文章编号：1003－6946（2015）02－115－05
鼠胚实验在新建体外受精胚胎培养室质量控制中的作用
王辉田，李涛，黎伟豪，欧建平
（中山大学附属第三医院生殖医学中心，广东广州510630）
【摘要】目的：检测新建体外受精实验室培养体系的可靠与否，是否符合人类胚胎体外培养的要求。方法：对昆明白小鼠进行超促排卵，手术获取昆明白小鼠雌雄配子进行体外受精和体内受精的胚胎；并进行体外培养观察两组鼠胚的受精率、2-细胞率、囊胚率及采用密度梯度离心法和上游法两种精液处理方法对小鼠体外受精胚胎发育情况的影响。结果：进行了30个周期的体内受精体外培养实验，共获卵1136枚；进行了35个周期的体外受精实验，共获卵1486枚。体内受精组获得的受精率（93.13?1.46）%和2-细胞率（94.52?1.67）%高于体外受精组的受精率（84.39?2.87）%和2-细胞率（87.80?3.21）%，两组间差异有统计学意义（P＜0.05）。密度梯度离心法处理精液后，其受精率（90.32?3.14）%和2-细胞率（88.54?2.28）%高于上游法的受精率（76.46?2.35）%和2-细胞率（82.67?2.62）%，两者差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：小鼠卵母细胞体内受精和体外受精后均有高的成胚率，体内受精后进行体外培养优于体外受精后培养，采用密度梯度离心处理精液实施体外受精优于上游法，鼠胚实验可对新建胚胎培养室的培养体系进行评估。
【关键词】鼠胚实验；体外受精；质量控制；胚胎培养
中图分类号：Ｒ332文献标志码：A
通讯作者：欧建平，Email：oujianping@hotmail．com
于被患者接受。操作简便、设备要求相对较低，具备超声介入条件的基层医院均可以推广。
研究认为，聚桂醇注射液主要是使绒毛附着处肌层血管闭塞，故主要适用于病灶累及肌层，子宫肌层连续性尚存在的CSP患者［9］。CSP处肌层菲薄，行B 超监护下胚囊清除术联合清宫术，可将不可视的清宫术变为相对可视的，减少子宫穿孔及残留。
本技术开展时间尚短，查阅文献联盟（万方数据库），国内外尚未见聚桂醇硬化剂广泛用于CSP治疗的报道。尚有诸多问题值得进一步探讨：瘢痕部位血供恢复情况，聚桂醇使用的最高剂量、最佳浓度，胚囊清除术联合清宫术的最佳时机，再次妊娠时子宫下段的伸展情况等尚需进一步随访观察。但超声介入下注入聚桂醇硬化剂治疗CSP成功率高，未出现明显副反应以及并发症，符合CSP治疗的原则，即最大限度地保留了女性的生育功能，不失为临床治疗CSP的又一适合部分女性患者和疗效满意的治疗方案，可供借鉴。
参考文献
［1］张淑珍，童水娟，寿坚．超声介入下注射硬化剂治疗剖宫产子
宫切口妊娠10例初探［J］．现代实用医学，2014，26（3）：274－
275．
［2］徐栋，李明奎，徐佳英，等．超声造影指导下聚桂醇硬化治疗子宫切口妊娠的临床价值［J］．中国超声影像学杂志，2014，23（2）：
162－164．
［3］蔡薇，杨太珠，罗红，等．剖宫产后瘢痕处妊娠经阴道超声图像分析的临床意义［J］．实用妇产科杂志，2009，25（10）：622－
624．
［4］郑艳，徐春丽．聚桂醇400临床应用进展［J］．药学进展，2012，31（2）：190－192．
［5］邓新粮，何小丽，肖松舒．剖宫产术后子宫切口部位妊娠保守治疗16例疗效分析［J］．实用妇产科杂志，2008，24（6）：372－373．［6］陈春林主编．妇产科放射介入治疗学［M］．北京：人民卫生出版社，2003：393－395．
［7］邵华江，马建婷，徐丽萍．剖宫产瘢痕妊娠治疗方法与疗效综合分析［J］．中华医学杂志，2012，92（31）：2191－2194．
［8］汪芳，石珍，朱亚飞，等．高强度聚焦超声治疗子宫切口妊娠临床分析［J］．中国超声医学杂志，2013，29（2）：177－179．
［9］倪雪君，谢阳桂，吴超，等．超声引导下瘤内注射聚桂醇硬化治疗子宫肌瘤的临床研究［J］．南通大学学报（医学版），2012，32
（5）：414－415，封2．
（收稿日期：2014-10-12；修回日期：2014-12-15）
TheＲole of Mouse Embryo Assay in the Quality Control of a Newly Constructed La-boratory for IVF Embryo Culture
WANG Huitian，LI Tao，LI Weihao，et al
（CenterforＲeproductive Medicine，The Third Affiliated Hospital，Sun Yat-sen university，Guangzhou Guangdong 510630，China）
Corresponding author：OU Jianping
【Abstract】Objective：To test the reliability of the embryo culture system of a newly constructed laboratory for IVF embryo culture and to testify whether it conforms to the requirement of in vitro cultivation of human embryo or not．Methods：Superovulation treatments with PMSG and HCG on Kunming mouse were conducted．Then male and female gametes as well as pronuclear embryo were obtained from surgical approaches for in vivo and in vitro fertilization，respectively．The two groups of mouse embryos were cultured in vitro to observe the fertilization rate，2-cell rate and blastocyst rate．The effect of density gradient centrifugation and upstream two methods of semen treated on mouse embryonic development of in vitro fertilization．Ｒesults：Totally1136oocytes in30-cycles of in vi-vo fertilization and totally1486oocytes in35-cycles of in vitro fertilization were obtained．In vivo the fertilization rate was（93.13?1.46）%and2-cell rate was（94.52?1.67）%were higher than that in vitro the fertilization rate was（84.39?2.87）%and2-cell rate（87.80?3.21）%，the differences between the two groups were statistically significant（P＜0.05）．There were statistically significant difference in fertilization rate（90.32?3.14vs76.46?2.35）%and2-cell rate（88.54?2.28vs82.67?2.62）%between destiny gradient centrifugation group and up-stream method group（P＜0.05）．Conclusions：The embryo development of in vivo and vitro fertilization mouse oo-cytes and two methods of semen processing have reached the requirements of indoor quality control，the results are better in vitro culture of vivo fertilization and density gradient centrifugation processing semen．So mouse em-bryo assay could used to evaluate the embryo culture system in the newly constructed assisted reproductive labo-ratory．
