的变性与酶的失活
限制性核酸内切酶（以下简称限制酶）：限制酶主要存在于微生物（细菌、霉菌等）中。一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子。是特异性地切断DNA链中磷酸二酯键的核酸酶（“分子手术刀”）。发现于原核生物体内，现已分离出100多种，几乎所有的原核生物都含有这种酶。是重组DNA技术和基因诊断中重要的一类工具酶。例如，从大肠杆菌中发现的一种限制酶只能识别GAATTC序列，并在G和A 之间将这段序列切开。目前已经发现了200多种限制酶，它们的切点各不相同。苏云金芽孢杆菌中的抗虫基因，就能被某种限制酶切割下来。在基因工程中起作用。 DNA连接酶：主要是连接DNA片段之间的磷酸二酯键，起连接作用，在基因工程中起作用。 DNA聚合酶：催化脱氧核苷酸之间的聚合反应。主要是连接DNA片段与单个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键，在DNA复制中起做用。 DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。 DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链；而DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来。因此DNA连接酶不需要模板。 RNA聚合酶（又称RNA复制酶、RNA合成酶）的催化活性：RNA聚合酶以完整的双链DNA为模板，转录时DNA的双链结构部分解开，转录后DNA仍然保持双链的结构。真核生物RNA聚合酶：真核生物的转录机制要复杂得多，有三种细胞核内的RNA聚合酶：RNA 聚合酶I转录rRNA，RNA聚合酶II转录mRNA，RNA聚合酶III转录tRNA和其它小分子RNA。在RNA复制和转录中起作用。 反转录酶：属RNA指导的DNA聚合酶，具有三种酶活性，即RNA指导的DNA聚合酶，RNA酶，DNA指导的DNA聚合酶。在分子生物学技术中，作为重要的工具酶被广泛用于建立基因文库、获得目的基因等工作。在基因工程中起作用。
名词解释 1、同工酶是指催化相同的化学反应，而酶蛋白的分子结构理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。 2、酶原：有些酶在细胞内合成或初分泌时只是酶的无活性前体，此前体物质称为酶原。 3、别构效应:当底物或底物以外的物质和别构酶分子上的相应部位非共价地结合后,通过酶分子构象的变化影响酶的催化活性,这种效应成为别构效应 4、酶的活性中心：酶的活性中心是指酶分子中直接和底物结合，并和酶催化作用直接有关的部位。 5、酶的抑制剂：能使酶的必需基团或酶活性部位中的基团的化学性质改变而降低酶的催化活性甚至使酶的催化活性完全丧失的物质。 6、酶的专一性酶对其所催化的底物具有较严格的选择性，即一种酶仅作用于一种或一类化合物，或一定的化学键，催化一定的化学反应并产生一定的产物，酶的这种特性称为酶的特异性。根据酶对其底物结构选择的严格程度不同，酶的特异性可大致分为三种类型，即绝对特异性，相对特异性和立体异构特异性。 7.核酶：有催化作用的RNA。 8、竞争性抑制作用：有的抑制剂与酶的底物结构相似，可与底物竞争跟酶结合，这种抑制称为竞争性抑制作用。 问答题 1、酶的活性中心特点： （1）活性部位在酶分子的总体积中只占相当小的部分； （2）酶的活性部位是一个三维实体； （3）酶的活性部位与底物诱导契合； （4）酶的活性部位是位于酶分子表面的一个裂缝内； （5）底物通过次级键较弱的力结合到酶上； （6）酶活性部位具有柔性或可运动性 2、简述酶具有高效催化的因素 答案要点：
（1）、邻近定向效应：指底物和酶活性部位的邻近，使底物反应浓度有效提高，使分子间反应成为分子内反应。 （2）、张力和形变：底物结合诱导酶分子结构变化，而变化的酶分子又使底物分子的敏感键产生张力甚至形变，促进酶-底物中间产物进入过渡肽。 （3）、酸碱催化: 酶活性部位上的某些基团可以作为良好的质子供体或受体对底物进行酸碱催化, 达到降低反应活化能的目的。 （4）、共价催化：酶和底物形成不稳定的共价中间物，从而促进产物形成。 3、举例说明竞争性抑制的特点和实际意义。 解答要点:有些抑制剂与底物竞争与酶结合,妨碍酶与底物结合,减少酶的作用机会,这种现象成为竞争性抑制. 竞争性抑制的一个特点是当底物浓度很高时,抑制作用可以被解除. 酶的竞争性可逆抑制剂的酶动力学特征是Vmax不变，Km增加.研究酶的竞争性抑制作用在医学,工农业生产上以及基础理论研究上都有一定的意义. 4、很多酶的活性中心均有组氨酸残基参与，请解释原因。 答题要点： 酶蛋白分子中组氨酸的侧链咪唑基pK值为6.0～7.0，在生理条件下，一半解离，一半不解离，因此既可以作为质子供体（不解离部分），又可以作为质子受体（解离部分），既是酸，又是碱，可以作为广义酸碱共同催化反应，因此常参与构成酶的活性中心。 5、简述竞争性抑制剂与非竞争性抑制剂的区别 竞争性抑制剂抑制剂结构与底物相似，共同竞争酶的活性中心，抑制作用大小与抑制剂和底物的相对浓度有关。Km值增大，Vm不变。 非竞争性抑制剂非抑制剂结构与底物不相似或完全不同，它只与活性中心外的必需基团结合，形成EI和EIS，使E和ES都下降。该抑制作用的强弱只与抑制剂浓度有关，Km值不变，Vm下降。 论述题
