项目名称：生姜蛋白酶的提纯与固定化及肉类嫩化技术
申报奖种：山东省科学技术进步奖
项目简介：
本项目是在多个“生姜蛋白酶”课题资助的基础上，由山东省科技攻关项目、山东省自然科学基金资助的研究成果，利用我省特色生姜资源进行生姜蛋白酶的提纯、固定化、应用研究，拥有自主知识产权，达到国内领先水平。包括以下主要内容：
（1）生姜蛋白酶的提取纯化技术：确定了生姜蛋白酶的最佳提取、纯化配套方案为无水乙醇沉淀法提取后采用Sephadex G-50 Medium尺寸排阻层析（SEC）纯化和Cellulose DE-52与Sepharose DE-52两种离子交换层析（IEC）联合纯化法。以姜汁酶活力为基准，SEC纯化倍数达到4.19倍，是粗酶的2.11倍。并确定了生姜蛋白酶由两个等电点不同的组分组成，且都是酸性蛋白质。
（2）双水相萃取法：确定了生姜蛋白酶的三步双水相萃取方法中聚乙二醇最佳分子量和浓度、硫酸铵和NaCl电解质的最佳浓度以及双水相的配比和最佳pH，确定了第二、三步硫酸铵盐溶液的添加量和浓度。第一步双水相萃取得到的生姜蛋白酶酶活力分配系数为6.17，酶活力回收率为393.77%，上相酶纯化倍数为1.85，酶的得率为1.20%；第二步分别为8.03，131.26%，2.81， 1.07%；第三步为2.04，80.63%，2.91，0.72%。
（3）确定了乳化-交联法制备活性壳聚糖微球的最佳制备条件，及以其为载体采用吸附-交联法固定生姜蛋白酶的最佳固定化条件，所得固定化酶的酶活力为672.6U/g，酶活回收率达到了69.3%。同时比较了固定化酶与游离酶的酶学性质差异。
（4）研究了生姜蛋白酶对肉类嫩化的最佳工艺条件是：酶用量为0.06%，pH为7.0，预处理温度为50℃，预处理时间是2h，嫩化效果显著。并通过测定牛肉肌纤维的小片化指数和牛肉肌纤维直径、全肌肉蛋白SDS-PAGE电泳等牛肉超微结构的变化，推断其嫩化机理可能是：生姜蛋白酶将牛肉肌纤维软化、分解，使牛肉肌纤维直径减小，促进牛肉肌纤维的小片化，同时促进了牛肉蛋白质降解成更小的物质，使牛肉成分整体上分解为更细、更小的成分，使其食用时变得细嫩、松软，从而达到嫩化的效果。
（5）收集到全国38种不同品种的生姜，比较了不同品种生姜中蛋白酶含量差异，发现不同品种生姜中蛋白酶含量从0.03（黄山老姜）到5.62（丹东姜），差异很大，从而分析出了国内外专家学者关于生姜蛋白酶的许多分歧点的可能原因是不同品种间的差异，这是造成生姜中蛋白酶含量差异较大的主要原因，远远高于不同提取方法造成的生姜蛋白酶含量差异。
授权专利情况：专利“生姜蛋白酶的三步双水相萃取方法”已经授权。
应用推广情况：生姜蛋白酶可广泛应用于食品、药品、纺织等领域，投资少，前景广阔，尤其发达国家，如欧美市场有大量需求。该项目已经在山东莱芜东兴源食品有限公司、山东日照赛普食品有限公司等4家单位进行了生产，三年新增利润10283.3万元，这主要是因为
市场上该类产品很少，满足不了市场需求，价格昂贵，利润丰厚。我单位与日照赛普食品科技有限公司于2010年正式合作，通过国家农业成果转化项目（2011GB2C600022）进行该成果的推广和大规模、专业化生产；2011年与山东莱芜东兴源食品有限公司合作，成功启动了国家科技支撑计划子课题“生姜功能成分高效分离关键技术研究与功能食品开发”。
全部完成人排序及对项目的贡献和工作量
全部完成人排序：唐晓珍、张平平、王玉民、位思清、姜媛、乔旭光、马明、赵冬艳、申江涛
全部完成人对项目的贡献和工作量：
唐晓珍负责项目的申报书撰写，实验内容、技术路线、实验方案的设计；各年度实施计划制定和年度总结、鉴定材料的撰写，对项目各项创新都做出了不同的贡献，对本项目各项创新的具体贡献分别是（1）有4篇通讯作者的文章；（2）有1项第一位发明专利和2篇通讯作者的文章；（4）有2篇第一位、2篇通讯作者的文章；（3）、（5）是相关研究生论文的导师。投入的工作量占本人工作总量的80%左右。
张平平参与完成了创新（1）、（2）、（3）、（5），具体负责生姜蛋白酶的酶学性质的整个研究的实验内容、技术路线、实验方案的设计；各年度实施计划制定和年度总结、鉴定材料的撰写，，在本项技术研发工作中投入的工作量占本人工作总量的70%。
王玉民：参与完成了创新点（1）、（2）、（3）、（5），具体负责生姜蛋白酶的纯化试验等技术路线和试验方案的设计以及部分实验，在本项技术研发工作中投入的工作量占本人工作总量的70%。
位思清：参与完成了创新点（1）、（2）、（3）、（5），具体负责生姜蛋白酶的纯化试验等技术路线和试验方案的设计以及部分实验。负责整个项目的设备选型、维修，数据处理以及38种生姜中姜酶含量差异试验的设计与试验。在本项技术研发工作中投入的工作量占本人工作总量的60%。
姜媛：参与完成了创新点（1）、（2）、（3）、（4）、（5），具体负责各个创新点的资料收集、查新、数据处理以及部分生姜蛋白酶的固定化技术试验的实施，在本项技术研发工作中投入的工作量占本人工作总量的60%。
乔旭光：参与完成了创新点（1）、（2）、（3）、（4）、（5），具体负责各个创新点的实验设计与技术路线，负责整个项目的组织实施和生姜蛋白酶的固定化技术路线和试验方案的设计和工作报告的撰写。在本项技术研发工作中投入的工作量占本人工作总量的60%。
马明：参与完成了创新点（1）、（2）、（3）、（4）、（5）的各种实验指标测试，重点参与了创新点（5）38种生姜的收集、调研以及提取试验的设计与试验。在本项技术研发工作中投入的工作量占本人工作总量的60%。
赵冬艳：参与完成了创新点（1）、（2）、（3）、（4）、（5），具体负责生姜蛋白酶固定化的实验内容、技术路线、实验方案的设计及其各年度实施计划制定和年度总结、鉴定材料的撰写，在本项技术研发工作中投入的工作量占本人工作总量的40%。
申江涛：参与完成了创新点（1）、（2）、（3）、（4）、（5），具体负责整个项目技术在其单位推广方案设计，组织生产的实施；推广技术在其单位应用效果的统计和经济效果的核算以及相关资料的撰写。在本项技术研发工作中投入的工作量占本人工作总量的30%。
全部完成单位及排序：
山东农业大学、日照赛普食品科技有限公司
五、推广应用情况、经济效益和社会效益