【Key words】Mouse embryo assay；In vitro fertilization；Quality control；Embryo culture
我国人类辅助生殖技术（assisted reproductive technology，AＲT）已呈现规范化发展，目前有超过300家治疗机构，每年开展AＲT治疗逾20万周期［1］。生殖医学中心胚胎培养室是人类胚胎的加工厂，是AＲT 顺利开展极为重要的核心部分。对于新建的胚胎培养实验室，其培养室的环境温度和湿度、仪器设备的温度和性能、试剂耗材的质量等是否达到配子及胚胎体外操作和生长发育的要求至关重要，因此在进行人类胚胎的体外操作和培养之前，要检测胚胎培养室的整个培养体系能否满足人胚胎的体外培养要求［2］。自从1984年Ackerman等［3］首先尝试用2-细胞鼠胚来作为胚胎实验室的质控方法，小鼠胚胎生物检测已成为评估新建体外受精（in vitro fertiliza-tion）实验室最为常用的方法。我院生殖医学中心于2013年12月建成体外受精胚胎培养室，前期对培养室进行“热处理”以去除在装修过程及仪器设备产生的挥发性有机化合物（volatile organic compound，VOC）后，于2014年3 4月在人体外受精条件下对昆明白小鼠进行体外受精鼠胚和体内受精胚胎进行体外培养研究，旨在对新建胚胎培养室的环境和培养体系进行检测，对技术员操作水平进行评估，为顺利开展人类胚胎体外培养提供可靠的实验依据和质量控制保证。1材料与方法
1.1实验材料
1.1.1实验动物昆明白小鼠购自中山大学实验动物中心。雌鼠：65只，8 10周龄、体重40 45g；雄鼠：14只，10 12周龄、体重50 55g。
1.1.2主要药品与试剂孕马血清促性腺激素（PMSG）和绒促性素（HCG）购自杭州第二激素制药厂。精子梯度分离液（SpermGrad）、洗精液（Sper-mＲinse）为瑞典Vitrolife培养液系列。HE-PES缓冲的人输卵管液（HTF）操作液（1023）、第三代HTF培养液（1020）、卵裂培养液（1026）、囊胚培养液（1029）、血清蛋白替代品（SPS3010）、胚胎培养矿物油（4008P）等均为美国SA-GE公司生产的Quinn's系列产品。
1.2实验方法
1.2.1小鼠促排卵和鼠卵获取体内受精组：分6批次，每次选取5只健康的雌性小鼠在下午的18时对其腹部消毒后腹腔内注射PMSG10U（0.1ml），48小时后腹腔内注射HCG10U（0.1ml），然后与雄性小鼠1?1合笼，20小时后颈椎脱臼法处死雌鼠，无菌条件下剪开下腹部后找到并取出输卵管，用1023洗涤去除血迹，然后将输卵管放入盛有1023+10%SPS的35mm的培养皿中，用1ml一次性注射器刺破输卵
管膨大部，将切口处轻轻挤压，释放出的卵团及受精卵用1026洗涤3次后，转移到30μl1026+10%SPS 卵裂皿中，每个液滴放10个受精卵，观察受精情况，然后放入37?、6%CO2、饱和湿度的培养箱中。
体外受精组：分7批次，每次选取5只健康的雌性小鼠在下午的18时对其腹部消毒后腹腔内注射PMSG10U（0.1ml），48小时后腹腔内注射HCG10U （0.1ml），14小时后颈椎脱臼法处死雌鼠，打开腹部后找到并取出输卵管，用1023+10%SPS洗涤去除血迹，然后将输卵管放入盛有2ml1023+10%SPS的35mm的培养皿中，用1ml一次性注射器刺破输卵管膨大部，将切口处轻轻挤压，收集释放出的卵团及卵子，用1020+10%SPS洗涤3次后，转移到1ml 1020+10%SPS受精皿中，每个皿放15个卵子，放入37?、6%CO
2
、饱和湿度的培养箱中等待受精。
1.2.2小鼠精液的采集及处理在体外受精取卵日早上7时30分颈椎脱臼法处死2只雄鼠，在无菌条件下分别取雄鼠附睾尾放入1023+10%SPS培养液中，用无菌的1ml一次性注射器刺破附睾尾，轻轻挤压出精子，制作精子悬液。一只采用密度梯度离心法处理精子悬液，另一只采用上游法处理精子悬液。方法见文献［1］中精子的收集与处理。
1.2.3小鼠体外受精采用集中受精法（3037皿，加矿物油覆盖），处理后的精子在显微镜下观察其活力及浓度，吸取精子悬液到含有卵子的培养液中，使终浓度为1?106/ml 2?106/ml，放入37?、6%CO2浓度和饱和湿度的培养箱中孵育4 6小时。
1.2.4原核胚及卵裂期胚胎的观察与培养参照文献［4］进行。
1.3统计学方法采用SPSS17.0软件对实验数据进行分析，并对两种方法的受精率、2-细胞率、囊胚形成率等进行卡方检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1不同来源昆明系白小鼠的2-细胞胚胎体外发育情况比较在新建人体外受精培养室条件下，昆明白小鼠体内受精共进行了6个批次、30个周期的体内受精实验，共获卵1136枚，受精卵1058个。在新建人体外受精培养室条件下，昆明白小鼠共进行了7个批次、35个周期的体外受精实验，共获卵1486枚，受精卵1254个。体内受精组获得的受精率和2-细胞率高于体外受精组的受精率（P＜0.05）；而两组囊胚率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。
表1不同来源昆明白小鼠2-细胞胚胎
体外发育情况比较（%）
Tab1Comparison of the development of2-cels in vitro fertilization embryo from different mouse sources
of Kunming species（%）
受精率2-细胞率囊胚率
体内受精组93.13?1.4694.52?1.6791.90?1.56
体外受精组84.39?2.8787.80?3.2190.55?2.93
χ226.3818.36 1.26
P＜0.05＜0.05＞0.05
2.2不同的精液洗涤处理方式对昆明白小鼠体外受精胚胎发育情况的影响密度梯度离心法处理精液后，其受精率和2-细胞率高于上游法，差异有统计学意义（P＜0.05）；两组间的卵裂率和囊胚率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。
表2不同的精液处理方式对昆明白小鼠
体外受精胚胎发育的影响（%）
Tab2Effects of the development of the vitro fertilization embryo from different washing semen-treating
of Kunming species（%）
受精率2-细胞率卵裂率囊胚率
密度梯度
离心法
90.32?3.1488.54?2.2894.27?1.8792.42?1.65上游法76.46?2.3582.67?2.6291.62?2.1490.32?2.32χ234.5218.357.39 2.58
P＜0.05＜0.05＞0.05＞0.05 2.3小鼠卵母细胞体外受精后胚胎发育情况小鼠正常受精卵有两个清晰的原核和明显的双极体（见图1A）；小鼠早期卵裂的胚胎，见2个卵裂球对称、大小均一、卵裂球中核单一及没有碎片（见图1B）；小鼠体外受精后第2天的胚胎，见卵裂球均一性好、大小均匀、形态规则、卵裂球中没有多核、4个卵裂球呈四面体排列（见图1C）；小鼠体外受精后第3天的胚胎，见8个均一的卵裂球，没有碎片（见图1D）；小鼠体外受精第4天的胚胎，见卵裂球紧密联系在一起，分不清单个卵裂球的界限（见图1E）；小鼠体外受精后第5天的囊胚，见囊胚腔扩张，内细胞团清晰完整，滋养层细胞多且结构致密（见图1F）。
1A
小鼠受精卵1B小鼠2-
细胞胚胎1C小鼠4-
细胞胚胎1D小鼠8-
细胞胚胎1E
小鼠桑椹胚1F小鼠囊胚
图1小鼠卵母细胞体外受精后胚胎发育情况（?200）
Fig1Embryo development of mouse in vitro fertilization oocytes（?200）
3讨论
胚胎实验室是人类AＲT实施的重要场所，培养室
所处的环境会对AＲT结局产生重要影响［5］，为了获
得更好的胚胎发育质量和更高妊娠率，培养室必须有
严格的质量控制体系。小鼠胚胎生物监测已经成为
评估新建体外受精实验室环境条件和培养体系质量
效果好坏的最为广泛应用的方法。通过连续的动态
观察小鼠胚胎的发育状况，在反应胚胎发育状况的同
时，可检测培养室的环境条件，包括空气质量、温度、
湿度以及各种耗材、培养液、培养箱和技术人员操作
水平等［6］。
本实验条件下，在对体外受精实验室培养体系进
行检测时，我们采用了两种来源的小鼠胚胎，即体内
受精胚胎和体外受精胚胎，其结果显示小鼠体内和体
外受精率分别为（93.13?1.46）%和（84.39?