年级2001 专业生物技术 一名词解释（每题3分，共计30分） 1.酶工程 2.自杀性底物 3.别构酶 4.诱导酶 5.Mol催化活性 6.离子交换层析 7.固定化酶 8.修饰酶 9.非水酶学 10.模拟酶 二填空题(每空1分,共计30分) 1.决定酶催化活性的因素有两个方面，一是，二是 。 2.求Km最常用的方法是。 3.多底物酶促反应的动力学机制可分为两大类，一类是，另一类是 。 4.可逆抑制作用可分为，，， 。 5.对生产酶的菌种来说，我们必须要考虑的条件有，一是看它是不是，二是能够利用廉价原料，发酵周期，产酶量，三是菌种不易，四是最好选用能产生酶的菌种，有利于酶的分离纯化，回收率高。 6.酶活力的测定方法可用反应法和反应法。 7.酶制剂有四种类型即酶制剂，酶制剂，酶制剂和 酶制剂。 8.通常酶的固定化方法有法，法，法， 法。 9.酶分子的体外改造包括酶的修饰和修饰。 10.模拟酶的两种类型是酶和酶。 11.抗体酶的制备方法有法和法。 三问答题(每题10分,共计40分) 1.固定化酶和游离酶相比，有何优缺点 2.写出三种分离纯化酶蛋白的方法，并简述其原理。 3.为什么酶制剂的生产主要以微生物为材料 4.下面是某人对酶测定的一些数据，据此求出该酶的最大反应速度和米氏常数。
10-6 10-6 10-5 10-5 10-5 10-4 10-4 10-2 酶工程试题（B） 一名词解释 1.抗体酶 2.酶反应器 3.模拟酶 4.产物抑制 5.稳定pH 6.产酶动力学 7.凝胶过滤 8.固定化酶 9.非水酶学 10.液体发酵法 二填空题(每空1分,共计30分) 值增加，其抑制剂属于抑制剂，Km不变，其抑制剂属于抑制剂，Km 减小，其抑制剂属于抑制剂。 2.菌种培养一般采用的方法有培养法和培养法。 3.菌种的优劣是影响产酶发酵的主要因素，除此之外发酵条件对菌种产酶也有很大的影响，发酵条件一般包括，，，， 和等。 4.打破酶合成调节机制限制的方有，，。 5.酶生物合成的模式分是，，， 。 6.根据酶和蛋白质在稳定性上的差异而建立的纯化方法有法，法和 法 7. 通常酶的固定化方法有法，法，法， 法。 8. 酶分子的体外改造包括酶的修饰和修饰。 9.酶与抗体的重要区别在于酶能够结合并稳定化学反应的，从而降低了底物分子的，而抗体结合的抗原只是一个态分子，所以没有催化能力 三问答题(每题10分,共计40分) 1.在生产实践中，对产酶菌有何要求 2.对酶进行化学修饰时，应考虑哪些因素 3.列出用共价结合法对酶进行固定化时酶蛋白上可和载体结合的功能团 4.某酶的初提取液经过一次纯化后，经测定得到下列数据，试计算比活力，回收率及纯化 倍数。
目前在高中教学中，对于转录是否需要ＤＮＡ解旋酶这个问题看法不统一，本人根据手边的资料、自己的理解就这一问题谈谈看法。 一、DNA解旋酶 ＤＮＡ解旋酶，即在ＤＮＡ不连续复制过程中，结合于复制叉前面，催化ＤＮＡ双链结构解链，并具有ＡＴＰ酶活性的酶，两种活性相互偶联，通过水解ＡＴＰ提供解链的能量。不同来源的ＤＮＡ解旋酶都需要通过水解ＡＴＰ提供解链的能量，而不同的酶对活性的影响与复制叉结构的存在与否有关。 ＤＮＡ解旋酶（ＤＮＡｈｅｌｉｃａｓｅ），通常为流体蛋白环，通过ＡＴＰ水解产生的能量由解旋酶装载器装载到ＤＮＡ单链上（单链穿过环中央），有方向极性，该极性就是它结合的单链的极性。像ＤＮＡ聚合酶一样同样具有延伸性。与解旋酶装载器结合，装载到单链ＤＮＡ之前，ＤＮＡ解旋酶是没有活性的，只有解旋酶装载器将它装载到单链ＤＮＡ上，解旋酶装载器自动离开之后，ＤＮＡ解旋酶的活性被激活。当双链全部解开时，运动到单链末端，它才离开从单链。需要注意，ＤＮＡ解旋酶结合的是ＤＮＡ单链，至于它结合的单链，是由起始子蛋白作用到被称为复制器的ＤＮＡ区段使该区段发生双链解旋才产生的。ＤＮＡ解旋酶作用于ＤＮＡ双链的氢键上。 二、RNA的转录 ＲＮＡ的转录过程是遗传信息从基因转移到ＲＮＡ的过程。ＲＮＡ聚合酶通过与一系列组分构成动态复合体，并以基因序列为遗传信息模板，催化合成序列互补的ＲＮＡ，包括转录起始、延伸、终止等过程。不需要ＤＮＡ解旋酶。 （一）ＲＮＡ的转录 １．ＲＮＡ合成的基本特征。需要底物：４种核糖核酸三磷酸ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ。方向：从５端到３端。不需要引物。需要ＤＮＡ为模板。转录是以ＤＮＡ两条链中的一条为模板合成ＲＮＡ的过程。 ２．转录过程所需酶和转录因子。转录过程需要启动子转录因子以及相关调控元件。大肠杆菌ＲＮＡ聚合酶的分子量约４５０ｋＤａ，由四种５个亚基（α２ββ＇σ）组成全酶（ｈｏｌｏｅｎｚｙｍｅ），σ解离后的部分（α２ββ＇）称为核心酶。α亚基可能参与全酶的组装及全酶识别启动子，从而决定哪些基因可转录；β亚基与底物（ＮＴＰ）及新生ＲＮＡ链结合；β＇亚基与模板ＤＮＡ结合；β和β＇亚基组成酶的活性中心，通过ＤＮＡ的磷酸基团与核心酶的碱性基团间的非特异性吸附作用，核心酶能与模板ＤＮＡ非特异性松弛结合；σ亚基的功能是识别启动子，辨认转录起始点，但不能单独与ＤＮＡ模板结合，当它与核心酶结合时，可引起酶构象的改变，在转录延长阶段，σ亚基与核心酶分离，仅由核心酶参与延长过程。 