2.87）%，虽然两种受精方法都大于80%，都符合鼠胚
生物监测的要求，达到质控的要求［7］，但是两种受精
方法的效果不同。产生这种现象的原因可能是：①在
体内卵母细胞处于一个无光、恒温、恒湿、低氧的环境
中，母体内分泌、子宫及输卵管会分泌一些物质促进
受精；在体外卵母细胞不具备任何保护和屏障功能，
可能暴露于含有害气体的空气中，面临温度、渗透压、
pH等变化的应激，降低精卵结合的机会，使受精率下
降。②在体内受精过程中精子从生殖道到达输卵管
需要漫长的旅途，同时经过严格的自然选择；而体外
受精过程中人工将大量精子直接与卵母细胞在体外
共同孵育完成受精，此过程对精子的自然选择是有限
的。③在体外受精过程中，需要对原始精液进行离
心、洗涤处理，在处理过程中会增加氧自由基水平，而
高水平的氧自由基会使精子质膜的脂质发生过氧化
反应，质膜拓扑结构遭到破坏，导致精子中段缺陷，影
响精子获能和顶体反应的发生，降低受精能力［8］。
两种来源的受精卵同时在体外培养第1次卵裂
所获得的2-细胞率也不同，体内受精2-细胞率（94.52
?1.67）%高于体外受精2-细胞率（87.80?3.21）%，
其原因可能是：①在体外受精过程中，卵母细胞在体
外培养时间延长，卵子发生老化，细胞核和细胞质成
熟过度，从而影响受精后的胚胎发育。②在体外培养
过程中要对受精后的卵母细胞进行去除颗粒细胞等
机械操作，这些操作可能会对细胞骨架和纺锤体造成
损伤，导致受精后的雌雄原核不能一起移动到第一次
有丝分裂的赤道板上，使原核不能联合，受精后的合
子不能进行分裂。③在体外受精过程中由于卵母细
胞会受到体外培养时间延长、精液氧化损伤、体外暴
露时间过长等不利的影响，这可能导致受精卵在细胞
周期的转化剂微管蛋白、纺锤体的形态上存在异常以
及非整倍体增加，导致受精卵不卵裂［9］。④近年来研究显示，体外操作或体外环境过长会对胚胎的表观遗传修饰有不利的影响，使DNA甲基化和组蛋白修饰重编程异常，导致体外受精胚胎发育能力减弱［10］。两种受精方法平均囊胚形成率都超过85%，也达到鼠胚实验对新建实验室检测质控标准的要求［11］。虽然体内囊胚率高于体外，但两者比较是没有差异的，体内囊胚率稍高，其原因可能是两者在体外培养过程中胚胎所处的环境相同，对胚胎发育影响较小，从统计学上说，这可能与偏倚等因素有关。
本实验还比较了密度梯度离心法和上游法处理精液对体外受精的影响，结果显示，密度梯度离心法对精液处理后所获得的受精率和2-细胞率优于上游法。原因可能是：①密度梯度离心法与上游法相比能去除精液中的细胞碎片、死精子、弱精子以及有害物质，回收更多形态正常的精子，并明显增加精子的活力和体外生存能力［12］。②密度梯度离心法在处理精液过程中对精子损伤小，并且能有效去除白细胞及精浆中的杂质，减少对正常精子的氧化应激。③上游法对运动精子的回收率较低，而且会与细胞碎片及白细胞紧密接触，后者会产生高水平活性氧，导致精子质膜发生脂质过氧化反应，影响精子受精能力和胚胎发育［13］。④上游法在培养箱孵育的时间相对很长，为了获得足够多的质量好的精子，往往需要上浮1 2小时，研究认为［14］孵育时间太长，会增加精子代谢产物活性氧的含量，造成精子氧化损伤，使体外受精率和2-细胞率下降。两种精液处理方法对卵裂率和囊胚率无显著差异，其原因可能是两者在体外胚胎所处的环境相同，对胚胎发育影响较小，这说明胚胎的卵裂与囊胚的形成与精液处理的方法无关，也表明胚胎的培养系统是良好的，适合胚胎发育。
体外受精原核数目的判断与原核形态的评估是受精观察的重要内容，原核的大小、形成速度及形态特征与胚胎的发育潜能相关，当雌雄两个原核位置远离或伴有碎核及微核存在时，胚胎发育潜能低下［15］。早期卵裂即从受精卵分裂为2-细胞，在胚胎发育过程中非常重要，早期卵裂胚胎与延迟卵裂的胚胎相比具有较高的囊胚形成率与妊娠率［16］。本研究中的图1可见，胚胎发育质量良好，达到质控要求。
小鼠卵母细胞体内受精后进行体外培养可以获得更好的受精率和2-细胞率，体内和体外受精都可以获得很好的囊胚形成率；密度梯度离心处理精液获得的受精率和2-细胞率优于上游法，两种精液处理方法都可以得到理想的卵裂率和囊胚率；可利用鼠胚实验对新建胚胎培养室的培养环境、培养系统及技术员操作水平等进行评估。
参考文献
［1］黄国宁主编．辅助生殖实验室技术［M］．北京：人民卫生出版社，2014：1．
［2］李小平，郝朝亮，高庭，等．鼠胚实验在新建胚胎培养实验室质量控制中的作用［J］．中南医学科学杂志，2013，41（1）：21－23．［3］Ackerman SB，Taylor SP，SwansonＲJ，et al．Mouse embryo culture for screening in human IVF［J］．Archives of Andrology，1984，12（sup-
pl）：129－136．
［4］胡卫华，侯文文，吴满意，等．鼠胚实验在新建IVF胚胎培养室中的质控研究［J］．皖南医学院学报，2013，32（3）：181－186．
［5］Emerson G，Hughes C，Moca E．Temperature variation during shipping of culture media hidden risk in AＲT［J］．HumanＲeproduction，2011，26（1）：115．
［6］Stamatkin CW，ＲoussevＲG，Stout M，et al．PreImplantation Factor （PIF）correlates with early mammalian embryo development-bovine
and murine models［J］．Ｒeprodctive Biology and Endocrinology，2011，15（9）：63．
［7］Punt-van der zalm JP，Hendriks JC，Westphal JＲ，et al．Toxicity tes-ting of human assisted reproduction devices using the mouse embryo
assay［J］．Ｒeproductive BioMedicine Online，2009，18（4）：529－
535．
［8］Penzias AS．Ｒecurrent IVF failure：other factors［J］．Fertility and Ste-rility，2012，97（5）：1033－1038．
［9］Douglas TC，Lihua L，Greg C．Polyploidy in mouse embryos derived from in vivo and vitro fertilization is dependent on the timing of preg-
nant mare serum gonadotropin（PMSG）injection［J］．Fertility and Ste-
rility，2007，87（6）：1470－1472．
［10］Guo H，Zhu P，Yan L，et al．The DNA methylation landscape of human early embryos［J］．Nature，2014，511（7511）：606－610．
［11］黄国宁，孙海翔主编．体外受精－胚胎移植实验室技术［M］．北京：人民卫生出版社，2012：35－36．
［12］Hammadeh ME，Kuhnen A，Amer AS，et al．Comparison of sperm preparation methods：effect on chromatin and morphology recovery
rates and their consequences on the clinical outcome after in vitro fer-tilization embryo transfer［J］．International Journal of Andrology，2001，24（6）：360－368．
［13］Jakab A，Kovacs T，Zavaczki Z，et al．Efficacy of the swim-up method in eliminating sperm with diminished maturity and aneuploidy［J］．
HumanＲeproduction，2003，18（7）：1481－1488．
［14］段彪，杜海燕，张荣．精子获能时间及精卵共孵育时间对小鼠体外受精和胚胎发育的影响［J］．中华临床医师杂志，2013，7
（7）：3011－3014．
［15］Elif GE，Eray C，Ender Y，et al．Frequency of embryo multinucleation detected by time-lapse system and its impact on pregnancy outcom ［J］．Fertility and Sterility，2014，102（4）：1029－1033．
［16］Javier H，Alberto T，Carmela A，et al．A time to look back：analysis of morphokinetic characteristics of human embryo development［J］．Fer-tility and Sterility，2013，100（6）：1602－1609．
（收稿日期：2014-09-27；修回日期：2014-12-20）
试验室工作制度和管理制度 （一）试验室检测质量保证制度1、检测人员 （1）检测人员必须具备检测人员的各项要求，凭检测合格证在指定岗位上进行检测工作。 （2）检测人员要按照料标准、操作规程进行检测工作，工作要精益求精，对检测数据负责。 （3）在测试过程中，发生故障或因外界干扰测试中途停止时，测试人员将详细情况记录专用本上，并口头告知技术负责人，采取必要措施或重做。 2、检定设备 （1）检定设备可按照设备仪器管理制度有关规定执行。（2）检定设备要有设备使用卡片，对设备运转及技术参数做详细记载，并规定详细的操作规程。 （3）检定设备有故障或过期未校定校准，不得投入检测工作。（4）对进口设备经培训确实掌握技术，方可操作使用。（5）保持设备运行完好率，试验室环境符合检测工作的要求。3、读取数据与记录数据 (1)读取数据与记录数据必须按有关标准规定的检验方法与步骤进行。（2）记录数据应如实准确地填写在检测记录中。 （3 ）对检测所得数据进行可靠性分析，确认检测结果有问题，专业资料
应立即报告有关人员，并及时分析其原因，必要时重检。 4、试验室管理 （1）试验室内设备、安全、卫生等应由各试验室内专人管理。（2）凡有机器运转和通电设备，人员不得离开（对有自控保险装置除外）。（3）凡对试验室养护箱（室）等有温度、湿度规定要求的均要严格控制，并有专人负责每天记录。 （4）检测报告是判定原材料、关成品、成品质量的主要技术依据，要严格履行审核手续。 （5）各检测项目的原始记录，必须本人签字并及时出具检测报告。（6）检测报告应进行认真审核，无误后签字存档。 （二）力学室工作制度 （1）每日上班应对本室的仪器设备、工具箱、水、电等检查一遍，如有异常，应立即采取措施。 （2）试验人员应对所使用的仪器设备性能完全了解，包括配套的仪器及配件如何正确使用，试验机、万能机应尽可能在基量程的20～80%范围内操作。 （3）试验人员在试验前应熟悉每项试验的操作程序，避免在试验过程中查阅操作规程。 （4 ）在操作过程中应集中注意力，如发现仪器异常，应立即关专业资料 机，切断电源，并查明原因。
分子生物学综合试验报告
综合实验Ⅰ.Southern杂交 （质粒DNA提取、PCR技术体外扩增DNA、质粒载体和外源DNA的连接反应、 地高辛标记的Southern杂交） 一.实验目的 1.学习Southern杂交的原理及操作方法。 2.学习碱裂解法提取质粒的原理。 3.学习PCR反应的基本原理和实验技术；了解引物设计的一般要求。 4.掌握DNA体外连接的基本技能，了解连接反应的注意事项。 二.实验原理 利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。在碱变性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当pH=的乙酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的碱裂解法提取质粒的主要原理是：利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体DNA与大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 聚合酶链反应（PCR）是体外酶促合成DNA片段的一种技术，PCR 进行的基本条件：DNA模板（在RT-PCR中模板是RNA）、引物、dNTP （dATP、dTTP、dGTP、dCTP）、Taq DNA聚合酶、反应缓冲体系。 PCR循环由三个步骤组成：变性、退火、延伸。每一个循环的产物可作为下一个循环的模板，通过30个左右循环后，目的片段的扩增可达106倍。
DNA片段之间的连接是通过DNA连接酶的催化实现的。DNA连接酶催化具有平末端或互补粘性末端的DNA片段间相邻碱基通过3’,5’磷酸二酯键连接起来。最常用的来源于T4噬菌体的T4DNA连接酶。对于平末端或互补的粘性末端可直接进行连接反应。一个片段是平末端，另一片段为粘性末端或两个片段都是粘性末端但不配对，则需要通过各种方式使其可一匹配或通过平末端进行连接。通常采用末端补平、加同聚物尾、加接头等方式是目的片段之间能够匹配。 地高辛随机引物法标记的原理：在随机引物法标记的反应液中，有随机合成的六聚核苷酸作为引物，dATP、dCTP、dGTP、dTTP和D1G-11-dUTP作为合成底物，以单链DNA作为模板，在Klenow酶的作用下，合成插入地高辛的DNA链。以地高辛标记的探针与靶基因DNA链杂交后，再通过免疫反应进行检测。一般通过酶标记地高辛抗体检测，就可以肯定杂交反应的存在。免疫检验一般用碱性磷酸酶系统，BClP/NBT显色，敏感性很高。 三．实验准备 1.实验材料： 含质粒的大肠杆菌DH5α，LB液体培养基， LB平板培养基 2.实验试剂： Taq DNA聚合酶，10×反应缓冲液（含25mmol MgCl2），dNTP，引物（P1、P2），溴乙啶 (EB) ，点样缓冲液Loading buffer（10×）：%溴酚蓝，40%甘油，目的基因及载体， 2×ligation 缓冲液，T4 DNA连接酶， L CaCl2，氨苄青霉素（100mg/mL）， TBE电泳缓冲液（5×）， DIG Random Labeling Mix（高效），Anti-DIG-AP Conjugate， BCIP/NBT Stock Solution，Blocking Reagent。 20×SSC：柠檬酸钠，3M NaCl，2×SSC：柠檬酸钠， NaCl， EDTA，变性液： NaOH， NaCl，中和度： Tris-HCl、、3M NaCl，Standard buffer：5×SSC、%(w/v) N-Lauroylsarcosine, % (w/v) SDS, 1% Blocking Reagent，Standard buffer+50% formamide，Anti-DIG-AP 碱性磷酸酶标记抗地高辛单抗体，BCIP/NBT储备液，冲洗液：0. 1M
生物学实验常用技术一、分子方面 1、基因工程 1)PCR (Polymerase Chain Reaction) (二楼PCR仪器全部会用) 2)RT-PCR;Q-PCR 3)琼脂糖凝胶电泳;胶回收 4)酶切/链接 5)转化 6)固体/液体LB培养基配制 (高压蒸汽灭菌锅使用方法) 7)质粒大/小抽原理及步骤 (手提、溶液I、II、III作用) 8)基因组DNA抽提 9)RNA提取; 2、蛋白质工程 1)蛋白收集 (蛋白裂解液+PMSF; 1×Loading 裂解(推荐)) 2)SDS-PAGE(电泳胶的配制) 2)考马斯亮蓝染色,银染 3)Western blot 4)蛋白定量常用的方法及原理, 以及熟练操作Bradford法蛋 白定量 (TRIZOL法原理、注意事项及步骤) 二、细胞方面 1)细胞培养、传代 2)细胞冻存与复苏 冻存液配制: (1)DMSO:血清=1:9(推荐)
(2)DMSO:培养基:血清=1:3:6 均可 DMSO为细胞专用型;现用现配,效果最好;冻存时细胞在-80℃中不要超过一周,最好在24-48h内放入液氮罐中保存。 3)细胞培养基配制(过滤除菌)、胰酶配制(过滤除菌),PBS配制(灭菌);(不同培养基的区别;谷氨酰胺(提供氮源),2周补充一次) 4)转染 5)MTT原理及操作(检测细胞存活率或死亡率) 6)碱性磷酸酶实验(ALP,检测细胞分化) (5、6 需学会SPSS软件及graphpad prism5软件使用) 7)Hoechst染色 8)结晶紫染色(不推荐) 9)苏木精/伊红染色 (9可以替代8,以后实验推荐使用9,图片漂亮) 10)荧光显微镜的使用 11)激光共聚焦显微镜样品制备(细胞固定,染色,洗脱) (7、8、9、10、11需学会Photoshop常用工具处理数据) 12)流式细胞仪样品制备(包括:转染效率与细胞凋亡染色标记)以及仪器操作(需学会FlowJo软件分析流式结果) 三、动物实验 1)小鼠的定制: 常见的小鼠: ICR小鼠(正常),9元/只