真核生物有三种ＲＮＡ聚合酶，分别催化不同ＲＮＡ的合成，每种酶都需要一些蛋白质辅助因子，称为转录因子。ＲＮＡ聚合酶Ⅰ催化ｒＲＮＡ前体的合成，ＲＮＡ聚合酶Ⅱ催化ｍＲＮＡ前体的合成，ＲＮＡ聚合酶Ⅲ催化ｔＲ－ＮＡ前体的合成。 ３．转录过程。转录分为几个阶段，转录泡的形成，ＲＮＡ合成开始，转录泡沿着ＤＮＡ迁移，转录的终止。转录因子聚集到基因的调控区域，ＲＮＡ聚合酶之类的酶分子把基因的ＤＮＡ序列信息转录为游离的ＲＮＡ分子，转录就开始了。在ＲＮＡ聚合酶和双链ＤＮＡ在启动子处形成一个“闭合复合物”识别模版。然后ＤＮＡ双链解聚，形成“开放复合物”，这个过程是由ＲＮＡ聚合酶完成的，ＤＮＡ双链的有限解聚并不需要来自于ＡＴＰ水解释放的能量，这与ＤＮＡ解旋酶不同（ＵｎｌｉｋｅａＤＮＡｈｅｌｉｃａｓｅｒｅａｃｔｉｏｎ，ｔｈｉｓｌｉｍｉｔｅｄｏｐｅｎｉｎｇｏｆｔｈｅｈｅｌｉｘｄｏｅｓｎｏｔｒｅｑｕｉｒｅｔｈｅｅｎｅｒｇｙｏｆＡＴＰｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ）。模板链暴露出来，可以和核苷酸配对，转录泡从ＲＮＡ聚合酶结合的地方开始，由ＤＮＡ链局部解链形成。转录起始是ＲＮＡ链的第一个核苷酸的合成。第一个核苷酸（ＮＴＰ）带着３个磷酸基，其后每加入一个核苷酸脱去一个焦磷酸，形成磷酸二酯键。在合成前９个核苷酸时候，ＲＮＡ聚合酶停留在启动子处。只有当聚合酶成功地在链上延伸并且离开启动子后，启动期才结束。启动子就是帮助ＲＮＡ聚合酶识别并结合到模板上，完成转录起始的一段ＤＮＡ序列。在此过程中形成较短的ＤＮＡ－ＲＮＡ杂交链。在延伸过程中，聚合酶沿着ＤＮＡ链移动不断合成ＲＮＡ链。随着酶的迁移，它使ＤＮＡ双螺旋解链，并且使模板的一个新区段以单链形式暴露出来。核苷酸共价结合到延伸的ＲＮＡ链的３＇端，在松弛区域形成一个 RNA的转录过程是否需要DNA解旋酶 张华玲 （四川省泸州市高级中学，四川泸州６４６３００） 摘要：目前在高中教学中，对于转录是否需要D N A解旋酶这个问题看法不统一，本人对此理解资料分析认 为，R N A聚合酶以基因序列为遗传信息模板，催化合成序列互补的R N A，包括转录起始、延伸、终止等过程。原 核生物与真核生物D N A转录都需要R N A聚合酶，但是有所差异。转录为R N A的过程不需要D N A解旋酶。 关键词：R N A的转录；D N A解旋酶；教学 中图分类号：[Q342+.3]文献标志码：B文章编号：1674-9324（2012）10-0161-02 【专题研讨】
2014~2015学年第一学期高一年段生物科作业 ——“降低化学反应活化能的酶（2）” （班级：姓名：座号：成绩：）一．单项选择题 1.关于酶生理功能的叙述，下列哪一项是正确的（） A．生物体内的化学反应提供能量 B．能加快生物体内的生化反应速度 C．酶是一种高效、专一的无机催化剂 D．能促进生物体内营养物质的运输 2.在唾液淀粉酶水解淀粉的实验中，将唾液稀释10倍，与用唾液原液的实验效果基本相同，这 表明酶具有（） A．专一性 B．多样性 C．高效性 D．稳定性 3. 下列条件中，不能使酶失活的是（） A．高温 B．低温 C．强酸 D．强碱 4. 在不破坏高等植物细胞正常生命活动的情况下，下列哪种物质最适于除去植物细胞的细胞壁（） A．蛋白酶 B．淀粉酶 C．盐酸 D．纤维素酶 5.下列有关酶的叙述错误的是 ( ) A.组成大多数酶的基本单位是氨基酸 B.少数的酶是RNA C.每种酶都具有高效性、专—性，但不具备多样性 D.酶都具有消化功能 6.不能催化过氧化氧生成H2O和O2的是 ( ) A.FeCl3中的Fe3+ B.FeCl3中的Cl- C.肝脏中的过氧化氧酶 D.马铃苗中的过氧化氢酶 7.关于酶的性质，下列表述中错误的一项是 ( ) A.化学反应前后，酶的化学性质和数量保持不变 B.一旦离开活细胞，酶就失去催化能力 C.酶是活细胞产生的—类特殊有机物，其中大多数酶为蛋白质，少数为RNA D.酶的催化效率很高，但受温度、酸碱度影响 8．胃蛋白酶的最适PH约为2左右，在测定胃蛋白酶活性时，将溶液PH由10降到2的过程中，胃蛋白酶的活性将（） 9.下图是在最适温度下，麦芽糖酶的催化速率与麦芽糖量的关系。有关叙述正确的是 ( ) A．可用斐林试剂鉴定麦芽糖的分解情况 B．A点时，麦芽糖酶全部参与催化 C．如果温度上升5 ℃，B点向左下方移动 D．因受酶活性的限制，BC段催化速率不再增加 10.甲图表示温度与淀粉酶活性的关系，乙图是将一定量的淀粉酶和充足的淀粉反应后，麦
酶工程复习题 一、选择题： 1.下面关于酶的描述，哪一项不正确( ) （A）（答案）所有的蛋白质都是酶 （B）酶是在细胞内合成的，但也可以在细胞外发挥催化功能 （C）酶具有专一性 （D）酶是生物催化剂 2.下列哪一项不是辅酶的功能( ) （A）转移基团 （B）传递氢 （C）传递电子 （D）（答案）决定酶的专一性 3.下列对酶活力的测定的描述哪项是错误的( ) （A）酶的反应速度可通过测定产物的生成量或测定底物的减少量来完成 （B）需在最适pH条件下进行 （C）（答案）按国际酶学会统一标准温度都采用25℃ （D）要求[S]远远小于[E] 4.下列关于酶活性部位的描述，哪一项是错误的 （A）活性部位是酶分子中直接与底物结合，并发挥催化功能的部位 （B）活性部位的基因按功能可分为两大类：一类是结合基团，一类是催化基团（C）酶活性部位的集团可以是同一条肽链但在一级结构上相距很远的集团（D）（答案）不同肽链上的有关基团不能构成该酶的活性部位 5.酶的高效率在于 （A）增加活化能 （B）降低反应物的能量水平 （C）增加反应物的能量水平 （D）（答案）降低活化能