农药残留分析实验室质量控制措施(一) 摘要农药残留分析实验室的分析质量控制是农产品监测工作的重要一环,其目的是为了保证监测数据的准确性。从多年农产品实验室质量控制工作的经验出发,对人员、试剂、设备、样品制备、标准溶液配制、加标回收率及数据分析等方面作了分析论述。 关键词农药残留分析;实验室;质量控制;措施 实验室的分析质量控制是监测工作的重要环节,是为了确保每个监测数据的准确与可信而采取的根本措施1]。 1人员管理 由于实验室分析人员的操作技术、判定能力等因素都会影响监测工作的质量,因此实验室必须对实验室人员实行培训、管理的有效控制。全面落实质量管理,关键在于对岗位员工进行全方面的职业技术和质量意识的培训,使其人员在具备本职工作能力的同时还要真正意识到质量的重要性,从而主动参与到质量控制活动中来2]。 2试剂管理 检测溶剂、试剂和吸附剂的纯度及适用性,不仅直接影响测定结果,而且对气相色谱仪中的色谱柱、检测器也有一定的影响,在试剂选择上不仅要选择合格供应商,同时还要建立检测试剂的质量标准和确认程序,对试剂厂家、方法、批号、有效期、储存温度在领取、使用中要进行核对,防止由于试剂的不合格导致检验结果错误。因此,在试验前必须测试每批次空白试剂、吸附剂和试剂的可用性。对溶剂而言一般每批溶剂
取100~200mL浓缩,定容1mL,进样1μL无干扰峰即可。而且在分析测定时,为避免交叉污染,要做全程序空白试验,确保测定结果的准确性、重现性。按比例配制的混合溶剂,由于各溶剂的沸点不同,放置时的挥发程度不同,比例易改变,因此混合溶剂宜现用现配。 3检验设备的管理 自动化设备的使用使试验结果对设备状况的依赖程度越来越高,因此设备状况在试验中至关重要。首先对实验室的设备进行科学有效的管理,要制订设备使用和维护的标准操作规程,做好培训和使用权限的管理,对色谱、气质联用等大型关键设备要专人管理,日、周、月维护要严格,及时让厂家校准、确认;软件系统的参数设置、试验的判定规则及检测结果的有效性必须经质量主管确认,数据由专人定期备份。 4样品制备管理 为了保证试验结果的准确性、可靠性,必须坚持包括样品采集在内的全过程质控,样本的质控分为样本交接、检测与保存3]。取样必须具有代表性,而且在每次切碎、打浆前都必须洗净所用的工具,避免样品之间的污染。样品前处理的基本要求就是尽量减少待测农药的损失、提高回收率、排除杂质的干扰、保持各操作的一致性。样本检验状态分合格、未检测、可疑样本,检测时要明确标识,不能混淆。样品的保存要按日期、目的分别保存,使其具有可追溯性。
一、名词解释 1.分配常数：又称分配系数，是指一种分析物在两种不相混合溶剂中的平衡常数。 2.多肽链的末端分析：确定多肽链的两末端可作为整条多肽链一级结构测定的标志，分为氨基端分析和羧基端分析。 3.连接酶：指能将双链DNA中一条单链上相邻两核苷酸连接成一条完整的分子的酶。 4.预杂交：在分子杂交实验之前对杂交膜上非样品区域进行封闭，用以降低探针在膜上的非特异性结合。 5.反转录PCR：是将反转录RNA与PCR结合起来建立的一种PCR技术。首先进行反转录产生cDNA,然后进行常规的PCR反应。 6.稳定表达：外源基因转染真核细胞并整合入基因组后的表达。 7.基因敲除：是指对一个结构已知但功能未知或未完全知道的基因，从分子水平上设计实验，将该基因从动物的原基因组中去除，或用其它无功能的DNA片断取代，然后从整体观察实验动物表型，推测相应基因的功能。 8.物理图谱：人类基因组的物理图是指以已知核苷酸序列的DNA片段为“路标”，以碱基对(bp，kb，Mb)作为基本测量单位(图距)的基因组图。 9.质谱图：不同质荷比的离子经质量分析器分开后，到检测器被检测并记录下来，经计算机处理后所表示出的图形。 10.侧向散射光：激光束照射细胞时，光以90度角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。
11.离子交换层析：是以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的层析。 12.Edman降解：从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程。 13.又称为限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)：是能够特异识别双链DNA序列并进行切割的一类酶。 14.电转移：用电泳技术将凝胶中的蛋白质，DNA或RNA条带按原位转移到固体支持物，形成印迹。 15.多重PCR：是在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份模板样品中不同序列的PCR 过程。 16.融合表达: 在表达载体的多克隆位点上连有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。 17.同源重组：发生在DNA同源序列之间，有相同或近似碱基序列的DNA分子之间的遗传交换。 18.遗传图谱又称连锁图谱(linkage map)，它是以具有遗传多态性的遗传标记为“路标”，以遗传学距离为图距的基因组图。 19.碎片离子：广义的碎片离子为由分子离子裂解产生的所有离子。 20.前向散射光：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度向前方散射的讯号用于检测细胞等离子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。 21.亲和层析:利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其他分子的一种层析法。(利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合
实验室质量常见的5种控制方法 一、空白样质量控制 空白样主要包括容器、现场、仪器、方法空白样等，通过测定空白样以判断实验用水、试剂纯度、器皿洁净程度、仪器性能及环境条件等的质量状况或是否受控。 空白实验质量控制应符合以下要求： 1.除分析方法另有规定之外，每一批样品小于10个时，检验人员制备方法空白样或仪器空白样不得少于1个；每一批样品不小于10个时，每10～20个样品制备1个方法空白样或仪器空白样。 2.空白试验分析值应低于方法检出限或低于方法规定值；空白平行测定的相对偏差应 不大于 50%。 3.有质量控制图的，将所测定值的均值点入图中进行控制。 4.若空白值不符合规定值范围，应查找原因，消除之后，重新分析。 二、平行样质量控制 平行样质量控制主要包括现场平行样、实验室平行样和密码平行样，通过平行样测定判断检测精密度状况或是否受控。 平行样质量控制应符合以下要求： 1.每一批样品小于10个时，检验人员制备的平行样不得少于 1 个；每一批样品不小于10 个，每10～20个样品制备1个平行样。 2.平行测定值不符合规定值范围的，应查找原因，消除之后，重新测定。 3.有质量控制图的，将所测定值的均值点入图中，进行控制。 三、加标回收质量控制 加标回收试验主要包括空白加标、基体加标、实际样品加标和密码加标回收试验，通 过加标回收试验判断检测准确度状况或是否受控。 加标回收试验质量控制应符合以下要求： 1.每一批样品小于10个时，检验人员制备加标样品不得少于1个；每一批样品不小于10个时，每10～20个样品制备1个加标样。 2.加标样品测定值不符合规定值范围的，应查找原因，消除之后，重新分析。
分子生物学实验 设计实验 题目：在大肠杆菌中表达绿色荧光基因（EGFP ） 学院：生命科学学院 专业：生态学 教师：吴传芳 姓名/学号：余光辉/20 方成/20
一、实验目的 在大肠杆菌中表达绿色荧光蛋白 二、实验流程 三、实验试剂、材料及步骤 (一)质粒DNA的提取 1.原理 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌 体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后， 质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染 色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。 经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和 RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常 规亚克隆及探针标记等要求 2.试剂 LB培养液:胰蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeast extract）5 g，NaCl 5g， 琼脂（固体培养基）15g，用1N NaOH调pH 7.5。 溶液Ⅰ：50mmol/L 葡萄糖， 10mmol/ EDTA-Na， 25mmol/L Tris-HCl (pH8.0) 溶液Ⅱ：0.4mol/L NaOH ， 2% SDS 临用前1：1配制。 溶液Ⅲ：5mol/L 醋酸钾60ml 冰醋酸11.5ml 双蒸水28.5ml 卡那霉素(20mg/mL) 抽提液（饱和酚：氯仿：异戊醇=25：24：1 ） 无水乙醇 70%乙醇 TE缓冲液或ddH2O
3.材料 含质粒pET-28a和pEGFP-N3菌液 1.5ml塑料离心管 EP管架 微量取液器和取液器吸头 常用玻璃器皿 4.实验步骤 （1）将带有质粒pET-28a和pEGFP-N3的大肠杆菌接种在液体培养基中（加氨苄青霉素50μg/mL），37℃培养过夜 （2）取培养菌液1.5mL置Eppendorf小管中，10000rpm×2min，弃上清液 （3）加入100μL溶液I，漩涡器上充分混匀，在室温下放置10 min （4）加入200μL新配制的溶液Ⅱ，轻轻翻转2~3次，使之混匀，冰上放置5 min （5）加入150μL冰冷的溶液Ⅲ，加盖后温和颠倒数次使混匀，产生白色絮状物，冰上放置15 min （6）10000rpm×5 min，取上清液于另一干净的离心管中 （7）向上清液中加入等体积（约400μL）酚/氯仿/异戊醇（25:24:1，v/v），振荡混匀，10000rpm ×10 min，将上清液转移至新的离心管中（8）加入等体积（约370μL）氯仿/异戊醇（24:1），混匀，离心2min ,取上清液于新离心管中 （9）向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀，-200C放置1h （10）12000rpm × 5 min，倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体 （11）加0.8mL70%乙醇，离心1 min，倒去上清液，真空抽干或室温自然干燥30min （12）加30μL ddH2O ，-200C保存备用 5.注意 （1）饱和酚（取下层）单独吸200μL，氯仿：异戊醇（24：1）吸200μL （2）制备质粒过程中，所有操作必须缓和，不要剧烈振荡（特别是加入溶液II 和III ），以避免机械剪切力对DNA的断裂作用 (二)DNA琼脂糖凝胶电泳检测 1.原理 在质粒提取的过程中，由于操作原因，提取的质粒可能有三种：线性DNA、 开环DNA 、闭环超螺旋DNA 。 当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA泳动速度：闭环超螺旋〉线状〉开 环。 但有时也有也会出现相反情况，因为与琼脂糖浓度、电流强度、离子强度及核 酸染料含量有关。 2.试剂 Gold view（DNA染料） 0.5×TBE缓冲液 上样缓冲液（6×） 3.材料 提取的pEGFP-N3和pET-28a ，琼脂糖，锥形瓶，一次性手套，胶铲，封口膜，
实验室内部质量控制措施培训试题实验室内部质量控制措施培训试题姓名: 得分: ,判断题,1、实验室质量控制措施仅仅是对检测过程的控制。, , ,多选题,2、重复性是指相同的测量条件～对同一样品进行同一项目的连续多次的测量～其中可重复的条件包括:( ) A.相同的测量程序, B.相同的观测者, C.在相同的条件下使用相同的测量仪器, D.相同的地点, E.在短时期内重复测量。 (判断题)3、实验室内部人员比对试验～就是不同的检测人员对相同样品的检测。, , ,判断题,4、实验室内部人员比对试验～对于新开展检测项目和新上岗人员很必要～对于日常开展的常规项目～并且多年经验的检测人员～则不必做比对试验了。, , ,判断题,5、实验室只要是认证项目～任何样品均可留样再测。, , ,判断题,6、设备比对就是实验室若干检测人员～使用同一方法～相同条件下～对同一样品～使用不同仪器设备～进行同一项目检测。, , ,判断题,7、通过方法比对～可以判断在实验室内部～标准是否受控、有效～并被正确理解和严格熟练地执行。, , ,多选题,8、下列哪些是有证标准物质所具有的属性, , A.均匀性、稳定性 B.有效期 C.溯源性
D.赋值与测量不确定度 E.重复性、复现性 ,多选题,9、加标回收试验加标原则有哪些,, , A.一致原则 B.可比原则 C.相近原则 D.不变原则 E.适用原则 (多选题)10、某实验室准备开展留样再测试验～对样品和检测项目进行了选取～下列选项中适于开展留样再测的有, , A. 生活饮用水～硫酸盐～126mg/L～水样4?冷藏保存1周。 B. 生活饮用水～pH值～7.65～水样4?冷藏保存1周。 C. 烤肠～亚硝酸盐含量～45mg/kg～样品4?冷藏保存2周。 D. 冰激凌奶冰～总固体～26.8,～样品4?冷藏保存1周。
食蟹猴人工授精及體外受精實驗初步程序 KHI Bioservices(Hong Kong)Limited 袁濤 D.V.M 1人工授精及體外受精實驗初步程序 : 1人工授精 (artificial insemination) 1.1母猴準備 利用獨立籠檢視母猴月經, 選擇有正常及規律性月經之猴子進行 利用腹腔鏡(Laparoscopy)或超聲波(Ultrasound)檢查卵巢及卵泡發育情況, 自月經後第5天每隔一天檢查, 接近排卵期時每天進行檢查, 直至確定排卵. [ 另有學者進行荷爾蒙測試 (estrogen, progesterone, LH) 確定排卵 (estrogen ,↓ ↑↑腹腔鏡(Laparoscopy)或超聲波(Ultrasound)較能直接檢視卵泡發育狀progesterone , LH ), 況 ] 1.2公猴取樣 -電激棒取樣 一般分有penile stimulation 及 rectal probe stimulation 電激棒之規格 -精子處理 方法 1取樣後, 凝固精液放於37C 30分鍾 5% CO2 培育箱液化 2液態精液以Tyrode albumin lactate pyruate-HEPES (TALP-HEPES)稀釋1:5 3抽取小許檢視精子活力, 形態及數量 4稀釋至2.0 – 4.0 x 108精子/ml [另有日本研究用2.5 – 5.0 x 107精子/ml 濃度進行 授精] 5培育於30 – 32 , 2-3小時 [另有加入1mM Caffeine使精子活能化(capacitation) ] 1.3授精程序 有文獻提及, 日本獼猴人工授精實驗中, 授精於陰道內之猴不能授精,而只有授精於子官內方可成功. 於食蟹猴陰道及子官均可. 1當母猴証實排卵時, 每天進行0.2ml輸精, 一般由11-14天
实验室质量控制措施 实验室是专门从事检验测试工作的实体，其工作的最终成果是检测报告。为了确保检测数据的准确可靠，以保证检测报告的质量，所以必须有一个质量控制过程，必须明确质量控制各阶段可能影响检测报告的各项因素。从而对这些因素采取相应的措施加以管理和控制，以使其过程处于受控状态。 可以选用的质量控制方法通常有以下几种： a）使用有证标准物质或次级标准物质开展内部质量控制； b）参加实验室间比对实验或能力验证计划； C）使用人员比对、方法比对、仪器比对等进行复现性检测； d）对存留物品进行再检测； e）分析一个物品不同特性结果的相关性； f）其他有效的技术核查方法。 质量控制的目的：监控检测、校准的有效性，保证检测结果可靠。 为了做好检测报告的质量控制我们该从几方面进行保证： 1.实验室硬件设施、包括场地、使用材料、建筑要求等要按相关实验室标准执行。 2.实验室内部技术质量控制：也就是检验人员的检验技术控制，具体方法有： （1）标准物质（样品）盲样检测：由检测人员对标准物质（样品）盲样检测，将检测结果与标准值比较，以验证检测测量能力。 （2）样品复测：某一样品的检测完成后，再用相同的方法对该样品的相同 参数进行复测，将两次的检测结果进行对比，以验证检测结果的可靠性。 （3）人员比对：由不同的检测人员对某一样品进行相同方法的检测，将两 次的检测结果进行对比，以验证检测结果的可靠性。 （4）样品不同特性的相关性检验：同一样品的某些参数之间往往有一定的内在联系，对这些参数的检测结果进行比较，亦可作为判断检测结果可靠性的方式之一，若相关参数检测结果相互矛盾，应查找原因，对有疑问的项目进行复测，使相关参数间的关系趋于合理。 3.第二步在实验室硬件软件的质控下，要做好实验室检测环节的质量控制。 首先要做好实验室标准物质以及试剂的管理 （1）标准物质（参考物质、标准溶液、对照品）对检测质量有重要的影响。
实验室质量控制方案 1.定义 1.1质量保证是试验检测过程的全面质量管理，包含了保证试验数据 准确可靠的全部活动和措施； 1.2质量控制指以满足试验检测质量需求所采取的操作技术和活动。 2.实验室质量控制技术 按照内控（含分析人员自控、他控）、外控进行控制，从检测人员、仪器设备、现场采样、实验室分析、数据记录、报告等方面严把 质控关。 2.1检测人员 检测人员应经培训，并按照《见证取样工程检测》要求持证上岗。 2.2监测仪器设备 2.2.1仪器设备的检定和校准 每年由仪器设备管理员制订年度仪器设备送检校准计划，对属于国家强制检定的仪器设备，应依法送检，并在合格期内使用；非强制 检定仪器设备按照相关规程进行自校或核查。每年对仪器与设备检定 及校准情况进行核查，未按规定检定或校准的仪器设备不得使用。 2.2.2仪器设备的运行和维护 每年由仪器设备管理员制订仪器与设备年度核查计划，并按计划执行，保证仪器设备运行正常。 3.质量监督检查