6.作为催化剂的酶分子，具有下列哪一种能量效应 （A）增高反应活化能 （B）（答案）降低反应活化能 （C）增高产物能量水平 （D）降低产物能量水平 二、填空题 1.酶和菌体固定化的方法很多。主要可分为吸附法、结合法、交联法和热处理法 2.系统命名法根据酶所催化的反应类型，将酶分为6大类。即1、氧化还原酶；2、转移酶； 3、水解酶； 4、裂合酶； 5、异构酶； 6、合成酶（或称连接酶）。 3.酶分子修饰中，经过修饰的酶的特性会改变，即可提高酶活力，增加稳定性或降低抗原性。 4.决定酶催化活性的因素有两个方面，一是酶分子结构，二是反应条件。 5.酶的特点酶是生物催化剂；其反应条件温和、催化效率高；酶具有高的作用专一性；其化学本质具有蛋白质性质。 6.常用产酶菌有细菌（大肠杆菌）；霉菌（黑曲酶；青酶；木酶；根酶）；放线菌（链酶菌）；酵母等。 7.通常酶的固定化方法有吸附法共价键结合法交联法包埋法 8.对生产酶的菌种来说，我们必须要考虑的条件有，一是看它是不是致病菌，二是能够利用廉价原料，发酵周期短，产酶量高，三是菌种不易退化，四是最好选用能产生胞外酶的菌种，有利于酶的分离纯化，回收率高。 9. 酶的生产方法有提取法，发酵法和化学合成法。 10. 借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。 11. 酶的分离纯化方法中，根据目的酶与杂质分子大小差别有凝胶过滤法，超滤法和超离心法三种。 12.酶的特点酶是生物催化剂；其反应条件温和、催化效率高；酶具有高的作用专一性；其化学本质具有蛋白质性质。 13.在酶的发酵生产中，培养基要从营养的角度考虑碳源、氮源、无机盐、生长因素的调
酶工程习题集 第一章绪论 1、发展史： 1903年Henri中间络合物学说；1913年Leonor Michaelis和Maud Menten 米氏方程；Daniel E. Koshland提出了诱导契合学说。1926年，萨母纳（Sumner）提出酶的本质是蛋白质的观点。1960年．雅各（Jacob）和莫若德（Monod）提出操纵子学说，1982年，切克（Cech）等人发现四膜虫（Tetrahynena）细胞的26s rRNA前体具有自我剪接功能(self-splicing)。核酶（Ribozyme，也称核糖核酸酶，以区别于蛋白质酶）；1983年阿尔彻曼（Sidney. Altman）发现核糖核酸酶P （RNAase P） 2、核酸类酶（ribozyme)：具有生物催化剂所有特性，是一类由RNA组成的酶。 底物有哪些？ 3、酶的新概念？分类？ 4、人工酶、模拟酶、化学修饰酶、克隆酶、突变酶、新酶、抗体酶 第二章酶学基础 1、酶促反应的特点？优缺点？ 2、按酶促反应性质将生物体所有的酶分为哪六大类？如何编号？ 3、终止一个酶促反应的方法有哪些？ 4、全酶的组成？按酶蛋白结构不同分类？ 5、别构酶、别构效应、配体 6、活性部位（结合部位与催化部位），必需基团，活性中心的亲核性基团：酸碱 性基团： 7、参与蛋白类酶活性中心频率最高的氨基酸7 种？ 8、酶活力单位（U）；比活力；同族酶；丝氨酸蛋白酶与巯基蛋白酶各有哪些？ 9、酶活性中心基团的检测方法有哪三种？ 10、酶的pH稳定性与温度稳定性如何测定？ 第三章酶的催化机制 1、酶高效率催化的五种机制 2、何谓邻近与定向效应？何谓构象变化效应？何谓共价催化？何谓酸碱催化？ 何谓微环境效应？如何理解？ 第四章酶的催化动力学 1、绘制底物浓度对酶促反应速度影响的双曲线（标明各参数），并简述其影响。 2、米-曼氏方程（Michaelis-Menten equation）；中间产物学说 3、稳态的含义，中心内容。
酶工程试题(A) 年级2001 专业生物技术 一名词解释（每题3分，共计30分） 1.酶工程 2.自杀性底物 3.别构酶 4.诱导酶 5.Mol催化活性 6.离子交换层析 7.固定化酶 8.修饰酶 9.非水酶学 10.模拟酶 二填空题(每空1分,共计30分) 1.决定酶催化活性的因素有两个方面，一是，二是 。 2.求Km最常用的方法是。 3.多底物酶促反应的动力学机制可分为两大类，一类是，另一类是 。 4.可逆抑制作用可分为，，， 。 5.对生产酶的菌种来说，我们必须要考虑的条件有，一是看它是不是，二是能够利用廉价原料，发酵周期，产酶量，三是菌种不易，四是最好选用能产生酶的菌种，有利于酶的分离纯化，回收率高。 6.酶活力的测定方法可用反应法和反应法。 7.酶制剂有四种类型即酶制剂，酶制剂，酶制剂和 酶制剂。 8.通常酶的固定化方法有法，法，法， 法。 9.酶分子的体外改造包括酶的修饰和修饰。 10.模拟酶的两种类型是酶和酶。 11.抗体酶的制备方法有法和法。 三问答题(每题10分,共计40分) 1.固定化酶和游离酶相比，有何优缺点？ 2.写出三种分离纯化酶蛋白的方法，并简述其原理。 3.为什么酶制剂的生产主要以微生物为材料？ 4.
酶工程试题（B） 一名词解释 1.抗体酶 2.酶反应器 3.模拟酶 4.产物抑制 5.稳定pH 6.产酶动力学 7.凝胶过滤 8.固定化酶 9.非水酶学 10.液体发酵法 二填空题(每空1分,共计30分) 1.Km值增加，其抑制剂属于抑制剂，Km不变，其抑制剂属于抑制剂，Km减小，其抑制剂属于抑制剂。 2.菌种培养一般采用的方法有培养法和培养法。 3.菌种的优劣是影响产酶发酵的主要因素，除此之外发酵条件对菌种产酶也有很大的影响，发酵条件一般包括，，，， 和等。 4.打破酶合成调节机制限制的方有，，。 5.酶生物合成的模式分是，，， 。 6.根据酶和蛋白质在稳定性上的差异而建立的纯化方法有法，法和 法 7. 通常酶的固定化方法有法，法，法， 法。 8. 酶分子的体外改造包括酶的修饰和修饰。 9.酶与抗体的重要区别在于酶能够结合并稳定化学反应的，从而降低了底物分子的，而抗体结合的抗原只是一个态分子，所以没有催化能力 三问答题(每题10分,共计40分) 1.在生产实践中，对产酶菌有何要求？ 2.对酶进行化学修饰时，应考虑哪些因素？ 3.列出用共价结合法对酶进行固定化时酶蛋白上可和载体结合的功能团 4.某酶的初提取液经过一次纯化后，经测定得到下列数据，试计算比活力，回收率及纯化 倍数。 （A）答案及评分细则 一 1. 酶工程：又叫酶技术，是酶制剂的大规模生产和应用的技术。
1、营养不良的人饮酒，或者剧烈运动后饮酒，常出现低血糖。试分析酒精干预了体内糖代谢的哪些环节？（p141 3题） 答：酒精对于糖代谢途径的影响主要有：肝脏的糖异生与糖原分解反应，也就是来源与去路的影响。 1)研究认为，酒精可以诱导低血糖主要取决于体内糖原储备是否充足，然而在人营养不良或者剧烈运动后， 体内糖原过度消耗，酒精又能抑制肝糖原的分解，饮酒后容易出现低血糖。 2）抑制糖异生： ①酒精的氧化抑制了苹果酸/天冬氨酸转运系统，导致细胞间质中还原当量代谢紊乱，使丙酮酸浓度下降，从而抑制糖异生； ②酒精能影响糖异生关键酶活性-非活性的转换，酶总量，酶合成或降解，从而抑制糖异生，如果糖二磷酸酶-1活性的抑制，磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶的表达降低等； 3）影响葡萄糖-6磷酸酶的活性，导致乳酸循环受阻，不利于血糖升高。 4）酒精使胰岛a细胞功能降低，促进胰岛素的分泌，抑制胰高血糖素的分泌，从而抑制糖原分解，促进糖酵解，造成低血糖。 5）酒精还会影响小肠对糖分的吸收，从而造成低血糖。 2、列举几种临床上治疗糖尿病的药物，想一想他们为什们有降低血糖的作用？(p141 4题) 答：1）胰岛素 它能增加组织对葡萄糖的摄取和利用，促进糖原的合成抑制糖异生，减少血糖来源，似血糖降低； 2）胰岛素促泌剂 ?磺脲类药物，格列苯脲等，通过刺激胰岛beta细胞分泌胰岛素，增加体内胰岛素水平而降低血糖；?格列奈类，如瑞格列奈，通过刺激胰岛素的早起合成分泌而降低餐后血糖。 3）胰岛素曾敏剂 如噻唑烷二酮类的罗格列酮可以通过增加靶细胞对胰岛素的敏感性而降低血糖。另外如双胍类药，如二甲双胍，它能降低血浆中脂肪酸的浓度而增加胰岛素的敏感性，增加周围组织对胰岛素的敏感性，增加胰岛素介导的葡萄糖的利用，也能增加非胰岛素依赖的组织对葡萄糖的摄取和利用。 4）a-糖苷酶抑制剂，如阿卡波糖，在肠道内竞争性的抑制葡萄糖苷水解酶，降低多糖或蔗糖分解成葡萄糖，抑制小肠对碳水化合物的吸收而降低餐后血糖。 3、治疗血浆胆固醇异常升高有哪些可能的措施？理论依据是什么？(p174 3题) 答：1）血浆胆固醇异常升高的治疗措施主要：有调整生活方式与饮食结构、降脂药物治疗、血浆净化治疗、外科治疗和基因治疗。具体的治疗方案则应根据患者的血浆LDL-胆固醇水平和冠心病的危险因素情况而决定。而且，降脂治疗的目标亦取决于患者的冠心病危险因素。一般而言，危险因素越多，则对其降脂的要求就越高(即目标血脂水平越低)。 2）但是继发型高脂血症的治疗主要是积极治疗原发病，并可适当地结合饮食控制和降脂药物治疗。 A. 控制理想体重。肥胖人群的平均血浆胆固醇和三酰甘油水平显着高于同龄的非肥胖者。除了体重指数(BMI)与血脂水平呈明显正相关外，身体脂肪的分布也与血浆脂蛋白水平关系密切。一般来说，中心型肥胖者更容易发生高脂血症。肥胖者的体重减轻后，血脂紊乱亦可恢复正常。 B. 运动锻炼体育运动不但可以增强心肺功能、改善胰岛素抵抗和葡萄糖耐量，而且还可减轻体重、降低血浆三酰甘油和胆固醇水平，升高HDL胆固醇水平。 C. 戒烟吸烟可升高血浆胆固醇和三酰甘油水平，降低HDL-胆固醇水平。停止吸烟1年，血浆HDL-胆固醇可上升至不吸烟者的水平，冠心病的危险程度可降低50%，甚至接近于不吸烟者。 D. 饮食治疗 血浆脂质主要来源于食物，通过控制饮食，可使血浆胆固醇水平降低5%～10%。饮食结构可直接影响血脂水平的高低。血浆胆固醇水平易受饮食中胆固醇摄入量的影响，进食大量的饱和脂肪酸也可增加胆固醇的合成。尽管单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸具有降低血浆胆固醇、LDL-胆固醇水平和升高HDL-胆固醇水平的