质控室制订质保监督检查计划，定期开展质量监督检查：一是利用有证标准物质开展内部质量控制活动；二是使用相同方法或不同方 法重复检测或校准测量；三是对存留样品进行再检测或再校准测量。 通过以上方式积极开展人员比对、方法比对、仪器比对等控制手段进 行质量监督检查。 4.有机分析质控要求 1.3分析仪器性能校准 对分析仪器按规定的方法进行校准,仪器校准应在分析当天或按仪器要求执行。 1.4标准曲线核查 样品分析当天或仪器每运行12 小时，应用标准溶液对标准曲线进行核查。通常情况下，若标准溶液的分析结果与标准值相对误差不 超过 20%，原标准曲线可继续使用；若分析方法中对标准曲线核查有 明确要求，则按方法要求执行。发现标准曲线失控，应立即重新绘制 曲线。 5.实验室外部质量控制 积极参加国家、河北省组织的实验室间参加能力验证、设施比对等活动，每年应至少参加一次。
一、实验名称:临时装片、切片、涂片的制作、观察与指导 二、实验目标:让学生通过独立自主的制作临时装片、切片、涂片的方法来感知细胞的形态与结构,从而使学生对细胞达到一定的认识,为以后的教学作下铺垫。制作临时装片的成功,对提高学生的生物学兴趣与生物科学素养都起着重要的作用。同时,这样锻炼了学生的动手能力,也培养了学生的自己动脑思考的能力。 三、实验方法及步骤: (一)实验材料:显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、刀片、吸水纸、解剖针、毛笔、滴管、擦镜纸;清水、碘酒溶液;西红柿、空心莲子草、洋葱;创可贴(切片时可能会有人受伤) (二)实验步骤: 1、临时装片的制作 ⑴准备 擦用擦镜纸把载玻片与盖玻片擦拭干净 改进:将洁净的纱布改为擦镜纸,擦拭玻片时要注意用左手的拇指与食指 夹住玻片的两端,右手的拇指与食指衬垫上洁净的纱布后,夹在玻片两面,同时擦拭,以防将玻片损坏, 滴用滴管在载玻片中央滴1-2滴清水 改进:在制片时至少滴2滴清水,这样加盖玻片时,盖玻片下的空间中水 较充盈,气泡就少,细胞的活性也较好 取用刀片在洋葱表面上划“井”字(大约0、5cm2),用镊子撕取外表皮 问题:由于叶表皮皱缩、学生不熟练等,导致撕下的表皮薄膜过厚,在显微 镜视野中难以找到理想的观察对象,致使实验效果较差。 改进:首先将洋葱鳞片叶切成宽1、0-1、5 cm 的纵向窄条,再用刀片将 洋葱鳞片叶内侧表皮划成小块(切忌划透),然后用镊子夹住所划表皮的 边缘,将其轻轻取下(洋葱鳞片叶内侧表皮易与叶肉分离,操作简便)即 可。这一改进降低了实验操作难度,提高了制片质量。 放把撕取的表皮浸入载玻片上的水滴中,并展平 ⑵盖盖玻片 盖用镊子夹起盖玻片,使它的一边先接触载玻片上的水滴,然后缓缓地 放下,盖在要观察的材料上 ⑶染色 染:将玻片倾斜10度左右,从高的一侧滴入碘液,让其自己流入玻片。 问题: 染色时书中要求就是把1-2滴碘液滴在盖玻片的一侧,然后用吸 水纸从盖玻片的另一侧吸引,使染液浸润标本的全部。然而,部分同学可 能将盖玻片下所有水全部吸干,做出的装片会有很多的大气泡,且气泡将 细胞掩盖了,或者有人将气泡误认为细胞。 改进:染色时不用吸水纸吸水,而就是将玻片倾斜10度左右,这个角度一
分子生物学实验报告专业：****** 班级：*** 指导老师：** 学生姓名：*** 目录： 实验一质粒DNA的小量制备 实验二DNA的含量、纯度与分子量的电泳法测定 实验三感受态细胞的制备及转化 实验四PCR扩增技术与琼脂糖凝胶电泳检测 分子生物学基础实验 分子生物学实验技术已成为生物化学及分子生物学以及相关学科院系教学科研不可缺少的一部分。为提高学生在分子生物学技术方面的动手能力，生物技术综合实验室主要开设常用而基本的分子生物学实验技术。它的内容包括质粒DNA的制备；DNA的重组；PCR基因扩增等等。 实验一质粒DNA的小量制备 一、实验原理 要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector）。载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必须具备下列条件:(1)是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体DNA链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，
如有抗四环素基因（Tc r），抗新霉素基因（Ne r）等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。细菌质粒具备上述条件，它是基因工程中常用的载体之一。 质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1～120kb之间，具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。 质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。后者的质粒在整个细胞周期中随时复制，在细胞里，它有许多拷贝，一般在20个以上。通常大的质粒如F因子等，拷贝数较少，复制受到严格控制。小的质粒，如ColE Ⅰ质粒（含有产生大肠杆菌素E1基因），拷贝数较多，复制不受严格控制。在使用蛋白质合成抑制剂－氯霉素时，染色体DNA复制受阻，而松弛型ColEⅠ质粒继续复制12－16h，由原来20多个拷贝可扩增至1000－3000个拷贝，此时质粒DNA占总DNA的含量由原来的2％增加到40％－50％。本实验分离提纯化的质粒pBR322、pUC19就是由ColE Ⅰ衍生的质粒。 所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（SDS）可使细胞壁解，经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌染色体DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在清液中。用乙醇沉淀、洗涤，可得到质粒DNA。 质粒DNA的相对分子量一般在106－107范围内，如质粒pBR322的相对分子质量为2.8×106，质粒pUC19的相对分子质量为1.7×106。在细胞内，共价闭环DNA（covalently closed circular DNA，简称cccDNA）常以超螺旋形式存在。如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫做开环DNA（open circular DNA，简称ocDNA）。在电泳时，同一质粒如以cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA的泳动速度快，因此在本实验中，自制质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。 二、实验目的 1．掌握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法。 2．了解制备原理及各种试剂的作用。 三、实验材料和试剂 材料：大肠杆菌E.coli，含pBR322质粒。 试剂：
2006 年《分子生物学实验技术》实验内容 RT-PCR （一）总 RNA的提取 实验安排：每两人抽提一管。为了使操作同步以节省时间，各组样品请一起离心。 操作步骤： TM（苯冰预冷的900μlLS -Biotragents液体样品加入 1.5ml Ep管中，再加入1、将100μ l 酚和异硫氰酸胍的混合物）。 2、将样品剧烈混合后，在室温放置5min。 3、加入200μl 氯仿，颠倒Ep 管混和两次，并剧烈振荡混和10s。 4、在4℃条件下，以10000×g 离心15min。 5、将上层水相转移到一个新的Ep 管中，加入等体积的异丙醇（Isopropanol）并混匀，然后在4℃放置至少10min。 6、在4℃条件下，以10000×g离心15min 后，小心并尽可能地去除全部上清夜。 7、用1ml 75%乙醇洗涤RNA 沉淀和管壁。 8、将RNA 沉淀进行干燥（不能完全干燥）处理后，用10μl 无RNase污染的水（RNase- Free Water）将RNA 溶解并于-20℃保存。 注意事项： 1、所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr 或更长时间。 2、所用的塑料材料，如吸头、离心管等需用0.1% DEPC 水浸泡过夜。 3、配制的溶液应尽可能用0.1% DEPC，在37℃处理12hr 以上。然后用高压灭 菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC 处理过的无菌双蒸水 配制，然后经0.22μm 滤膜过滤除菌。 4、操作人员需在超净工作台上操作，并戴一次性口罩、手套，实验过程中手套要勤换。 二）反转录 实验安排： 每人做一管反应体系（20μ l）：按下列顺序加样 μl4 5× Buffer