《酶工程》复习 一、名词解释…………………………………………… 1 酶工程：又称酶技术，是酶制剂的大规模生产和应用的技术，包括化学酶工程和生物酶工程。 2酶的诱导：由于加进某种物质，使酶的生物合成开始或者加速进行，称为酶的生物合成的诱导作用。 3 微滤：以压力差为推动力，截留水中粒径在0.02~ 10m之间的颗粒物的膜分离技术。 4固定化酶：通过物理的或化学的方法，将酶固定在载体上，能使酶发挥催化作用的酶。 5酶的非水相催化：通过改变反应介质，影响酶的表面结构和活性中心，从而改变酶的催化特性。 6 原生质体：脱去细胞壁的植物、真菌或细菌细胞。 7超滤：超滤是采用中空纤维过滤新技术，配合三级预处理过滤清除自来水中杂质；超滤微孔小于0.01微米，能彻底滤除水中的细菌、铁锈、胶体等有害物质，保留水中原有的微量元素和矿物质。 8 固体发酵：固态发酵是指没有或几乎没有自由水存在下，在有一定湿度的水下溶性固态基质中，用一种或多种微生物的一个生物反应过程。 二、填空题………………………………………………. 1酶的分类（氧化还原酶）、（转移酶）、（水解酶）、（裂合酶）、（异构酶）、（合成酶）。 2酶活力是（酶催化速度）的量度指标，酶的比活力是（酶纯度）的量度指标，酶转换数是（酶催化效率）的量度指标。 3微生物产酶模式可以分为同步合成型，（延续合成型），中期合成型，（滞后合成型）四种。 4动物细胞培养主要用于生产疫苗、激素、单克隆抗体、多肽因子、酶等（功能性蛋白质）。 5细胞破碎的主要方法有机械破碎法、物理破碎法、（化学破碎法）、（酶促破碎法）。 6有机溶剂的极性系数lgP越小，表明其极性（越强），对酶活性的影响（越大）。 7通常酶的固定化方法有：吸附法、包埋法、结合法、交联法、热处理法。
1. 举例说明酶催化的绝对专一性和相对专一性。 绝对专一性：具有绝对专一性的酶仅作用于一种底物，催化一种反应。 例如脲酶只能催化脲（又称尿素）水解成氨和二氧化碳，而对尿素的氯或甲基取代物都无作用。 相对专一性：有些酶的专一性较低，它们能作用于一类化合物或一类化学键。这种专一性称为相对专一性。其又可分为族类专一性（或称基团专一性）和键专一性，前者对底物化学键两端的基团有要求。 例如α-D-葡糖苷酶作用于α-糖苷键，并要求α-糖苷键的一端必须有葡糖基团。因此，它可催化蔗糖和麦芽糖水解。键专一性只作用于一定的化学键，而对键两端的基团无严格要求，如酯酶可使任何酯键水解。 例子不唯一，尽量不要相同 第二版：P3-P5 第三版：P3-P4 2. 酶的生产方法有哪些？用于酶生产的微生物应具有什么特点？ 酶的生产方法主要有提取分离法，生物合成法和化学合成法等。 产酶微生物应具有的特点有： 1.酶的产量高:通过筛选获得高产菌株，妥善保存并定期复壮 2.容易培养和管理:对培养基成分和工艺条件没有苛刻的要求，适应能力强 3.产酶稳定性好:能稳定生长并表达所需的酶，菌种不易退化 4.有利于酶的分离纯化:酶的分离提纯要比较容易，能获得较高纯度 5.安全可靠:菌种对环境及对操作人员安全，不产生不良影响 第二版：P22-P25 第三版：P20-P22 3. 固定化细胞发酵产酶具有哪些特点？ 固定化细胞发酵产酶的特点有： 1.提高酶的产率：细胞固定化滞后，单位空间内细胞密度增大，因此加速了生化反应； 2.可以反复使用，可以在高稀释率下连续发酵； 3.提高基因工程菌质粒的稳定性； 4.固定化细胞对pH值、温度等外界条件的适应范围增宽，对抑制剂的耐受能力增强，因此发酵稳定性好； 5.可先经预培养再转入发酵生产，缩短发酵周期，提高设备利用率 6.固定化发酵是非均相体系，产品容易分离纯化 7.一般只适用于胞外酶的生产 第二版：P68-P70
一、名词解释（本题共8个小题，每小题2分，共16分）。 1、固定化酶： 2、原生质体： 3、超滤： 4、酶的催化特性： 5、生物酶工程： 6、酶的必需基团和活性中心： 7、诱导与阻遏： 8、酶反应器： 二、填空题（本题共5个小题，每空2分，共24分）. 1、酶的分类（）（）（）。（三种即可） 2、酶活力是（）的量度指标，酶的比活力是（）的量度指标，酶转换数是（）的量度指标。 3、微生物产酶模式可以分为同步合成型，（）中期合成型，（）四种。 4、酶的生产方法有（），生物合成法和化学合成法。 5、优良的产酶微生物所具备的条件：（1）（）（2）（）（3）（）（写出三种即可）。 三、判断题（本题共10个小题，每空1.5分，共15分）。 1、酶是具有生物催化特性的特殊蛋白质。 2、酶活力是指在一定条件下酶所催化的反应速度，反应速度越大，意味着酶活力越高。 3、液体深层发酵是目前酶发酵生产的主要方式。 4、培养基中的碳源，其唯一作用是能够向细胞提供碳素化合物的营养物质。 5、在酶与底物、酶与竞争性抑制剂、酶与辅酶之间都是互配的分子对，在酶的亲和层析分离中，可把分子对中的任何一方作为固定相。 6、补料是指在发酵过程中补充添加一定量的营养物质，补料的时间一般以发酵前期为好。 7、酶固定化过程中，固定化的载体应是疏水的。 8、在酶的抽提过程，抽提液的 pH 应接近酶蛋白的等电点。 9、青霉素酰化酶不但能催化青霉素侧链的水解作用，而且也能催化逆反应。 10、亲和试剂又称活性部位指示试剂,这类修饰剂的结构类似于底物结构。 四、问答题（本题共5个小题，共45分）。 1、试述提高酶发酵产量的措施。（8 分，答出四点即可） 2、酶失活的因素？（8分） 3、酶的提取方法有哪些？（8分） 4、酶分子修饰的意义有哪些？（6分） 5、试简述酶分子的定向进化。（5分） 6、固定化酶和游离酶相比，有何优缺点？（10分，优缺点答五点即可） 答案 一、1、固定化酶：通过物理的或化学的方法，将酶固定在载体上，能使酶发挥催化作用的酶；2、原生质体：脱去细胞壁的植物、真菌或细菌细胞；3、超滤：超滤是采用中空纤维过滤新技术，配合三级预处理过滤清除自来水中杂质；4、酶的催化特性：①极高的催化效率②高度的专一性③酶活性的可调节性④酶的不稳定性5、生物酶工程：是指在基因水平上，对酶蛋白分子进行修饰、改造，改进酶蛋白的催化特性或酶蛋白的蛋白质特性等；6、酶的必需基团：指酶分子中与酶的活性密切相关的基团；活性中心：是与底物结合并催化反应的场所；7、酶合成的诱导是指加入某种物质使酶的合成开始或加速进行的过程；酶合成
ScPif1解旋酶的结构与功能研究 Pif1解旋酶作为一种依赖于ATP供能的DNA解旋酶,广泛分布于原核生物和真核生物体内,在基因组稳定性的维持和核酸代谢调控等方面发挥着重要作用。酿酒酵母Pif1（Saccharomyces cerevisiae Pif1,ScPif1）解旋酶作为Pif1家族中的典型成员,是该家族中被最早鉴定并且深入研究的成员之一。体内研究表明,ScPif1解旋酶参与端粒稳定性的维持、冈崎片段的成熟、DNA复制过程中G4 DNA的解除以及同源重组修复等多种重要代谢途径。体外研究则显示ScPif1同时拥有5’-3’方向的双链DNA、RNA/DNA杂交链以及G4 DNA的解旋活性,其中最为引人注目的是其高效的G4DNA解旋功能,在体内条件下,G4 DNA因其高度的稳定性而成为生物体生理代谢的一大阻碍,ScPif1通过其高效的G4 DNA解旋功能而在多种生理代谢途径中发挥着重要作用。目前,关于ScPif1的研究主要集中在体内或体外的生理生化实验中,对于ScPif1结构的研究则非常有限。本研究针对以上难点,首先采用多序列比对的方式鉴定了ScPif1的解旋核心结构域,并通过二级结构预测的方式,对全长ScPif1蛋白进行了合理的截短设计,通过大肠杆菌表达系统对截短后的 ScPif1237-780蛋白进行了表达纯化,获得了可用于结晶实验的高纯度蛋白样品,并在随后的结晶实验中获得了多种DNA复合物的晶体,结合硒代蛋白晶体的反常散射数据获得的相位,首次解析了ScPif1解旋核心结构域的高分辨率三维结构。之后,基于解析的晶体结构,本研究综合利用定点突变实验、凝胶过滤层析技术、X射线
1. 三羧酸循环中只以FAD为辅助因子的是[ 1分] A.α-酮戊二酸脱氢酶系 B.丙酮酸脱氢酶系 C.琥珀酸脱氢酶 D.苹果酸脱氢酶 E.异柠檬酸脱氢酶 * 2. 生理条件下发生糖异生的主要器官是[ 1分] A.肺 B.肝脏 C.肌肉 D.脑 E.肾脏 * 3. 糖原分子上每连接1个葡萄糖单位消耗的高能化合物分子数是[ 1分] A.1 B.2 C.3 D.4 E.5 * 4. 体内能量的主要来源是[ 1分] A.磷酸戊糖途径 B.糖的有氧氧化途径 C.糖酵解途径 D.糖异生途径 E.糖原合成途径* 5. 关于糖酵解的正确叙述是[ 1分] A.不消耗ATP B.全过程是可逆的 C.生成38分子ATP D.在细胞液中进行 E.终产物是CO2和H2O * 6. 使血糖降低的激素是[ 1分] A.胰岛素 B.胰高血糖素 C.肾上腺素 D.糖皮质激素 E.生长素 * 7. 位于糖酵解途径、糖异生途径、磷酸戊糖途径、糖原合成途径和糖原分解途径交汇点上的化合物是[ 1分] A.1,6-二磷酸果糖 B.1-磷酸葡萄糖 C.3-磷酸甘油醛 D.6-磷酸果糖 E.6-磷酸葡萄糖 * 8. 指出关于胰岛素的错误叙述[ 1分] A.促进糖异生 B.促进糖原合成 C.促进糖转化成脂肪 D.提高肝葡萄糖激酶的活性 E.提高细胞膜对葡萄糖的通透性 * 9. 属于糖的有氧氧化、糖酵解和糖原合成共同中间产物的是[ 1分] A.1-磷酸葡萄糖 B.3-磷酸甘油醛 C.5-磷酸核糖 D.6-磷酸果糖 E.6-磷酸葡萄糖 * 10. 成熟红细胞的能源主要来自[ 1分]
A.磷酸戊糖途径 B.糖的有氧氧化途径 C.糖酵解途径 D.糖异生途径 E.糖原合成途径* 11. 糖酵解途径不产生[ 1分] A.1,3-二磷酸甘油酸 B.1,6-二磷酸果糖 C.2-磷酸甘油酸 D.3-磷酸甘油 E.磷酸二羟丙酮 * 12. 能抑制糖异生的激素是[ 1分] A.肾上腺素 B.生长激素 C.糖皮质激素 D.胰岛素 E.胰高血糖素 * 13. 在线粒体内进行的糖代谢途径是[ 1分] A.磷酸戊糖途径 B.三羧酸循环 C.糖酵解途径 D.糖异生途径 E.糖原合成途径 * 14. 关于尿糖阳性，哪项叙述是正确的？[ 1分] 错误：正确答案是A A.一定是血糖过高 B.一定是由于肾小管不能将糖全部吸收 C.一定是有糖代谢紊乱 D.一定是由胰岛素分泌不足引起的 E.一定是食物含糖过多 * 15. 下列化合物中既是糖酵解产物、又是糖异生原料的是[ 1分] A.丙氨酸 B.丙酮 C.甘油 D.乳酸 E.乙酰CoA * 16. 糖酵解途径中发生裂解反应的是[ 1分] A.1,3-二磷酸甘油酸 B.1,6-二磷酸果糖 C.3-磷酸甘油醛 D.3-磷酸甘油酸 E.乳酸 * 17. 可直接转化成3-磷酸甘油醛的是[ 1分] A.6-磷酸葡萄糖 B.草酰乙酸 C.琥珀酸 D.磷酸二羟丙酮 E.磷酸烯醇式丙酮酸 * 18. 三羧酸循环中底物水平磷酸化反应直接生成的高能化合物是[ 1分] A.ATP B.CTP C.GTP D.TTP E.UTP * 19. 缺氧时为机体提供能量的是[ 1分] A.磷酸戊糖途径 B.糖的有氧氧化途径 C.糖酵解途径 D.糖异生途径 E.糖原合成途径
酶工程思考题汇总 第一章P25 1．何谓酶工程?试述其主要内容和任务. 酶的生产，改性与应用的技术过程称为酶工程。 主要内容：微生物细胞发酵产酶，动植物细胞培养产酶，酶的提取与分离纯化，酶分子修饰，酶、细胞、原生质体固定化，酶非水相催化，酶定向进化，酶反应器和酶的应用等。 主要任务：经过预先设计，通过人工操作获得人们所需的酶，并通过各种方法使酶的催化特性得以改进，充分发挥其催化功能。 2．酶有哪些显著的催化特性？ 专一性强（绝对专一性——钥匙学说、相对专一性——诱导契合学说）、催化效率高、作用条件温和 3．简述影响酶催化作用的主要因素. 底物浓度、酶浓度、温度、pH、激活剂浓度、抑制剂浓度等诸多因素 第二章P63 5．酶的生物合成有哪几种模式？ 生长偶联型（同步合成型、中期合成型）、 部分生长偶联型（延续合成型） 非生长偶联型（滞后合成型） 7．提高酶产量的措施主要有哪些？ a.添加诱导物（酶的作用底物、酶的催化反应物、作用底物的类似物） b.控制阻遏物的浓度 c.添加表面活性剂 d.添加产酶促进剂 11．固定化微生物原生质体发酵产酶有何特点？ 1.提高产酶率 2.可以反复使用或连续使用较长时间 3.基因工程菌的质粒稳定，不易丢失 4.发酵稳定性好 5.缩短发酵周期，提高设备利用率 6.产品容易分离纯化 7.适用于胞外酶等细胞产物的生产 第三章P84 3．植物细胞培养产酶有何特点？ 1.提高产率 2.缩短周期 3.易于管理，减轻劳动强度 4.提高产品质量 5.其他 4．简述植物细胞培养产酶的工艺过程。 外植体细胞的获取细胞培养分离纯化产物 6．动物细胞培养过程中要注意控制哪些工艺条件？ 1.培养基的组成成分 2.培养基的配制 3.温度的控制 4.ph的控制 5.渗透压的控制 6.溶解氧的控制