专题三胚胎工程 3.1——3.2听写 姓名： 1、胚胎工程的操作对象：。 2、精子的发生时间：；卵子的发生是从 开始，减数第一次分裂是在完成的，减数第二次分裂是在 过程中完成的，当时，说明卵子已经完成了受精（卵子已完成受精的标志）。排卵是指：。哺乳动物卵泡的形成和在卵巢内的储备，是在时完成的，这是精子和卵子在发生上的重要区别。 3、精子形成时要经过变形，其中，变为头部，发育为顶体，演变成尾，聚集在尾的基部形成，作用是。细胞内的其他物质浓缩成，最后脱落。 4、在受精之前，须经准备阶段，包括和，其中，卵子要在 内进一步成熟，须达到期，才具备与精子受精的能力。 5、受精时，精子首先发生反应，穿越，然后穿越，并接触到。阻止多精入卵的的屏障有。受精作用完成的标志是。 6、卵裂期的细胞数量，但胚胎的总体积，早期发育的胚胎按时间先后顺序包括：。其中，其中，阶段前的每个细胞属于全能细胞。期开始出现了细胞分化，将来发育成胎儿的各种组织，滋养层细胞将来发育成，该时期还出现了腔，胚胎进一步扩大，出现现象。期出现了胚层分化。内细胞团表层的细胞形成，下方的细胞形成。 7、培养试管动物所用的技术有：， 培育试管动物的意义是。 8、体外受精的步骤主要包括：。 9、实验动物常采用的获取卵母细胞的方法是，所用激素是， 从中冲取卵子，直接与获能的精子在体外受精。从屠宰场已屠宰母畜的卵巢中或从活体中采集的卵母细胞，都需进行体外培成熟养，其目的是。10、采集精子的方法有。从良种公牛采集的精子需才能进行受精作用。体外获能的方法有法和法两种，其中后者是将精子放在一定浓度的溶液中，用化学药物诱导精子获能。 11、获能的精子和培养成熟的卵子，一般可以在溶液中完成受精作用。 12、早期胚胎培养的培养液称为培养液，成分是： 。受精卵在其中培养的目的是。 13、牛、羊等动物的胚胎需培养到阶段进行移植，人的体外受精胚胎可在阶段移植。 14、试管牛和克隆牛中，属于有性生殖的是，二者均用到的技术有：。
微生物学实验报告（格式标准） (生命科学专业) 教师：黎勇 目录索引
实验一油镜的使用和细菌的简单染色法 3 实验二细菌的革氏染色与芽孢染色 5 实验三常用培养基的配制7 实验四酵母菌霉菌的形态结构观察及酵母死活细胞的鉴别8 实验五、微生物大小的测定与显微计数10 实验六环境中微生物的检测和分离纯化11 实验七细菌鉴定中常用的生理生化反应12 实验八（综合实验）化能异养微生物的分离与纯化13 课程名称：微生物学实验班级：化生系生命科学本科 实验日期：指导教师：黎勇 实验一油镜的使用和细菌的简单染色法 〔目的要求〕学习并熟练掌握油镜的使用技术；观察细菌的基本形态；学习观察细菌的运动性的基本方法。 〔基本原理〕 1. N2A=n2sinα 2. D=λ/2N.A 3. 目镜可提高放大倍数，但有效放大率取决于镜口率。已经分辨的物体不放大看不清，未分辨物放得再大也看不清。 4. 用悬滴法或凹玻片法观察细菌的运动性时，可以通过真运动能定向地由一处快速运动来区别于颗粒的布朗运动。 〔器材用具〕显微镜、载玻片、凹玻片、盖玻片、接种环、香柏油、二甲苯、凡士林、吸水纸、擦镜纸；细菌、放线菌等固定装片；培养18小时左右的B.subtilis. S.arueus 菌斜面培养物；无菌水、生理盐水。
〔方法步骤〕： （一）油镜的使用 镜检装片在中倍（或高倍镜）下找到目的物，并使位于视野正中聚光镜上升到最高位置，虹彩光圈开到最大，镜头转开成八字形在玻片的镜检部位（光斑处）滴一滴香柏油油镜转入正下方侧视小心上升载物台（缩短镜头与装片距离，镜头浸入油中，至油圈不扩大为止镜头几与装片接触）粗调器徐徐下降载物台（密切注视视野，当捕捉到物像时，立即用细调器校正）仔细观察并绘图 取出装片，清洗油镜：擦镜纸拭去镜头上的香柏油擦镜纸沾少许二甲苯擦去残留（用手指辅助，迅速拭擦一、二次）用清洁擦镜纸仔细擦干二甲苯（2-3次）。 （二）细菌的简单染色法：涂片干燥火焰固定染色水洗干燥油镜观察 （三）细菌运动性的观察取洁净盖玻片，四周涂上凡士林滴加一小滴菌悬液凹玻片的凹窝向下盖于盖玻片上翻转观察 〔结果分析〕 1、画一圆圈表示视野，选取所观察的微生物绘图，注意特殊结构、形状和排列。（描绘时按视野实际大小5－10倍绘制） 菌名：大肠杆菌菌名：金黄色葡萄球菌 放大倍数：100310（35）放大倍数：100310（35） 特殊结构：无特殊结构：无视野观察下微生物的形态 2、油镜使用时为什么必须干燥装片？ 防止水油分层，光受到折射而影响油镜性能的发挥 〔实验讨论〕 首次实验中有几个要点：一是按无菌操作取用菌；二是涂片技术的掌握；三是油镜使用技术。凡实验中学生的所思所想，如无菌操作技术要点、自行处理实验材料、失败与思考等均可进行讨论（如涂片时蒸馏水不宜过多、取用菌时防止菌被灼烫变形、取菌宜少不宜多等均是可以讨论的内容）。
前言 1.本课程主要讲述了哪些实验技术，其中被称为生化实验室中三大实验技术的是？ 答：层析技术、电泳技术、离心技术、分光光度技术、免疫化学技术。其中层析技术、电泳技术、离心技术是生物学的三大实验技术。 第一章生物化学基本操作与要求 1.洗涤液的种类配置与应用 答：（1）铬酸洗液（称取5g重铬酸钾粉末置于250mL烧杯中，加水5mL，尽量使其溶解，慢慢加入浓硫酸100mL，边加边搅拌。冷却后贮存备用，若颜色变绿，表示洗液已失效。）用于洗涤玻璃器皿。（2）浓盐酸，洗去水垢或某些无机盐沉淀。（3）30%硝酸，洗涤CO2 测定仪器及微量滴管（4）45%尿素，洗涤蛋白制剂、血样（5）有机溶剂，洗涤油脂、脂溶性染料（6）去污粉，一般污染物 2.化学试剂的分级 答： 3.什么是准确度、精密度？ 答：准确度表示实验分析测量值与真实值相接近的程度。误差。精密度是指在相同条件下多次测量结果互相吻合的程度，表现了测定结果的再现性。偏差。 4.如何提高实验的准确度、精密度？ 答：准确度：减少系统误差1.仪器校正2.空白试验3.对照实验；精密度：减少偶然误差 1.平均取样 2.多次取样。 第二章层析技术 1.层析技术及其原理 答：层析技术是一种基于被分离物质的物理、化学、生物学特性的不同，使它们在某种机制中移动速度不同而进行分离和分析的方法。 2.名词：固定相、流动相、分配系数 答：固定相：固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂、凝胶、离子交换剂等）也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附、溶解、交换等作用。 流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体等。 分配系数：是指在一定的条件下，某种组分在固定相和流动相中含量的比值， Kd=固定相中的总量/流动相中的总量。 3.层析法的分类 答：按流动相的形式分：气相色谱法1.气固色谱法2.气液色谱法，液相色谱法1.液固色谱法2.液液色谱法；按固定相的形式分：1.柱层析法2.纸层析法3.薄层层析法。 4.几种主要凝胶的中英文名称、型号、及型号数字代表的含义 答：葡萄糖凝胶（dextran型号Sephadex G-10~200数字代表凝胶的吸水率） 聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide主要型号有Bio-Gel P-2~300,数字代表它们的排阻极限的10-3）琼脂糖凝胶（agarose Sepharose,Bio-Gel A）
实验室质量控制 实验室质量控制是指为将分析测试结果的误差控制在允许限度内所采取的控制措施。它包括实验室内质量控制和实验室间质量控制两部分内容。实验室内质量控制包括空白实验、校准曲线的核查、仪器设备的标定、平行样分析、加标样分析以及使用质量控制图等。它是实验室分析人员对对测试过程进行自我控制的过程。实验室间质量控制包括分发标准样对诸实验室的分析结果进行评价、对分析方法进行协作实验验证、加密码样进行考察等。它是发现和消除实验室间存在的系统误差的重要措施。它一般由通晓分析方法和质量控制程序的专家小组承担。 实验室质量控制的方式有几种？实验室分析质量控制的目的是什么？ 可以选用的质量控制方法通常有以下几种： a）使用有证标准物质或次级标准物质开展内部质量控制； b）参加实验室间比对实验或能力验证计划； c）使用人员比对、方法比对、仪器比对等进行复现性检测； d）对存留物品进行再检测； e）分析一个物品不同特性结果的相关性； f）其他有效的技术核查方法。 质量控制的目的：监控检测、校准的有效性，保证检测结果可靠。 实验室质量管理制度大全 一、科室必须成立质量控制小组并设质量监督员一人，质量监督员必须做好有关质量管理日常工作记录，科主任全面负责质量控制管理工作。 二、质量控制小组由科主任、质量监督员、质量管理员组成，监督实验室整个质量管理体系的有效进行。 三、由科主任或质量监督员组织质控小组每月召开一次“质量控制监督会”，并作好记录。 四、质量监督员负责执行检验过程的各项指标的质量控制程序和对本科室室内质量控制、室间质量评价进行分析和处理。 五、各专业实验室质量管理员负责本室室内质控是否按照实验室内部质量控制程序文件和作业指导书有关要求进行工作。 六、室内质量控制：对检验科开展的检验项目检验程序进行质量控制，以保证检验结果的准确性。 （一）技术负责人负责批准室内质控规则和检验过程的质量控制程序； （二）各组组长负责制定本组室内质控规则和检验过程的质量控制程序；（三）检测人员负责执行检验过程的质量控制程序和对本岗位室内质控进行分析和处理； （四）质量监督员监督本组内是否按照程序文件和作业指导书有关要求进行。