不同生物解旋酶的氨基酸序列分析发现它们有9 个高度保守的序列，分别称为Q、I、Ia、Ib、II、III、IV、V 和VI（Fairman-Williams et al., 2010）（图1-2），这说明所有的解旋酶可能起源于相同的基因。这些保守区域是ATP 酶、解旋酶活性以及NTP 和DNA 结合的功能区。其中基序Ia 区通常是GTP 和ATP 结合区；Ⅱ区是ATP 结合蛋白B 区的特殊翻版；I 区可形成一套索结构与NTP 磷酸结合，其结构属ATP 结合蛋白的A区；而Ⅱ区保守的天冬氨酸与镁离子介导的磷酸结合有关；Ia 以及Ⅵ区的保守酪氨酸与可能的DNA 结合蛋白相关，提示涉及多核苷酸的结合；基序VI 则参与ATP 磷酸盐的结合；其他的基序（Ia、Ib、IV、V）则参与RNA 结合以及通过RNA 结合激活ATP 水解的活性；III 是RNA 解旋酶活性必需的结构。 依据以上Motif 的不同，真核生物的解旋酶分为两个大家族Helicase superfamily I和II （SFI 和SFII）（图1-3），其中多数RNA 解旋酶属于SFII，少数属于SFI（Fairman-Williams et al., 2010）。SFI 一般是真菌中的解旋酶；高等植物、酵母、动物中一般都是SFII，它又分为DEAD-box、DEAH-box、DExH、RecQ 和SW1/SNF。 解旋酶SF1 和SF2 的家族分类，引自Fairman-Williams et al., 2010Figure1-5, Helicase SF1 and SF2 family classification .2006 年，RIKEN 基因组科学中心、冈崎研究所的研究人员发现，果蝇DEAD-boxprotein Vasa 的催化核的结构，该催化核与一个单链RNA 和一个ATP 类似物形成复合体。ATP 类似物紧密与这两个结构域结合，并使他们变成更为紧密的形式，而且保守残基间发生域间相互作用。 核糖体rRNA 的成熟和核糖体亚基的装配涉及至少170 个辅助蛋白，包括内切和外切核糖核酸酶、RNA 解旋酶、‘伴侣’或‘组装因子’和很多小核仁核糖核蛋白蛋白（snoRNPs）（Venema et al., 1999;de la Cruz et al., 1999）。在这个复杂的途径中很多步骤涉及RNA 结构的变换，这需要能量的参与。因此，参与核糖体合成的最大的一类作用因子就是RNA 解旋酶。已经确定的酵母中有16 个RNA 解旋酶参与核糖体的组成过程，其中Dbp4p，Dbp8p，Dhr1p，21Dhr2p，Fal1p，Rok1p，和Rrp3p 对于pre-rRNA 早期A0 到A2 的剪接过程是必须的，敲除这些RNA解旋酶导致pre-rRNA加工的异常，说明这些蛋白质相互间没有功能冗余（dela Cruz et al., 1999）(图1-5)。Rok1p 抑制18S pre-rRNA 在A0、A1 和A2 位点的剪接，导致无法合成成熟的18S rRNA。 真核细胞的分化需要来自细胞核到细胞质的转运RNA 分子、蛋白和联合体。通过拟南芥的突变体得到的CRYOPHYTE/LOS4 基因，它编码DEAD-box RNA 解旋酶，并且IMG1 基因编码DEAH‐box RNA 解螺旋酶参与拟南芥雌配子体的发育22已证实与mRNA 的输出有关，还在植物的发育及抗逆中有重要作用（Gong et al., 2005）。酵母中Dbp5p 也与细胞核内带有polyadenylated [poly(A)+]的mRNA 输出有关，Dbp5p主要定位在核膜周围，细胞质中也有少量定位。它可以与CAN/Nup159p 相互作用，从而招募细胞质核孔复合纤维，在细胞质中mRNA 从转运复合体上解离有关。 在真核细胞中，翻译的调节在基因表达调控方面具有十分重要的作用。翻译的调节主要出现在起始阶段，真核细胞翻译起始因子（eukaryocyte protein translation initiationfactors，elFs），它们在翻译起始的过程中发挥各自不同的作用。其中elF-4A 和elF-4B都是依赖于ATP 的DEAD-box RNA 解旋酶，能打开mRNA 分子中的二级结构，保证翻译的顺利进行。酵母中，通过遗传学和生物化学实验，elF-4A 在翻译起始中的作用已被证实。elF-4A蛋白的活性可能被不同的mRNA 分子的各种加工所需要（Rogers et al., 2002; Svitkin etal., 1996）。1992 年，Metz 等人从拟南芥中克隆获得eIF-4A，证实其功能是真核生物中的翻译起始因子（Metz et al., 1992）。细胞器的基因表达在真菌和高等真核生物中，线粒体、叶绿体中基因组的表达需要RNA 解旋酶蛋白。如烟草中的VDL 基因对于叶肉栅栏组织和叶绿体的发育是必须的，它编码一个定位在叶绿体中的DEAD-box RNA 解旋酶，vdl 突变体叶片组织